CZ277298A3

CZ277298A3 - Sloučeniny z amidiniové skupiny, farmaceutické prostředky, které je obsahují a jejich použití

Info

Publication number: CZ277298A3
Application number: CZ982772A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Marie Lehn; Pierre Lehn; Jean-Pierre Vigneron
Original assignee: Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 1998-12-16
Also published as: EP0888379B1; HUP9902465A3; ES2154453T3; DK0888379T3; US6143729A; EP0888379A1; WO1997031935A1; HU228072B1; IL125926A0; AU723998B2; JP4271260B2; AU1930497A; KR100452062B1; NO983691D0; NO983691L; DE69703878D1; CZ295225B6; SK283575B6; ATE198599T1; PT888379E

Description

Předkládaný vynález se týká nových sloučenin z amidiniové skupiny, včetně zejména guanidiniových sloučenin, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich aplikací.

Podstata vynálezu

Přesněji se předkládaný vynález týká sloučenin obecného vzorce I a jejich solí ^r2

\)-Rl

R²^ (¹) kde

R¹ je derivát cholesterolu nebo alkylaminoskupina -NR'R, kde R' a R jsou nezávisle na sobě nasycená nebo nenasycená lineární nebo rozvětvená alifatická skupina obsahující 12 až 22 atomů uhlíku,

R² a R³ jsou nezávisle na sobě atom' vodíku nebo skupina obecného vzorce II, kde alespoň jedna ze skupin R² a R³ je jiná než atom vodíku,

-J-(CH₂)_n n]—R5

L | Jm

R4 _(ii) kde:

n a m jsou nezávisle na sobě a rozdílně u skupin R² a R³, celé číslo 0 až 4,

• · • ·

R⁴ a R^s jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina obecného vzorce III (CH₂)_p-(X) •(CH₂)_q-C

NHZ/

NHX (III) kde p a q jsou nezávisle na sobě celé číslo 0 až 4 a r je rovno 0 nebo 1, kde r j e rovno 1

X je skupina NH a x je potom rovno 1

X je atom dusíku a x je potom rovno 2 a je možné, že p, q a r se mění nezávisle mezi skupinami R⁴ a R⁵.

Jako výhodná podskupina může být v rámci předkládaného vynálezu uvedena sloučenina obecného vzorce I, kde R² a R³ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina obecného vzorce IV

CH₂)

(IV) kde:

n, m a p jsou definovány výše a R⁴ je atom vodíku nebo skupina obecného vzorce V —(CH₂) _q——(NH) _rNH₂ ih₂ (V) kde q a r jsou definovány výše, • 0

a je možné, že m, n, p, q a r se nezávisle mění mezi různými skupinami R² a R³.

Tyto nové sloučeniny obecného vzorce I mohou být připraveny ve formě nejedovatých a farmaceuticky přijatelných solí. Mezi tyto nejedovaté soli patří soli s anorganickými kyselinami (kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná nebo kyselina dusičná) nebo soli s organickými kyselinami (kyselina octová, kyselina propionová, kyselina jantarová, kyselina maleinová, kyselina hydroxymaleinová, kyselina benzoová, kyselina fumarová, kyselina methansulfonová nebo kyselina šfavelová). Nebo soli s anorganickými bázemi (hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný nebo hydroxid vápenatý) nebo soli s organickými bázemi (terciární aminy jako je triethylamin, piperidin nebo benzylamin).

Mezi representativní sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které mohou být zvláště zmíněny, patří sloučeniny následujících obecných vzorců:

(H₂N)/C-NH- (CHJj-NH-COO-R¹ VI [ (H₂N) ₂ ⁺C-NH- (CH2) 3] [ (H2N) 2C⁺-nh- (CH2) ₄] -N-COO-R¹ VII ( (H₂N) /C-NH- (CH₂) ₂] ₂-N- (CH₂) 2-NH-C00-R¹ VIII [(H₂N)₂ ⁺C- (CH₂)₂] ,-N-COO-R¹ IX [ [ (H₂N) ₂ ⁺C-(CH₂) ₂] ₂-N-(CH₂) ₂] jN-COO-R¹ X kde R¹ má výše uvedený význam.

Jako representativní příklady nárokovaných guanidiniových a amidiniových sloučenin mohou být uvedeny zvláště sloučeniny výše uvedených vzorců VII, VIII a IX, kde R¹ je cholesterylová skupina. Tyto tři sloučeniny budou v tomto pořadí později označeny názvem BGSC (bis guanidino spermidin cholesterol) a

Λ · (bis amidinium ·· ··

BGTC (bis guanidino třen cholesterol) a BADC diethylentriamin cholesterol bishydrochlorid).

Nárokované sloučeniny jsou zejména velmi výhodné z léčebného hlediska pro svou nejedovatou povahu a amfifilní vlastnosti. Kvůli těmto vlastnostem mohou být zejména použity pro komplexaci nukleových kyselin s perspektivou jejich buněčné transfekce. Tyto sloučeniny mohou být proto výhodně použity v genové léčbě.

Sloučeniny VII (BGSC) a VIII (BGTC) jsou nejvýhodnější pro in vivo genový přenos. Tyto dvě sloučeniny tvoři komplex s DNA a chrání proti degradaci způsobené změnami pH v průběhu přenosu na buňky, které mají být léčeny.

Vynález se proto týká farmaceutických prostředků, které obsahují nejméně jednu sloučeninu podle předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu je sloučeninou bisguanidinospermidincholesterol (BGSC) a v jiném výhodném provedení podle předkládaného vynálezu je sloučeninou bisguanidinotrencholesterol (BGTC).

Hlavním předmětem genové léčby je korigovat genetická onemocnění spojená s nedostatečnou a/nebo abnormální expresí, což je nedostatečná nebo nadměrná exprese jedné nebo více nukleových kyselin. Je snahou korigovat tento typ genetické poruchy pomocí buněčné exprese klonovaných genů in vivo nebo in vitro.

Nyní je navrženo několik způsobů pro intracelulární dodání tohoto typu genetické informace. Jeden ze způsobů, který se běžně používá, je založen na použití chemických nebo biochemických vektorů. Tyto syntetické vektory mají dvě hlavní funkce: spojení DNA, která má být transfekovaná, a podporu jejího buněčného připojení a její průchod přes plazmatickou membránu a, pokud je to vhodné, přes dvě buněčné membrány. Pro • · · · • » tento účel byly určeny pozitivně nabité kationtové lipidy jako je N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-Ν,N,N-trimethylamoniumchlorid (DOTMA). S výhodou interaguji ve formě liposomů nebo malých měchýřků spontánně s DNA, která je v této části záporně nabitá, za vzniku komplexů lipid-DNA, které jsou schopny spojení s buněčnou membránou a umožňují tedy intracelulární dodání DNA. Ve specifickém případě DOTMA však ·dobrá schopnost transfekce bohužel zůstává spojená s poruchou v biologickém odbourání a toxickým charakterem vůči buňkám.

Po DOTMA byly vyvinuty jiné kationtové lipidy na stejném modelu struktury: lipofilní skupina kombinovaná s aminoskupinou pomocí takzvané „spojovací ruky. Mezi tyto sloučeniny zejména patří sloučeniny, které obsahují jako lipofilní skupinu dvě mastné kyseliny a derivát cholesterolu a dále, pokud je to vhodné, obsahují jako aminoskupinu kvarterní amoniovou skupinu. Jako represantativní sloučeniny této skupiny kationtových lipidů mohou být uvedeny DOTAP, DOBT nebo ChOTB.

Na základě chemické struktury a jejich biologické rozložitelnosti spojují nárokované sloučeniny podle předkládaného vynálezu dobře požadavky potřebné pro transfekční vektor nukleovych kyselin.

