KR19990087372A - 아미디늄류 관련 화합물, 이를 함유한 약학조성물, 및 이의용도 - Google Patents
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Abstract
R1이 콜레스테롤 유도체 또는 알킬아미노-NR'R'' 그룹이고,
R2 및 R3 각각이 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 2 그룹이며,
R4 및 R5 각각이 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 3 그룹인 화학식 1의 신규 아미디늄 유도체가 기재됨. 치료 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 요법에 특히 유용한 상응하는 약학 조성물도 또한 기재됨.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
Description
[기술분야]
[배경기술]
도 1: BGSC 및 BGTC의 제조를 위한 작업 프로토콜의 개략적인 표시도.
도 2: BADC의 제조를 위한 작업 프로토콜의 개략적인 표시도.
도 3: 지질 화합물/DNA 비의 함수에 따른 형질감염 효율의 측정도.
도 4: 총 지질/DNA 비의 함수에 따른 형질감염 효율의 측정도.
도 5: HepG2(5A), HeLa(5B), NIH 3T3 (5C) 및 293(5D) 세포의 형질감염 효율에 영향을 미치는 혈청의 측정도. 빗금친 막대: 혈청 존재; 백색 막대: 혈청없이 2시간 동안 형질감염.
도 6: 생체내에서 BGTC/DOPE 리포솜으로의 형질감염 후 호흡기의 상피세포에서 리포터 유전자의 발현을 보여주는 쥐 호흡관의 냉온절단 사진 (6A) 및 (6B): 상피세포 (6A)의 표면에 위치된 형질감염 세포 및 하점막선(6B)에서 베타-갈락토시다제의 발현 검출; (6C): 항-베타-갈락토시다제 모노클로날 항체를 이용한 면역퍼록시다제 표지에 의한 하점막선에서의 베타-갈락토시다제를 발현시키는 세포의 검출; (6D): 항-루시퍼라제 폴리클로날 항체를 이용한 면역퍼록시다제 표지에 의한 하점막선에서의 루시퍼라제 발현 세포의 검출; (6E): 면역퍼록시다제 염색: 항체의 부재하에 수행된 음성 대조군.
도 7: 생체 내에서 DNA/BGTC-리포솜 복합체의 정맥 주사에 의한 유전자 전달 효율의 측정.
도 8: 생체 내에서 DNA/BGTC-리포솜 복합체의 복강내 주사에 의한 유전자 전달 효율의 측정.
A. 본 발명에 따른 유도체의 제조
재료 및 방법
1. 물리적 측정
양성자 핵 자기 공명 스펙트럼(1H NMR)을 브루커 AC200 분광계상에 기록한다. 화학 이동은 TMS에 대한 상대적인 ppm으로 표시된다.
2. 실리카상의 크로마토그래피
·박층 크로마토그래피(TLC)는 0.2 ㎜ 두께의 머크 실리카 겔 평판상에서 수행된다.
·컬럼 크로마토그래피는 입자 크기 분포가 0.040 내지 0.063 ㎜인 머크 실리카 겔 60에서 수행된다.
본 발명은 특정 구아니디늄을 포함하는 아미디늄류 관련 신규 화합물, 이를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
좀더 정확하게는, 본 발명은 화학식 1의 화합물 및 이의 염에 관한 것이다.
상기식에서,
R1은 콜레스테롤 유도체 또는 R' 및 R''가 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 C12또는 C22지방족 라디칼을 나타내는 알킬아미노 -NR'R'' 그룹을 나타내고,
R2 및 R3는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 2 그룹을 나타내며, 이들 중 적어도 하나는 수소 원자가 아니며,
n 및 m은 그룹 R2 및 R3간에 서로 독립적이고 상이하며, 정수 0 내지 4를 나타내며,
R4 및 R5는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 3의 그룹을 나타내며,
p 및 q는 서로 독립적으로 정수 0 내지 4를 나타내고 r은 0 또는 1이며, r이 1인 경우,
X는 NH 그룹을 나타내고 그때 x는 1이거나
X는 질소 원자를 나타내고 그때 x는 2이며
p, q 및 r은 그룹 R4 및 R5간에 독립적으로 변할 수 있다.
