NO311806B1 - Forbindelser tilhörende amidiniumfamilien, farmasöytiske preparater inneholdende disse samt anvendelse derav - Google Patents

Abstract

Nye derivater av amidiniumfamilien med den generelle formel:. der. Rbetyr et kolesterolderivat eller en alkylaminogruppe, NRR", der Rog Ruavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formelen:. der. Rog R; uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formel. Videre beskrives tilsvarende farmasøytiske preparater som særlig kan anvendes ved genterapi fox.overføring av terapeutiske gener til celler.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye forbindelser tilhørende amidiniumfamilien og særlig guanidiniumfamilien, videre farmasøytiske preparater inneholdende disse forbindelser og anvendelse derav.

Mere spesielt angår foreliggende oppfinnelse forbindelser som karakteriseres ved den generelle formel (I) samt salter derav:

der

Ri betyr et kolésterolderivat

R.2 og R3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med den generelle formel (II) hvorved minst et av symbolene har en annen betydning enn hydrogen:

der

n og m uavhengig av hverandre og uavhengig av gruppene R2 og R3 betyr et helt tall fra 0 til 4 og

R4 og R5 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med den generelle formel (JU)

forutsatt at minst en av R4 og R5 er forskjellig fra et hydrogenatom, og

der

p og q, uavhengig av hverandre, betyr et helt tall fra 0 til 4 og

r er lik 0 eller 1, idet når r er lik 1,

X betyr en NH-gruppe og x er lik 1 eller

X betyr et nitrogenatom og x er 2.

Symbolene p, q og r kan variere uavhengig av gruppene R4 og R5.

Som foretrukken undergruppe innenfor rammen av oppfinnelsen kan man særlig nevne forbindelse med den generelle formel (I) der R2 og R3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formel (IV)

der

n, m og p er definert som ovenfor og

R4 betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formel (V)

der

q og r er som angitt tidligere og

m, n, p, q og r kan variere uavhengig mellom de forskjellige grupper R2 og R3.

Disse nye forbindelser med den generelle formel (I) kan foreligge som ikke-toksiske og farmasøytisk akseptable salter. Disse ikke-toksiske salter omfatter salter med mineral-syrer (salt-, svovel-, bromhydrogen-, fosfor- eller salpetersyre) eller med organiske syrer (eddik-, propion-, rav-, malein-, hydroksymalein-, benzo-, fumar-, metansulfon- eller oksalsyre) eller med mineralbaser (natrium-, kalium-, litium- eller kalsiumhydroksyd) eller organiske baser (tertiære aminer som trietylamin, piperidin eller benzylamin).

Som representative for forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan man særlig nevne forbindelsene med de følgende generelle underformler:

der Ri har den ovenfor angitte betydning.

Som representative for de krevede guanidinium- og amidiniumforbindelser kan man særlig nevne forbindelser med foregående underformler (VII), (VET) og (DC), der Ri betyr en kolesterylgruppe. De tre forbindelser er respektivt identifisert nedenfor under betegnelsen BGSC (bis-guanidinospermidinkolesterol), BGTC (bis-guanidinotrenkolesterol) og BADC (bis-hydroklorid av bis-amidiniumdietylentriaminkolesterol).

De krevede forbindelser er spesielt interessante på det terapeutiske plan på grunn av deres ikke-toksiske karakter og deres amfifile egenskaper. Tatt i betraktning disse egenskaper kan de særlig benyttes for kompleksdannelse av nukleinsyrer innenfor perspektivet av en cellulær transfeksjon derav. Disse forbindelser kan således med fordel benyttes i genterapien.

Forbindelsene (VE) (BGSC) og (VIE) (BGTC) er særlig fordelaktige for overføring av gener in vivo. De to forbindelser kompleksdanner seg med DNA og beskytter denne mot nedbrytning på grunn av pH-variasjoner under transporten mot cellen som skal behandles.

Foreliggende oppfinnelse angår også et farmasøytisk preparat som karakteriseres ved at det omfatter minst en av forbindelsene som beskrevet ovenfor.

I en spesielt foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er forbindelsen bis-guanidinospermidinkolesterol (BGSC) og i en annen foretrukken utførelsesform er forbindelsen bis-guanidinotrenkolesterol (BGTC).

Genterapien har som hovedgjenstand å korrigere genetiske sykdommer forbundet med en feil ved ekspresjonen og/eller en anormal ekspresjon, det vil si defektiv eller eksessiv, av en eller flere nukleinsyrer. Man tar sikte på å bøte på denne type genetiske anomalier ved hjelp av cellulær ekspresjon in vivo eller in vitro av klonede gener.

I dag er det foreslått mange metoder for intracellulær avlevering av denne type genetisk informasjon. En av de i dag benyttede teknologier hviler nettopp på anvendelsen av kjemiske eller biokjemiske vektorer. Disse syntetiske vektorer har to hovedfunksjoner, nemlig å kompaktere det DNA som skal transfekteres og å fremme dets cellulære fiksering samt dets passasje gjennom det plasmiske membran og eventuelt gjennom de to nukleære membraner. De positivt ladede, kationiske lipider som kloridet av N-[l-(2,3-dioleyloksy)propyl]-N,N,N-trimetylammomumklorid (DOTMA) har således vært foreslått. Fordelaktig interagerer dette i form av liposomer eller små vesikler, spontant med DNA som selv er negativt ladet og danner komplekser lipid:DNA, i stand til å fusjonere med de cellulære membraner for derved å tillate intracellulær avlevering av DNA. I det spesielle tilfellet med DOTMA er imidlertid den gode effektivitet når det gjelder transfeksjonen dessverre forbundet med en mangel når det gjelder bionedbryt-barheten og en toksisk karakter hva angår cellene.

Efter DOTMA er andre kationiske lipider utviklet på denne strukturmodell: lipofil gruppe forbundet med en aminogruppe via en arm kalt "spacer". Blant disse kan man

særlig nevne de som som lipofil gruppe omfatter to fettsyrer eller et kolesterolderivat og som videre, alt efter som, som aminogruppe, bærer en kvaternær aminogruppe. DOT AP, DOBT eller ChOTP kan særlig nevnes som representative for denne kategori kationiske lipider.

På grunn av den kjemiske struktur og den bionedbrytbare karakter tilfredsstiller forbindelsene ifølge oppfinnelsen de krav som rettes mot transfeksjonsvektorer for nukleinsyrer.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelsen av en forbindelse som beskrevet ovenfor for transfeksjon in vitro og/eller ex vivo i celler.

Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for overføring av en nukleinsyre til celler og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at nukleinsyren, in vitro og/eller ex vivo, bringes i kontakt med en forbindelse som beskrevet ovenfor og at den resulterende blanding inkuberes med cellene.

Det skal her påpekes at oppfinnelsens teknologi, utenfor rammen av de ledsagende krav, også kan finne anvendelse in vivo.

