CZ418599A3 - Sloučeniny, způsob jejich přípravy a jejich použití pro přenos nukleových kyselin do buněk - Google Patents

Abstract

Lipopolyaminy obsahující airádinové funkční skupiny obecného vzorce I. Sloučeninyjsou vhodné pro přenos důležitých nukleových kyselin do různých typů buněk in vitro, in vivo a ex vivo.

Description

Oblast techniky '

Předkládaný vynález se týká nových.sloučenin pro přenos nukleových kyselin do 'buněk. Tyto nové sloučeniny, jsou přesněji členy skupiny lipopolyaminových sloučenin a obsahují amidinové funkční skupiny. Tyto sloučeniny se mohou použít pro ..přenos důležitých nukleových kyselin do různých typů buněk, jak in vitro, tak in vivo nebo ex vivo. h

Dosavadní stav.techniky

Š vývojem biotechnologie'vyvstává potřeba nalézt vhodný způsob· .pro účinný přenos nukleových kyselin do buněk. Může zahrnovat přenos nukleových kyselin do buněk' in vitro, například při výrobě rekombinantních ,prot,einú nebo v laboratořích při studiu regulace exprimace genů,, klonování genů. nebo . jakékoli jiné manipulace s DNA. Může také zahrnovat, přenos nukleových kyselin do buněk in vivo, například při tvoření transgenních zvířat, při výrobě yakcín,· studiích se·’ značením·· nebo také při terapeutických přístupech. Může to být také přenos nukleových kyselin do buněk . ex vivo,, v pří stupech Zahrnuj ících· transplantaci, kostní dřeně, imunoterapii nebo jiné způsoby zahrnující přenos genů do ^;buněk odebraných z organismu pro účel. jejich následného zpětného podávání.

Pro zlepšení přenosu nukleových kyselin», do buněk sě vyvinuly různé typy syntetických vektorů. Mezi . těmito vektory mají .výhodně vlastnosti -kationtové lipidy. Tyto. vektory se skládají z kationtové polární části, která intěraguje s nukleovými ky- · * selinami a hydrofobní lipidové části/ které podporují proniknutí do buněk. Specifickými příklady kationtových lipidů jsou zejména monokationtové lipidy (DOTMA: Lipofectin®) ; některé kationtové detergenty (DDAB); lipopolyaminy a zejména diok-

«··· ·« tadecylamidoglycylspermin (DOGS) -'^řnebo 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidylethanolaminu (DPPES), jehož penetrace je popsaná například v patentové přihlášce EP 394 111. Jinou

I skupinu lipopolyaminů představují sloučeniny popsané v patentové přihlášce WO 97/18185, která je zde uvedena jako odkaz.

Předkládaný vynález se týká nového typu činidel pro přenos nukleových kyselin, které mají zvláště výhodné vlastnosti. Přesněji jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu kationtovými lipidy, které nesou nové kationtové oblasti, propůjčující molekulám lepší vlastnosti. Tuto kationtovou část přesněji představuje zejména polyamin, .nesoucí jednu nebo více amidinových funkčních skupin. . .. .

Podstata vynálezu ; - '

První předmět podle, předkládaného vynálezu se· týká sloučenin v D, L nebo DL formě, a také jejich solí, obecného vzorce I:

R->

/ ,N

(1)

- Ri, R₂ ,a/R₃ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo . skupina

- (CH₂) _q-NRR^z , kde . . ’ • q je celé. číslo 1 až 6 včetně, hodnoty q jsou na sobě nezávislé u různých skupin R_lř R₂ a R₃ a • R and R' jsou nezávisle na sobe atom vodíku nebo skupina vzorce II:

taaařssfflsssaáaawfes

<Π) kde r je celé číslo, které se může měnit od 0 do 6 včetně a R_s je nezávisleatom vodíku nebo uhlovodíkový zbytek, a je třeba poznamenat, že nejméně jedna skupina R₁₍ R₂ a R₃ obsahuje nejméně jednu skupinu vzorce.II,

- m a n jsou nezávisle ná.sobě celé číslo, které se může měnit od 0 do 6 včetně, kde, pokud n je vyšší než .1, m může mít různé hodnoty a R₃ různé významy podle vzorce I,

- p je celé číslo, které se může měnit od 1 do 6 včetně a

- R₄ je skupina vzorce III:

-ř-x— (CH) —Y-^-íS

X^R7 (III) kde :. . .' • R₇ a Rg- jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo lipofilní skupina, alespoň jedna ze skupin R₇ a R_g je jiná než . atom vodíku, • t je celé číslo 0 až 10 včetně, kde R_s, X, Y a s mohou mít různé významy podle různých, jednotek [X-(CHR_S) _S-Y] , kde t je celé číslo vyšší než 1, . ' ' • X je atom kyslíku nebo atom síry nebo aminoskupina nebo alkylamínoskupina, alkylová skupina je lineární nebo rozvětvená a obsahuje 1 až 8 atomů uhlíku,

• · • Y je karbonylová skupina· nebo methylenová skupina, • Rg je atom vodíku nebo postranní řetězec přírodní aminokyseliny,' který je pokud je to vhodné substituovaný, • s je celé číslo 1 až 10 včetně, kdy, pokud s je rovno·1, R₆ je postranní řetězec přírodní aminokyseliny, který ' je pokud je to vhodné substituovaný a pokud je s vyšší než 1, R_s je atom vodíku:

, Termín „DL forma podle předkládaného vynálezu znamená' směs D a L forem v jakémkoli poměru, například v rovném poměru.

Pro účeTy podle předkládaného vynálezu znamená termín „uhlovodíkový zbytek jakoukoli alifatickou nebo aromatickou alkylovou skupinu, karbamátovou skupinu'nebo acylovou,skupinu, která -je popřípadě halogenovaná. Mezi alifatické zbytky patří zejména cyklické nebo necýklické, lineární nebo rozvětvené, nasycené .nebo· nenasycené alifatické zbytky, které'; jsou •popřípadě· halogenované. Výhodněji jsou to alifatické . zbytky obsahující 1 až 10 atomu uhlíku. Jsou, to zejména alkanoylová , skupina, alkylQvá. skupina a- alkylkarbamátová skupina, jako je například formylová skupina, butylová skupina, terč.butylová skupina nebo· terč.butylkarbamátová' skupina. Podle vyrionty podle předkládaného vynálezu je R₅ terč.butylkarbamát.

Mezi aromatickými zbytky je možné uvést zejména benzylovou skupinu a její substituované deriváty, jako je chlorobenzylová •a ί skupina, benzylkarbamátová skupina nebo chlorbenzylkarbamátová > . ' O i ' skupina . . ·

S výhodou je R₅ terč.butylkarbamátová skupina, be,nzylkarbamáto. vá skupina nebo chlorbenzylkarbamátová-skupina.

V prvním provedení podle předkládaného vynálezu je jedna skupina R₅ atom vodíku a druhá je alifatická skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku. .

···· ·«

Ve druhém provedení podle předkládaného vynálezu je jedna skupina R₅ atom vodíku- a druhá je aromatická skupina s výhodou vybřnaá z benzylové skupiny a jejích derivátů.

V jiném provedení podle předkládaného vynálezu jsou obě skupiny R§ atom vodíku.

Výhodně, pokud R₁₍ R₂ a/nebo R₃ jsou jiné než atom vodíku, a obsahují skupinu vzorce II, q má hodnoty 2 nebo 3 a r je rovno nule. '

S výhodou je v obecném vzorci I m vybráno z 2, 3 a 4.

)

Jak je uvedeno výše, ve vzorci III je nejméně jedna skupina R₇ a R_a lipořilní skupina. Pro účely podle předkládaného vynálezu znamená termín „lipořilní skupina jakoukoli skupinu hydrofob’-ního, lipidóvého. typu, která podporuje buněčnou penetraci, a která je odborníkům v této oblasti známá. Může to být jeden nebo více alifatických mastných řetězců, steroidní derivát, » · přírodní nebo, syntetický .lipid,, který je s výhodou schopný tvořit lamelární nebo hexagonální . fázi. nebo popřípadě jejich kombinace. S výhodou může být přítomen lineární nebo rozvětvený, nasycený nebo nenasycený alifatický zbytek obsahující 5 až 22 atomů uhlíku, který je popřípadě halogenovaný. Může to být také derivát -steroidu nebo skupina (CH₂)_U-NH-R₉, kde. u je celé číslo 2 až 6 včetně a R₉ je acylová skupina, jako' je například cholesterylformiátová skupina, ar.achidonylová skupina nebo kyselina cholová.

Dalšími příklady steroidních derivátů jsou zejména · cholesterol, cholestanol, 3-a-5-cyklo,-5-a-cholestan-6-p-ol, kyselina cholová, cholesterylformiát, chotestanylformiát, 3a,5-cyklo5a-choléstan-6P-ylformiát, cholesterylamin, 6-.(1,5-dimethyl hexyl) -3a,5a-dimethylhexadekahydrocyklopenta [á]cyklopropa[2,3]cyklopenta[1,2-f]naftalen-10-ylamin nebo chOlestanylamin.

9 9

S'výhodou je lipofilní skupina alifatická skupina obsahující' 10 až 22 atomu uhlíku, s výhodou 14, 16, 17, 18 nebo 19 atomů uhlíku. Zejména je možné uvést skupinu (CH₂)_i3CH_3i skupinu (CH₂)isCH₃, skupinu (CH₂)₁₆CH₃, skupinu (CH₂)i₇CH₃, skupinu (CH₂)i₈CH₃ a oleylovou skupinu.

Ve specifickém provedení obě skupiny R₇. a R₈ představují lipofilní skupiny definované výše. Ve zvláště výhodném provedení představují obě skupiny R₇ a R₈ alifatický řetězec^obsahující 5 z

až.22 atomů uhlíku a výhodněji 12'až 22 atomů uhlíku.

Podle varianty podle předkládaného vynálezu je R₆ postranní řetězec přírodní aminokyseliny. Postranní řetězec přírodní aminokyseliny může , zejména obsahovat amidiniové jednotky', jako je například postranní řetězec argininu. Tento postranní.řetězec může být také, jak bylo uvedeno výše, substituovaný lineární ,. rozvětvenou nebo cyklickou, nasycenou nebo nenasycenou alifatickou skupinou obsahující 1 až 24 atomů uhlíku. Jako příklady je. možné uvést postranní aminokyselinové řetězce substituované cholesterylovou skupinou, arachidonylovou skupinou nebo retinoylovou' . skupinou, mono- nebo polyaromatické skupiny, jako je například benzyloxykarbonylová skupina, benzylesterová skupina,., rhodaminylová skupina nebo deriváty biotinylu,. -které jsou substituované nebo riesubstituované.

Ve zvláště výhodném provedení nárokované sloučeniny dále obsahují směrující složky, které umožňují orientovat přenos nukleové kyseliny, se kterou jsou spojeny. Tato směrující složka je s výhodou umístěna na sloučenině vzorce\I v místě aminoky.se' ' ·. 3 · .

linového postranního řetězce, který představuje, substituent R₆,. Výhodněji je tato směrující složka vázána, buď kovalentně nebo nekovalentně, ke sloučenině podle předkládaného vynálezu.

Skupinou, která umožňuje orientaci transferu nukleové kyseliny k určitému typu buněk nebo k určité požadované tkáni (nádorovým buňkám, hepatitickým buňkám, hematopoietickým buňkám a

« φ φ · φ φ · φφφφ φφ φ φ φφφ'φ • ' φ φ . ·φ φ φ φφφφφφ.

-7 φΦΦ Φ · ·· / ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ *·· ·· ·* podobně), může být extracelúlární . směrující složka. V této souvislosti to může být ligand buněčného receptoru přítomného na povrchu cílového typu buněk, jako je například cukr, folát, transferin, insulin, asialoorosomukoidní protein nebo jakákoli bioaktivní molekula rozlišená extracelulárními receptory. Může to být také i.ntracelulární směrující složka, která .umožňuje orientovat přenos nukleové kyseliny k určitým výhodným buněč- » ným částem (mitochondriím, jádru a podobně), jako je například lokalizační signální sekvence jádra (nls),. která podporuje akumulaci transfekované DNA uvnitř v jádru. ’

Obecněji; zahrnují'' směrující složky,- které se mohou použít podle předkládaného vynálezu, ' cukry, peptidy, -oligonukleotidy, steroidy nebo lipidy. S výhodou to jsou cukry a/nebo peptidy, Jako jsou protilátky nebo fragmenty protilátek, ligandy buněčných receptorů nebo jejich fragmenty, receptory nebo fragmenty receptorů a podobně. Zejména to mohou být ligandy receptorů růstových faktorů, .receptorů cytokinů, receptorů buněčných lektinů nebo- receptorů adhezních proteinů, jako. jsou iritegriny. Dále je možné uvést receptor transferinu, HDL lipidů a . LDL.. Směrující 'složka může být také. cukr, který umožňuje zasáhnout lektiny, jako. jsou receptory ašiáloglycoproteinu nebo fragmenty protilátky Fab, které umožňují zasáhnout' receptory imunoglobulinového Fc fragmentu.. . ’

Podobně je možné navrhnout kombinaci sloučeniny obecného vzorce. I se značkovačem biotinového, rhodaminového nebo folátového typu, například na R₆ aminokyselinovém postranním řetězci. Tento značkovač může být také lineární nebo cyklický peptidová nebo pseudopeptidová· sekvence obsahující’ Arg-Gly-Asp. epitop pro rozlišení primárních a/nebo sekundárních receptorů adhezních· proteinů integrinového typu.