바람직한 아류(subfamily)로는, 좀더 상세하게는 본 발명의 구성내에서 R2 또는 R3가 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 4 그룹을 나타내는 화학식 1의 화합물이 언급될 수 있다.
상기식에서,
n, m 및 p는 앞서 정의한 바와 같고,
R4는 수소 원자 또는 화학식 5 그룹을 나타내며,
q 및 r은 앞서 정의한 바와 같으며,
m, n, p, q 및 r은 상이한 그룹 R2 및 R3간에 독립적으로 변할 수 잇다.
이러한 화학식 1의 신규 산물은 무독성 및 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 무독성 염은 무기산(염산, 황산, 브롬산, 인산 또는 질산) 또는 유기산(아세트산, 프로피온산, 숙신산, 말산, 하이드록시말산, 벤조산, 푸마르산, 메탄술폰산 또는 옥살산) 또는 무기 염기(나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 리튬 하이드록사이드 또는 칼슘 하이드록사이드) 또는 유기 염기(트리에틸아민과 같은 3급 아민, 피페리딘 또는 벤질아민)와의 염을 포함한다.
본 발명에 따른 대표적인 화합물로는, 좀더 상세하게 말해 하기 화학식의 화합물들이 언급될 수 있다.
상기식에서,
R1은 앞서의 의미를 지닌다.
청구된 구아니디늄 및 아미디늄 중 대표적인 것으로는, 좀더 상세하게는 R1이 콜레스테릴 그룹을 나타내는 상기 화학식 7, 8 및 9의 화합물이 언급될 수 있다. 이 3가지 화합물은 이하 각각 BGSC(비스 구아니디노 스퍼미딘 콜레스테롤) 및 BGTC(비스 구아니디노 트렌 콜레스테롤) 및 BADC(비스 아미디늄 디에틸렌트리아민 콜레스테롤 비스하이드로클로라이드)로 구분지어질 것이다.
청구된 화합물은 치료적인 관점에서 볼 때 무독성 및 양친매성으로 인해 매우 특히 이롭다. 부여된 이러한 특성으로 인해, 이들 화합물은 특히 세포 형질감염의 견지에서 핵산 합성에 이용될 수 있다. 이들 화합물은 그 결과 유전자 요법에 유리하게 이용될 수 있다.
화합물 7(BGSC) 및 8(BGTC)은 생체내에서 유전자 전달에 매우 특히 이롭다. 이 두 화합물은 DNA와 복합체를 형성하고 처리될 세포로 운반하는 도중 pH 변화로 인한 파괴로부터 이를 보호한다.
본 발명은 따라서 본 발명에 따른 화합물을 적어도 한가지 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 화합물은 비스 구아니디노 스퍼미딘 콜레스테롤(BGSC)이고 기타 바람직한 양태에서, 화합물은 비스 구아니디노 트렌 콜레스테롤(BGTC)이다.
유전자 요법의 주요 목적은 발현 결함 및/또는 변이, 즉 하나 이상의 핵산의 결손 또는 과도한 발현과 연관된 유전병을 치유하는데 있다. 생체 내 또는 시험관 내에서 클로닝 유전자의 세포 발현을 통해 이러한 형태의 유전 변이를 치유하는데 노력해 왔다.
현재, 몇몇 방법이 이러한 형태의 유전 정보의 세포내 전달을 위해 제안되어 왔다. 현재 사용되는 기술 중 하나는 정확하게는 화학 또는 생화학적 벡터를 이용한 것에 기초하고 있다. 이러한 합성 벡터는 2가지 주요 기능을 가진다: 형질 감염될 DNA의 응축, 및 세포 부착 및 원형질막과 적절한 곳에, 2개의 핵막을 가로지르는 통과 촉진. 양으로 하전된 양이온 지질 예를 들어 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)가 제안되어 왔다. 유리하게도, 이는 리포솜 또는 소낭의 형태로, 일부가 음으로 하전된 DNA와 자발적으로 상호작용해 세포막과 융합할 수 있는 지질-DNA 복합체를 형성하고, 이에 따라 DNA의 세포내 전달을 허락한다. 그러나, 특정 DOTMA의 경우, 형질감염에 있어 우수한 효율은 불행하게도 생분해성의 결여 및 세포에 대한 독성과 연관되어 존재하게 된다.