Předkládaný vynález se proto také týká jakéhokoli použití těchto nových sloučenin při in vitro, ex vivo a/nebo in vivo transfekci buněk a zejména při vektorizaci nukleovych kyselin. Předkládaný vynález se týká zejména jakýchkoli farmaceutických prostředků obsahujících nukleové kyseliny společně s nejméně jednou sloučeninou podle předkládaného vynálezu.

V prostředcích podle předkládaného vynálezu může být nukleová kyselina kombinovaná s nejméně jednou nárokovanou sloučeninou buď deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Mohou to být oligonukleotidové nebo polynukleotidové sekvence přírodního nebo umělého původu a zejména genomická DNA, cDNA, • · · ·

• · · · « * · · ·· · · ·· ···· · • · · · · · · • · ·· ·· ·· mRNA, tRNA, rRNA, hybridní sekvence nebo syntetické nebo polosyntetické sekvence. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního nebo virového původu a podobně. S výhodou obsahují terapeutické geny.

Jiný předmět podle předkládaného vynálezu se tedy týká farmaceutických prostředků obsahujících dále nukleovou kyselinu. S výhodou je tato nukleová kyselina deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu obsahuje nukleová kyselina terapeutický gen.

Pro účely podle předkládaného vynálezu se terapeutickým genem, rozumí zvláště jakýkoli gen kódující proteinový produkt, který má terapeutický účinek. Takto kódovaným proteinovým produktem může být protein, peptid a podobně. Tento proteinový produkt může být homologický vzhledem k cílové buňce (to znamená produkt, který se normálně vylučuje v cílové buňce, pokud buňka nevykazuje žádnou chorobnou změnu). V tomto případě umožňuje exprese proteinu například kompenzaci nedostatečné exprese v buňkách nebo expresi proteinu, který je neaktivní nebo slabě aktivní z důvodu modifikace nebo alternativně nadměrnou exprimaci jmenovaného proteinu. Terapeutické geny mohou také kódovat mutant buněčného proteinu, který má zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu a podobně. Proteinový produkt může také být heterologní vzhledem k cílové buňce. V tomto případě může například doplňovat nebo poskytovat činnost, která je v buňce nedostatečná, což umožňuje potírání chorobných změn nebo stimulaci imunitní odpovědi.

Mezi terapeutickými produkty pro účely podle předkládaného vynálezu mohou být uvedeny zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF a podobně (FR 92/03120), růstové faktory, neuropřenašeče nebo jejich prekurzory nebo syntetické enzymy, trofické faktory: BDNF, • ·

CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 , NT5, HARP/pleiotrofin a podobně, dystrofin nebo minidistrofin (FR 91/11947), protein CFTR spojený s cystickou fibrózou, geny potlačující nádory, p53, Rb, RaplA, DCC, krev a podobně (FR 93/04745), geny kódující faktory obsažené ve sraženinách: faktor VII, VIII a IX, geny obsažené v opravě DNA, sebevražedné geny (thymidinkináza, cytosin deamináza), geny pro hemoglobin nebo jiné nisičové proteiny, geny odpovídající proteinům obsaženým v metabolismu tuků, alipoproteinový typ vybraný ze sady, která obsahuje apolipoproteiny A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzymy jako je například lipoproteinlipáza, jaterní lipáza, lecitincholesterolacyltransferáza, 7-alfacholesterolhydroxylázy, fosfatáza fosfatidové kyseliny, nebo alternativně proteiny pro přenos lipidů jako je protein pro přenos esterů cholesterolu a protein pro přenos fosfolipidů, protein pro vazbu HDL nebo alternativně receptory vybrané například z LDL receptorů, receptorů pro zbytky chylomikronů a lapače receptorů a podobně.

Terapeutická nukleová kyselina může být také ' gen nebo protismyslná sekvence, které expresí v cílové molekule umožňují kontrolu genů nebo transkripce buněčné mRNA. Tyto sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na RNA komplementární k buněčné mRNA, a tak blokovat jejich translaci na protein podle postupu popsaného v patentu EP 140 308. Terapeutické geny mohou také obsahovat sekvenci kódující ribozomy, které jsou schopny selektivně ničit cílovou RNA (EP 321 201).

Jak je uvedeno výše, nukleová kyselina může také obsahovat jeden nebo více genů kódujících antigenní peptid schopný vyvolání imunitní odpovědi u člověka nebo zvířat. V tomto specifickém provedení předkládaný vynález poskytuje přípravu buď vakcíny nebo imunoterapeutické léčby aplikované na člověka nebo zvířata, zejména proti mikroorganismům, virům nebo

• · 9 · • · · • · · tt 9 9 · • 9 · • · 9 · rakovině. Toto provedení mohou representovat zejména antigenní peptidy specifické pro Epsteín-Barrův virus, virus HIV, virus hepatitidy B (EP 185 573), pseudovzteklinový virus, virus tvořící syncitium (soubuní) nebo jiné viry nebo alternativně antigenní peptidy specifické pro nádory.

S výhodou obsahuje nukleová kyselina také sekvenci umožňující expresi terapeutického genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid v buňce nebo požadovaném orgánu. Mohou to být sekvence, které jsou přírodně odpovědné za expresi uvažovaného genu, kdy tyto sekvence jsou schopny působit v nakažených buňkách. Mohou to být také sekvence jiného původu (odpovědné za expresi jiných proteinů) nebo dokonce syntetické. Zejména to mohou být* sekvence podporující eukaryotické nebo virové geny. Například to mohou být podpůrné sekvence odvozené od genomu buňky, kterou je žádoucí nakazit. Podobně mohou být podporující sekvence odvozeny od genomu viru. V tomto ohledu mohou být například uvedeny promotory E1A, MLP, CMV a RSV genů a podobně. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním aktivační nebo regulační sekvence a podobně. Promotor může být stimulující nebo potlačující.

Dále mohou nukleové kyseliny obsahovat, zejména proti proudu terapeutického genu, signální sekvenci terapeutického produktu syntetizovaného sekreční cestou cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvence terapeutického produktu, ale může to také být jiná funkční signální sekvence nebo umělá signální sekvence. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci řídící terapeutický produkt syntetizovaný pro určitou část buňky.

Kationtové lipidy popsaného podle předkládaného vynálezu, a zejména BGTC a BGSC, jsou schopny tvořit komplex s DNA a představují výhodnou alternativu virových vektorů pro přenos nukleových kyselin, které jsou terapeutiky zajímavé, in vitro, • · ♦ · ex vivo nebo in vivo. Kvůli chemickým vlastnostem guanidiniových skupin, zejména jejich vysokému pKa, jsou tyto kationtové lipidy schopny chránit molekulu DNA proti degradaci způsobené změnami pH. Výsledky uvedené v příkladech ukazují, že tyto sloučeniny umožňují transfekci mnoha buněčných typů s velkou účinností. Účinnost transfekce závisí zejména na poměru kationtový lipid/DNA ve vytvořeném komplexu. Poměr mezi dvěma sloučeninami, který zvláště vhodný pro transfekci tvoří 6 až 8 guanidiniových skupin na jednu fosfátovou skupinu DNA.

Účinnost transfekce komplexů kationtový lipid/DNA může být dále zlepšena pomocí přidání neutrálního lipidu a tvorbou kationtových liposomů. Tyto lipidy se připraví pomocí komplexace mezi kationtovým lipidem a neutrálním lipidem. Neutrální lipidy jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří:

- dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE),

- oleoylpalmitoylfosfatidylethanolamin (POPE),

- distearoyl, dipalmitoyl, dimirystoyl fosfatidylethanolamin

- jejich deriváty, které jsou 1 až 3krát N-methylovane,

- fosfatidylglyceroly

- diacylglyceroly,

- glykosyldiacylglyceroly,

- cerebrosidy (jako jsou zejména galaktocerebrosidy),

- sfingolipidy (jako jsou zejména sfingomyeliny) a '

- asialogangliosidy (jako jsou zejména asialoGMl a GM2).