··<*' ^Γ·-./ν .

·· ···· · • · · · · ·

Specifickou skupinou sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, kde R_x obsahuje skupinu vzorce II a R₂ a R₃ jsou atom vodíku. _x

Druhou specifickou skupinou sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, kde R₃ a R₂ obě obsahují skupinu vzorce II a R₃ je atom vodíku.

Další specifickou skupinou sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, kde R₃ a. R₃ obě obsahují skupinu vzorce II a R₂ je atom vodíku.

Další specifickou skupinou sloučenin jsou sloučeniny, kde Ri, R₂ a R₃ .obsahují skupinu II.

Nové -sloučeniny obecného vzorce I podle předkládaného vynálezu se mohou připravit ve formě s výhodou netoxických a farmaceuticky přijatelných solí. Mezi tyto netoxické soli patří soli vzniklé s anorganickými kyselinami (kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou fosforečnou nebo kyselinou dusičnou), připravené s organickými kyselinami (kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou jantarovou, kyselinou maleinovou, kyselinou hydroxymaleinovou, kyselinou benzoovou, kyselinou fumarovou,, kyselinou methansulfonovou nebo kyselinou šúavelovou) nebo připravené s anorganickými bázemi . (hydroxidem - sodným, hydroxidem draselným, hydroxidem lithným, hydroxidem česným) nebo organickými bázemi (terciárními aminy, jako je triethylamin, piperidin, benzylamin).

Jako příklady sloučenin, podle předkládaného vynálezu je možné uvést sloučeniny vzorců uvedených níže:

τι

ΗΝ ,ΗΝ-^ΝΗ

R₄ a Rg jsou definovány výše.

Jako příklady činidel pro přenos nukleových kyse.lin podle předkládaného vynálezu- je možné uvést sloučeniny následujících vzorců:

. NH

H.N^ANN' - II II

sloučenina 1

'v ~~ —η- -rr ; -

f'

Η,Ν

sloučenina 2

Nil

A

sloučenina -5

- A' '· - '*£>·' ιΛ,Μλ'····'·':'· aj ► ♦ 44 « • β • ' 4

Hj-r

ΝΗ t

ΝΧ-,

Η Ν' .HNyNHj jj-NH ,Ν

Η 7 Ν^ν

HJW • NH

'sloučenina 6

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu.: se mohou připravit různými způsoby,. zejména pomoci syntézy v roztoku a/nebo pomocí syntézy na pevné fázi na polymerním nosiči.

Podle prvního způsobu syntézy se. sloučeniny podle předkládaného -vynálezu obecného vzorce I mohou ' získát pomocí reakce thio nebo oxo derivátu močoviny,, jejíž aminoskupiny jsou popřípadě chráněny, s lipopolyaminem vzorce VIII:.

R’,

R·,

R',/ *N*4 (Vlil) kde R'i, R'.2, R',3 jsou nezávisle na sobě atom vodíku, skupina (CH₂) q-NR₉Rioz <3 se , může měnit mezi 1 až 6 včetně, různé typy q jsouna sobě nezávislé, i , - .

R₉ a Rio jsou nezávislé na sobě atom-vodíku/nebo skupina vzorce/ (CH₂)_r-ŇH₂, r se -může nezávisle měnit od 1 do 6 včetně, a m, n, pa R₄ jsou definovány výše.

Působení derivátu močoviny se obvykle provádí v přítomnosti báze, ve vhodném: protickém nebo aprotickém rozpouštědle a při teplotě 0 až 100 °C.

Bází.je obecně nenukleofilní báze, jako je například terciární amin, uhličitan sodný nebo hydrogenuhličitan sodný. S výhodou Ί ΤΟ ···'·· ··

X ···· ·· ··· ··· ·· ·· se použijí terciární aminy, například triethylamin (TEA) nebo N-ethyldiisopropylámin (ĎIEA).

Reakce se s výhodou provádí v rozpouštědle, jako je voda, alkoholy ’(methanol, ethanol, isopropanol a podobně), dimethylformamid, dichlormethan, chloroform, toluen, tetrachlormethan, benzen, acetonitril, N-methylpyrrolidon a podobně. Reakční teplota se s výhodou pohybuje mezi 20°C až 60°Č a výhodněji mezi 30°C až 50°C.

Deriváty močoviny, které jsou zvláště výhodné, jsou například O-methylisomočovina (J. Med. Chem.·, 38 (1995) ,16, 3053-3061), hemisulfát S-methylisothiomočoviny (Int. J. Pept. Prot. Res., 40(1992), 119-126), bis-Boc-thiomočovina (Tet. Lett. 48(1993), 7677-7680) , N,N' -bis (benzyloYcykarbonyl) -S-methylisothiomočovi:'na nebo N,Ň' -bis (terč .butóxykarbonyl) -S-methylisothiomočovina . (Synth. Commun., 26 (1996),.2, 407-413)..

Lipopolýaminy obecného vzorce' VIII se získají podle způsobů popsaných v patentové přihlášce WO97/18185, která je.zde uvedena ..j.akó odkaz nebo podobnými způsoby, které jsou odborníkům v této oblasti známé.

Podle předkládaného vynálezu se může přenosové činidlo obecného vzorce I také připravit pomocí peptidové kondenzace, mezi kyselinou vzorce IX: '

R, ο Γ I ⁰

R, N,

JÍi(CH₂)^z OH (ix) a molekulou lipidu vzorce R₄H, kde Ri, R2, R3, m, n, p a R₄ jsou definovány výše.

*·

Kondenzace peptidů se provádí podle známých postupů (Bodanski Μ. , Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) nebo podobnými způsoby, které jsou odborníkům v této oblasti známé.

Reakce se zejména obvykle provádí v přítomnosti nenukleofilní báze ve vhodném aprotickém rozpouštědle, ‘při teplotě 0 až 100 °C, kdy se pH upraví na hodnotu 9 až 11.

Jako rozpouštědlo se může - například použít chloroform, dimethylformamid, N-methylpyrrolidon, acetonitril, dichlormethan, toluen nebo benzen.

.

Jako nenukleofilní báze se s výhodou používají terciární aminy, ' uhličitan vápenatý nebo hydrogenuhličitan sodný. Ještě výhodnějšími bázemi jsou terciární aminy, napříkladtriethylamin (TEA) nebo Nrethyldiisopropylamin (DIEA) .· y /

Reakce ses výhodou provádí při.teplotě 0 až 50 °C a výhodněji 10 až 30 °C.

Molekula lipidu R₄H, kde R₄ je definováno výše, se může získat pomocí peptidové kondenzace, mezi komerčně dostupnou sloučeninou vzorce X:

''I·'. . I , .

H-p-X— (CH)_s-y4?

ÓH (X) a aminem vzorce NHR7R3, kde X, Y, s, t,. R₆, R7 a R_s jsou definovány výše.

Peptidová kondenzace se provádí běžnými -způsoby (Bodanski. Μ. , Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. SpringeVerlag) nebo podobnými způsoby, které jsou odborníkům v této oblasti známé. .

AA AAAA

AAA· ·«

A A A A

A A A A ··· ·♦· • · • A A A

Obecně se reakce provádí v přítomnosti nenukleofilní báze v přítomnosti vhodných aprotických rozpouštědel;, při teplotě 0 až 100 °C, kdy se pH upraví na hodnotu 9 až 11, jak je popsáno výše.

Kyselina obecného vzorce IX se může získat pomocí tříkrokové syntézy na pevné fázi následujícím způsobem:

- polyamid.obecného vzorce IX:

R‘,

R*

NÍCH,) (XI) •kde R'i, R'_2/ R'₃, m a n jsou definovány výše, se naroubuje na za získání naroubované sloučeniny Vzorce polymerní nosič XII :

R‘, . M—C-O-CO-ICHpq-N—(CHjll·

Π, (XII)

Reakce, se s výhodou provádí při teplotě 0 až 100 °C v přítomnosti vhodného aprotického rozpouštědla, například chloroformu, dichlormethanu, dimethylformamidu, N-methylpyrrolidonu, . acetonitrilu,. toluenu, benzenu, a podobně; S výhodou se reakce provádí při teplotě místnosti. .

Vhodné jsou. různé polymerní .- nosiče. Pro syntézu peptidu na pevné fázi (Merrifieldova syntéza) se s výhodou, vyberou komerčně dostupné pryskyřice. S výhodou se mohou vybrat O-chlórtritylchloridová pryskyřice nebo.HMP pryskyřice, které poskytují produkty nesoucí volné kyselinové funkční skupiny nebo pryskyřice typu Rink. POlyaminokyseliny se. mohou syntetizovat přímo

• 9 99

9 9 9

99· ··· ·

99 ω-aldehydkyselinu.

na peptidu předem syntetizovaném bromalkylovou funkční skupinu nebo

Alkylační činidla používaná pro přípravu příslušné pryskyřice se vyberou podle alkylační metody,. Pro běžnou alkylaci se například vyberou kyselina bromoctová nebo ω-halogenkarboxylové kyseliny. Pro redukční alkylaci se například vyberou ω-aldehydkarboxylové kyseliny, jako je kyselina glyoxalóvá, semialdehyd kyseliny jantarové a podobně nebo ketdkyseliny, jako kyselina acetoóctová nebo kyselina pyrohroznová a podobně. .

'1 Výchozí_;polyaminy obecného vzorce. XI jsou buď komerčně dostupné, například spermidin, spermin, tris(2-aminoethyl)amin, fenylendiamin, diaminoethan (propan, butan,' pentan, hexan apodobně) nebo se mohou připravit běžnými způsoby, například kyanoethylací komerčně dostupných aminů, jako je diaminoethan, (propan, butan, pentan, hexan a ,’poďobně) aminů, „ špermidinu, sperminu, za získání rozvětvených polyaminů.

- ve druhém kroku se naroubovaná sloučenina vzorce XII. reaguje ' s thio nebo oxo. derivátem močoviny, kdy_; aminoskupiny j sou popřípadě '..chráněny, za získání roubované- polyaminpamidinové sloučeniny obecného vzorce XIII:

na pevné fázi, který nese

-C-O-CO-(CH₂)^N—(CH₂) H,

(xiii) kde R_lř R₂, R₃, m, nap jsou definovány výše.

Reakce se provádí podle způsobů, které- jsou odborníkům v této oblasti známé. (Bergeron, R.J. a McManis, Total synthesis of. 15-Deoxyspergualin, J. Org. Chem., 1987, 52. 1700-1703) nebo podobnými způsoby. '

·· ··♦« .·· ···· ·« ··· ···

Reakce se běžně provádí při teplotě -20 až 100 °C v přítomnosti protického nebo aprotického rozpouštědla.

Jako rozpouštědla se použijí například voda, alkoholy, (methanol, ethanol, isopropanol a podobně), dimethylformámid, dichlormethan, chloroform, aromatická rozpouštědla (toluen, benzen a podobně), tetrachlormethan, acetonitril, N-methylpyrrolidon a podobně.

Výhodnějšími deriváty močoviny jsou například O-methylisomo3053-3061), hemisulfát

Prot. Res. , 40 (1992),

Lett. 48 (1993), 7677čovina (J. Med. Chem., 38(1995) 16,

S-methylisothiomočoviny (Int. J.Pept 119-126), bis-Boc-thiomočovina (Tet.

7680), N,N' -bis(benzyloxykarbonyl)-S-methylisothiomočovina nebo Ν, N' -;bis (terč . butoxykarbonyl) -S-methylišothiómočovina (Synth. Comraun., 26(1996), 2, 407-413).