I preparatene ifølge oppfinnelsen kan nukleinsyren forbundet med minst en krevet forbindelse både være en desoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om oligonukleotidiske eller polynukleotidiske sekvenser av naturlig eller kunstig opprinnelse og særlig genomisk DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridsekvenser eller syntetiske eller semisyntetiske sekvenser. Disse nukleinsyrer kan være av human, animalsk, vegetabilsk, bakteriell, viral eller annen opprinnelse. De omfatter fortrinnsvis et terapeutisk gen.

Oppfinnelsen angår også et farmasøytisk preparat som karakteriseres ved at det inneholder en forbindelse ifølge krav 1, et nøytralt lipid og en nukleinsyre.

Fortrinnsvis er denne nukleinsyre enten en desoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre. I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen omfatter nukleinsyren et terapeutisk gen.

Ifølge oppfinnelsen mener man med terapeutisk gen ethvert gen som koder for et proteinprodukt som har en terapeutisk effekt. Det således kodede proteinprodukt kan være et protein, et peptid, og så videre. Dette proteinprodukt kan være homologt vis å vis målcellen (det vil si et produkt som vanligvis uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfellet tillater ekspresjonen av et protein, for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon av et inaktivt eller lite aktivt protein på grunn av en modifikasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for mutant av et cellulært protein med en øket stabilitet, modifisert aktivitet, og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være heterologt vis å vis målcellen. I dette tilfellet kan for eksempel et eksprimert protein komplettere eller tilveiebringe en defektiv aktivitet i cellen som tillater den å kjempe mot en patologi, eller å stimulere en immunitær respons.

Blant de terapeutiske produkter innenfor rammen av oppfinnelsen kan man særlig nevne enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TFN, og så videre (FR 9203120), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, de trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, og så videre, dystrofin eller et minidystrofin (FR 9111947), proteinet CTFR forbundet med mukoviskidose, tumorsuppressorgener: p53, Rb, Rap IA, DCC, k-rev, og så videre, (FR 9204745), gener som koder for en av faktorene som er implikert i koaguleringen: faktorene VII, VIII, DC, gener som inter-venerer i reparering av DNA, selvmordsgener (thymidinkinase, cytosindeaminase), gener av hemoglobin eller andre proteintransportører, gener som tilsvarer proteiner implikert i lipidmetabolismen, apolipoproteintypen valgt blant apolipoproteinene A-I, A-H, A-IV, B, C-I, C-E, C-HI, D, E, F, G, H, J og apo(a), metabolismeenzymer som for eksempel lipoproteinet lipase, hepatisk lipase, lecitinkolesterolacyltransferase, 7a-kolesterolhydroksylase, fosfatidinsyrefosfatase, eller også proteiner for overføring av lipider som overføringsproteinet for estere av kolesterol og overføringsproteinet for fosfolipider, et bindingsprotein for HDL eller også en reseptor valgt for eksempel blant LDL-reseptorene, chylomikronrester og renholdsreseptorer, og så videre.

Den terapeutiske nukleinsyre kan likeledes være et gen eller en antiretningssekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulære mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel være transkribert i målcellen til RNA som er komplementær med cellulær mRNA og således blokkere dets traduksjon til protein, ifølge den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. De terapeutiske gener omfatter likeledes sekvenser som koder for ribozymer, som er i stand selektivt å destruere mål-RNA (EP 321 201).

Som antydet ovenfor kan nukleinsyren likeledes omfatte et eller flere gener som koder for et antigenisk peptid i stand til hos mennesker eller dyr å generere en immunrespons. I denne særlige utførelsesform tillater oppfinnelsen således å tilveiebringe enten vaksiner eller immunoterapeutiske behandlinger som kan anvendes på mennesker eller dyr, særlig mot mikroorganismer, vimser eller cancere. Det kan særlig dreie seg om spesifikke, antigeniske peptider for Epstein-Barr-virusen, HIV-virusen, hepatitt-B-virusen (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirusen, den syncytiadannende virus samt andre vimser, eller peptider som er spesifikke for tumorer (EP 259 212).

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren likeledes sekvenser som tillater ekspresjon av det terapeutiske gen og/eller genet som koder for det antigeniske peptid i den ønskede celle eller det ønskede organ. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når disse sekvenser er i stand til å funksjonere i den infekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av forskjellig opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser for eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av cellen man ønsker å infektere. Likeledes kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av en virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterene for genene EIA, MLP, CMV, RSV, og så videre. Videre kan disse ekspresjonssekvenser være modifisert ved addisjon av aktiveringssekvenser, reguleringssekvenser, og så videre. Det kan likeledes dreie seg om induktible eller repressible promotere.

Videre kan nukleinsyren likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske gen, omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens

i sekresjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens, eller en kunstig signalsekvens. Nukleinsyren kan likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt mot et særlig rom i cellen.

De kationiske lipider som beskrives ifølge oppfinnelsen og særlig BGTC og BGSC, er i stand til kompleksdannelse med DNA og representerer en alternativ fordel til de virale vektorer for overføring av nukleinsyrer av terapeutisk interesse, in vitro eller ex vivo. På grunn av de kjemiske egenskaper for guanidiniumgruppene og særlig på grunn av deres pKa-verdi, er disse kationiske lipider i stand til å beskytte DNA-molekylene mot nedbrytning på grunn av pH-variasjonen. Resultatene som vises i eksemplene viser at disse forbindelser tillater transfeksjon av tallrike cellulære typer med stor effektivitet. Transfeksjonseffektivitet avhenger særlig av forholdet kationisk lipid:DNA i de dannede komplekser. Et forhold mellom de to forbindelser som er særlig gunstig for transfeksjon, ligger i å ha 6 til 8 guanidiniumgrupper pr. fosfatgruppe i DNA.

Transfeksjonseffektiviteten for kationisk lipid:DNA-kompleksene kan videre forbedre ved tilsetning av nøytralt lipid og dannelse av kationiske liposomer. Disse liposomer dannes av et kompleks mellom det kationiske lipid og det nøytrale lipid. Disse kan velges blant:

-dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE),

-oleoyl-palmitoylfosfatidyletanolamin (POPE),

-di-stearoyl-, -palmitoyl-, -myristoylfosfatidyletanolamin,

-deres 1-3 ganger N-metylerte derivater,

-fosfatidylglyceroler,

-diacylglyceroler,

-glykosyldiacylglyceroler,

-cerebrosidene (som særlig galaktocerebrosidene),

-sfingolipidene (som særlig sfingomyelinene) og

-asialogangliosidene (som særlig asialoGMl og -GM2).

Man benytter fortrinnsvis DOPE.

Fortrinnsvis er forbindelsen ifølge oppfinnelsen og det nøytrale lipid til stede i et forhold mellom 1 og 5 og helst mellom 2 og 4. Videre er forholdet totalt lipid (forbindelse ifølge oppfinnelsen pluss nøytralt lipid):DNA fortrinnsvis valgt slik at nettoforholdet mellom de positive ladninger ligger innen 2 til 5. Særlig fordelaktig er det hvis forholdet ligger rundt 3.