S výhodou se používá DOPE.

S výhodou je sloučenina podle předkládaného vynálezu a neutrální lipid přítomen v poměru 1 až 5, výhodněji 2 až 4.

• · 4 ·

Dále poměr úplný lipid (sloučenina podle předkládaného vynálezu plus neutrální lipid) ku DNA je s výhodou vybrán tak, že čistý poměr kladných nábojů je mezi 2 a 5. Zvláště výhodný je poměr 3.

Předkládaný vynález se také týká jakýchkoli farmaceutických prostředků obsahujících sloučeninu podle předkládaného vynálezu, neutrální lipid a nukleovou kyselinu. S výhodou je sloučenina podle předkládaného vynálezu vybrána z BGTC a BGSC. Stejně výhodně je neutrálním lipidem DOPE. Nukleová kyselina je bud' deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. S výhodou nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.

Dále k použití nárokovaných amidiniových derivátů, je také možné je použít v následujících aplikacích: interference při interakci mezi nukleovou kyselinou a proteinem za dosažení inhibice nebo stimulace určitého procesu, například regulace genetické exprese nebo enzymatické aktivity (polymerázy, transkriptázy a. podobně), selektivní komplexace aniontových druhů při jejich extrakci, jejich odstranění nebo jejich detekci například za pomoci membrány elektroda/sonda, použití jako laboratorního činidla pro provádění in vitro transfekčních operací a podobně.

Předmětem podle předkládaného vynálezu je tedy také terapeutická aplikace amidiniových derivátů, jak je popsáno výše, buď přímo nebo ve farmaceutických prostředcích.

S výhodou farmaceutické prostředky obsahují farmaceuticky přijatelná vehikula pro injekční podávání prostředků, zejména pro přímé injekční podávání v množství vhodném pro orgán, nebo pro podávání místním způsobem (na pokožku a/nebo sliznici). Prostředky mohou být ve formě zejména isotonických, sterilních roztoků nebo v suché formě, s výhodou sušené za mrazu, která se při podávání v závislosti na druhu rozpustí ve sterilní vodě

• · ···· • · *· ·· • 9 9 • ·· • · · · 9

9 *

9· 99 nebo ve fyziologické solance za získání roztoku pro injekční podávání.

Předkládaný vynález bude dále podrobněji popsán pomocí následujících příkladů a obrázků, které jsou pouze ilustrativní a předkládaný vynález neomezují.

Obrázky

Obrázek 1: Schématicky zobrazuje postup pro přípravu BGSC a BGTC.

Obrázek 2: Schématicky zobrazuje postup pro přípravu BADC.

Obrázek 3: Měření účinnosti transfekce jako funkce poměru lipidní sloučenina/DNA.

Obrázek 4: Měření účinnosti transfekce jako funkce poměru úplné lipidy/DNA.

Obrázek 5: Měření vlivu séra na účinnost transfekce HepG2 (5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) a 293 (5D). Šrafované sloupce: přítomnost séra; prázdné sloupce: transfekce za nepřítomnosti séra 2 hodiny.

Obrázek 6: Fotografie kryosekcí průdušnice myši ukazující expresi genu v epitelu dýchacích cest po in vívo transfekci liposomy BGTC/DOPE. (6A) a (6B) : detekce exprese beta-galaktosidázy v transfekovaných buňkách umístěných na povrchu epitelu (6A) a ve žláze pod sliznicí (6B) ; (6C) : detekce buňky vylučující beta-galaktosidázu ve žláze pod sliznicí pomocí imunoperoxidázového značení za použití antibetagalktosidázové monoklonální protilátky; (6D) : detekce buňky vylučující luciferázu ve žláze pod sliznicí pomocí imunoperoxidázového značení za použití antiluciferázové polyklonální protilátky; (6E): zbarvení imunoperoxidázy: negativní kontrola prováděná za nepřítomnosti protilátek.

·· ··

·· ·· * ♦ * · • · ·· · ♦ · · ♦ • « 1 • » ··

Obrázek 7: Měření účinnosti přenosu genů in vivo pomocí nitrožilní injekce komplexu DNA/BGTC-liposom.

Obrázek 8: Měření intraperitoneální účinnosti inj ekce přenosu genů komplexu in vivo pomocí DNA/BGTC-liposom.

4 « • 44 » 44

4 1

44 » 4 4 «

44

Příklady provedeni vynálezu

A. Příprava derivátů podle předkládaného vynálezu

Látky a způsoby

1. Fyzikální měření

Protonová spektra nukleární magnetické resonance (^{1 * *}H NMR) byla zaznamenána na spektrometru Bruker AC200. Chemické posuny jsou vyjádřeny v ppm vzhledem k TMS.

2. Chromatografie na silikagelu

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) se prováděla na silikagelových deskách Merck 0,2 mm silných.

Kolonová chromatografie se prováděla na silikagelu Merck 60 o velikosti částic 0,040 až 0,063 mm.

Příklad 1

Příprava guanidínospermidincholesterolu BGSC

1. Příprava di-Bockarbamátu (1)

Roztok cholesterylchloroformiátu (0,9 g, 2 mmol) a triethylaminu (0,214 g, 2 mmol) v dichlormethanu (40 ml) se přidá k roztoku , ⁸N-Boc₂-spermidinu (0,690 g, 2 mmol) v dichlormethanu (20 ml). Po 5 hodinách zahřívání k varu se směs promyje vodou (2 x 50 ml), suší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Surový produkt se čistí pomocí chromatografie na silikagelu za eluce směsí dichlormethan/methanol 95/5 za získání surového karbamátu (1,3 g, 86 %).

¹H NMR δ (deuterochloroform, 200 Mhz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu, Boc signál a centrální CH₂ skupiny ze spermidinu) , 3,1-3,3 (m, 8H, N-CH₂) , 4,50 (m, ÍH, 5,37 (d, ÍH, H_s) .

·· • ♦ · • ·♦

9 ♦

9 9 ····

99

9 9

99

999 9 ·

9 9

99

2. Příprava aminokarbamátu (2)

Sloučenina (1) (1,3 g) se rozpustí v 20 ml dichlormethanu a k tomuto chlazenému roztoku (ledová lázeň) se přidají 2 ml čerstvě destilované kyseliny trifluoroctové a odstraní se tak chránící skupiny BOC. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se přidá 50 ml IN hydroxidu sodného a směs se extrahuje dichlormethanem. Organické vrstvy se promyjí vodou, suší se nad síranem sodným a odpaří za získání surového aminokarbamátu (2) (0,945 g, 98 %) .

^XH NMR δ (deuterochloroform, 200 Mhz); 0,5-2,5 (m, struktura

cholesterylu a centrálních	skupin ze spermidinu), 2,7 (m	, 4H,
CH₂-N-CO-) , 3,25	(široký m,	4H, N-CH₂) , 4,49 (m,	1H, H_3a),	5,35
(d, 1H, H_s)
3. Příprava BGSC
Surový karbamát	(2) (0,94	g) se rozpustí v	3 0 ml	směsi
tetrahydrofuran:	methanol	85/15. Potom se	přidá	1H-

pyrazolkarboxamidin (0,495 g, 3,4 mmol) a diisopropylethylamin (0,436, 3,4 mmol) v 30 ml směsi tetrahydrofuran: methanol

85/15. Po 18 hodinách míchání při teplotě místnosti se pomalu přidá 250 ml diethyletheru a získaná sraženina se oddělí slitím. Surová sloučenina se třikrát suspenduje v diethyletheru a oddělí se slitím za získání surového GSC (0,570 g, 47 %) .