- Nakonec se v posledním kroku naroubované .polyaminoamidiny obecného vzorce XIII .odštěpí'od polymerního nosiče za zí skání kyseliny obecného vzorce IX, která je definovaná výše. Odštěpení se provádí jakýmkoli běžným způsobem, který je odborníkům v této oblasti známý. Zejména še provádí působením měkké kyseliny; která nedegraduje zbytek molekuly. Výhodnými měkkými kyselinami jsou - například fluorované alkoholy _r. a zejména* 1,1,. 1- trif luorethan-2-ol.

Protože polyaminoamidin obecného vzorce XIII obsahuje kyselinové', amino,; alkylamino a/nebo ¹ amidinové funkční skupiny, je výhodné, pokud je to. vhodné, tyto skupiny před štěpením od polymerního nosiče ' chránit . Chránění se může provést pomocí jakékoli’ kompatibilní ’ skupiny, jejíž použití a odstranění neovlivní . zbytek molekuly. Způsob provádí zejména podle způsobů popsaných v. T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, A..Wiléy-Interscience Publication- (1981), nebo v McOmie, Protective Groups' in Organic Chemistry, Plenům Press (1973) . ..

·· ···· ···· ·· ··# ··· chránících skupin se provádí kyselinou vzorce IX získanou

Pokud je to vhodné, odstranění před peptidovou kondenzací mezi po odštěpení od polymerního nosiče, a sloučeninou, vzorce R₄H pomocí běžných způsobů, které jsou odborníkupm v této oblasti známé.

Jako chránící skupiny se mohou použít například trimethylsilylová skupina, benzhydrylová skupina,, tetrahydropyranylová skupina, formylová skupina, acetylová skupina, chloracetylová skupina, trichloracetylová skupina, trifluoracetylová skupina, ethoxykarbonylová skupina, terč.butoxykarbonylová skupina., trichlorethoxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina a fluorenyloxykarbonylová. skupina a podobně.

Do rozsahu podle předkládaného vynálezu také spadají další způsoby-, které jsou odborníkům v teto Oblasti známé, a jsou popsány například v ,Bodanski Μ. , Principles and Practices of' Peptides Synthesis, Ed.. Springe-Verl.ag, které vedou, k činidlům pro přenos nukieových. kyselin podle předkládaného vynálezu.

Další předmět podle, předkládaného vynálezu se týká prostředku obsahujícího činidlo definované výše a nukleovou , kyselinu.. S výhodou' jsou sloučenina a nukleová kyselina přítomny v'takových množstvích, že poměr ?R kladných nábojů sloučeniny ku negativním . nábojům nukleové kyseliny . se pohybuje mezi 0,1 až 50 a. výhodněji 0,1 až 20. · Tento poměř, může snadno odborník pracující v. této oblasti upravit v závislosti na použité sloučenině, nukleové kyselině a. požadované aplikaci (zejména na typu buněk, které se mají transfekovatj .

Pro' účely podle - předkládaného' vynálezu znamená termín „nukleová kyselina jak deoxyribonukleovou kyselinu, tak .ribonukleovou kyselinu. Mohou to být přírodní nebo syntetické sekvence a zejména genomická DNA (gDNA), komplementární DNA (cDNA), mediátorová RNA (mRNA), transferová RNA (tRNA),. ribosomální RNA (rRNA), 'hybridní sekvence nebo polosyntetické sekvence,

I

l

í i* '·* ···· ♦ · · « · • · • · · ···· α· ··· ·· ·· ·· • · · · · · 9 »·· <··· • · • fl ·· oligonukleotidy, které jsou modifikované nebo podobně. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, živočišného, roslinného, bakteriálního nebo virového původu a podobně. Mohou se získat pomocí postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé a, zejména pomocí screeningu knihoven, chemickou syntézou nebo smíšenými postupy, včetně chemických a enzymatických modifikací sekvencí získaných pomocí screeningu knihoven. Mohou se chemicky modifikovat.

Pokud jde o deoxyribonukleové kyseliny, mohou být jedno nebo dvoupramenné a také to mohou být krátké oligonukleotidy nebo delší sekvence. Nukleové kyseliny mohou zahrnovat plasmidy, vektory, episomy, expresní- kazety a podobně. Tyto deoxyribo-, nukleové kyseliny mohou nést replikační počátek, který je funkční nebo jiný v cílové buňce, jeden nebo více,markerových genů, sekvence pro regulaci transkripce nebo replikace, geny terapeutického významu, „anti-sense sekvence, které jsou modifikované, nebo jiné.

Nukleové kyseliny s výhodou zahrnují' expresní kazety skládající se z jednoho nebo více genů. terapeutického významu pod kontrolou jednoho nebo více. promotérů, a terminátorů·transkripce, které .jsou aktivní na cílových buňkách. .

Pro účely podle předkládaného vynálezu se genem terapeutického .významu rozumí zejména gen kódující proteinový produkt, který má terapeutický význam. Takto kódovaný proteinový produkt může být zejména protein nebo peptid. Tento proteinový produkt může být exogenní, homologní nebo endogenní vzhledem k-cílové buňce, to znamená produkt, který je normálně exprimován v ci\ lově buňce, pokud· tato' buňka nevykazuje onemocnění. V tomto případě umožňuje expr.imačé proteinu například překonat nedostatečnou exprimaci v buňce nebo exprimaci proteinu, který je neaktivní nebo slabě aktivní, protože je modifikovaný, nebo překonat nadbytečnou exprimaci tohoto proteinu. Geri terapeu-

tického.významu může také kódovat .mutant buněčného proteinu, který má zvýšenou stabilitu; modifikovanou aktivitu a podobně. Proteinový produkt může být také heterologní vzhledem k cílové buňce. V tomto případě může exprimovány protein například doplňovat nebo poskytovat, aktivitu, která je v buňce nedostatečná, čímž . se umožní boj s onemocněním nebo se . stimuluje imunitní odpověď.

Mezi- terapeutickými produkty podle předkládaného vynálezu je možné uvést, zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfo.. · _x , I ....

kiný, interleukiny, interferony, TNF a podobně (FR 92/03120), růstové faktory,, neurotransmitéry nebo jejich prekurzory nebo syntetické enzymy, trofní.faktory (BDNF, CNTF, NGF, IGF,. GMF, aFGF, bFGF, NT3, HARP/pleiotrofin a podobně), apolipoproteiny, (ApoAI,ApoAIV, ApoE a podobně, FR 93/05125). dystrofin nebo minidystrofin (FR 91/11947) CF.TR protein spojený s cystickou fibrózou, nádorové expresní geny (p53 , Rb, · RaplA, DCC, k-rev,. a podobně, . FR 93/04745) , geny -kódující faktory, zahrnuté při· koagulaci (faktory' VII, VIII., IX) , geny zahrnuté při reparaci , DNA (thymidinkináza, cvtosindeamináza) ,' geny pro hemoglobin nebo . jiné proteinové transportéry, metaboli.cké nebo katabolické enzymy a podobně.'

Nukleová kyselina terapeutického významu může být také „anti-. sense gen . nebo sekvence, jejichž exprimace v cílové buňce umožňuje kontrolu exprimace genů nebo¹ transkripce .buněčné mRNA. Tyto.· sekvence se. mohou například přepisovat v cílové buňce na RNA komplementární s buněčnou mRNA a tak blokovat její translaci do proteinu, ..podle techniky popsané v patentu EP 14 0,3 08. Terapeutivké geny také zahrnují sekvence kódující, ribózomy, které jsou schpně selektivně zničit cílové RNA (EP 321,201). < /

Nukleová kyselina může- také obsahovat jeden nebo více genů kódujících .antigenní peptidy,. schopné generovat. imunitní od..y.

ít>

W'9' poveď u člověka nebo živočichů. V.tomto konkrétním provedení předkládaný vynález umožňuje výrobu buď vakcín nebo imunoterapeutickýóh léčiv podávaných člověku nebo živočichům, zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovině. Může také zahrnovat zejména antigenní peptidy specifické pro Epstein Barrův virus, virus HIV, virus hepatitidy B (EP'185,573), psěudovzteklinové .viry, „viry tvořící syncitie, jiné viry nebo antigenní peptidy specifické pro pro nádory (EP 259,212).

Nukleové kyseliny také s výhodou' zahrnují sekvence umožňující exprimaci genu terapeutického významu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid v.požadované buňce nebo orgánu. Mohou to být sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za exprimaci uvažovaného genu, pokud,jsou tyto sekvence schopné fungovat v nakažené buňce.‘Mohou to být také sekvence jiného původu (zodpovědné za exprimaci jiných’ proteinů ·nebo dokonce ' syntetické sekvence) Zejména to mohou být promotorové sekvence . eukaryotických nebo virových genů. Například to mohou být promotorové sekvence odvozené od genomu· buňky,' který ' se má infikovat. Podobně to mohou být promotorové sekvence odvozené od genomu viru.. V této souvislosti je možné uvést například promotory E1A, MLP, CMV a RSV genů a podobně. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním, aktivujících a regulačních sekvencí a podobně. Mohou, také obsahovat indukovatel.né. nebo potlacitelné promotory.

Dále může nukleová. kyselina také obsahovat, zejména „upstream genu terapeutického . významu, .signální sekvenci řídící terapeutický. produkt syntetizovaný ve. vyměšovacích·drahách cílové buňky.' Touto signální sekvencí může být přirozená’ signální sekvence terapeutického produktu, ale- může to být také jakáko-, li jiná. funkční, signální sekvence nebo umělá signální· sekvence. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt směrem k příslušné části buňky.

··

V jiném provedení se předkládaný vynález také týká prostředků obsahujících nukleovou kyselinu, transfekční. činidlo I, jak bylo definováno výše a jednu nebo více přísad schopných kombinace s komplexém transfekční činidlo/nukleová kyselina a zvyšujících jeho transfekční sílu. Přítomnost takového typu přísady '(například lipidů, peptidů nebo proteinů) může například umožňovat zvýšení transfekční síly sloučenin.

V; tomto ohledu mohou prostředky podle předkládaného vynálezu jako přísadu .obsahovat jeden nebo více neutrálních lipidu. Tyto prostředky jsou zvláště výhodné, zejména pókud poměr náboje R núkleolipidových komplexů je malý. Přihlašovatel skutečně dokázal, že přidání neutrálního lipidu umožňuje zlepšit . vznik núkleolipidových částic a zlepšit penetraci částic do buněk pomocí destabilizace jejičh membrány;

Výhodněji jsou neutrálními lipidy používanými. podle předkládaného vynálezu lipidy obsahující dva mastné řetězce.' Zvláště výhodně .se použijí přírodní'.nebo syntetické lipidy,/které'jsou za' fyziologických podmínek oboje tnými ionty ’ nebo. nemá j í\ iontový náboj. Mohou se zejména vybrat ze skupiny, kterou tvoří dioleylfosfatidylethanolamin (DOPE) , oleoýlpalmitovlfosfati'dylethanolamin (POPE), di-stearoyl,/ -palmitoyl a -myristoylfosfatidylethanolaminy a také jejich deriváty, které jsou jednou až , třikrát N-methylovane; fo.sf atidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosýldiacylglyceroly, cerebrosidy (jako. jsou zejména galaktoCerebrosidy), sfingolipidy (jako jsou například šfingomyeliny) nebo asialogangliosidy (jako jsou zejména asial.oGMl a GM2 ) . '

Tyto různé lipidy se mohou připravit buď synteticky nebo pomocí extrakce z orgánů (například z mozku) nebo z vajec, pomocí běžných postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé . Zejména extrakce přírodních lipidů se může provádět pomocí organických rozpouštědel (viz. Lehniňger, Biochemistry)..

,í

···¹ ·· ·

Nedávno přihlašovatelé demonstrovali, že je také zvláště' výhodné použít.jako přísadu sloučeniny přímpfnebo jinak zahrnuté při kondenzaci jmenované nukleové kyseliny \(W0 96/25508).

Přítomnost těchto sloučenin v prostředku podle předkládaného vynálezu umožňuje snížit množství transfekční sloučeniny, což je zejména výhodné z toxikologického hlediska, bez jakéhokoli ' poškození účinku na transfekční aktivitu.' Sloučenina zahrnutá při\ kondenzaci nukleové kyseliny by měla přímo nebo .nepřímo definovat sloučeninu, která tvoří nukleovou kyselinu. Přesněji může.· tato sloučenina buď působit přímo na úrovni nukleové kyseli-ny, která se má transfekovat nebo může být zahrnuta na . úrovni další.sloučeniny, která je přímo zahrnuta při kondenzaci této nukleové kyseliny.S výhodou působí přímo na úrovni nukleové kyseliny. Tímto činidlem může být jakýkoli polyka: ti;on, například polylysin. Podle . výhodného provedení toto činidlo, které je zahrnuto při kondenzaci nukleové kyseliny, je ' odvozeno, úplně nebo částečně, od protaminu, od histonu nebo od nukleoliriu a/nebo od 'jednoho z jejich derivátů. Toto činidlo se může také. skládat, úplně nebo částečně, z peptidových jednotek' (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA) . Počet jednotek se ⁴ může měnit od 2 do 10. Ve struktuře sloučeniny podle předkládaného vynálezu se tyto jednotky mohou opakovat nepřetržitě nebo jinak. Mohou být tedy.odděleny pomoci můstků bipchemické povahy, například jednou nebo více aminokyselinami, nebo chemické povahy.