DOTMA로 인해, 기타 양이온 지질은 이러한 구조 양식으로 전개된다: 소위 "스페이서" 암에 의해 아미노 그룹과 결합된 친지질성 그룹. 이들 중, 좀더 특별하게는 친지질성 그룹으로서, 2개의 지방산 또는 콜레스테롤 유도체를 포함하고, 또한, 경우에 따라, 아미노 그룹으로서, 4급 암모늄 그룹을 포함하는 것들이 언급될 수 있다. DOTAP, DOBT 또는 ChOTB가 특히 이러한 양이온 지질류의 대표격으로 언급될 수 있다.
화학 구조 및 생분해성으로 인해, 청구된 화합물은 핵산 형질감염 벡터에 필요한 요구 사항을 정확히 충족한다.
본 발명은 따라서 시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내에서 세포의 형질감염시 이러한 신규 화합물의 용도 및 특히 핵산의 벡터화와도 관련된다. 이는 특히 본 발명에 따른 적어도 한 화합물에 첨가시 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에서, 청구된 최소 한가지 화합물과 결합된 핵산은 데옥시리보핵산 또는 리보헥산이 가능하다. 이들은 천연 또는 인공 기원의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 특히 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원 등일 수 있다. 이들은 바람직하게는 치료 유전자를 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은 따라서 핵산을 또한 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 핵산은 데옥시리보핵산 또는 리보핵산이 가능하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 핵산은 치료 유전자를 포함한다.
본 발명을 위해, 치료 유전자는 특히 치료 효과를 지닌 단백질 산물을 암호화하는 임의 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 이렇게 암호화된 단백질 산물은 단백질, 펩티드 따위일 수 있다. 이 단백질 산물은 표적 세포에 대해 상동일 수 있다(즉 후자가 병원성을 나타내지 않을 경우 표적 세포에서 일반적으로 발현되는 산물). 이 경우, 단백질의 발현은 예를 들어, 세포내에서의 불충분한 발현 또는 변형으로 인해 불활성이거나 활성이 약한 단백질 발현을 보충하거나, 다른 방법으로는 상기 단백질을 과발현시키는 것이 가능하다. 치료 유전자는 또한 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 돌연 변이체를 암호화할 수 있다. 이 단백질 산물은 또한 표적 세포에 대해 이질적일 수도 있다. 이 경우, 발현된 단백질은 예를 들어, 세포내에 결핍된 활성을 보충하거나 제공하여, 병리와 싸우거나 면역 반응을 자극시킬 수 있게 한다.
본 발명을 위한 치료 산물 중, 좀더 특별하게는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120), 생장 인자, 신경 전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 섬유증과 관련된 단백질 CFTR, 종양 억제 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고와 관련된 인자 암호화 유전자: 인자 VII, VIII 및 IX, DNA 수선 관련 유전자, 자살 유전자(티미딘 키나제, 사이토신 디아미나제), 헤모글로빈 또는 기타 담체 단백질용 유전자, 아포리포단백질 A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 apo(a)로부터 선택된 아포리포단백질 유형, 예를 들어 리포단백질 리파제, 헤파틱 리파제, 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 7-알파-콜레스테롤 하이드록실라제, 포스파티드산 포스파타제와 같은 대사 효소, 또는 콜레스테롤 에스테르의 전달용 단백질 및 인지질의 전달용 단백질과 같은 지질 전달용 단백질, HDL 결합용 단백질 또는 예를 들어, LDL 수용체, 잔여 킬로미크론용 수용체 및 스캐빈저 수용체로부터 선택된 수용체와 같은 지질 대사와 관련된 단백질에 상응하는 유전자 등이 언급될 수 있다.