^XH NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 Mhz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu and centrální skupiny CH₂) , 3,1 (m, 8H,

N-CH₂) , 4,3 (m, 1H, Η_3α) , 5,3 (d, 1H, H_s) ; 7,2 (široký s, 8H,

NH₂₊) ,7,8 (s, 2H, NH) .

Elementární analýza pro C₃₇H₆₇N₇O₂.2HC1 vypočteno: C, 62,15; H, 9,67; N, 13,71 nalezeno: C, 62,28; H, 9,81; N, 13,15 ·♦«· • 44 ·

• · · • 4 *4 444 ♦ 4 44 * 4 4 4

4 4* • 4 4 4

4 4 4 ·♦ > 4 4 ί ·

4*4 * • 4 * 4 • 4

Příklad 2

Příprava guanidinotrencholesterolu (5)

1. Příprava aminokarbamátu

Roztok cholesterylchloroformiátu (1,8 g, 4 mmol) v 100 ml dichlormethanu se pomalu přidá k roztoku tris(2-aminoethyl)aminu (TŘEN) (11,68 g, 80 mmol) v- 400 ml dichlormethanu. Po dvou hodinách míchání při teplotě místnosti se inertní amin odstraní promytím vodou (3 x 100 ml) a po sušení nad síranem sodným se rozpouštědlo odpaří. Sloučenina (5) se izoluje ve formě trihydrochloridu následujícím způsobem: surový produkt se rozpustí v 10 ml methanolu a přikape se nasycený methanolický roztok (5 ml) kyseliny chlorovodíkové; získaná sraženina se oddělí slitím a získaná čistá sloučenina se třikrát suspenduje v methanolu a oddělí slitím. Po sušení za vakua se získá čistý trihydrochlorid (6) (1,71 g, 64 %) .

¹H NMR δ (deuterochloroform + ε perdeuteromethanol, 2 00 Mhz) ; 0,5-2,4 (m, struktura cholesterylu), 2,5 (m, 2H, CH₂NHCO) , 2,8 (široký s, 4H, +HN-CH₂) , 3,06 (široký s, 4H, CH₂NH₃₊) , 3,2 0 (m, 2H, ®HN-CH₂), 4,4 (m, 1H, H_3a) , 5,3 (d, 1H, H_s) .

Elementární analýza pro C₃₄H_S2N₄O₂ · 3HC1 ;

vypočteno: C 61,10; H, 9,80; N, 8,3 8; nalezeno: C, 61,25; H, 9,96; N, 8,22.

2. Příprava BGTC

Roztok cholesterylchloroformiátu (2,24 g, 5 mmol) v 100 ml dichlormethanu se pomalu přidá k roztoku tris(2-aminoethyl)aminu (TŘEN) (29,2 g, 200 mmol) v 250 ml dichlormethanu. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti se. inertní amin odstraní promytím vodou (3 x 100 ml) a potom se organický roztok suší nad síranem hořečnatým, rozpouštědlo se odpaří. Surový produkt (3,2 g) se rozpustí ve směsi tetrahydrofuran: methanol 50/50 ··«· (20 ml); potom se ke směsi přidá lH-pyrazol-1-karboximidin (1,465 g, 10 mmol) a diisopropylamin (1,3 g, 10 mmol). Po 18 hodinách míchání při teplotě místnosti se přidá diethylether a získaná sraženina se oddělí slitím. Pro získání čistého vzorku se surová sloučenina suspenduje třikrát v diethyletheru a oddělí se slitím (2,15 g), 60 % po sušení ve vakuu.

^XH NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 Mhz); 0,5-2 (m, struktura cholesterylu) , 2,2 (m, 2H, N-CH₂) , 2,6 (široký s, 4H,

N-CHJ , 3,0 (d, 2H, N-CH₂) , 3,2 (široký s, 4H) , 4,3 (m, ÍH, Η_3α) , 5,3 (d, ÍH, H_s) , 7,3 (široký s, 8H, NH₂₊) , 7,8 (široký s, 2H, NH).

Elementární analýza pro C_3SH_SSN₈O₂.2HC1;

vypočteno: C, 60,39; H, 9,57; N, 15,65, nalezeno: C, 60,38; H, 9,67; N, 15,56.

Příklad 3

Příprava bisamidiniumbishydrochloridu BACD

1. Příprava dinitrilu

Roztok cholesterylchloroformiátu (8,97 g; 20 mmol) v dichlormethanu (100 ml) se přikape k roztoku iminopropionitrilu (2,46 g, 20 mmol) a triethylaminu (2,02 g, 20 mmol) v dichlormethanu (100 ml) . Po 6 hodinách míchání při teplotě místnosti se reakční směs promyje vodou (2 x 100 ml) a suší nad síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří a surový produkt (10,5 g) se rekrystalizuje z methanolu (8,59 g; 80%).

^XH NMR δ (deuterochloroform, 200 Mhz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu), 2,7 (m, 4H; -CH₂CN) , 3,62 (m, 4H, -CH₂-N-),

4,50 (m, ÍH, Η_3α) , 5,39 (d, ÍH, H_s) .

• •49

	17	* »w » • · · Ϊ • · · · · • · · · · »· ··· ··	99 · · ·· • · · 999 · 9 9 · · 9· 9 * * t
2. Příprava dithioamidu
Slabý proud sirovodíku se	2 hodiny	probublává	roztokem
dinitrilu připraveného tak,	jak je popsáno výše	(0,324 g,

mmol) a diethylaminu (0,884 g; 12 mmol) v dimethylformamidu (30 ml), teplota se udržuje na 50 °C. Modrý roztok se nalije na led a získaná sraženina se oddělí filtrací. Surový produkt se rozpustí v dichlormethanu a promyje vodou (2 x 50 ml) . Po sušení nad síranem sodným se rozpouštědlo odpaří a získaný produkt se rekrystalizuje dvakrát z methanolu (1,86 g; 51,5 %).

NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 Mhz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu) , 2,67 (t, 4H, N-CH₂) , 3,50 (t, 4H,

S=C-CH₂) , 4,3 (m, 1H, Η_3α) , 5,33 (d, 1H, H_s) .

3. Příprava dithioamidátu bisjodidu

Methyljodid (2 ml) se přidá k roztoku dithioamidu (0,603 g; 1 mmol) v acetonu (20 ml) a směs se nechá stát při teplotě místnosti 48 hodin. Získaná sraženina se odfiltruje (0,741 g;

83,5 %). Tento produkt se použije přímo bez dalšího čištění.

4. Příprava bisamidiniumbishydrochloridu BADC

Prou amoniaku se při teplotě varu probublává 2 hodiny přes suspenzi bisjodidu (0,741 g; 0,83 mmol), který se získá tak, jak je uvedeno výše, v isopropanolu (10 ml), a potom pokračuje zahřívání k varu další 4 hodiny. Isopropanol se odpaří a nzbytek se převede do methanolu (10 ml). Roztok se přefiltruje přes bazickou jontoměničovou pryskyřici, potom se rozpouštědlem nechá procházet proud kyseliny chlorovodíkové a roztok se odpaří do sucha. Takto získaný bishydrochlorid se rozpustí v minimálním objemu ethanolu (asi 5 ml) . Světlá nerozpustná látka se odfiltruje a k filtrátu se přidá velký přebytek diethyletheru. Získá se prášek, který se odfiltruje a suší

4444 ·· 44 • · 4 4 • 4 44

4 4 • 4 4 4 (320 mg; 60 . Rekrystalizace z isopropanolu umožni izolovat očekávaný produkt v analyticky čisté formě.

^XH NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 Mhz); 0,5-2,6 (m, struktura cholesterylu a -CH₂-amidinia) , 3,57 (s, široký 4H, NCH₂) 4,3 (m, 1H, H_3a) , 5,3 (d, 1H, H₅) , 8,64 (s, široký; 2H;

NH₂) , 9,07 (s; široký; 1H; NH) , 9,18 (s; široký; 2H) .