Oppfinnelsen angår videre ethvert farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, et nøytralt lipid og en nukleinsyre. Fortrinnsvis er forbindelsen ifølge oppfinnelsen valgt blant BGTC og BGSC.

I tillegg er fortrinnsvis det nøytrale lipid DOPE. Nukleinsyren er enten en desoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre. Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren et terapeutisk gen.

I tillegg til denne anvendelse av de krevede amidiniumderivater er det likeledes mulig å ta sikte på deres valorisering ved følgende anvendelser: interferens hva angår inter-aksjoner mellom nukleinsyrer og proteiner som resulterer i en inhibering eller stimu-lering av visse prosesser, for eksempel regulering av den genetiske ekspresjon eller enzymatiske aktivitet (polymerase, transkriptase, og så videre), selektiv kompleksdannelse med anioniske specier for deres ekstraksjon, eliminering eller detektering ved hjelp av sonder/elektroder med membran, anvendelse som laboratoirereaktant for å effektuere transfeksjonsoperasjoner in vitro, og så videre.

Som følge av dette angår foreliggende oppfinnelse også enhver terapeutisk anvendelse av amidiniumderivatene som beskrevet ovenfor, enten direkte eller i farmasøytiske preparater.

Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen også en bærer som er farmasøytisk akseptabel for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte i det ønskede organ, eller for en administrering ad topisk vei (på huden og/eller slimhinnen). Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørre preparater, særlig lyofiliserte slike, som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysio-logisk serum tillater konstituering av injiserbare oppløsninger.

Foreliggende oppfinnelse skal forklares nærmere ved hjelp av de følgende illustrerende eksempler med de dertil hørende figurer.

I figurene er:

figur 1 en skjematisk representasjon av en arbeidsprotokoll for fremstilling av BGSC og BGTC.

figur 2 en skjematisk representasjon for arbeidsprotokoller for fremstilling av BADC.

figur 3 en illustrasjon av målinger på transfeksjonseffektiviteten som funksjon av forholdet lipidisk forbindelse:DNA.

figur 4 resultater av målinger på transfeksjonseffektiviteten som funksjon av forholdet totale lipider:DNA.

figur 5 viser måling av serumeffektiviteten på transfeksjonseffektiviteten for cellene HepG2 (5 A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) og 293 (5D). Grå søyler: nærvær av serum; tomme søyler: transfeksjoner i fravær av serum i 2 timer.

figur 6 viser fotografi av kryoseksjoner av murine struper som viser ekspresjonen av rapportørgenet i epiteliet i åndedrettsapparatet efter transfeksjon in vivo med liposomene BGTC:DOPE. (6A) og (6B): Deteksjon av ekspresjonen av B-galaktosidase i transfekterte celler, lokalisert ved overflaten epitelium (6A) og de mukosale kjertler (6B); (6C): Deteksjon av celler som eksprimerer B-galaktosidase i de undermukosale kjertler ved markering med immunoperoksydase under anvendelse av et monoklonalt anti-6-galaktosidase-antistoff; (6D): Detektering av celler som eksprimerer luciferase i dé submukale kjertler ved markering med immunoperoksydase under anvendelse av et polyklonalt anti-

luciferase-antistoff; (6E): Farving med immunoperoksydase: negativ kontroll gjennomført i fravær av antistoff.

figur 7 viser målinger av effektiviteten av overføring av gener in vivo ved intravenøs injeksjon av et DNA:BGTC-liposomkompleks.

figur 8 viser måling av effektiviteten av overføringen av gener in vivo ved intraperitoneal injeksjon av et DNA:BGTC-liposomkompleks.

A - FREMSTILLING AV DERIVATER IFØLGE OPPFINNELSEN

MATERIELL OG METODER

1. Fysiske målinger

2. Kromatografi på silikagel

Tynnsjiktskromatografi ( TLC)

TLC ble gjennomført på 0,2 mm tykke silikagelplater fra Merck.

Kolonnekromatografi

Kolonnekromatografi ble gjennomført på silikagel 60 fra Merck med en partikkel-størrelse på 0,040-0,063 mm.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av guanidinospermidinkolesterol ( BGSC)

1. Fremstilling av di-Boc-karbamat (1)

En oppløsning av kolesterylklorformat (0,9 g, 2 mmol) og Et3N (0,214 g, 2 mmol) samt 40 ml CH2CI2 ble satt til en oppløsning av <1>N,<8>N-Boc2-spermidin (0,690 g, 2 mmol) i 20 ml CH2CI2. Efter 5 timers tilbakeløpskoking ble oppløsningen vasket med 2 x 50 ml H2O, tørket med Na2S04 og dampet inn. Råproduktet renses ved kromatografi på silikagel med CH^C^MeOH, 95:5, som elueringsmiddel, hvorved man oppnådde det rene karbamat (1,3 g, 86%).

'H-NMR 5 (CDCI3, 200 MHz): 0,5-2,5 (m, kolesterylstruktur, Boc-signal og sentrale CH2-grupper fra spermidinet), 3,1-3,3 (m, 8H, N-CH2), 4,50 (m, 1H, H3a),5,37(d, 1H,H6).

2. Fremstilling av aminokarbamat (2)

Man oppløser (1) (1,3 g) i 20 ml CH2C12 og setter 2 ml nydestillert CF3C02H til denne avkjølte oppløsning (isseng) for å fjernet Boc-beskyttelsesgruppene. Efter 3 timers om-røring ved romtemperatur tilsettes 50 ml IN NaOH og blandingen ekstraheres med CH2C12. De organiske faser vaskes med vann, tørkes med Na2S04 og dampes, hvorved man oppnår det urene aminokarbamat (2) (0,945 g, 98%).

'H-NMR 8 (CDCI3, 200 MHz): 0,5-2,5 (m, kolesterylstruktur og sentrale CH2-grupper fra spermidinet), 2,7 (m, 4H, CH2-N-CO-), 3,25 (bred m, 4H, N-CH2), 4,49 (m, 1H, H3a), 5,35 (d, 1H, H6).

i 3. Syntese av BGSC

Man oppløser det urene karbamat (2) (0,94 g) i 30 ml THF:MeOH, 85:15. Deretter tilsetter man lH-pyrazolkarboksamidin (0,495 g, 3,4 mmol) og diisopropyletylamin (0,436 g, 3,4 mmol) i 30 ml THF:MeOH, 85:15. Efter 18 timers omrøring ved romtemperatur tilsettes langsomt 250 ml Et20 og man dekanterer det dannede precipitat. Den urene forbindelse suspenderes i dietyleter og dekanteres, noe som gir GSC (0,570 g, 47%).