치료 핵산은 또한 유전자 또는 비전사 서열일 수 있는데, 표적 세포에서의 발현은 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있다. 이러한 서열은 예를 들어, 유럽 특허 제 140 308 호에 기술된 기술에 따라, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되어 단백질로의 해독을 차단할 수 있다. 치료 유전자는 또한 리보솜 분해 효소를 암호하는 서열을 포함하는데, 이는 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있다(EP 321 201).
앞서 지적한 바와같이, 핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역 반응을 야기할 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 그 결과 백신 또는 특히 미생물, 바이러스 또는 종양에 대항해 인간 또는 동물에 적용될 수 있는 면역치료제의 제조를 허락한다. 이는 특히 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185 573), 의사-광견병 바이러스, 신시티아 형성 바이러스 또는 기타 바이러스에 특이적이거나, 또는 다르게는 종양(EP 259 212) 특이적인 항원성 펩티드를 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 또한 세포 또는 원하는 기관에서 치료 유전자 및/또는 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자를 발현시키는 서열을 포함한다. 이들은 원래 이러한 서열이 감염 세포에 작용 가능할 경우 관련 유전자의 발현을 담당하는 서열일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원(기타 단백질의 발현, 또는 합성 담당)의 서열일 수도 있다. 특히, 이들은 진핵 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들어, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이들은 바이러스 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 관점에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성 또는 조절 유전자 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 억제성일 수 있다.
또한, 핵산은 특히 치료 유전자의 상류에, 표적 세포의 분비 경로에서 합성된 치료 산물을 지시하는 시그널 서열을 포함할 수도 있다. 이 시그널 서열은 치료 산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 또한 기타 작용성 시그널 서열, 또는 인공 시그널 서열일 수도 있다. 핵산은 또한 합성된 치료 산물을 세포의 특정 구획으로 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 기술된 양이온성 지질, 특히 BGTC 및 BGSC는 DNA와 복합체를 형성할 수 있고, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서, 치료 관련 핵산의 전달을 위한 바이러스 벡터에 대해 유리한 대체물을 나타낸다. 구아니디늄 그룹의 화학적인 특성, 특히 이들의 높은 pKa로 인해, 이러한 양이온 지질은 pH 변화로 인한 분해로부터 DNA 분자를 보호할 수 있다. 실시예에서 나타낸 결과는 이러한 화합물이 높은 효율로 다수의 세포 유형의 형질감염을 허락함을 보여준다. 형질감염 효율은 특히, 형성된 복합체에서 양이온 지질/DNA 비에 좌우된다. 특히 형질감염을 선호하는 이 두 화합물간의 비는 DNA상의 하나의 포스페이트 그룹에 대해 6 내지 8개의 구아니디늄 그룹을 가진 상태로 존재한다.
양이온 지질/DNA 복합체의 형질감염 효율은 또한, 중성 지질의 첨가 및 양이온 리포솜의 형성에 의해 개선될 수 있다. 이 리포솜은 양이온 지질과 중성 지질간의 복합체에 의해 형성된다. 후자는 하기로부터 선택될 수 있다:
- 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE),
- 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민 (POPE),
- 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민,
- 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체,
- 포스파티딜글리세롤,
- 디아실글리세롤,
- 글리코실디아실글리세롤,
- 세레브로사이드(특히 갈락토세레브로사이드),
- 스핑고지질(특히 스핑고미엘린),
-아시알로갱글리오사이드(특히 아시알로GM1 및 GM2).
바람직하게는 DOPE가 이용된다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물 및 중성 지질은 약 1 내지 5, 좀더 바람직하게는 2 내지 4의 비로 존재한다. 또한, 총 지질(본 발명 화합물 + 중성 지질) : DNA 비는 유리하게는 양전하의 총비가 2 내지 5인 경우에 선택되어진다. 특히 유리하게는, 이 비는 약 3이다.
본 발명은 따라서 또한 본 발명에 따른 화합물, 중성 지질 및 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물은 BGTC 및 BGSC로부터 선택된다. 평균적으로 바람직하게는, 중성 지질은 DOPE이다. 핵산은 데옥시리보핵산 또는 리보핵산이다. 바람직하게는, 핵산은 치료 유전자를 포함한다.