Analýza pro C₃₄H_SSN₄O₂.2HC1:

vypočteno: C, 65,25; H, 9,32; N, 8,94; nalezeno: C, 65,40; H, 9,87; N, 9,55.

B. Použití derivátů podle předkládaného vynálezu pro in vitro a in vivo přenos genů

Látky a způsoby

- Transfekční testy uvedené níže se provádí s BGSC a BGTC, které se připraví podle postupu popsaného v příkladech 1 a 2.

- Příprava liposomů

Směs kationtového lipidu a DOPE (v molárním poměru 3/2) v chloroformu (CHC1₃) se odpaří za vakua a v dusíkové atmosféře se suspenduje v 20 mM HEPES pufrovacím roztoku při pH 7,4.

Koncentrace úplného lipidu je 1,2 mg/ml.

Směs se 5 minut míchá a potom se na ni působí ultrazvukem (sonikuje) 5 minut pomocí ultrazvukového přístroje (sonikátor) (Branson Ultrasonic 2210), nakonec se skladuje při +4 °C 24 hodin za hydratace.

Vzniklá disperze se znovu sonikuje (Sonikátor Branson 450) 5 až 10 min za vzniku liposomů.

Po odstředění se roztok filtruje na filtru s velikostí pórů 0,22 μω (Millex GS, Millepore) a skladuje při +4 °C.

·· 9 · « · 9 9 99 9 9 99 . : : *: :: :· ··::

..........* *·

Velikost liposomů obsahujících BGSC nebo BGTC se zkoumá pomocí laserového difrakčního přístroje (Autosizer 4700, Malvern Instruments). Tento test vykáže jeden pík odpovídající střednímu průměru 50 nm při mnoha multimodálních analýzách.

- Buněčné kultury

Zdroje (druhy a tkáně) většiny buněčných kmenů použitých pro transfekční pokusy jsou uvedeny v tabulce I.

Buňky buněčného kmene HeLa (P. Briand, ICGM Paříž) jsou odvozeny od lidské rakoviny pocházející z krčního epitelu. Buňky NIH 3T3 (C. Lagrou, Pasteurův institut, Lilie) jsou fibroblasty myší.

Buněčný kmen NB2A (C. Gouget, Paříž) je odvozen od neuroblastomu myší.

Všechny buňky kromě buněk AtT-20 a PC12 se kultivují v modifikovaném médiu Dulbecco (DMEM, GIBCE) doplněném 10% fetálním telecím sérem (FCS, GIBCO), penicilinem o 100 jednotkách/ml (GIBCO) a streptomycinem (GIBCO) při 10 0 μ9/ιη1.

Buňky AtT-20 se kultivují v DMEM/F12 (GIBCO) doplněném o 10% fetální sérum telat.

Buňky PC12 se kultivují v DMEM doplněném 10% FCS a 5% sérem koní .

Všechny buňky se udržují v kultuře v plastových miskách (Falcon) ve vlhké atmosféře s 5 % oxidu uhličitého.

- Plasmidy

Plasmidy pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paříž) a pRSV-nlsLacZ se namnoží v E. Coli a připraví se čištěním na CsCl gradientu pomocí standardní techniky. V plasmidu pRSV-nlsLacZ a plasmidu • · « 9

99 9

9 9 9 9 9

99 999

9 9 9 999 9

9 9 9 9

99 9 pRSV-Luc je gen E. Coli LacZ a jeho sekvence jaderného lokalizačního signálu a gen luciferázy v tomto pořadí pod transkripční kontrolou LTR/RSV („Rous sarcoma virus). Plasmid pXL2774 obsahuje gen kódující luciferázu pod kontrolou promotoru cytomegaloviru (CMV).

- Postup pro in vitro transfekci

Jeden den před transfekci se 2 x 10⁵ buněk uloží do každé jamky (sestijamkové desky Falcon).

Každá jamka obsahuje jiný buněčný kmen.

V den transfekce jsou tedy buňky semikonfluentní.

Plasmid DNA (5 ^ig) a požadované množství bis-guanidiniumlipidu se vždy zředí 250 μΐ FCS bez DMEM a promíchá. Asi po 5 minutách se dva roztoky nechají inkubovat 15 minut při teplotě místnosti. Transfekční směs se potom přidá k buňkám (0,5 ml na jamku), které byly promyty médiem bez séra. Po 4 až 6 hodinách inkubace při 37 °C se bez odstranění transfekční směsi do každé jamky přidá 1 ml média se sérem. Po 24 hodinách po transfekci se médium nahradí 1 ml čerstvého kultivačního média. Buňky se izolují 2 dny po transfekci a změří se exprese luciferázy.

Kontrolní transfekce se prováděla za použití komerčně dostupných transfekčních činidel:

- lipopolyamin Transfectam® (JP Behr, Strasbourg, Francie) se použil v alkoholickém roztoku v optimálním poměru Transfectam®/DNA jontový měnič 6-8.

Lipofectin® (Life Technologies lne., Cergy Pontoise, Francie), který je liposomovým prostředkem obsahujícím jako neutrální lipid DOPE a jako kationtový lipid DOTMA. (N-[1(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamoniumchlorid).

·· • 0 00 • · 0 · • · ·· • 000 • · • 0

00 0·· t ·

0 0 00 0·

Komplex DNA/liposotn se získá za standardních podmínek doporučených výrobcem.

Buňky se transfekují pomocí precipitace fosforečnanem vápenatým. (Keown, W. A., Campbell, C. R., Kucherlapati, R. S., (1990) Methods in Enzymology; Academie Press: New York, 185, 527-537) .

- Měření luciferázy pro transfekci prováděnou in vitro

Aktivita luciferázy se měřila 48 hodin po transfekci za použití varianty postupu popsaného v De Wet a kol. (De Wet J. R., Wood K. V., DeLuca M., Helinski D. R., a Subramani S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737).

- odstraní se kultivační médium

- buňky se promyjí solným roztokem studeného fosfátového pufru

- potom se lyžují inkubací v 250 μΐ lyzovaciho pufru (25mM trifosfát pH 7; 8,8 mM chlorid hořečnatý, 1 mM dithiotreitol,

15% glycerol a 1% triton X-100).

- Po odstranění nerozpustných látek pomocí odstředění (15 mm, 4 °C) v mikroodstředivce se získá čirý lyzát,

- alikvotní díl (2 0 μΐ) buněčného extraktu se zředí v 100 μΐ lyzovaciho pufru, ke kterému se přidá 9 μΐ 25mM ATP (Sigma) a 20 μΐ 25 mM luciferinu (Sigma).

- vzorky se umístí do luminometru (Lurmet LB9501 Berthold, Nashua, NH) a 10 sekund se měří emise světla.

Kalibrace křivky RLU/luciferáza se provádí za použití různých zředění čisté luciferázy ze světlušek (Sigma) a zjistí se, že lineární část křivky se pohybuje od 10⁴ až 10⁷ RLU (relativní světelná jednotka).

···· • ·

• · «· ·

Koncentrace proteinu se měří pomocí BCA (bicinchoninová kyselina) testu za použití hovězího sérového albuminu jako kontroly.

Údaje pro aktivitu luciferázy jsou vyjádřeny v RLU/mg proteinu.

- Postup pro in vivo injektáž na úrovni dýchacích cest myší

Použitými myšmi jsou samice 0F1 myší (hmotnost 30 g) získané od Iffa-Credo (Lyon, Francie). Použijí se kationtové liposomy BGTC/DOPE (molární poměr 3:2). Transfekčni směs se získá z 10 pg plasmidu DNA (v 10 μΐ vody) , 2 0 μΐ kat iontového liposomu v 20 mM média Hepes (pH 7,4), při koncentraci úplného lipidu 5 mg/ml. Agregáty DNA/lipid takto připravené mají poměr náboje řádu 6.