Prostředky podle , předkládaného vynálezu s .výhodou obsahují 0,01 až 20 ekvivalentů přísady na ekvivalent nukleových kyselin v mol/mol a výhodněji 0,5 až 5.

.Ve zvláště výhodném provedení prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují dále' směrující složky, které umožňují orien.továt přenos nukleové kyseliny. Tato směrující složka může být složkou pro extracelulární směrování,, která umožňuje orientovat přenos DNA k určitým typům buněk nebo určitým požadovaným

I

»« · tkáním (nádorové buňky, hepatitické buňky, hematopoietické buňky a podobně) . Může to být také intracelulární směrující složka, která umožňuje orientovat přenos, nukleové kyseliny směrem k výhodným částem buněk (mitochondriím, jádru a podobně) . Směrující složka může být připojena k přenosovému činidlu nukleové .kyseliny podle předkládaného' vynálezu nebo také k nukleové kyselině, která je definovaná výše.

Mezi směrující složky, které se mohou použít podle předkládaného vynálezu, patří například cukry, peptidy, proteiny, oligonukleotidy, lipidy, neuromediátory, hormony, vitaminy nebo jejich, deriváty. S výhodou jsou to cukry nebo‘ proteiny,

I jako, jsou protilátky nebo fragmenty protilátek, ligandy buněčných receptorů nebo jejich fragmenty, receptory nebo fragmenty receptorů a podobně. Zejména to mohou být ligandy pro receptory. ; růstových faktorů, receptory cytokinu, receptory buněčného lektinového typu nebo.ligandy obsahující -RGD sekvenci s afinitou k.'receptorům . adhezních proteinů, '.jako jsou- integriny. Mohou to být také receptory transferinu., HDL a LDL nebo přenašeč folátu. Směrující .složkou může být také cukr, který umožňuje zasáhnout - lectiny, jako jsou receptory asiáloglykoproteinů nebo syalydú, jako je sialyd Lewis X nebo fragment Fab protilátky nebo jednořetězcové protilátka (ScFv).

?·

Kombinace směrujících složek s nukleolipidovými komplexy se může provést pomocí technik, které jsou odborníkům v této oblasti známé,' například- pomocí' kondenzace k hydrofobní části nebo k části, která intěraguje s nukleovou, kyselinou přenosového činidla· podle předkládaného vynálezu nebo ke skupině, která intěraguje s přenosovým činidlem podle předkládaného vynálezu nebo s nukleovou kyselinou. Požadovaná interakce může mít s výhodou iontovou nebo kovalentní povahu.

···· ·* ·** *** ** **

Předmětem podle předkládaného vynálezu je také použití sloučenin definovaných výše pro přenos nukleových kyselin (a obecně polyaniontů) do buněk.

Pro použití in vivo, například pro studium regulace genů, pro přípravu zvířecích modelů patologických stavů, nebo pro léčení se mohou prostředky podle předkládaného vynálezu upravit pro podávání místním, kožním, -orálním, rektálním, vaginálním, parenterálním, intranásálním, nitrožilním, nitrosvalovým, podkožním, nitroočním, transdermálním, intratracheálním nebo intraperitoneálním způsobem a podo'bně. Prostředky podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahují vehikulúm, které je farmaceuticky přijatelné pro injekční prostředky, zejména, pro přímé injekční .podáváni do požadovaného orgánu nebo pro podávání místním způsobem (na pokožku a/nebo na sliznici.) . Mohou.to být zejména isotonické sterilní roztoky nebo suché, .zejména sušené za zmrazení, prostředky, které se před podáváním v závislosti na.způsobu podávání,, zředí sterilizovanou vodou nebo fyziologickým roztokem solanky, čímž vzniknou roztoky vhodné pro injekční podávání.’ Dávky 'nukleová kyseliny používané pro injekční prostředky a také počet podávání se mohou upravit podle různých parametrů a zejména . podle způsobu podávání, odpovídajícího onemocnění, genu, který se má exprimovat' nebo na požadqvané době léčby. Pokud jde.o způsob podávání, může. se použít buď -přímé injekční podávání do tkáně, například na úrovni nádorů nebo do oběhového systému nebo léčení buněk při kultivaci před jejich zpětnou implantací ' in vivo, pomocí injekce nebo transplantace. Odpovídající tkáně nebo oběhový systém podle předkládaného . vynálezu jsou .například svaly, kůže, mozel, plíce, .‘játra, slezina, kostní dřeň, brzlík, srdce, míza, krev, kosti, chrupavky, slinivka břišní, ledviny, měchýř, žaludek, střevo, varlata, vaječníky, konečník, nervový systém, oči, žlázy, pojivové tkáně a podobně.

··. · • ·'· · · · ·

Předkládaný vynález se dále týká způsobu přenosu nukleových kyselin do buněk, který zahrnuje následující kroky:

(1) uvedení nukleové kyseliny do styku s přenosovým činidlem definovaným výše za vzniku komplexu a (2) uvedení buněk do styku s komplexem vzniklým v (1).

Buňky se mohou uvést do kontaktu s komplexem pomocí inkubace buněk s jmenovaným komplexem (při použití in vitro nebo ex vivo) nebo pomocí injektování komplexu do organismu (pro použití in vivo} . Inkubace se s výhodou provádí v přítomnosti například. 0,01 až 1000 pg nukleové kyseliny na 10⁵ b.uněk. Při .in vivo podávání se může použít dávka nukleové kyseliny 0,01 až 10 mg.. · •V případě, že prostředky, podle předkládaného.vynálezu obsahují dále jednu nebo více přísad a/nebo směrující složku, která je definovaná výše, se přísada(y) a/nebo .směrující složka smísí předem s přenosovým' činidlem podle předkládaného vynálezu nebo s nukleovou kyselinou.

^Předkládaný vynález tedy poskytuje zvláště výhodný způsob přenosu nukleových kyselin (zejména při léčení onemocnění) zahrnující in .vitro, in vivo nebo ex vivo, podávání nukleové kyseliný .schopné ovlivnit jmenované onemocnění, . v kombinaci s přenosovým činidlem obecného vzorce I .za podmínek definovaných výše. Přesněji lze způsob použít pro léčení onemocnění vznikajících z· důvodu nedostatku proteinu n'ebo nukleového produktu, kdy podávaná nukleová kyselina kóduje jmenovaný proteinový produkt nebo se přepisuje do nukleového produktu nebo tvoří jmenovaný nukleový produkt. .

Předkládaný vynález také rozšiřuje jakékoli použití přenosového činidla obecného vzorce I podle předkládaného vynálezu na in vivo, ex vivo nebo in vitro transfekci buněk.

• ·· ·· ··· · · · · · · » · * ·' ······· • · · ' . ♦ ·

26- ······ ···-··· ·· ··

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou použít zej ména. pro přenos nukleových kyselin do primárních buněk nebo do

-daných kmenů. Mohou to být buňky fibroblastů, svalové buňky, nervové buňky (neurony, astrocyty, buňky glií) , jaterní buňky, buňky herna topoietické ho kmene (lymfocyty, CD34, dendritické buňky a podobně),, buňky epitelu a podobně, v’diferencované nebo pluripotentní formě (prekurzory) . ·.

Kromě výše uvedených, rysů předkládaný vynález zahrnuje také další charakteristiky a výhody, které se ozřejmí pomoci příkladů a obrázků,. . které následuj í, a které je možné považovat za ilustrativní příklady . podle předkládaného vynálezu, které v žád.ném ohledu neomezují jeho rozsah.

Obrázky ‘••Obr. 1/15: Schéma syntézy sloučeniny vzorce 1 podle, předkládaného vynálezu.

Obr. 2/15: Měření ih vitro účinnosti transfekce sloučeniny 1 podle předkládaného vynálezu do NIH3T3, HepG2 a HeLa buněk, v nepřítomnosti sérových' proteinů a ve srovnání s jejím homologem obsahujícím, amin (RPR120535) .

\ · „Homolog: obsahující amin znamená kat.iontový lipid, který je. stejný s tou výjimkou, že amidinová a/nebo guanidinová funkční skupina jsou nahrazeny aminoskupinami.. ;

Měření se provádí při různých poměrech náboje, které jsou zaznamenány na Osách x. Exprese lucifeřázy je zaznamenána na osách y a je vyjádřena v RLU (relativní světelné jednotky) na jamku. x i.

Obr. 3/15:. Měření in ' vitro účinnosti transfekce sloučeniny . 1 podle předkládaného vynálezu do NIH3T3, HepG2 a HeLa buněk, v nepřítomnosti (bílé sloupečky) a přítomnosti (černé sloupec9B2SSKSSS3S«m«SK

ky) sérových proteinů a ve srovnání s jejich homology obsahujícími aminoskupinu (RPR120535).

Měření se provádí při různých poměrech .náboje, které jsou zaznamenány na osách x. Exprese luciferázy je zaznamenána na osách y a je vyjádřena v RLU (relativní světelné jednotky) na jamku.

•Obr. 4/15: Měření in vitro účinnosti transfekce sloučeniny 2 podle předkládaného vynálezu do HeLa buněk v nepřitomnsoti' sérových proteinů. Měření se u sloučeniny vzorce 2 provádí v micelární formě ,a v kombinaci s neutrálním kolipidem (DOPE a cholesterol). .

Osa x představuje poměr náboje pro komplex· vzniklý mezi kati.orttovým lipidem a DNA. Osa y představuje expresi luciferázy -vyjádřenou v pg/jamka, kdy. každá jamka, obsahuje 100 OÓO buněk.

'Λ

Obr. , 5.: ..Měření in ...vitro účinnosti transfekce sloučeniny 3 podle předkládaného vynálezu do HeLa buněk v nepřítomnosti sérových proteinů. Měření se.u. sloučeniny vzorce 3 provádí v micelární .formě a v kombinaci s -neutrálním kolipidem (DOPE a cholesterol). i

Osa x představuje poměr náboje- pro komplex vzniklý' mezi kationtóvým lipidem a DNA. Osa y představuje expresi, luciferázy vyjádřenou v pg/jamka, kdy každá jamkaobsahuje 100 .Ó00 buněk.

Obr. - '6/15 : -Měření ,in vitro účinnosti transfekce sloučeniny 5podle předkládaného vynálezu ..do HeLa buněk v nepřítomnosti sérových proteinů. Měření se .u sloučeniny vzorce 5 provádí v micelární‘formě a v kombinaci, s neutrálním kolipidem (DOPE a cholesterol).

Osa x představuje poměr náboje pro komplex vzniklý mezi . katióntovým lipidem a DNA. Osa y představuje expresi luciferázy vyjádřenou v pg/jamka, kdy každá jamka obsahuje 100 000 buněk.

• φ · · ·

V 9, ΦΦΦ φφφ

ΦΦΦ · · · · φφφφ ΦΦ ΦΦΦ ··· ·· .··

Obr. 7/15: Měření ín vitro účinnosti transfekce sloučeniny 6 podle předkládaného vynálezu do HeLa buněk v nepřítomnosti sérových proteinů. Měření se u sloučeniny vzorce 6 provádí v. micelární formě a v kombinaci s neutrálním kolipidem (DOPE a cholesterol).

Osa x .představuje poměr náboje pro komplex vzniklý mezi kationtovým lipidem a DNA. Osa y představuje expresi luciferázy vyjádřenou v pg/jamka, kdy každá jamka obsahuje 100 000 buněk.

Obr . · 8/15:. Tabulka ukazuj-e. fyzikálně chemické fáze (fáze A, B a C) ., ve kterých existují nukleolipidové komplexy vzniklé se sloučeninou 2 ve srovnání s jejím analogem obsahujícím aminoskupinu, jako funkci poměru náboje.

Určení fáze se provádělo pro sloučeninu vzorce 2 a pro její homolog obsahující aminoskupinu v micelární formě a v kombinaci s neutrálním kolipidem (DOPE a cholesterol).

Při porovnání obou tabulek lze. v případě sloučeniny 2 pozorovat. posun od nestabilní fáze.B směrem k nižším poměrům náboje.