주장된 아미디늄 유도체의 용도뿐만 아니라, 하기 용도시 이 값을 높이는 것을 포함할 수 있다: 예를 들면, 유전자 발현 또는 효소 활성(폴리머라제, 트랜스크립타제 등)의 조절을 위한 임의 공정을 저해 또는 촉진시키는 핵산과 단백질간의 상호 작용 저해, 예를 들어, 시험관 내에서 형질감염 작업을 수행하는 실험용 시제로 막 전극/탐침의 사용에 의해 이들의 추출, 제거 또는 검출용 음이온 종의 선택적인 결합 등.
결국, 본 발명의 주제는 또한 직접 또는 약학 성분으로 앞서 기술된 바와 같이 아미디늄 유도체의 치료적 용도이다.
바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 주사 가능한 제형, 특히 원하는 기관의 수준에서 직접 주사, 또는 국부 경로(피부 및/또는 점막)에 의한 투여용의 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균 용액 또는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있는데, 이들은 경우에 따라, 멸균수 또는 생리식염수의 첨가와 동시에, 주사 가능한 용액을 구성한다.
본 발명은 하기의 실시예 및 도면에 의해 좀더 상세히 기술될 것이고 설명적이면서 비제한적으로 간주되어야 한다.
실시예 1
구아니디노 스퍼미딘 콜레스테롤 BGSC의 제조
1; Di-Boc 카바메이트(1)의 제조
콜레스테릴 클로로포르메이트(0.9 g, 2mmol) 및 CH2Cl2(40 ㎖)중의 Et3N(0.214 g, 2 mmol) 용액을 CH2Cl2(20 ㎖) 중의1N,8N-Boc2-스퍼미딘(0.690 g, 2 mmol) 용액에 첨가한다. 5시간 동안 환류시킨 후, 이 혼합물을 물(2 x 50 ㎖)로 세척하고, Na2SO4로 건조한 다음 용매를 증발시킨다. 조 산물을 용출제로 CH2Cl2/MeOH 95/5를 이용해 실리카 겔상에서 크로마토그래피시켜 정제한 다음 순수한 카바메이트(1.3 g, 86%)를 생성한다.
1H NMR δ(CDCl3, 200 Mhz); 0.5-2.5(m, 콜레시테릴 구조, Boc 시그널 및 스퍼미딘으로부터 중앙 CH2 그룹), 3.1-3.3(m, 8H, N-CH2), 4.50(m, 1H, H3α), 5.37(d, 1H, H6).
2. 아미노카바메이트(2)의 제조
화합물(1)(1.3 g)을 CH2Cl220 ㎖에 용해시키고 갓 증류된 CF3CO2H 2 ㎖를 냉각된 용액(아이스 베드)에 첨가하여 보호 BOC 그룹을 제거한다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후,1N NaOH 50 ㎖를 첨가하고 이 혼합물을 CH2Cl2로 추출한다. 유기층을 물로 세척하고, Na2SO4로 건조한 다음 증발시켜 조 아미노카바메이트(2)(0.945 g, 98%)를 수득한다.
1H NMR, δ(CDCl3, 200 Mhz); 0.5-2.5(m, 콜레스테릴의 구조 및 스퍼미딘의 중앙 그룹), 2.7(m, 4H, CH2-N-CO-), 3.25(광범위 m, 4H, N-CH2), 4.49(m, 1H, H3α), 5.35(d, 1H, H6).
3. BGSC의 합성.
조 카바메이트(2)(0.94 g)를 THF/MeOH 85/15 30 ㎖에 용해한다. 다음, THF/MeOH 85/15 30 ㎖ 중의 1H-피라졸카복사미딘(0.495 g, 3.4 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(0.436 g, 3.4 mmol)을 첨가한다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 디에틸 에테르 250 ㎖를 서서히 첨가하고 수득된 침전물을 따라내어 분리한다. 조 화합물을 디에틸 에테르에서 3회 현탁시키고 기우려 따라내어 분리한 다음 순수한 GSC(0.570 g, 47%)를 수득한다.