'H-NMR 5 (DMSO, d6, 200 MHz): 0,5-2,5 (m, kolesterylstruktur og sentral CH2-gruppe), 3,1 (m, 8H, N-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 7,2 (bred s, 8H, NH2<+>), 7,8 (s, 2H, NH).

Elementanalyse for C^HeTNA • 2HC1:

EKSEMPEL 2

Syntese av guanidinotrenkolesteroh BGTC

1. Fremstilling av aminokarbamat (5)

Til en mettet oppløsning av tris(2-aminoetyl)amin (TREN) (11,68 g, 80 mmol) i 400 ml CH2C12 settes langsomt en oppløsning av kolesterylklorformat (1,8 g, 4 mmol) i 100 ml CH2CI2. Efter omrøring i 2 timer ved romtemperatur frigjøres det inerte amin ved vasking med 3 x 100 ml vann og efter tørking over Na2S04 dampes oppløsningen inn. Man isolerer (5) i form av trihydroklorid på følgende måte: Man oppløser råproduktet i 10 ml MeOH og setter denne oppløsning dråpevis til 5 ml av en mettet metanoloppløs-ning av HC1; den oppnådde utfelling separeres ved dekantering. For å oppnå en ren forbindelse må fellingen fortsette i metanolsuspensjon (3 ganger) og separeres ved dekantering. Efter vakuumtørking oppnås det rene trihydroklorid (6) (1,71 g, 64%).

'H-NMR 5 (CDCI3 + sCD3OD, 200 MHz): 0,5-2,4 (m, kolesterylstruktur), 2,5 (m, 2H, CH2NHCO), 2,8 (bred s, 4H, <+>HN-CH2), 3,06 (bred s, 4H, CH2NH3<+>), 3,20 (m, 2H, ^HN-CH2), 4,4 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6).

Elementanalyse for C34H62N402 • 3HC1:

2. Fremstilling av BGTC

Man setter langsomt en oppløsning av kolesterylklorformat (2,24 g, 5 mmol) i 100 ml CH2CI2 til en mettet oppløsning av tri(2-aminoetyl)amin (TREN) (29,2 g, 200 mmol) i 250 ml CH2CI2. Efter omrøring i 2 timer ved romtemperatur frigjøres det inerte amin ved vasking med 3 x 100 ml vann og efter tørking over Na2SC>4 dampes oppløsningen inn. Råproduktet (3,2 g) oppløses i 20 ml THF:MeOH, 50:50. Deretter tilsettes 1H-pyrazol-l-karboksimidin (1,465 g, 10 mmol) og diisopropylamin (1,3 g, 10 mmol). Efter omrøring i 2 timer ved romtemperatur tilsettes dietyleter og det oppnådde precipitat separeres ved dekantering. For å oppnå en ren prøve fortsettes fellingen i suspensjon i dietyleter (3 ganger), separeres ved dekantering og tørkes under vakuum (2,15 g, 60%).

'H-NMR 6 (DMSO, d6, 200 MHz): 0,5-2 (m, kolesterylstruktur), 2,2 (m, 2H, N-CH2), 2,6 (bred s, 4H, N-CH2), 3,0 (d,2H, N-CH2), 3,2 (bred s, 4H), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 7,3 (bred s, 8H, NH2<+>), 7,8 (s, 2H, NH).

Elementanalyse for C36H66N8O2 • 2HC1:

EKSEMPEL 3

Fremstilling av bis- hydrokloridet av bis- amidinium ( BACD)

Fremstilling av dinitril

Man setter dråpevis en oppløsning av kolesterylklorformat (8,97 g, 20 mmol) i 100 ml CH2CI2 til en oppløsning av iminopropionitril (2,46 g, 20 mmol) og Et3N (2,02 g, 20 mmol) i 100 ml CH2CI2. Efter omrøring i 6 timer ved romtemperatur vaskes oppløs-ningen med 2 x 100 ml vann og efter tørking over Na2SC>4 dampes oppløsningen inn. Råproduktet (10,5 g) omkrystalliseres fra metanol (8,59 g, 80%).

•H-NMR 8 (CDCI3, 200 MHz): 0,5-2,5 (m, kolesterylstruktur), 2,7 (m, 4H, -CH2CN), 3,62 (m, 4H, -CH2-N-), 4,50 (m, 1H, H3a), 5,39 (d, 1H, H6).

2. Fremstilling av ditioamid

I en oppløsning av dinitril (0,324 g, 6 mmol) (fremstilt som beskrevet ovenfor) og dietylamin (0,884 g, 12 mmol) i 30 ml DMF, holdt ved 50°C, bobler man gjennom en svak strøm av H2S. Man heller den blå oppløsning på is og separerer det således oppnådde precipitat ved filtrering. Man oppløser råproduktet i CH2Cl2 og vasker med 2 x 50 ml vann. Efter tørking over Na2S04, fordampes oppløsningsmidlet og det oppnådde produkt omkrystalliseres 2 ganger fra metanol (1,86 g, 51,5%).

'H-NMR 8 (DMSO, d6, 200 MHz): 0,5-2,5 (m, kolesterylstruktur), 2,67 (t, 4H, N-CH2), 3,50 (t, 4H, S=C-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,33 (d, 1H, H6).

3. Fremstilling av bisiodidet av ditioamidat

Til en oppløsning av ditioamid (0,603 g, 1 mmol) i 20 ml aceton settes 2 ml metyliodid og man lar dette stå ved romtemperatur i 48 timer. Man filtrerer det oppnådde precipitat (0,741 g, 83,5%). Dette produktet benyttes direkte uten ytterligere rensing.

4. Fremstilling av bis-hydrokloridet av bis-amidinium (BADC)

I en suspensjon under tilbakeløp av bis-iodidet (0,741 g, 83 mmol) som oppnådd ovenfor i 10 ml isopropanol, bobler man en strøm av NH3 i 2 timer og deretter fortsetter man oppvarmingen under tilbakeløp i 4 ytterligere timer. Man fordampes isopropanolen og resten tas opp i 10 ml metanol. Efter føring av denne oppløsning over en basisk ione-bytteharpiks, leder man gjennom en strøm av saltsyre i oppløsningsmidlet og fordamper til tørr tilstand. Bis-hydroksykloridet som oppnås på denne måte oppnås i en minimal mengde etanol (rundt 5 ml). Man filtrerer et lett, uoppløselig materiale og setter et stort

overskudd av dietyleter til filtratet. Man oppnår et pulver som filtreres og tørkes (320 mg, 60%). En omkrystallisering fra isopropanol tillater å isolere det ønskede produkt i en analytisk ren form.

<!>H-NMR 5 (DMSO, d6, 200 MHz): 0,5-2,6 (m, kolesterylstruktur og CH2-amidinium),

3,57 (bred s, 4H, N-CH2-), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 8,64 (bred s, 2, NH2), 9,07 (bred s, 1H, NH), 9,18 (bred s, 2H).