Po anestézii myši pomoci pentobarbitalu se transfekční směs (30 μΐ) injektuje do dýchacích cest pomocí intratracheálního nakapání pomocí kanyly vložené do dýchací dutiny. 48 hodin po nakapání se zvíře usmrtí pomocí předávkování pentobarbitalem a plíce a průdušnice se vyjmou pro analýzu.

- barvení pomocí X-gal

Pro měření exprese E. coli betagalaktosidázy v primární kultuře se buňky napouštěly 15 minut při 4 °C 4% roztokem paraformaldehydu a potom se inkubovaly s chromogenním betagalaktosidázovým X-gal substrátem (Sigma). Modrá barva jader transfekovaných buněk se měřila pomocí luminiscenční mikroskopie .

- Měření X-gal buněk na úrovni dýchacích cest transfekovaných in vivo

Pro detekci X-gal buněk na úrovni dýchacích cest se plíce a průdušnice podrobily 1 hodinu působení 4% paraformaldehydu, potom se ponořily na noc do PBS obsahujícího 3 0 % sacharózy, ·· • · média a zmrazily kapalným potom barvily na aktivitu činidlem X-gal (Sigma) přes • · ·· potom se uložily do mrazícího dusíkem. Zmrzlé části 5 μ se β-galaktosidázy pomocí inkubace s noc.

- Měření luciferázy na úrovni dýchacích cest transfekovaných in vivo

Pro měření aktivity luciferázy na konci in vivo transfekce se části tkáně vystavily 30 μΐ lyzovacího pufru (25 mM trisfosfát pH 7,8, 1 mM dithiotreitol (DTT), 15 % glycerol a 1 % triton X-100) , lyžovaly se asi 1 minutu v homogenizéru (Polylabo, Strasbourg, Francie) a skladovaly se v ledu. Po odstředění se 20 μΐ lyzátu použilo pro měření. Aktivita luciferázy je vyjádřena v RLU na mg proteinu.

- Imunohistochemický postup

Zmrazené části vzorků plic a průdušnice se 1 hodinu inkubovaly bud' s myší monoklonální protilátkou anti-E. coli β-galaktosidázou při 5 μg/ml (Genzyme, Cambridge, MA) nebo s králičí polyklonální protilátkou při zředění 1:400 (Progema).

Escherichia coli β-galaktosidázový protein se měřil pomocí barvení imunoperoxidázou za použití biotinem značené sekundární protilátky anti-myší Ig (Boehringer) a konjugátu streptavidin-POD (Boehringer). Luciferázový protein se měřil pomocí barvení imunoperoxidázou za použití protilátky kozího séra proti králičímu séru (ICN Biomedicals, lne) a králičího systému peroxidáza-antiperoxidáza (PAP) (Dako Glostrup, Dánsko). Sekce se testovaly pomocí luminiscenční mikroskopie. Negativní kontrola se prováděla bez protilátky.

• ·

Příklad 4

Transfekce in vitro při různém poměru transfekčního činidla/DNA

Aby se optimalizovala účinnost transfekce dosažená s agregáty BGTC/DNA, studoval se vliv poměru BGTC/DNA na rychlost transfekce u 3 různých typů buněk savců, které jsou známy pro svou citlivost na běžné postupy transfekce. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 3.

Transfekční pokusy se tedy prováděly s myšími fibroblasty 3T3, lidskými buňkami epitelu HeLa a myšími neuroblastomy NB2A. V průběhu těchto testů se určité pevné množství plasmidu pRSV-Luc uvedlo do kontaktu s různými množstvími BGTC v roztoku. Aby se určil rozsah poměru, který má být studován, vyšlo se z principu, že jeden μ9 DNA je ekvivalentní 3nm negativně nabitého fosfátu a že pouze dvě guanidiniové skupiny jsou pozitivně nabité při neutrálním pH pro vznik agregátu a pro transfekci. Aktivita luciferázy se měřila 48 hodin po transfekci. Exprese luciferázy je maximální pro agregáty obsahující 6 (buňky HeLa) až 8 (3T3 a NB2A buňky) guanidiniových skupin na jednu fosfátovou skupinu DNA, tedy agregáty mající velký kladný náboj.

Příklad 5

Transfekce in vitro s různými typy buněk

Přenos genů pomocí íntermediace kationtových lipidů je zajímavou transfekční technikou nejen proto, že nevyžaduje meziprodukty, ale také proto, že umožňuje transfekovat velmi širokou škálu buněk různých tkání a organismů. Pro studium míry účinnosti BGTC jako transfekčního činidla se testovalo několik buněčných kmenů různého původu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 níže. Poměr náboje pro maximální účinnost byl určen mezi 6 až 8. Pro porovnání se buňky stejných kmenů transfekovaly za použití lipopolyaminu na jedné straně a fosforečnanu vápenatého • ·

na druhé straně. Výsledky ukazují, že BGTC je běžně účinný jako Transfectam a dvakrát účinnější než fosforečnan vápenatý.

Tabulka 1: Exprese luciferázy na různých kmenech buněk savců pomocí BGTC, fosforečnanu vápenatého a Transfectamu®.

	RLU/mg t	>uněčných proteinů
Druhy	Buněčné kmeny	Tkáně	BGTC	Fosforečnan vápenatý	Transfectam®
Člověk	A549	Rakovina plic	4xl0⁵	7xl0³	3,1x10®
Opice	COS-7	Ledviny trnasformované SV4 0	2 , lxlO⁷	3,7x10®	8,4x10®
Pes	MDCK-1	Ledviny	3XlO⁶	4,5xlO^s	2,2x10®
Krysa	RIN-m5F	Nádorové buňky rakoviny ostrůvku slinivky břišní	2x10’	2x10®	3,3x10®
	ROS	Osteosarkom	4,0x10®	4,5x10®	2,3x10®
	PC12	Fenochromocytom	3xl0⁷	1,7x10®	SxlO®
Myš	AtT-20	Nádor podvěsku mozkového	2xl0⁷	8x10®	3xl0⁷

Všechny transfekce se prováděly nejméně dvakrát (n>2)

Příklad 6

Transfekce in vitro za přítomnosti neutrálního lipidu

Sloučenina BGSC je méně rozpustná ve vodném médiu než sloučenina BGTC, použili jsme BGSC ve formě liposomů v přítomnosti neutrálního lipidu DOPE (dioleylfosfatidylethanolamin). Prostředky se připraví v molárním poměru 3/2. Druhý prostředek obsahující BGTC se připraví s DOPE za stejných podmínek.

6.1 Určení poměru úplný lipid/DNA • · • · · • · ·

Nejprve jsme určili poměr lipid/DNA během transfekčního experimentu na buňkách HeLa. Získaná křivka je uvedena na obrázku 4. Optimální transfekce se získá pro poměry BGSC liposomy/DNA mezi 1,5 až 5 s centrem na 2,5 až 3. Guanidiniová skupina se protonuje při neutrálním pH, nej lepší agregáty BGSCDOPE/DNA mají kladný náboj okolo 3 (obrázek 4).

Nej lepší poměry BGSC-DOPE/DNA jsou proto nižší než poměry získané s agregáty typu BGTC/DNA (mezi 6 a 8) . Transfekce za přítomnosti kationtových liposomů se usnadňuje za přítomnosti DOPE a pomocí jeho fusogenních vlastností.

6.2 Transfekce různých buněčných kmenů pomocí kationtových liposomů

Transfekční pokusy se prováděly na různých buněčných kmenech za použití prostředků kationtových liposomů BGSC-DOPE a BGTC-DOPE v molárním poměru 3/2. Poměr náboje guanidinium lipid/fosfát DNA je asi 2,5 (~ 3) pro tyto dvougenové přenosové systémy. Transfekce Lipofectinem® slouží jako kontrola. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 níže.