1H NMR δ(DMSO d6) 200 MHz; 0.5-2.5(m, 콜레스테릴의 구조 및 중앙 CH2), 3.1(m, 8H, N-CH2), 4.3(m, 1H, H3α), 5.3(d, 1H, H6), 7.2(광범위 s, 8H, NH2+), 7.8(s, 2H, NH), C37H67N7.2HCl에 대한 분석치, C, 62.15; H, 9.67; N, 13.71
성분 분석 결과: C, 62.28; H, 9.81; N, 13.15
실시예 2
구아니디노 트렌 콜레스테롤, BGTC의 제조
1. 아미노카바메이트(5)의 제조
CH2Cl2100 ㎖중 콜레스테릴 클로로포르메이트(1.8 g, 4 mmol) 용액을 CH2Cl2400 ㎖ 중 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)(11.68 g, 80 mmol) 포화물에 서서히 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 불활성 아민을 물(3 x 100 ㎖)로 세척하여 제거하고 Na2SO4로 건조시킨 후, 용매를 증발시킨다. (5)를 하기의 방법에 의해 트리하이드로클로라이드의 형태로 분리한다: 조 산물을 MeOH 10㎖에 용해시키고 포화 메탄올성 HCl 용액(5 ㎖)을 적가하며; 수득된 침전물을 기우려 따라내어 분리하고 순수한 화합물을 수득하기 위해, MeOH에서 3회 현탁시키고 기우려 따라내어 분리한다. 진공하에 건조시킨 후, 순수한 트리하이드로클로라이드(6)를 수득한다(1.71 g, 64%).
1H NMR δ(CDCl3+ εCD3OD, 200 MHz): 0.5-2.4(m, 콜레스테릴의 구조), 2.5(m, 2H, CH2NHCO), 2.8(광범위 s, 4H, +HN-CH2), 3.06(광범위 s, 4H, CH2NH3+), 3.20(m, 2H,+HN-CH2), 4.4(m, 1H, H3α), 5.3(d, 1H, H6) C34H62N4O2.3HCl에 대한 분석치; C, 61.10; H, 9.80; N, 8.38. 결과: C, 61.25; H, 9.96; N, 8.22.
2. B.GTC의 제조
CH2Cl2100 ㎖ 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(2.24 g, 5 mmol) 용액을 CH2Cl2250 ㎖ 중 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)(29.2 g, 200 mmol) 광 포화액에 서서히 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 불활성 아민을 물(3 x 100 ㎖)로 세척하여 제거하고 Na2SO4로 건조한 후, 용매를 휘발시킨다. 조 산물(3.2 g)을 THF/MeOH 50/50(20 ㎖)에서 용해시킨다; 다음, 1H-피라졸-1-카복시미딘(1.465 g, 20 ㎖) 및 디이소프로필아민(1.3 g, 10 mmol)을 이 혼합물에 첨가한다. 실온에서 18 시간 동안 교반한 후, 디에틸 에테르를 첨가하고 수득된 침전물을 기우려 따라내어 분리한다. 순수한 샘플을 수득하기 위해, 진공하에 건조한 후, 조 화합물을 디에틸 에테르에서 3회 현탁시키고 기우려 따라내어 분리한다(2.15 g, 60%).
1H NMR(DMSO d6, 200 MHz);0.5-2(m, 콜레스테릴의 구조), 2.2(m, 2H, N-CH2), 2.6(광범위 s, 4H, N-CH2), 3.0(d, 2H, N-CH2), 3.2(광범위 s, 4H), 4.3(m, 1H, H3α), 5.3(d, 1H, H6), 7.3(광범위 s, 8H, NH2+), 7.8(광범위 s, 2H, NH). C36H66N8O2.2HCl에 대한 분석치; C, 60.39; H, 9.57; N, 15.65. 결과: C, 60.38; H, 9.67; N, 15.56.