Obr. 9/15: Tabulka ukazuje fyzikálně chemické fáze (fáze A, B a C) , ve kterých existují nukleolipidové komplexy vzniklé se sloučeninou 3 ve srovnání s jejím.analogem obsahujícím aminoskupinu, jako funkci poměru náboje.

Určení fáze se provádělo pro sloučeninu vzorce 3 a. pro její homolog obsahující aminoskupinu v micelární formě a v kombinaci s neutrálním, kolipidem (DOPE a cholesterol).

- i * .

Při porovnání obou tabulek lze v případě sloučeniny 3 pozorovat posun od nestabilní, fáze B směrem k nižším poměrům náboje.

Obr. 10/15: Tabulka - ukazuje .fyzikálně chemické fáze (fáze A, B a C) , ve .kterých existují nukleolipidové komplexy vzniklé še

· ..'· v. .

analogem obsahujícím amino29 sloučeninou 5 ve srovnání s jejím skupinu, jako .funkci poměru náboje.

Určení fáze se provádělo pro. sloučeninu vzorce 5 a pro· její homolog obsahující aminoskupinu v micelární formě a v kombinaci s neutrálním'koíipidem (DOPE a cholesterol) .

Při porovnání- obóu tabulek lze v případě sloučeniny 5 pozorovat posun od nestabilní fáze B směrem k nižším poměrům náboje.

Obr. 11/15: Tabulka ukazuje fyzikálně chemické fáze (fáze A, B a C), ve kterých existují nukleolipidové komplexy vzniklé se sloučeninou 6 ve srovnání s jejím analogem' obsahujícím aminoskupinu, jako funkci poměru náboje.

Určení fáze ge .provádělo pro sloučeninu vzorce 6 a pro· její homolog Obsahující aminoskupinu v micelární formě a v kombinaci s neutrálním koíipidem (DOPE a cholesterol) ..

Při porovnání obou tabulek lze v-případě^;sloučeniny 6 pozorovat posun od nestabilní fáze B směrem k nižším poměrům náboje.

Obr. 12/15:( Tabulka představuje snížení fluorescence po·přidání' ethidíumbromidu pro sloučeniny 2,3, 5a 6 ve formě micel. Náhrada ethidíumbromidu DNA lipidem je indikaci vazby k DNA. Fluorescence získaná pomocí DNA je def inovaná jako 10,0 %.

Obr. 13/15: Tabulka představuje snížení fluorescence po. přidání ethidíumbromidu pro sloučeniny 2, 3, 5 a 6. v přítomnosti cholesterolu-. Náhrada ethidíumbromidu. DNA lipidem je indikací vazby k DNA.' Fluorescence získaná pomocí DNA je .definovaná . jako' 100 %.

Obr. 14/15: Tabulka představuje snížení fluorescence po přidání ethidíumbromidu pro sloučeniny 2, 3, 5 a 6 v přítomnosti DOPE. Náhrada ethidíumbromidu DNA lipidem je indikací vazby

♦·· · . ·

··· ··· k DNA. Fluorescence získaná pomocí DNA_ j e 'definovaná ,-j ako 100

O, · - , o ·

Obr. 15/15: Representace plasmidu pXL3031.

Zkratky a symboly:

AcOEt: ethylacetát

BOC: terč . butoxykarbonyl ová skupina .

BOP: benzótriazol-l-yloxytris(dimethylaminoffosfonium hexafluorfosfát ·/

DCC: dicyklohexylkarbodiimid

DCU: dicyklohexylmočovina

DIEA: N-ethyidiisopropylamin - '

DMAP: 4-dimethylaminopyridin

DMF: dimethylformamid ¹

DMSO: dimethylsulfoxid.

DODÁ: dioktadecylamin ’

PE: petrolether

EtOH:· ethanol ' ' .

NEt₃: triethylamin

Rf.: retenční, faktor

TEA: triethylamin _;

TFA: kyselina trif luoroctová ' ' , ·' THF: .tetrahydrofúran TMS: tetramethylsilan.

UV: ultrafialové záření ^z .

SPPS: syntéza peptidů na pevné fázi

HPLC: vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Z: benzyloxykarbonylová skupina '

CIZ: 'p-chlorbenzyloxykarbonylová skupina 'V“ ·«-_ t,“

. . . \

Látky a způsoby pro chemickou syntéžu

a) Sloučeniny

Výchozí polyaminy jsou komerčně dostupné, například spermidin, spermin, tris(2-aminoethyl)amin, . fenylendiamin, diaminoethan , (propan, butan, pentan, hexan, a podobně) nebo se mohou připravit běžnými způsoby, například pomocí kyanoethylace komerčně dostupných aminů, jako je diaminoethan (propan, butan, pentan, hexan a podobně), aminů, spermidinu, šperminu za vzniku rozvětvených polyaminů.

Použité polymery jsou komerčně dostupné pryskyřice pro syntézu peptidů- na pevné', fázi (Merrifieldova syntéza) , ' zejména pryskyřice -O-chlortritylchlorid, pryskyřice HMP, které poskytují produkty nesoucí volné kyselinové 'funkční skupiny nebo pryskyřice Rinkova typu. Polyaminokyseliny se mohou syntetizovat přímo na peptidů předem syntetizovaném na pevné . fázi.. a nesoucím bromalky lovou funkční skupinu nebo ω-aldehydkyselinu.

Dioktadecylamiň,- triethylamin, · trifluoroctová kyselina, BOP,

DMAP, benzylchlorof ořmiát- jsou komerčně' dostupné produkty. Roztoky chloridu, .sodného a hydrogenuhličitanu sodného jsou nasycené.; roztok hydrogensíránu draselného je 0,5M.

. b). Fyzikální měření

Protonová NMR spektra se měřila na spektrometrech Bruker 400 a 600 MHz.

Hmotová spektra (MS) se získala na API-MS/III. .\

c) Čištění a analytické techniky ' .

(i) Podmínky chromatografie na přímé fázi

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) se ' prováděla na silikagelovych deskách ód Merck o tloušťce 0,2 mm. Vyvíjely se za

• 0 ···· · • 0 · ·· • 0 · • · · ·

0 · . · ···· ·· ···

použití UV (254 nm), ninhydrinem^ postříkáním ethanolickým roztokem ninhydrinu ; (4 0 mg/100 ml ethanolu), aby se po,zahřátí na 150 °C zjistily aminy nebo amidy, fluoreskaminem pomocí postříkání roztokem (40 mg/100 ml acetonu), aby se zjistily přimární aminy nebo jodem pomocí pokrytí destičky práškem jodu. <

Kolonové chromatografíe na přímé fázi se prováděly na silikagelu Merck 60 o velikosti částic 0,063 až 0,200 mm.

(ii) Analytické· chromatografické techniky .

HPLC analýza (vysokoúčinná kapalinová chromatografíe) sě prováděla na zařízení .Merck-Hitachi .vybaveném' HITACHI D 2500 integrátorem-kalkulátorem, automatickým vzorkovačem AS-2000A, pumpou L-6200A a UV-vis detektorem L-4000 s nastavitelnou vlnovou délkou, která byla pro analytické aplikace nastavena r.a 200 nm. Kolony pro analytické dělení byly BU-300 aguapore Butyl 7m, 300 A 300 x 4’, 6 mm kolony od Perkin-Elmer.. Mobilnímifázemi byla demineralizovaná voda obsahující 0,1 % TFA a acetonitril obsahující 0,1 % TFA.... Nástřiky ’. roztoku obsahujícího asi 1 mg/ml do ΙΟΟμΙ smyčky ventilu byly 20μΐ. Průtok byl při analýzách nastaven na 1'ml/min.

Podmínky dělení:

Rozpouštědlo- A v' Rozpouštědlo 3 demineralizovaná voda 2500 ml acetonitril pro HPLC 2500 ml kyselina trifluoroctová 2 ml 'kyselina trifluoroctová2,5 ml

Gradient: '

Cas v minutách	% rozp. A	% rozp. B	Průtok v ml/min
0 /	60	40	1
3	60	4.0	1
20	o	10 0	1
35	o	100	1
35'1- .	60	40 '	4

. '

• · ·9 9· ·· ·· · ·· ·,

36,1.	60	.> 40	4
3 6,-2	60	40	2
44	60	40	2

iii) Preparativní chromatografické techniky

Zařízení -pro chromatografií s kapalnou fází je nastaveno v gradientovém módu umožňujícím UV detekci. Tento preparativní řetězec se skládá z následujících složek:

Pumpa A: GILSON model 305 vybavený 50 SC hlavou. ·

Pumpa B: GILSON model 303 vybavený 50 SC hlavou.

Nástřiková smyčka: GILSON model 303 vybavený 25 SC hlavou. Tlakový modul: GILSON model 806/

Míchadlo: GILSON model 811 C vybavený 23 ml hlavou.

UV detektor: GILSON model 119 vybavený preparativní buňkou. /Sběrač frakcí: GILSON model 202 vybavený stojanem č. 21. Integrátor: SHIMADZU model C-R6A.

Kolona: Kolona G4 (10 mm) vyrobená z nerezové oceli, dlouhá 25 cm o průměru 2,2 cm, prodávaná společností VYDAC, model 214 TP 1022. ' ^r

Roztok produktu, který se má čistit, se nanese na kolonu pomocí nástřikové pumpy při průtoku 15 ml/min a.eluát se odebírá ve frakcích do zkumavky po.30 sekundách. Detektor je nastaven na vlnové délky 220 nm a 235 nm.

Mobilní fáze je definována následujícím- způsobem:

Rozpouštědlo A Rozpouštědlo B demineralizovaná-voda 2500 ml acetonitril pro HPLC 2500 ml kyselina trifluoroctová 2 ml kyselina trifluoroctová 2,5 ml

Gradient:

Cas v minutách	% rozp. A	% rozp. B<	Průtok v ml/min
0	70	30	18
10	70	30	18
8.0	0	100 '	18

120	0		100	18

iv) Technika syntézy peptidů na pevné fázi

Syntéza na pevné fázi se provádí.'v manuálním reaktoru pro SPPS syntézu peptidů, který je vyroben ručně, a je vybaven míchadlem Flash Shaker model A5-6021. Varianty kondenzace polyaminů na pevnou fázi a také varianty chránění polyaminů při SPPS se monitorují pomocí Kaiserova testu {Kaiser E., Colescot D.L., Bossinger C.D. a Cook P.I., Anal. Biochem. 34(2), 595 (1970)].

Pryskyřicí použitou, v příkladech pro SPPS je „chlortritylchloridová pryskyřice od společnosti NOVABIOCHEM.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza sloučeniny 1 (N-díoktádecýlkarbamoylmethyl-2-{3-[4-(3guaňidinópropylamino) butylamino] propylaminojacetámidu) ze sloučeniny RPR 120535 (jejíž příprava, je popsána v₍ patentové přihlášce WO 97/18185, která se zde uvádí jako odkaz).

Syntetický postup je uveden-na obrázku 1/15 ve výkresech..

0,,784 mmol . RPR 120535 se rozpustí v 25 ml methanolu ,.v baňce s kulatým dnem opatřené . magnetickým míchadlem. K tomuto roztoku 'se přidá 10,21 mmol triathylaminu TEA·. Potom- se přes směs pomalu (5 minut) přelije roztok O-methylisomočoviny/kyseliny sírové v 9 ml vody. Po přidání - se ve. směsi objeví •zakalení. Směs se udržuje 16 hodin při 40 °C a potom se roztok odpaří do sucha. Získaný produkt se čistí pomocí pr.eparativní HPLC. Důležité frakce se suší za zmrazení. Získá se 0,157 mmol sloučeniny 1 ve formě soli, tj. výtěžek 20,1 %.

HPLC_anaiytická: Rt = 14,94 min.

M iify'’ 1 • a ···« • · «

A A ··· ^XH NMR spektrum (400 MHz, perdeuterpdimethylsulfoxid, δ v ppm) : 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H: CH₃ mastných řetězců); 1,24 (mt, 60H:

střední (CH₂)is skupiny mastných řetězců); 1,43 a 1,53 (2 mt,

2H každý:. 1 CH₂ každého, mastného řetězce); 1,63 (mt, 4H: střední (CH₂)₂ skupiny butylu) ; 1,81 a, 1,96 (2 mt, 2H každý:, střední CH₂ propylú) ; 2,85 až 3,10 a 3,22 (2 mt, 16H celkem:

NCH₂ butyl - NCH₂ propylú a NCH₂ mastných řetězců)’; 3,81 (široký s, 2H: NCH₂CON) ; 4,03 (d, J = 4,5 Hz, 2H: CÓNCH₂CON glycylu); 7,32-7,97-8/62-8,75 a 9,02 (v tomto poř. nerozl. sl. - t - t - nerozl'. sl. a nerozl. sl. : odpovídá vyměnitelným protonům).