Tyto výsledky ukazují, že deriváty cholesterolu opatřené guanídiniovymi skupinami ve formě kationtových liposomů jsou minimálně stejně účinné pro transfekci jako Lipofectin. Tyto výsledky mohou být samozřejmě pro každý buněčný kmen optimalizovány.

• · • · · • · · • * · »· ·· • · ·

Tabulka 2: Exprese luciferázy v různých eukaryotických buněčných kmenech transfekovaných pomocí BGSC/DOPE liposomů, BGTC/DOPE liposomů a Lipofectinu®

	RLU/mg celulárních proteinů
Buněčné kmeny	BGSC liposomy	BGTC liposomy	Lipofectin®
HeLa	4,6xl0⁶	7,7xl0⁶	3,3xl0⁶
A 549	6xl0⁵	2xl0⁵	4xlO^s
COS - 7	ND	1,4xl0⁷	9,5xl0⁶
MDCK-1	lxlO⁶	7xl0⁶	1,9xl0⁶
ROS	ND	9xl0⁶	6xl0⁶
NB2 A^a	1,5xl0⁷	1,4xl0⁷	ND
NIH 3T3^a	7xl0⁶	1,5xl0⁶	ND

Všechny transfekce se prováděly nejméně třikrát (n>3).

^a: znamená měřeni při RLU aktivity luciferázy pro

100 μ5/500 μ9 úplného lyzátu (n>4) .

Příklad 7

Testování účinku přítomnosti sérových proteinů na účinnost přenosu genu in vitro

Většina transfekčních prostředků založených na kationtových lipidech má sníženou účinnost v přítomnosti séra. Cílem tohoto příkladu je testovat citlivost sloučenin podle předkládaného vynálezu na působení séra.

7.1 Prostředky kationtových lipidů

Lipidy popsané v předkládaném vynálezu se rozpouští v ethanolu.

i) Roztoky „liposomů se získají za přítomnosti DOPE následujícím způsobem: DOPE (AVANTI) v roztoku v chloroformu se přidá k roztoku lipidu v ethanolu v molárním poměru kationtový • 4 4 4

4 4 4 4

444 4 444 • 4 44 · · · · · · lipid/DOPE 3/2. Po odpaření do sucha se směs převede do vody a zahřívá se 30 minut na 50 °C;

ii) roztoky „micel se získají podle postupu popsaného pro přípravu „liposomů, ale roztok DOPE se nahradí chloroformem.

Roztoky se všechny upraví na lOmM kationtového lipidu.

7.2 Nukleová kyselina

Použitou nukleovou kyselinou je plasmid pXL2774.

7.3 Směsi cytofektantů (příprava těsně před použitím)

DNA se zředí na 20 μ9/ιη1 v 150 mM chloridu sodném a různé prostředky kationtového lipidu se zředí ve vodě na 40, 80, 120 a 160 μΜ. Stejné objemy roztoků DNA a lipidu se smísí za získání poměrů v nmol/pg DNA 2, 4, 6 a 8 v tomto pořadí;

koncentrace solanky je 75 mM.

7.4 Transfekce

Buňky se kultivují za vhodných podmínek v 24 jamkové mikrotitrační desce (2 cm²/jamka) a při exponenciálním růstu se transfekují a z 50-70 % se slijí. Buňky se dvakrát promyjí 500 μΐ média bez sérových proteinů a kultivují se znovu buď v médiu bez séra (transfekce za nepřítomnosti séra) nebo v úplném médiu (transfekce za přítomnosti séra) a k buňkám (3 jamky/stav lipid-DNA) se přidá směs cytofektantů (0,5 μg DNA/jamka).

Když se buňky transfekují „v nepřítomnosti séra, kultivační médium se doplní vhodným množstvím séra 2 hodiny po transfekci.

Účinnost transfekce se hodnotí pomocí měřeni exprese luciferázy podle doporučení uvedeného pro použití sady Progema (luciferázový testovací systém). Toxicita směsi cytofektantů se určí měřením koncentrací proteinu v buněčném lyzátu.

• · ft í • · • · ♦ • · · • · · · • · · » ·· ····

7.5 Výsledky (obrázek 5)

Výsledky získané se čtyřmi buněčnými typy (NIH3T3 - 293 - HepG2 - HeLa) ukazují, že za testovaných podmínek jsou prostředky ve formě „liposomů účinnější než prostředky ve formě micel. Dále naproti tomu, co bylo pozorováno u většiny cytofektantových prostředků obsahujících kationtové lipidy nemůže být za podmínek naší transfekce demonstrován žádný výrazný inhibiční účinek na BGTC ve formě „liposomů nebo „micel spojený s přítomností séra.

Příklad 8

In vivo exprese transgenu v dýchacích cestách myši s BGTC/DOPE líposomy

Pro tento účel jsme využili kationtových liposomů BGTC/DOPE. Příprava agregátů DNA/liposomy a podávání se provádělo tak, jak je popsáno v látkách a způsobech.

X-gal buňky se v epitelu dýchacích cest u léčených myší detekovaly 48 hodin po transfekci LacZ plasmidu do buněk pomocí BGTC/DOPE liposomů. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 6.

Většina transfekovaných buněk se nacházela v průdušnici a pouze malé množství X-gal buněk bylo nalezeno v sekundárních dýchacích cestách. Tento typ rozdělení byl již zmiňován u jiných buněčných transfekci.

Imunohistochemie byla dále prováděna za účelem identifikace produktu uvedeného genu. Na úrovni povrchu epitelu (obrázek 6A) byly převážně transfekované maturované buňky. Tyto údaje ukazují, že kationtové liposomy jsou schopny indukovat transfekci genů u neproliferačních a úplně diferencovaných buněk epitelu dýchacích cest. Exprese transgenu se také zjišťovala ve žláze pod sliznicí (obrázek 6B). Detekce pomocí imunologického značení transfekovaných buněk za použití monoklonální

·♦ ·· • * · · • · ·· • · · · ·· ·· protilátky namířené proti E. coli β-galaktosidáze potvrzuje tuto expresi ve žláze pod sliznicí a na povrchu epitelu (obrázek 6D) . Transgenni exprese se také demonstruje ve žláze pod sliznicí pomoci imunoperoxidázového značení protilátkou řízenou proti luciferázovému proteinu po transfekci pRSV-Luc pomocí BGTC/DOP (obrázek 6D).

Negativní kontrola se prováděla bez·protilátky (obrázek 6E).

Tyto výsledky jsou velmi zajímavé pro genovou léčbu namířenou proti cystické fibróze. Samozřejmě je pro léčbu tohoto onemocnění nutné zasáhnout žlázu pod sliznicí, která je hlavním místem exprese CFTR v lidských průduškách.

Příklad 9

Kvantitativní měření účinnosti transfekce BGTC/Dope in vivo

Pro tento účel se plíce a průdušnice myši léčené BGTC/DOPE liposemem a plasmidem pRSV-Luc za podmínek popsaných v příkladu 8 vyjmou 48 hodin po transfekci a aktivita luciferázy se měří pomocí postupu popsaného v látkách a způsobech.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3 níže.

Tabulka 3

Vektory	Aktivita luciferázy (RLU/mg proteinu)
BGTC/DOPE liposomy:	2,8xl0⁵
pRSV-Luc	(průměr: 3xl0⁴ - 8xl0⁵
pRSV-Lac Z	0
Prostá DNA
pRSV-Luc	0

····

Aktivita luciferázy se detekuje soustavně v homogenátech průdušnic, ale ne v homogenátech plic. Toto pozorování je v souladu s předchozími výsledky získanými v průběhu testování rozdělení buněk pozitivních na X-gal. Je třeba poznamenat, že exprese luciferázy je přímo spojená s expresí plasmidů, protože se v kontrolním vzorku obsahujícím LacZ plasmid nedetekuje žádná aktivita. Kontrolou byla také transfekce plasmidu prováděná bez vektoru. Při tomto kontrolním testu nebyla pozorována žádná exprese luciferázy.