Elementanalyse for C34H56N4O2 • 2HC1:

B - ANVENDELSE AV DERIVATENE IFØLGE OPPFINNELSEN FOR OVERFØRING AV GENER IN VITRO OG IN VIVO

MATERIALER OG METODER

1. Transfeksjonsforsøkene ble utført med BGSC og BGTC, fremstilt i henhold til de protokoller som er beskrevet i eksemplene 1 og 2.

2. Fremstilling av liposomer

En blanding av kationisk lipid og DOPE (i et molforhold lik 3:2) i kloroform (CHC13)

fordampes under undertrykk og tas opp i suspensjon i en oppløsning av HEPES-buffer, 20 mM, ved pH 7,4 under en N2-atmosfære. Sluttkonsentrasjonen av lipid er 1,2 mg/ml. Blandingen omrøres med et vortex-apparat i 5 minutter og sonikeres så i 5 minutter med en sonikator (Branson Ultrasonic 2210) og settes så hen ved +4°C i 24 timer for hydra-tisering.

Den resulterende suspensjon sonikeres på ny (Sonifier Branson 450) i 5-10 minutter for å danne liposomene.

Efter sentrifugering blir oppløsningen filtrert på et filter med porediameter 0,22 u (Millex GS, Millipore) og settes hen ved 4°C.

Størrelsen på liposomene inneholdende BGSC eller BGTC studeres ved hjelp av et laserdiffraksjonsapparat (Autosizer 4700, Malvem Instruments). Denne studie viser en unik topp tilsvarende en midlere diameter på 50 nm ved numerisk multimodal analyse.

3. Cellekulturer

Opprinnelsen (art og vev) for de fleste cellelinjer som benyttes for transfeksjons-forsøkene er gitt i tabell I. Celler av cellelinjen HeLa (P. Briand, ICGM, Paris) avledes fra en human karsinom av cervikal epitelial opprinnelse.

Cellene NTH 3T3 (C. Lagrou, Institut Pasteur, Lille) er musefibroblaster.

Cellelinje NB2A (C. Gouget, Paris) stammer fra en museneuroblastom.

Alle cellene bortsett fra cellene AtT-20 og PC 12 var dyrket i et modifisert Dulbecco-medium (DMEM, Gibco), komplettert med 10% føtalt kalveserum (GCS, Gibco), penicillin 100 enheter/ml (Gibco) og streptomycin 100 ug/ml (Gibco).

Cellene AtT-20 var dyrket i DMEM/F12 (Gibco) komplettert med 10% føtalt kalveserum.

Cellene PC 12 var dyrket i DMEM som var komplettert med 10% FCS og 5% heste-serum.

Alle cellene ble holdt i kultur i plastskåler (Falcon) under en fuktig atmosfære med 5% C02.

4. Plasmider

Plasmidene pRSV-Luc (O. Bensaude, ENS, Paris) og pRSV-nlsLacZ forsterkes i E. coli og prepareres ved rensing med en CsCl-gradient ved standardteknikker. I plasmidet pRSV-nlsLacZ og plasmidet pRSV-Luc er genet LacZ av E. coli og dets signalsekvens for lokalisering av kjernen henholdsvis luciferasegenet under transkripsjonen kontroll av LTR/RSV (Rous Sarkomvirus). Plasmidet pXL2774 bærer det gen som koder for luciferasen under kontroll av promoteren fra cytomegalovirus (CMV).

5. Transfeksjonsprotokoll in vitro

Dagen før transfeksjonen blir 2 x IO<5> celler avsatt i hver brønn (plater med 6 brønner, Falcon). Hver brønn inneholder en annen cellelinje.

På transfeksjonsdagen er halvparten av cellene konfluente.

5 ug plasmidisk DNA og den ønskede mengde av bis-guanidiniumlipid blir begge for-tynnet i 250 ul DMEM uten FCS og rystet i et vortex-apparat. Efter ca. 5 minutter lar man de to oppløsninger inkuberes ved omgivelsestemperatur i 15 minutter. Transfeksjonsblandingen settes så til celler (0,5 ml pr. brønn) som er vasket med et medium uten serum. Efter 4 til 6 timers inkubering ved 37°C blir 1 ml medium uten serum satt til hver brønn uten at man fjernet transfeksjonsblanding. 24 timer efter transfeksjon blir mediet erstattet med 1 ml frisk kulturmedium. Cellene gjenvinnes 2 dager efter transfeksjonen for å måle ekspresjonen av luciferasen.

Sammenligningstransfeksjoner gjennomføres under anvendelse av kommersielt til-gjengelige transfeksjonsmidler: - lipopolyamin Transfectam® (J.P. Behr. Strasbourg, Frankrike) benyttes i alkoholisk oppløsning i et optimalt ioneladningsforhold Transfectam® :DNA på 6-8. - Lipofectin® (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, Frankrike) som er en liposom-formulering som som nøytralt lipid har DOPE og som kationisk lipid har DOTMA (N-[ 1 -(2,3-dioleyloksy)propyl]-N,N,N-trimetylammomumklorid).

Kompleksene DNA:liposomer oppnås under de standardbetingelser som er anbefalt av fabrikanten.

Cellene transfekteres ved precipitering fra kalsiumfosfat (W.A. Keown, CR. Campbell, R.S. Kucherlapati (1990), "Methods in Enzymology", Academic Press, New York, 185, 527-537). 6. Måling av luciferase for transfeksjoner gjennomført in vitro Luciferase-aktiviteten måles 48 timer efter transfeksjon under anvendelse av en variant av prosedyren ifølge De Wet et al. (J.R. De Wet, K.V. Wood, M. DeLuca, D.R. Helinski 6 S. Subramani (1987), "Mol. Cell. Biol.", 7, 725-737).

- man trekker av kulturmediet

- cellene vaskes med en kold fosfatsaltbufferoppløsning

- deretter lyseres cellene ved inkubering i 250 ul lyseringsbuffer (25 mM trifosfat, pH 7,8, 8 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 15% glycerol, 1% Triton X-100).

- efter eliminering av uoppløst materiale ved hjelp av sentrifugering i en mikrosentri-fuge (15 minutter ved 4°C), oppnår man et klart lysat,

- 20 ul cellulær ekstrakt fortynnes med 100 ul lyseringsbuffer, hvor til man setter 9 ul ATP (25 mM, Sigma) og 20 ul luciferin (25 ul, Sigma),

- prøvene anbringes i et luminometer (Lurnet LB9501 Berthold, Nashua, NH) og man måler lysemisjonen i løpet av 10 sekunder,

- hvoretter kalibrering av RLU-luciferase-kurven utføres ved at man anvender forskjellige fortynninger av luciferase fra renset luciol (Sigma), noe som viste at den lineære del av kurven gikk fra IO<4> til IO7 RLU (relative lysenheter),

- proteinkonsentrasjonen måles via BCA-test (bicinkoninsyre) ved å anvende BSA (bovinserum albumin) som kontroll.