MH⁺ = 863 .Příklad 2

Syntéza sloučeniny 2 (2-{2-[bis(2-guanidinoethyl)amino]ethylamino}-N, N-dioktadecylacetamid) ze - sloučeniny RPR 120527 (jejíž příprava je popsána v patentové přihlášce WO 97/1818.5, která je zde uvedena jako odkaz).

pmol RPR .120527 se rozpustí v 10 ml methanolu a -potom se přidá 85 pl 'DIEA .(10 ekvivalentů) a 32 mg 1,3-bis (terč .'butoxykarbonyl) -2-methyl-2-thiopseudomočoviny (2,3 ekvivalentu). Průběh reakce se monitoruje pomocí HPLC.. Po 24 hodinách se rozpouštědlo odpaří a ke získanému zbytku ..se přidá 2 0 ml· •roztoku TFA/dichlormethan 1:1. Po odpaření ve vakuu se zbytek čistí pomocí preparativní- HPLC. Frakce obsahující produkt se smísí,, zmrazí se kapalným dusíkem a - potom - se suší za zmrazení. Získá se 0,035 mmol sloučeniny 2, tj. výtěžek 73 %.

Analytická HPLC: Rt. = 16,2Ó min. ' · x' ¹H NMR spektrum (400 MHz, perdeuterodimethylsulfoxid, δ v ppm) : 0,9 (m>6H,CH₃) 1,2 (m, 60H, CH₂) 1,6 (m, 4H,CH₂CH₂N) 2,7-2,9 (m,

»· ··· • · ► ··

6H, CH₂N(CH₂)₂) 3,0 (m,2H,CH₂CH₂N(CH_2?)₂) 3,2

4H,CH_ZNCOCH₂N) .

(m,8H,CH₂N) 3,8 (m, ,MH = 7 93

Příklad 3

Syntéza, sloučeniny 3 (N-ditetradecylkarbamoylmethyl-2-(3-[4(3-guanidinopropylamino)butylamino]propylamíno}acetamidu) ze sloučeniny RPR 122766 (jejíž příprava je popsána v patentové přihlášce WO 97/18185, která je zde uvedena jako odkaz).

0,784 mmol RPR 122766 se rozpustí v 25 ml methanolu v baňce s kulatým dnem opatřené magnetickým míchadlem. K tomuto roz- .

-toku se přidá 10,21 mmol triethylaminu TEA. Potom se ke směsi pomalu (5 minut) přidá 1,173 mmol roztoku O-met-hyl.isomočoviny/kyseliny sírové v 9 ml vody. Po přidání se.objeví zakalení.· Směs se udržuje 16 hodin při 40 °C a potom se odpaří do sucha. Získaný, produkt se čistí pomocí, pr.eparativní HPLC. . Frakce obsahující produkt se smísí a suší za zmrazení. Získá se 0,2289. mmol sloučeniny. 3, tj. výtěžek 29 %. '

Analytická HPLC: Rt = 9,8 min.

/H NMR spektrum (400 MHz, perdeuterodimethylsulfoxid, δ v ppm) : 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H, CH₃ mastného řetězce); 1,15,- 1,40 (mt,

44H, střední (CH₂)₁₁- skupiny mastných řetězců); 1,46. a 1,55 (2 mt, 2H každý, 1·CH₂ každého mastného řetězce); 1,63 (mt, 4H, 2 střední CH_? skupiny butylu); 1,81 a 1,95- (2 mt, 2H každý, střední . CH₂ propylů) ; 2,85 -. 3,10 (mt, ' 10H, 2 NCH₂ skupiny butylu - 2 NCH₂ skupiny jednoho ze dvou propylů - a 1 ze 2 NCH₂ skupin druhého, propylů) ; - 3,15 - .3,25 (mt, 6H, druhá N.CH₂ druhého propylů a NCH₂ mastných řetězců): 3,82 (nerozl.· sl. , 2H NCH₂CON),; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H, CONCH₂CON glycylu); 7,00 až

7,60* - 8,60 až 8,75 a 9,00 (v tomto pořadí, široké nezl. sl. a 2 nerozl. sl., 3H - 5H a 2H, NH₃ ⁺CF3COO' - NH2⁺CF3COO' a =NH) ;

• fl ···· • · · · · • * • · · • ·· · ··.

’ * -~~s’~'·τ·~~ ' - '· / 37

- 7,78 (široký t, J = 5,5 Hz, ,1H, N=CNH) ; 8,65 (nerozl sl., odpovídající CONH).

1H

MH⁺ = 751

Příklad 4

Syntéza sloučeniny 4 (2-{2-[bis(2-guanidinoethyl)amino]ethylamino} -N-ditetradecylkarbamoylmethylacetamidu) .

Krok A: Desetimolární přebytek tris (aminoethyl)aminu se rozpustí v 50 ml dichlormethanu a, roztok se zavede do reaktoru obsahujícího bromacetyl(chlor)tritylovou pryskyřici (získanou předem reakcí kyseliny bromoctové s .chlortritylovou pryskyřicí) . Reakční směs' se míchá 2 hodiny při teplotě· místnosti. . Rozpouštědlo se odfiltruje a pryskyřice se. desetkrát promyje >50 ml dichlormethanu a isopropanolu. Kaišerův test je pozitivní.

KrokB: Získaná pryskyřice se za míchání na 24 hodin uvede db styku s přebytkem 10 ekvivalentů 1,3-bis(terč.butoxykarbonyl)- 2-methyl-e-thiopseudomočoviny rozpuštěné v dichlormethanu.

Rozpouštědlo se odfiltruje a pryskyřice se promyje desetkrát 50 ml dichlormethanu a isopropanolu. Tříminutový Kaisérův test při nízké teplotě je. negativní .

Krok- C: 50 mmol DIEA se rozpustí v ’5Q. ml dichlormethanu a, směs se zavede do reaktoru obsahujícího produkt získaný v. kroku B. Potom se přidá 4 8 mmol diterc.butyldikarbonátu. .Reakční směs se míchá přes noc. ' Další den je Kaisérův test negativní. Rozpouštědlo se odfiltruje a pryksyřice se střídavě desetkrát promyje 50 ml dichlormethanu a isopropanolu, dvakrát 50 ml methanolu a dvakrát 50 ml etheru. Pryskyřice se potom suší v proudu dusíku. Kaisérův test je stále negativní.

Krok D: Pryskyřice získaná v kroku C se zavede do 250ml baňky s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem. Přidá se roztok* 1· 5- , τ ,Λ ‘ 'C ~ ‘ r

’..·· . , < f ·ί·~

«.> V —’ΪΡ’ν’Τ’ φφ φφφφ

Φ Φ φ • « φ φ φ φ · · φφφφ φφ φφ φφ φ

ΦΦΦ φ

φ ' φ φ

ΦΦΦ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦΦ ΦΦΦ φ · φφ φφ obsahující 50 ml dichlormethanu a 25 ml 1,1,1-trifluorethan-2olu a směs se míchá 2 hodiny. Roztok se odfiltruje a pryskyřice se promyje dvakrát 10 ml -dichlormethanu. Takto, získané organické fáze se spojí a odpaří se za vakua. Produkty se čistí na silikagelu (eluent: chloroform/methanol 8:2 objemově). Požadované frakce se spojí a potom se odpaří ve vakuu za získání 168 mg produktu následujícího vzorce:

tj.. ve výtěžku 20 %.

TLC: Rf = 0,9. * · '

MH⁺ - 789. Krok E: 9 mmol Boc-glycinylditetradecyiamidu se zavede do baňky. s kulatým· dnem opatřené magnetickým míchadlem. Při 4 °C se přidá 30 ml kyseliny trifluoroctové. Roztok se míchá jednu ho•dinu a kyselina trifluóroctová se odpaří ve vakuu. ' Získaný produkt se znovu rozpustí přidáním 70 ml dimethylformamidu a potom se přidá 30 'mmol TEA a 9 mmol kyseliny, získané výše. pH se upraví na 10 a přidá se 3 3 mmol BOP. Roztok se .míchá 2 hodiny a monitoruje se. pomocí TLC.' Když je kondenzace -dokončená,. přidá se 700 ml roztoku síranu draselného a produkt se extrahuje' třikrát 100 ml, ethylacetátu. Organická fáze se pro.myje třikrát 50 ml síranu draselného, třikrát.50 ml uhličitanu sodného, á třikrát 50 ml' chloridu sodného. Potom se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpří se ve vakuu. Získaný produkt se analyzuje pomocí NMR, TLC a MS ,a chránící skupiny se odstraní pomocí přidáni 50 ml kyseliny trifluoroctové k získanému produktu bez předchozího čištění. Roztok se. potom míchá1,5 . hodiny. Nakonec se kyselina trifluoroctové odpaří a

>^4 ' -V* ' i -' ··. . v - - -- - i ••v·’· ·’

9 ······ ······ · · « koncový produkt se čistí pomocí semipreparativní HPLC. Nakonec se získá 8,1 mmol sloučeniny 4, tj . výtěžek 90 % pro poslední krok.

Analytická HPLC: Rt = 11,4 min.

?H NMR (400 MHz, perdeuterodimethylsulfoxid, δ v ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H, CH₃ mastných řetězců) ; 1,15 až 1,35 (mt, 44H, střední (CH₂)n skupiny mastných řetězců); 1,45 a 1,54 (2 mt,

2H každý, 1 CH₂ každého mastného řetězce); 2,65 - 2,78 - 3,06 a 3,23 (v tomto pořadí t, J = 6,5 Hz - široký t, J = 6,5 Hz nerozl. sl. a mt, v tomto pořadí 4H - 2Ή - 2H a 8H, NCH₂CH₂N 2 NCH₂CH₂NC=N skupiny a NCH₂ skupiny mastných řetězců); 3,83 (široký s, 2H, NCH₂CON) ; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H,· CONCH₂CON glycylu) ; 7,34 (široký nerol. sl,, =NH a NH₂) ,· 7,61 (t, J = 5,5 Hz, 2H, NH) ; 8,65 (t, J = 5 Hz, 1H, NH) ; 8,75 (nerozl. sl. NH) : '

MH-r = 737 , .

Glycinyl-di-tetradecylamid použitý v kroku Έ se získá následujícím způsobem: .

mmol glycinu chráněného Boč substituenty a 10 mmol di% tetradeoylaminu se zavede do 250ml baňky s kulatým dnem. Přidá se 100 ml chloroformu a směs se míchá dokud še .nedosáhne, úplného rozpuštění. Potom se přidá 10 mmol TEA a 33 mmol BOP. Pomocí triethylaminu. se pH udržuje na 10. Reakční směs se míchá 2 hodiny. Když je reakce, která se monitorovala pomocí TLC, dokončená, chloroform se odpaří. Získá se pevná látka, která, se znovu rozpustí v 300 ml ethylacetátu. Organická fáze se potom čtyřikrát promyje 100 ml síranu draselného, čtyřikrát .100 ml uhličitanu sodného a čtyřikrát. 100 ml chlridu · sodného. Potom se organická fáze suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný produkt se analyzuje pomocí TLC, NMR a MS a -použije se bez čištění.

· 9 « · · ·

9 99 9

Příklad 5 ' I . · **

Synetéza sloučeniny 5 (N-ditetradecylkarbamoylmethyl-2-{(3-guanidinopropyl)-[4-(3-guanidinopropylaminó)butyl]áminojacetamidu)

Sloučenina se připraví stejným způsobem, jako je popsáno pro sloučeninu 4, ale vyjde se ze sperminu jako výchozího polyaminu za získání kyseliny, která má následující strukturu:

Ν'®⁰ N^ANkc

N I

Boc

Aon pcc

N '-Boc

Po odštěpení od pryskyřice se zbytek čistí na silikagelu (elu‘ ent: chlorform/methanol 8:2 objemově). Frakce obsahující produkt se smísí a potom, še odpaří za sníženého tlaku za získání 0/69 mmol jmenované sloučeniny, t j . výtěžek'50 %..

'·. TLC: Rf = 0,5 . , ' , ’

MH⁺ - 845.

Sloučenina 5 se získá pomocí kondenzace mezi. výše připravenou sloúčeninou a glycinyl-dí-tetradecylatnidém podle stejného postupu, jako je popsáno v příkladu 4. Glycinyl-di-tetradecylamid. se také získá stejným způsoben, jako. bylo popsáno výše. Získá

- se 0,65 'mmol sloučeniny .5, t j . výtěžek 94 % v posledním kroku.