Tyto údaje demonstrují účinnost BGTC/DOPE lipozomů pro in vivo genovou transfekci v dýchacích cestách.

Příklad 10

Genový přenos in vivo pomocí nitrožilní nebo intraperitoneální injekce

Prostředky kationtových lipidů a DNA jsou popsány v příkladu 7.

10.1 Vliv dávky kationtových lipidů (obrázky 7 až 8)

Pět týdnů staré myši BalbC se injektují pomocí nitrožilní (ocasní žíla) nebo intraperitoneální injekce 200 μΐ transfekční směsi v roztoku 37,5 mM chloridu sodného, 5% glukózy a exprese luciferázy se určí 24 hodin po transfekci v plicích po nitrožilní injekci a v játrech a ve slezině po intraperitoneální injekci. Orgány se vyjmou a umístí do studeného lyzovacího pufru (Promega E153A) doplněného inhibitory proteázy (Boehringer 1697498) a homogenizují se v homogenizéru Heidolph DIAX600. Aktivita luciferázy se určí v 14 000 g supernatantu extraktu tkáně.

Nitrožilní injekce

Každá myš dostala 50 μρ DNA komplexované s různými koncentracemi BGTC ve formě „liposomů. Pozorovaný optimální poměr

• ft ···· v nanomolech kationtového lipidu/gg DNA je 9 (obrázek 7) ; pro dávky 900 nanomolů injektovaného BGTC nebyla pozorována žádná toxicita.

Intraperitoneální injekce

BGTC ve formě „liposomů se injektoval s 10 0 μ9 DNA na myš. Maximální exprese jak pro játra (obrázek 8B) , tak pro slezinu (obrázek 8A) byla získána pro 1,5 nanomolů BGTC/^g DNA.

10.2 Kinetika exprese po nitrožilní injekci

Určili jsme biologické rozložení exprese luciferázy v 7 orgánech jako funkci času po injekci 200 μΐ směsi BGTC „ liposomů /DNA v 37,5 mM chloridu sodného, 5 % glukózy (50 μ9 DNA a 9 nanomolů BGTC^g DNA) do ocasní žíly 5 týdnů starých BalbC myši. Výsledky jsou vyjádřeny v pikogramech luciferázy extrahované na orgán vzhledem ke kalibrační křivce s luciferázou značenou v krystalizované formě. Mez detekce se pohybuje mezi 0,5 až 1 pikogramem luciferázy.

Ukázali jsme, že za testovaných podmínek se maximální exprese dosáhne 23 hodin po transfekci pro 6 ze 7 testovaných orgánů, kterými jsou bránice, žaludek, srdce, plíce, játra a slezina. Exprese na úrovni jater byla více prematurovaná. Maximální exprese se získá na úrovni plic v hladině 0,5 nanogramu 23 hodin po transfekci.

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce I a její soli

O /

R² (I)

R¹ je derivát cholesterolu nebo alkylaminoskupina -NR'R, kde R' a R jsou nezávisle na sobě nasycená nebo nenasycená lineární nebo rozvětvená alifatická skupina obsahující 12’ až 22 atomů uhlíku,

R a R³ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina obecného vzorce II, kde alespoň jedna ze skupin R² a R³ je jiná než atom vodíku, kde:

R⁴ a R⁵ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina obecného vzorce III nh₂ nh₂ (III) • « • · • * ···· <·· ··

I · · I

I · ·· ··* · « • · a kde p a q jsou. nezávisle na sobě celé číslo 0 až 4 a r je rovno 0 nebo 1, kde r j e rovno 1

X je skupina NH a x je potom rovno 1 nebo

2. Sloučenina podle nároku 1, kde R² a R³ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina obecného vzorce IV +

kde :

n, ín a p jsou definovány výše a R⁴ je atom vodíku nebo skupina obecného vzorce V

NH₂

-(CH₂) q—(NH) nh₂ (V) kde q a r jsou definovány výše, a je možné, že m, n, p, q a r se nezávisle mění mezi různými skupinami R² a R³.

3. Sloučenina podle nároků 1 nebo 2, která je s výhodou jednou ze sloučenin následujících obecných vzorců:

(H₂N)₂ ⁺C-NH- (CHJ^NH-COO-R¹

VI /

9999 • 9 9 ·

9 9 49

9 9999 ·

VIII

IX [{H₂N)₂ ⁺C-NH- (ch2)3] [ (H2N)2C⁺-NH-(CH2)J -n-coo-r¹ VII , [ (H₂N)₂ ⁺C-NH- (CH₂)₂]₂-N- (CH^-NH-COO-R¹ [ (H₂N)₂ ⁺C- (CH₂)₂] 2-N-COO-R¹ [ [ (H₂N) ₂ ⁺C- (CH₂) ₂] ₂-N- (CH₂) ₂] jN-COO-R¹ kde R¹ má výše uvedený význam.

4. Sloučenina podle kteréhokoli z předcházejících nároků, která je vybrána z následující sady:

[ [ (H₂N) ₂ ⁺C- (CH₂) ₂] ₂-N- (CH₂) ₂] .N-COO-R¹, [ (h₂n)₂ ⁺c-nh- (ch2)3] [ (h2n)2c⁺-nh-(ch2)J-n-coo-r¹ a [ (H₂N) ₂ ⁺C- (CH₂) ₂] ^N-COO-R¹ kde R¹ je cholesterylová skupina.

5. Sloučenina podle kteréhokoli z předcházejících nároků 1 až

4, kterou je Bis Guanidino Spermidin Cholesterol (BGSC).

6. Sloučenina podle kteréhokoli z předcházejících nároků 1 až

5, kterou je Bis Guanidino Třen Cholesterol (BGTC).

7. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu sloučeninu podle kteréhokoli z předcházejících nároků.

8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 vyznačuj í cí se tím, že sloučeninou je Bis Guanidino Spermidin Cholesterol (BGSC).

9. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 vyznačující se tím, že sloučeninou je Bis Guanidino Třen Cholesterol (BGTC).

···» ·»♦♦ • * ftft · · ·· ftft ftft ·· ···· * • · · * * · · ftft ·· ·· ·· z nároků 7 až 9 dále obsahuje vvznacu36 ·· ·*·

10. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli vyznačující se tím, že nukleovou kyselinu.

11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 jící se tím, že nukleovou kyselinou je deoxyribonukleová kyselina.

12. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že nukleovou kyselinou je ribonukleová kyselina.

13. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 10 až 12 vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.

14. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1, neutrální lipid a nukleovou kyselinu.

15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14 vyznačující se tím, že sloučenina je vybrána ze sady, kterou tvoří BGTC a BGSC.

Farmaceutický jící se prostředek podle nároku 14 tím, že neutrálním lipidem vyznačuj e DOPE.

17. Farmaceutický prostředek podle nároku 14 vyznačující se tím, že nukleovou kyselinou je deoxyribonukleová kyselina.

18. Farmaceutický prostředek podle nároku 14 vyznačující se tím, že nukleovou kyselinou je ribonukleová kyselina.

19. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 17 a 18 vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.

···· · ·· ·· ·· ··. • ·· »··· ♦ ♦·· • · »♦·· «···

20. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 7 až 19 vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelné vehikulum pro prostředky pro inj ekční podávání.

21. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 7 až 19 vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelné vehikulum pro aplikaci na pokožku a/nebo na sliznici.

22. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 6 pro in vitro, ex vivo a/nebo in vivo transfekci buněk.

23. Způsob převedení nukleová kyseliny na buňky vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení jmenované nukleové kyseliny do styku se sloučeninou podle nároku 1 a inkubaci vzniklé směsi se jmenovanými buňkami.