Luciferase-aktiviteten uttrykkes i RLU/mg protein.

7. Protokoll for injeksjon in vivo i luftveiene hos mus

Musene som ble benyttet var OFl-hannmus med kroppsvekt 30 g, fra Iffa-Credo (Lyon, Frankrike). De kationiske liposomer BGTC:DOPE (molforhold 3:2) anvendes. Transfeksjonsblandingen oppnås fra 10 ug plasmidisk DNA (i 10 p.1 vann), 20 ul kationiske liposomer i et 20 mM Ffepes-medium (pH 7,4), ved en total lipidkonsentrasjon på 5

mg/ml. Aggregatene DNA:lipid som dannes på denne måte har et ladningsforhold i størrelsesorden 6.

Efter bedøvning av musene med pentobartital, injiseres transfeksjonsblandingen (30 ul) i åndedrettsveiene ved intratrakeal installering via en kanyle, innført i den trakeale lumen. 48 timer efter installering avlives dyrene med en overdose av pentobarbital og lunger og luftrør fjernes for analyse.

8. Farving med X-gal

For å bestemme ekspresjonen av 8-galaktosidase av E. coli i primærkulturene impreg-nerer man cellene i 15 minutter ved 4°C med en 4 %-ig paraformaldehydoppløsning og inkuberer dem deretter med X-gal fra det kromogene 6-galaktosidasesubstrat (Sigma).

Blåfarvingen av cellekjernene hos de transfekterte celler bestemmes ved luminescens-mikroskopi.

9. Bestemmelse av X-gal-celler som er transfektert in vivo i luftveiene For å kunne detektere X-gal i luftveiene behandles lungene og luftrøret i 1 time med en 4 %-ig p-formaldehydoppløsning og legges deretter hen over natten i PBS inneholdende 30% sucrose og innarbeides så i et frysemedium og fryses i flytende nitrogen. Kryostat-snitt på 5 u farves deretter for å bestemme B-galaktosidase-aktiviteten ved inkubering en hel natt med X-gal-reaktant (Sigma).

10. Bestemmelse av luciferasen i luftveiene, transfektert in vivo For å bestemme luciferase-aktiviteten efter transfeksjon in vivo, blir vevfragmenter bragt i nærvær av 30 ul lyseringsbuffer (Tris-fosfat, 25 mM, pH 7,8; ditiotreitol, 1 mM; 15% glycerol; og 1% Triton X-100), lyseres i ca. 1 minutt med en homogenisator (Polylabo, Strasbourg, Frankrike) og oppbevares på is. Efter sentrifugering benyttes 20 ul lysat for bestemmelsen. Luciferase-aktiviteten uttrykkes i RLU/mg protein.

11. Immunohistokjemisk protokoll

Kryosnitt av lunge- og luftveisprøver inkuberes i 1 time med enten monoklonale anti-fl-galaktosidase (E. coli) muse-antistoffer (5 ug/ml, Genzyme, Cambridge, MA) eller polyklonale kanin-antistoffer (fortynning 1:400, Promega).

fi-galaktosidase-proteinet fra E. coli bestemmes ved farving med immunoperoksydase under anvendelse av et sekundært anti-Ig-antistoff fra mus, merket med biotin (Boehringer) og et streptavidin-POD-konjugat (Boehringer). Luciferase-proteinet bestemmes ved farving med immunoperoksydase under anvendelse av et anti-kanin-antistoff (ICN-Biomedicals, Inc.) og systemet peroksydase-kanin-antiperoksydase (PAP)

(Dako Glostrup, Danmark). Snittene undersøkes ved luminescens-mikroskopi. Negative kontroller utføres uten antistoff.

EKSEMPEL 4

Transfeksjon in vitro med forskjellige forhold transfeksjonsmiddel:DNA

For å optimalisere transfeksjonseffektiviteten som oppnås med aggregatene BGTC:DNA har man i tre forskjellige typer pattedyrceller, kjent for den relative følsomhet i klassiske transfeksjonsmetoder, studert innvirkningen av BGTC:DNA-forholdet på transfeksjonsgraden. Resultatene er vist i figur 3.

Transfeksjonsforsøkene gjennomføres med muse-fibroblaster 3T3, humane HeLa-epitelialceller og muse-neuroblastomer NB2A. Under forsøkene satte man en bestemt mengde pRSV-Luc-plasmid til varierende mengder BGTC i oppløsning. For å bestemme variasjonsbredden for det studerte forhold gikk man ut fra prinsippet at 1 ug DNA tilsvarte 3 ng negativt ladet fosfat og at kun to guanidiniumgrupper er positivt ladet ved nøytral pH-verdi ved aggregatdannelse og transfeksjon. Man målte luciferase-aktiviteten 48 timer efter transfeksjon. Ekspresjonen av luciferase er maksimal for aggregater inneholdende 6 (HeLa-celler) til 8 (3T3-, NB2A-celler) guanidiniumgrupper pr. fosfatgruppe i DNA, det vil si for aggregater med stor positiv ladning.

EKSEMPEL 5

Transfeksjon in vitro med forskjellige celletyper

Overføring av ved hjelp av kationiske lipider er en attraktiv transfeksjonsmetode, ikke bare på grunn av det faktum at den ikke krever at man går via noe mellomprodukt, men

i også fordi den mulige transfeksjon har meget forskjellige vevcelletyper og forskjellige organismer. For å studere utstrekningen av effektiviteten av BGTC som transfeksjons-middel, ble det prøvet forskjellige cellelinjer av forskjellig opprinnelse. Resultatene er vist i tabell 1. Ladningsforholdet ble valgt til mellom 6 og 8 for å oppnå maksimal effektivitet. For å kunne sammenligne forskjellige reagenser transfekterte man også celler fra samme cellelinje ved å anvende delvis et lipopolyamin og delvis kalsiumfosfat. Resultatene viser at BGTC vanligvis er like effektiv som Transfectam® og dobbelt så effektiv som kalsiumfosfat.

EKSEMPEL 6

Transfeksjon in vitro i nærvær av et nøytralt lipid

Da forbindelsen BGSC er mindre oppløselig i vannmedium enn BGTC, har man anvendt den første i form av liposomer i nærvær av et nøytralt lipid DOPE (dioleoylfosfatidyletanolamin). Preparatene ble fremstilt i et molforhold på 3:2. Et andre preparat, denne gang inneholdende BGTC, ble også tildannet med DOPE og under de samme forhold.

6.1 Bestemmelse av forholdet totalt lipid:DNA

Man bestemte først forholdet mellom totalt lipid og DNA ved hjelp av et transfeksjons-forsøk på HeLa-celler. Den oppnådde kurve er vist i figur 4. Optima for transfeksjonen ble oppnådd ved BGSC:DNA-forhold i intervallet 1,5 til 5 méd sentrum rundt 2,5 til 3. Da guanidiniumgruppene er protonert ved nøytral pH-verdi, har de beste BGSC-DOPE-DNA-aggregater en positiv ladning rundt 3 (figur 4).