Analytická HPLC: Rt = 10,1 min.

¹H NMR spektrum (400 MHz, perdeuterodimethylsulfoxid, při/teplotě 120 °C, δ v ppm): 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H, CH₃ mastných řetězců) ; 1,25 až 1,45 (mt, 44H, střední (CH₂)n skupiny mastných řetězců); 1,57 (mt, 4H, střední CH₂ skupiny butylu); 1,57 a . 1,67 (2 mt, 2H každý, 1 CH₂ každého mastného řetězce) ; í,74 a 1,91 (2 mt, 2H každý, střední CH₂ propylů) 2,62 - 2,85 - 3,20 až 3,35 (3 mt, 16H celkem, NCH₂ skupiny- - CH₂NC=N skupiny a

«· · ··

NCH₂ skupiny mastných řetězců); 3,17 (s, 2H, NCH₂CON) ; 4,02 (d, J = 5 .Hz, 2H, CONCH₂CON glycylu); 6,89 - 7,30 až 7,55 a 7,65 (v tomto pořadí nerozl. sl. - široký nerozl. sl. a nerozl. sl. vyměnitelné vodíkové atomy).

MH+ = 845.

Příklad 6

Syntéza sloučeniny 6 (2/{3- [{4- [bis(3-guanidinóprópyl)amino] butyl}-(3-guanidinopropyl)amino]propylamino}-N-ditetřadecylkarbamoylmethylacetamid)

Sloučenina se připraví stejným způsobem, jako je uvedeno výše pro sloučeninu 4 a 5, ale jako výchozí polyamin se použije N,Ň-N' ,N' - (tet ráaminópropyl) butyl endiamin·. .za získání následující sloučeniny:

Po odštěpení od pryskyřice se zbytek čistí na silikagelu (elu,ent: čhlorform/methanol 8:2 objemově). Frakce obsahující produktse smísí a potom se odpaří za sníženého tlaku,za získání .0,099 mmol jmenované sloučeniny, tj. výtěžek 20 %.

TLC: Rf = 0,3.

MH+ = 1201 . '

Sloučenina 6 se získá kondenzací mezi kyselinou připravenou výše a glycinyl-di-tetradecylamidem podlé stejného postupu,' jako je popsáno v příkladu 4. Glycinyl-di-tetradecylamid se

~'^s3PK.’TWWS^^f' ·· ···· · 9 ·· ' ··

-, ·······«··« • · »····· '······ ·· · ··· ^A · · · · · 9 9

4^2 ···· ·· ··· «·· ·· ·· také připraví stejným způsobem. Získá se 0,09 mmol sloučeniny 6, tj. výtěžek tohoto kroku je 90 %.

Analytická HPLC: Rt = 11,2 min.

^XH NMR spektrum (400 MHz, perdeuterodimethylsulfoxid, za přidání několika kapek perdeuterooctové kyseliny, δ v ppm) : 0,87 (t, J =,7 Hz,’ 6H, CH₃ mastných řetězců); 1,20 až 1,40 (mt, 44H, .střední (CH₂)n skupiny mastných řetězců); 1,45 a 1,54 (2 mt, i ' . -

2H- každý, 1' CH₂ každého mastného řetězce); 1,67 (mt, 4H, střední CH₂ skupiny butylu); 1,80 až 2,10 (mt, 8H, střední CH₂ propylů); 2,95 až 3,30 (mt, 20H, NCH₂ skupiny.propylů a NCH₂ skupiny butylu); 3,15 až 3,30 (mt, 4H, NCH₂ skupiny mastných řetězců); 3,84. (s, 2H, NCH₂CON) ; 4,05 (s, 2H; CONCH₂CON glycylu). . ? ' ·

’. MH⁺ = 949;

Příklad 7

Použití sloučeniny vzorce 1 pro in vitro transfekci genetického. materiálu '

Použitý genetický materiál: , ''^!

Použitou nukleovou kyselinou je plasmid pXL2774 (WO- 97/10343) obsahující' gen kódující luciferázu pod kontrolou promotéru lidského cytomegaloviru (CMV).

Roztoky nukleových kyselin se zředí na 20 pg/ml fyziologickou solankou (0,15M roztok chloridu sodného).

Transfekční roztoky (připraveně. těsně před použitím) . ' ’ · · ' _ í

Produkty popsané podle vynálezu.se rozpustí ve vodě při koncentrací měnících se od 60 do 240 μΜ a smísí se objem na objem roztoku DNA; konečná koncentrace solanky, je 75 mM.

Transfekce

Buňky ' se kultivují za vhodných podmínek v 24jamkových mikrodestičkách (2 cm²/jamka) a transfekují se v exponenciálním stádiu růstu a při 50-70% konfluenci.

Buňky se promyj£ dvakrát 500 μΐ média bez sérových proteinů a kultivují se znovu buď v médiu bez séra (transfekce bez přítomnosti séra) nebo* v úplném médiu (transfekce v přítomnosti » séra). K buňkám [3 jamky/ DNA vektor] se přidá 50 μΐ transfekční směsi [tj . 0,5 pg DNA/j amka] . Když se buňky transfekují v nepřítomnosti séra, kultivační médium se doplní 2 hodiny po transfekci vhodným množství séra.

Účinnost transfekce^ se hodnotí 48 hodin po transfekci měřením τ’- exprimace luciférázy podle instrukcí uvedených pro použití / soupravy Promegá [Luciferázový testovací systém]. Toxicita transfekčních směsí se odhadne měřením koncentrací proteinů . v buněčných lysátech. '

Výsledky

Sloučenina vzorce 1 se.použila ve srovnání s kationtovým lipidem' RPR120535 (sůl s TFA) [popsáno v patentové přihlášce WO 97/18185, která je zde uvedena jako odkaz] jako DNA vektor pro transfekci tří různých buněčných kmenů: NIH3T3 buněk, HepG.2 buněk a HaLa buněk. Vzhledem k těmto třem typům buněk nebyla *

pro sloučeninu 1, jejíž příprava je popsaná v příkladu 1., de- tekována žádná významná toxicita.'Transf ekční účinnost sloučeniny vzorce 1 a srovnávacího kationtového lipidu pro tyto tři /typy buněk je uvedena, na'obrázku. 2/15, pro poměry nmol / sloučeniny/μα DNA 3 až 12.

Z obrázku 2/15 je možné vyvodit, že maximální transfekční účinnosti se dosáhne pro poměr 6 nmol kationtového lipidu/pg

<. -<X ΐΛ·Μβ<«*«ί'ΑΜΚί:

«• •010 « · 0 · 0 ·«,·· • 0 0 000 0 00 « 0 .00

0 ·»· ' 0'0 0 0

DNA pro buňky NIH3T3 a pro poměr 9 nmol kationtového lipidu/pg DNA pro buňky HeLa a HepG2. .· Pro transfekci v nepřítomnosti séra jsou získané expresní hladiny u buněk HeLa nebo HepG2 dvakrát až čtyřikrát vyšší pro sloučeninu 1 nebo pro produkt testovaný pro srovnání.

Obrázek 3/15 představuje transfekční účinnost pro komplex sloučenina l/DNA ve srovnání se stejným referenčním kationtovým lipidem, jako výše (RPR120353), komplexovaným s DNA. Bílé sloupce představují transfekční účinnost pro. riukleolipidový komplex v nepřítomnosti séra po dobu 2 hodin. Černé sloupce představují transfekční účinnost nukleolipidových komplexů v přítomnosti séra. . ...

Z obrázku 3/15 je možné demonstrovat jednu ze specifických výhod transfekčních činidel podle předkládaného vynálezu. Skutečně se pozorovalo, že transfekční hladiny s nebo bez sérových proteinů jsou; stejné v případě sloučeniny 1 podle vynálezu, zatímco u srovnávacího kationtového lipidu se .pozoruje silná inhibice způsobení přítomností sérových proteinů. Toto je zvláště výhodná, vlastnost při transfekcích in vivo.

Příklad 8

Použití sloučenin 2, 3, 5 a 6 pro in vitro transfekci genetického materiálu. ,

Použitý genetický materiál

Použitou nukleovou kyselinou je plasmid pXL3031 obsahující gen kódující luciferázu -pod kontrolou promotéru,lidského cytomegaloviru (CMV). Tento plasmid , pXL3031 je uveden, na obrázku 15/15. Izoloval se podle standardního postupu, který je odborníkům v této oblasti známý a zejména podle Maniatis T., Fritsch E. F. a Sambroók J. , Methods in Molecular- Biology: a

Laboratory Manual, 1982, str,

NY. . ·'·· '/'A'.· <83-94, Cold Spring Hařbor Lab., •í

* x ϊ **

Přesněji se použije metoda alkalické lýzy a čištění gradientem chloridu česného.

Transfekce

Buňky se kultivují za vhodných podmínek v 24jamkových mikrodestičkách. Po kultivaci přes noc každá jamka obsahuje 100 000 buněk.·

Transfekční. směs, která' obsahuje 1 . gg DNA v 0,5 ml DMEM se v nepřítomnosti séra zavede do každé jamky. Po^- 5 hodinách po transfekci se kultivační médium doplní vhodným množstvím séra (DMEM a; fetální telecí sérum, 10 %) . Buněčné lyzáty se získají 24 hodin .po . transfekci . a trans-fekční. účinnost se vypočte pomocí měření exprimace luciferáty podle doporučení uvedeného pro použití soupravy Promega (detekční souprava.pro luciferázu) .

_FVýsledky ...

Transfekční hladiny jsou uvedeny na obrázcích 4/15, 5/15, 6/15 a 7/15. . ··.

V každém čase se transfekční účinnost měřila pro lipid ve formě micel a ve směsi s kolipidem (DOPE nebo cholesterol). Z těchto tabulek je^- možné vyvodit, že transfekční hladiny jsou velmi vysoké, dokonce i při velmi nízkých poměrech nábojů, což je velmi výhodné zejména z důvodu toxicity.- Toto je jedna z výhod sloučenin podle předkládaného vynálezu. Skutečně je u kationtových . lipidů neobsahujících „ žádnou amidinovou funkční skupinu často nutné použít velmi vysoké poměry nábojů, pokud chceme dosáhnout takových transfekčních- hladin, což ale často způsobuje zvýšení toxicity. , ' , , ,

Příklad 9

Studium afinity sloučenin 2, 3, 5 a 6 k DNA

i¹*/ -sý-?’’·?

r-s^KSWp^r^rt^·'/'' ?3«SfÍ

999999 · · ·· · ·· • · · 9 9 .99 «··· · 9 · « » ·

V · 9 9 9 <· 999999 · · 9 9 9 ·

9999 99 999 9·9 99 ·9

Jako' nukleová kyselina se použil' .plasmid pXL3031, který je popsaný v předchozím příkladu.

Komplexy se připraví při koncentracích 0,25 mg DNA/ml s vhodným množstvím lipidu, jak je definováno, podle vynálezu, v požadovaném poměru náboje. Komplex sě připraví v médiu obsahujícím 5 % glukózy a 20 mM roztoku chloridu sodného. 50 μΐ nukleolipidového komplexu se potom zředí dvacetkrát v 950 μΐ roztoku obsahujícího 5 % glukózy a 20 mM roztoku, chloridu sodného. - ’ F Velikost komplexů se určí měřením hydrodynamického průměru pomocí dynamického rozptylu světla pomocí zařízení Coulter ' ^N4+·

Pro všechny sloučeniny se objevily 3 odlišné fyzikálně chemické fáze v závislosti na poměru náboje:

; - Fáze A, pro -kterou není· DNA nasycená kationtovým lipidem, to znamená, že se dosud ve směsi vyskytuje zbývající obnažená'' DNA, což znamená, že DNA není úplně chráněna lipidem a může proto podlehnou- degradaci působením enzymů. Vzniklé komplexy jsou celkově záporně nabité, což ztěžuje průchod buněčnými

'.membránami. Pro transfekci je proto výhodné, když hodnoty neleží v této oblasti.