De beste BGSC-DOPE-DNA-forhold er altså lavere enn de som oppnås med aggregater av typen BGTC-DNA (6-8). Transfeksjonen i nærvær av kationiske liposomer lettes ved nærvær av DOPE og dennes fusjonsegenskaper.

6.2 Transfeksjon av forskjellige cellelinjer ved hjelp av kationiske liposomer Man har gjennomført transfeksjonsforsøk i forskjellige cellelinjer ved å anvende preparater av de kationiske liposomer BGSC-DOPE og BGTC-DOPE i molare forhold på 3:2. Forholdet mellom lipidenes guanidiniumladninger og DNA-fosfatladningene er ca. 2,5 (« 3) for disse to genoverføringssystemer. En transfeksjon med Lipofectin® fungerte som kontroll. Resultatene er vist i tabell 2. Disse resultater viser at kolesterolderivatet som har guanidiniumgrupper i form av kationiske liposomer er minst like effektive for

transfeksjon som Lipofectin®. Disse resultater kan naturligvis optimeres for hver cellelinje.

EKSEMPEL 7

Studiet av virkningen av nærværet av serumproteiner på genoverførings-aktiviteten in vitro

De fleste transfeksjonsblandinger basert på kationiske lipider viser en synkende effektivitet ved nærvær av serum. Dette eksempel har til hensikt å prøve følsomheten overfor serum hos forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

7.1 Preparater av kationiske lipider

Lipidene ifølge oppfinnelsen oppløses i etanol.

i) Liposomoppløsninger oppnås i nærvær av DOPE som følger:

DOPE (Avanti) i kloroformoppløsning settes til lipidoppløsninger i etanol i et molforhold kationisk lipid:DOPE på 3:2. Efter inndamping til tørr tilstand tilsettes vann og blandingen oppvarmes til 50°C i 30 minutter.

ii) Micelloppløsninger oppnås ved å følge den protokoll som er beskrevet for oppnåelse

av liposomer, men der DOPE-oppløsningen erstattes med kloroform.

Alle oppløsninger justeres til 10 mM med henblikk på kationisk lipid.

7.2 Nukleinsyre

Den nukleinsyre som anvendes var plasmidet pXL2774.

7.3 Celleinfekterte blandinger (øyeblikkelig tilberedning)

DNA fortynnes til 20 ug/ml i 150 mM NaCl og de forskjellige preparater av kationisk

lipid fortynnes med vann til 40, 80,120 og 160 uM. Like store volumer av DNA-oppløsningene og lipidoppløsningene blandes slik at forholdet nmol lipiding DNA blir 2, 4, 6 henholdsvis 8. Saltkonsentrasjonen er 75 mM.

7.4 Transfeksjoner

Cellene dyrkes under egnede forhold på mikrotiterplater med 24 brønner (2 cmVbrønn) og transfekteres når de er i eksponensiell vekstfase og oppviser 50-70% konfluens. Cellene vaskes med 2 x 500 ul medium uten serumproteiner og får igjen vokse enten i medium uten serum (transfeksjon i fravær av serum), eller i komplett medium (transfeksjon i nærvær av serum), hvoretter 50 ul cytofektantblanding (0,5 ug DNA/brønn) settes til cellene (3 brønner pr. lipid:DNA-forhold).

Når cellene transfekteres i fravær av serum, kompletteres vekstmediet 2 timer efter transfeksjonen med en egnet mengde serum.

Transfeksjonseffektiviteten vurderes ved måling av luciferase-ekspresjonen ifølge de anbefalinger som er gitt av brukeren for Promega-satsen (Luciferase Assay System). Toksisiteten hos de cytofektante blandinger bestemmes ved en måling av protein-konsentrasjonene i cellelysatene.

7.5 Resultater (figur 5)

Resultater oppnådd fra 4 celletyper (NIH 3T3, 293, HepG2 og HeLa) viser at, under de prøvede betingelser, er formuleringer i form av "liposomer" mere effektive enn celler i form av "miceller". Forøvrig og i motsetning til det som er observert med det største antall av celle-infekterte preparater inneholdende kationiske lipider, kan man ikke påvise noen signifikant inhiberingseffektivitet knyttet til nærværet av serum under disse transfeksjonsforhold for BGTC i liposomform eller micellform.

EKSEMPEL 8

Transgenekspresion in vivo inn i luftveiene hos mus ved hjelp av BGTC- DOPE-liposomer

For å gjøre dette har man benyttet de kationiske BGTC-DOPE-liposomer. Fremstilling og administrering av DNA-liposom-aggregat beskrives under rubrikken "Materiell og metoder".

X-gal-cellene detekteres i epitelet i luftveiene hos behandlede mus 48 timer efter transfeksjonen av cellene med LacZ-plasmidet ved hjelp av BGTC-DOPE-liposomer. Resultatene er vist i figur 6.

Hoveddelen av de transfekterte celler befant seg i strupen, mens noen X-gal-celler ble observert i de sekundære luftveier. Denne type fordeling er allerede rapportert ved andre celletransfeksj oner.

Man har dessuten gjennomført en immunohistokjemi for å identifisere produktet av det overførte gen. For det meste er det modne celler som transfekteres i overflaten på epitelet (figur 6A). Disse fakta viser at kationiske liposomer er i stand til å indusere gentransfeksjon i ikke-prolifererende og helt differensierte celler i epitelet i luftveiene.

Transgenekspresjonen detekteres også i de nedre slimkjertler (figur 6B). Deteksjon med immunologisk merking av transfekterte celler ved å anvende et monoklonalt antistoff rettet mot B-galaktosidase (E. coli) bekrefter denne ekspresjonen i de nedre slimkjertler og i epitelet (figur 6C). Den transgene i de nedre slimkjertler bevises også ved farving med immunoperoksydase, med et antistoff rettet mot luciferaseproteinet efter transfeksjon av pRSV-Luc med BGTC-DOPE (figur 6D).

Negative kontroller ble gjennomført uten antistoff (figur 6E).

Disse resultater er av helt spesiell interesse for genterapi rettet mot muskovidose. For å behandle denne patologi, er det således nødvendig å sikte seg inn på de nedre slimkjertler som er hovedsetet for CFTR-ekspresjonen i bronkiene hos mennesker.

EKSEMPEL 9

Kvantitativ bestemmelse av transfeksjonseffektiviteten av BGTC- DOPE in vivo For å gjøre dette tar man, 48 timer efter transfeksjonen, ut lunge og luftstrupen fra mus som har vært behandlet med BGTC-DOPE-liposomer og pRSV-Luc-plasmid under forhold som beskrevet i eksempel 8. Luciferase-aktiviteten bestemmes ifølge proto-kollen som beskrevet under "Materiell og metoder". Resultatene er oppført i tabell 3.