- Fáze B, pro kterou je DNA úplně nasycená kationtovým lipidem a komplexy jsou celkově neutrální nebo slabě kladně nabité. Odpuzování iontů je maximální, tato fáze je nestabilní. Může -docházet . k jevu . „zesítění, což vede ke srážení, komplexu. Komplexy v tomto stavu se tedy nemohou použít jako injekční prostředky. ·

-'ί«3·ίί<

- Fáze C, pro kterou je DNA přesycená lipidem a komplexy jsou celkově. kladně nabité. DNA je proto úplně chráněna lipidem a její průchod buněčnou membránou (celkově negativní) je proto

♦ · ·· ·· • · · · · ··„·• · · · · · • · · ··· ···

·.·-··- · · • · · ·« · · · · · 'usnadněn. Komplexy ve. fázi C jsou proto zvláště vhodné použití při přenosu nukleových kyselin do buněk.

pro

Tabulky označující fázi, ve které jsou komplexy situovány jako funkci poměru náboje, jsou uvedeny na obrázcích 8/15, 9/15, 10/15 a 11/15.

t

Tabulky, na obrázcích 8/15, 9/15, 10/15 a 11/15 porovnávají fáze jako funkci poměrů náboje mezi 'sloučeninami podle předkládaného vynálezu a jejich analogy obsahujícími aminoskupinu, to znamená kationtové lipidy, jejichž amidinové a guanidinové funkční skupiny jsou nahrazeny .aminoskupinami. Zjistilo se, že fáze B je posunuta směrem k nižším poměrům náboje. Začlenění amidinových funkčních skupin do kationtové hlavy tedy přispívá ke zvýšení af-ini.ty sloučenin k DNA. Toto je důležitá vlastnost sloučenin podle přédkládaného vynálezu, protože komplexy, které tvoří ,s DNA, se mohou použít ve .fázi C, aniž by to byl výsledek příliš vysokého poměru náboje, což je výhodné zejména z hlediska toxicity. ’

Afinita sloučenin podle předkládaného vynálezu k DNA byla také hodnocena pomocí měření· snížení fluorescence po přidání ethidiumbromidu. Nahrazení ethidiumbromidu DNA lipidem je' skutečně známkou vazby k DNA. , . ~

Tedy, 4 μΐ roztoku ethidiumbromidu o koncentraci 1 mg/ml se přidají k připraveným komplexům a potom, se měří .fluorescence při excitační vlnové délce 260 nm a emisní ylnové délce 590 nm. Fluorescence získaná pro samotnou DNA je definována jako 100 %. '

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách na .· obrázcích 12/T5, 13/15 a 14/15. Tyto výsledky ukazují, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu vykazují velmi dobrou afinitu k DNA, což je zvláště výhodná vlastnost sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Claims (31)

1. PAT ENTOVÉ NÁROKY

   1. Lipopolyam.in v D, L nebo DL formě a také ve formě solí, obecného vzorce I:

   R, /·

   N (I) kde.:

   - R_lř R₂ a R3 jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina

   - (CH₂) q-NRR', kde .... .

   • q je celé číslo 1 až 6 včetně, hodnoty q jsou n'a .sobě nezávislé u různých skupin R_lř R₂ a R₃ a • R and R' jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina vzorce II:

   NR, i

   (CH₂), ^nhr₃ (Π) kde r je celé číslo, které se může měnit od 0 do 6 včetně a skupiny R₅ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo uhlovodíkový zbytek, d je třeba,poznamenat, že nejméně jedna skupina Ri, R₂ a R₃ obsahuje nejméně jednu skupinu vzorce II,

   - man jsou nezávisle na sobě celé číslo, které se může měnit od 0 do- 6 včetně, kde, pokud n je vyšší než 1, m může mít různé hodnoty a R₃ různé významy podle obecného vzorce I, '

   - p je celé číslo, které se může měnit od 1 do-6'včetně a * ty * »» ?·**.

   ···· · • · · • · • · '· ♦ · ·

   -· · · » · · · · • « » · ·

   - R₄ je skupina vzorce III:

   I X

   -f-X-(CH),—Y-fpN 011)/ kde :

   • R₇ a Rg jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo lipofilní skupina, alespoň jedna ze skupin R₇ a R_a je jiná než atom vodíku, • t je celé číslo 0 až 10.včetně, přičemž R₆, X, Y a s mohou mít různé významy u různých jednotek [X-(CHR_S) _S-Y] , pokud t je celé číslo, vyšší než 1, . ’ • X je atom kyslíku nebo nebo alkylaminoskupina,- alkylová rozvětvená a obsahuje 1 až 8 .atomů i?

   atom síry nebo aminoskupina skupina je' lineární '-nebo· uhlíku, • Y je karbonylová skupina nebo methylenová skupina, • R₆ je atom vodíku nebo postranní řetězec přírodní aminokyseliny, který je, pokud je to vhodné, substituovaný, • s jé celé .číslo 1 až 10. včetně, kdy, pokud s je rovno 1, R_s·. je postranní řetězec přírodní aminokyseliny, který

   I .... ' je pokud je to vhodné . substituovaný a pokud jě s vyšší . než 1, R₆ je atom. vodíku.
2. 2. Sloučeniny podle nároku 1, kde ve vzorci II je. R₅ atom vodíku nebo alifatický nebo aromatický zbytek, který je popří,pádě halogenovaný.
3. 3. Sloučeniny podle nároku 2, kde ve vzorci II je jedna ze skupin R₅ atom vodíku a druhá je alifatická skupina obsahující f -i < τ. K -AfA.

   %

   'Ά

   1 až 10 atomů uhlíku nebo aromatická skupina s výhodou vybraná z benzylové skupiny a jejích derivátů.
4. 4. Sloučeniny podle nároku 2, kde ve vzorci II jsou obě skupiny R₅ atom vodíku.
5. 5. Sloučeniny podle kteréhokoli z nároku 1 až 4, kde Ri, R₂ a/nebo R₃ jsou jiné než atom vodíku a zahrnují vzorec II, q je 2 nebo 3a r je rovno 0.

   i¹ 6. Sloučeniny vzorci I je m podle kteréhokoli z vybráno ze skupiny, nároků kterou 1 až tvoři 5, .kde v obecném 2, 3 a 4. 7. Sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde ve * vzorci III nejméně j edna ze skupin R₇ a Rg je lipofilní skupina

   složená · z jednoho nebo více ' alifatických mastných řetězců, steroidních derivátů, přírodních nebo syntetických lipidů nebo jejich kombinací.

   •8. Sloučeniny podle nároku 7,,_; kde -lipofilní 'skupina --je lineární . nebo rozvětvená, nasycená nebo nenasycená alifatická skupina obsahující 5 až 22 atomů uhlíku,, která jě popřípadě -halogenovaná ....,-.
6. 9. Sloučeniny podle' nároku 7, kde lipofilní skupinou ' je steroidní derivát vybraný ze skupiny, kterou tvoří cholesterol, cholestanol, 3-a-5-cyklo-5-a-cholestan-6-P-ol, kyselina cholová,· čholesterylfořmiát, choťestanylfořmiát, -' 3a, 5-cyklo5a-cholestan-ββ-ylfořmiát, cholesterylamin, 6-(1,5-dimethylhexyl) -3a, 5a-dimethylhexadekahydrqcyklopenta[a]cyklopropa[2,3]cyklopenta[1,2-f]naftalen-10-ylamin nebo cholestanylamin.
7. 10. Sloučeniny podle nároku 7, kde lipofilní skupina je skupina (CH₂) _u-NH-R₉, kde u je celé číslo .2' až 6 včetně a R₉ je acylová skupina, jako je například čholesterylfořmiát, ,ařachidonyl nebo kyselina cholova.

   , t- V-.'-¹/ r 'k - < v. *»

   .'^{; ť}- »51 ,«<t

   0 0·· * ' « 0 · 0 0 «0 • 0 0 0 • · · 0

   0 · · · • ·· 0 0 0 >0
8. 11. Sloučeniny podle nároku 1, kde obě lipofilní skupiny.

   skupiny R₇ a

   R_s jsou
9. 12, Sloučeniny podle nároku 11, kde obě skupiny R₇ a R₈ jsou alifatické skupiny obsahující 5 až 22 atomů uhlíku a· s výhodou 12 až 22 atomů .uhlíku.
10. 13. Sloučeniny podle nároku 1, II a R₂ a R₃ jsou atomy vodíku,
11. 14. Sloučeniny podle nároku 1, vzorce II a R₃ je atom vodíku.
12. 15. Sloučeniny podle nároku 1, vzorce II a R₂ je atom vodíku.
13. 16. Sloučeniny podle nároku 1, skupinu vzorce II.

    kde Rizahrnuje skupinu vzorce kde¹ Ri a R₂ obě zahrnuj i skupinu kde Rf a R₃ obě zahrnují skupinu kde Ri, R₂. a. R₃ všechny zahrnují
14. 17. Sloučeniny .podle. ..kteréhokoli z nároků 1 až 16, které se kombinují s extra- nebo intracelulárními, směruj í.cími složkami .
15. 18. Sloučeniny, podle nároku .17, které obsahují' směrující ^.složku v oblasti R_s aminokyselinového postranního, řetězce..
16. 19.. Sloučeniny podle' kteréhokoli z nároků 1 až 18, které' obsahují značkovači gen typu obsahujícího biotin, rhodamin, folát nebo lineární; nebo cyklický peptid nebo pseudopeptidovou' sekvenci obsahující' Arg-Gly-Asp epitop -v oblasti R-₆ aminokyselinového postranního řetězce.
17. 20. Sloučeniny podle nároku 1, které jsou vybrány ze sloučenin následujících vzorců, kde R₄ a R₅ mají význam uvedený v,nároku (IV)

    ¹

    y.í^ • · ··· ·

    0··· 00

    NH

    NHR, (VI)

    Y

    NH
18. 21. Sloučenina podle nároku, 1, kterou tvoří:

    která' je vybraná ze skupiny, sloučenina 1

    nii h,n^an‘ ‘ H

    N

    H • · ··· · ^η^νη

    HN

    ΠΝ · NKZVJI.N H sloučenina 2 .sloučenina' 5

    Λ w ι. $

    sloučenina 6
19. 22. Prostředek, vyznačující se t í. m , že obsahuje sloučeninu, podle kteréhokoli z nároků 1 až 21. a nukleovou kyselinu. ...
20. 23. Prostředek podle nároku 22 . v y. z.n a'č u j í c .í . s e tím, že dále obsahuje jeden nebo více adjuvantů.
21. 24. Prostředek, podle nároku 23 vyznačující . se

    -ti m , že adjuvantem je jeden nebo více neutrálních lipidů.

    .
22. 25. Prostředek podle 'kteréhokoli z nároků 23 a 24 vyznačující’ s e t. i m , že neutrálními lipidy jsou lipidy obsahující dva mastné řetězce.
23. 26. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 23 až 25-v y z n a č u j í c í -se t í^m , že neutrálními lipidy jsou přírodní nebo syntetické lipidy, které jsou . za fyziologických podmínek obojetnými ionty, nebo -nemají iontový náboj, vybrané například ze skupiny, kterou, tvoří dioleoylfosfatidylethanolamin. (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidylěthanolamin (POPE), di-stearoyl, palmitoyl .a -myristoylfosfátidyleťhanolaminy a také jejich deriváty, které jsou jednou až třikrát N-methylováné; fošfati.· ' · ' . *· > . dylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (jako jsou zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (jako jsou například sfingomyeliny) , nebo asialogangliosidy (jako-jsou zejména asiáloGMl a GM2).

    X.

    \ K < Λ

    -UNÍJ- tyty /tyty)

    4*

    ·· ····
24. 27. Prostředek podle nároku- 23 , v y z n a č u j í c i s e tím, že adjuvántem je sloučenina zahrnutá přímo nebo jinak v úrovni kondenzace nukleové kyseliny.
25. 28. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 23 až 25 vyznačuj ící se tím, že jmenovaný adjuvant je jako celek nebo částečně odvozen od protaminu, histonu nebo nukleolinu a/nebo od jejich derivátů nebo se skládá, jako celek nebo částečně, z peptidových jednotek (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA)-, kdy se počet jednotek může měnit mezi 2 až 10 a může se opakovat souvisle nebo.jinak. ' ' ,
26. 29. Prostředek podle nároku 22 vyznačující se t i m , že dále obsahuje směrující složku. '
27. 30.. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 22 až 29' v y .z ,n a č ují c i. s e tí m , že obsahuje nosič, který je farmaceuticky přijatelný pro injekční prostředky.
28. 31. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 22 až 29 v y. znač u j. i c i - s ě . tím, že obsahuje nosič, který je. farmaceuticky přijatelný pro aplikaci na pokožku a/nebo sliznici..
29. 32. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z· nároků - 1 až 21 pro převedení nukleových kyselin do buněk.
30. 33 . Způsob, přípravy/.sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 21 vyznačující se tím, že amidinová skupina· vznikne reakcí thi.o- nebo oxo^derivátu močoviny s lipopolyaminem nebo že se polyaminoamidin’ naroubuje ha lipid pomocí peptidové kondenzace.
31. 34. Způsob přenosu nukleových kyselin- do buněk v y z n a č u

    Z . ·'