Luciferase-aktiviteten detekteres på systematisk måte i de homogeniserte biter fra strupen, men ikke i de fra lungene. Denne observasjon stemmer overens med de resultater som tidligere er oppnådd ved undersøkelse av fordelingen av X-gal-positive celler. Man kan merke seg at luciferase-ekspresjonen er direkte koblet til plasmidekspr esj onen ettersom ingen aktivitet har kunnet detekteres i kontroller inneholdende LacZ-plasmid. For kontroll har man også transfektert et plasmid uten vektor. Man har i denne forsøks-kontroll ikke observert noen luciferase-ekspresjon.

Dette viser effektiviteten hos BGTC-DOPE-liposomer ved gentransfeksjon in vivo i luftveiene.

EKSEMPEL 10

Genoverføring in vivo via intravenøs eller intraperitoneal injeksjon

Preparatene av de kationiske lipider og DNA er beskrevet i eksempel 7.

10.1 Virkningen av størrelsen av dosen av kationisk lipid (figur 7-8)

5 uker gamle BalbC-mus ble injisert intravenøst (i halevenen) eller intraperitonealt med 200 ul transfeksjonsblanding i oppløsning (NaCl 37,5 mM; glucose, 5%) og luciferase-ekspresjonen ble undersøkt 24 timer efter transfeksjon, i lungen efter intravenøs injeksjon og i lever og milt efter intraperitoneal injeksjon. Organene tas ut under kalde forhold i lyseringsbuffer (Promega El53A) hvor til det er satt proteaseinhibitor (Boehringer 1697498) og det hele homogeniseres med en Heidolph DIAX600-opp-malingsapparatur. Luciferase-aktiviteten undersøkes i supernatanten efter sentrifugering i 14000g av vevekstraktene.

Intravenøs injeksjon

Hver mus mottar 50 ug DNA som er kompleksa"annet med forskjellige konsentrasjoner av BGTC i form av "liposomer". Det optimale forhold nmol kationisk lipid:funnet ug DNA er 9 (figur 7); ingen toksisitet kunne påvises ved doser helt opp til 900 nmol injisert BGTC.

Intraperitoneal injeksjon

BGTC i "liposomform" injiseres med 100 ug DNA pr. mus. På samme måte i leveren (figur 8B) som i milten (figur 8A) oppnås den maksimale ekspresjon for en 1,5 nmol BGTC pr. ug DNA.

10.2 Genetisk ekspresjon efter intravenøs injeksjon

Man har undersøkt biofordelingen av ekspresjonen av luciferase i syv organer som

f funksjon av tiden efter injeksjon av 200 ul blanding av "liposom" BGTC:DNA i NaCl 37,5 mM glucose 5% (50 ug DNA og 9 nmol BGTC pr. ug DNA) i halevenen på

BalbC-mus med en alder på 5 uker. Resultatene er uttrykt i pikogram luciferase-ekstrakt

pr. organ og følger en kalibreringskurve som opprettes med kommersielt tilgjengelig luciferase i krystallinsk form. Detekteringsgrensen ligger mellom 0,5 og 1 pikogram luciferase.

Man beviser at under de prøvede forhold oppnås maksimal ekspresjon 23 timer efter transfeksjon for seks av de syv organer, nemlig diafragma, den store lukkemuskel, hjerte, lunger, nyre og milt. Tiden virker å være for kort for de samme resultater i leveren. Ekspresjonsmaksimum oppnås i lungene ved et innhold på 0,5 nanogram, 23 timer efter transfeksjon.

Claims (23)

1. Forbindelse, karakterisert ved den generelle formel (I) samt salter derav: der Ri betyr et kolesterolderivat R2 og R3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med den generelle formel (II) hvorved minst et av disse symboler har en annen betydning enn hydrogen: der n og m uavhengig av hverandre og uavhengig mellom gruppene R2 og R3 betyr et helt tall fra 0 til 4 og Rt og R5 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med den generelle formel (IH) forutsatt at minst en av R4 og R5 er forskjellig fra et hydrogenatom, og der p og q, uavhengig av hverandre, betyr et helt tall fra 0 til 4 og r er lik 0 eller 1; idet når r er lik 1, betyr X en NH-gruppe og x er lik 1 eller betyr X betyr et nitrogenatom og x er 2; hvorved symbolene p, q og r kan variere uavhengig mellom gruppene R4 og R5.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved atR2 0g R3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formel (TV) der n, m og p er definert som tidligere og R4 betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formel (V) der q og r er som angitt tidligere og m, n, p, q og r kan variere uavhengig mellom de forskjellige grupper R2 og R3.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den fortrinnsvis representeres ved en av de følgende formeler: der Ri er som angitt i krav 1.

4. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den er valgt blant [[(H2N)2<+>C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N-COO-Ri, [(H2N)2<+>C-NH-(CH2)3][(H2N)2<+>C-NH-(CH2)4]-N-COO-Ri og i [(H2N)2<+>C-(CH2)2]2N-COO-Ri der Ri betyr en kolesterylgruppe.

5. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den er bis-guanidinospermidinkolesterol (BGSC).

6. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den er bis-guanidinotrenkolesterol (BGTC).

7. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter minst en av forbindelse ifølge et av kravene 1 til 6.

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det er forbindelsen bis-guanidinospermidinkolesterol (BGSC).

9. Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det er forbindelsen bis-guanidinotrenkolesterol (BGTC).

10. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 9, karakterisert ved at det i tillegg inneholder en nukleinsyre.

11. Preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at nukleinsyren er en desoksyribonukleinsyre.

12. Preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at nukleinsyren er en ribonukleinsyre.

13. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 12, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter et terapeutisk gen.

14. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder en forbindelse ifølge krav 1, et nøytralt lipid og en nukleinsyre.

15. Farmasøytisk preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at forbindelsen er BGTC eller BGSC.

16. Farmasøytisk preparat ifølge krav 14, karakterisert v e d at det nøytrale lipid er DOPE.

17. Farmasøytisk preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at nukleinsyren er en desoksyribonukleinsyre.

18. Farmasøytisk preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at nukleinsyren er en ribonukleinsyre.

19. Farmasøytisk preparat ifølge krav Heller 18, karakterisert v e d at nukleinsyren omfatter et terapeutisk gen.

20. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 19, karakterisert ved at det inneholder en farmasøytisk bærer godtagbar for en injiserbar blanding.

21. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 19, karakterisert ved at det inneholder en farmasøytisk bærer som er godtagbar for applikasjon på hud og/eller på slimhinner.

22. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 for transfeksjon in vitro og/eller ex vivo i celler.

23. Fremgangsmåte for overføring av en nukleinsyre til celler, karakterisert ved at nukleinsyren in vitro og/eller ex vivo, bringes i kontakt med en forbindelse ifølge krav 1 og at den resulterende blanding inkuberes med cellene.