실시예 3
비스 아미디늄 비스하이드로클로라이드 BACD의 제조
1. 디니트릴의 제조
CH2Cl2(100 ㎖) 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(8.97 g; 20 mmol) 용액을 CH2Cl2(100 ㎖) 중 이미노프로피오니트릴(2.46 g, 20 mmol) 및 Et3N(2.02 g, 20 mmol) 용액에 적가한다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 이 혼합물을 물(2 x 100 ㎖)로 세척하고 Na2SO4로 건조한다. 용매를 휘발시키고 조 산물(10.5 g)을 메탄올로부터 재결정화한다. (8.59 g; 80%)
1H NMR δ(CDCl3, 200 MHz);0.5-2.5(m, 콜레스테릴의 구조), 2.7(m, 4H, -CH2CN), 3.62(m, 4H, -CH2-N-), 4.50(m, 1H, H3α), 5.39(d, 1H, H6).
2. 디티오아미드의 제조
약간의 H2S 스트림을 앞서 기술한 바와 같이 제조된 디니트릴(0.324 g, 6 mmol) 및 DMF(30 ㎖) 중의 디에틸아민(0.884 g; 12 mmol) 용액을 통해 2 시간 동안 버블링시키고, 50℃로 유지한다. 청색 용액을 아이스 위에 붓고 이렇게 하여 수득된 침전물을 여과시켜 분리한다. 이 조산물을 CH2Cl2에 녹이고 물(2 x 50 ㎖)로 세척한다. Na2SO4로 건조한 후, 용매를 휘발시키고 수득된 산물을 메탄올(1.86 g; 51.5%)에서 2회 재결정한다.
1H NMR(DMSO d6, 200 MHz);0.5-2.5(m, 콜레스테릴의 구조), 2.67(t, 4H, N-CH2), 3.50(t, 4H, S=C-CH2), 4.3(m, 1H, H3α), 5.33(d, 1H, H6).
3. 디티오아미데이트 비스이오다이드의 제조
메틸 이오다이드(2 ㎖)를 아세톤(20 ㎖) 중의 디티오아미드(0.603 g; 1 mmol) 용액에 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 48시간 동안 정치한다. 수득된 침전물을 여과한다(0.741 g; 83.5%). 이 산물은 추가 정제없이 직접 이용된다.
4. 비스 아미디늄 비스하이드로클로라이드 BADC의 제조
NH3스트림을 환류 온도에서 이소프로판올(10 ㎖) 중의 앞서 수득된 비스이오다이드(0.741 g; 0.83 mmol) 현탁액을 통해 2시간 동안 버블링한 다음 환류하에 추가 4시간 동안 가열을 계속한다. 이소프로판올을 휘발시키고 잔사를 메탄올(10 ㎖) 중에 취한다. 이 용액을 염기성 이온-교환 수지 위로 통과시킨 후, 염산 스트림을 용출제에 통과시키고 용액을 휘발시켜 건조 상태로 만든다. 수득된 비스하이드로클로라이드를 최소 에탄올(약 5 ㎖)에 용해시킨다. 경 불용성 물질을 여과하고 과량의 디에틸 에테르를 여액에 첨가한다. 여과되고 건조된 분말을 수득한다(320 ㎎; 60%). 이소프로판올에서의 재결정화는 기대 산물을 분석적으로 순수한 형태로 분리가능케 해준다.
1H NMR(DMSO d6, 200 MHz);0.5-2.6(m, 콜레스테릴의 구조 및 -CH2-아미디늄), 3.57(s, 광범위 4H, N-CH2), 4.3(m, 1H, H3α), 5.3(d, 1H, H6), 8.64(s, 광범위; 2H, NH2), 9.07(s; 광범위; 1H, NH). 9.18(s; 광범위; 2H).
C34H56N4O2.2HCl에 대한 분석치; C, 65.25; H, 9.32; N, 8.94. 결과: C, 65.40; H, 9.87; N, 9.55.
B: 시험관 내 및 생체 내에서 본 발명에 따른 유전자 전달을 위한 유도체의 용도
재료 및 방법
1- 하기의 형질감염 실험은 실시예 1 및 2에 기술된 프로토콜에 따라 제조된 BGSC 및 BGTC를 이용해 수행된다.
2- 리포솜의 제조
클로로포름(CHCl3) 중 양이온 지질 및 DOPE(3/2 몰비)의 혼합물을 진공하에 증발시키고 N2대기하에 pH 7.4에서 20 mM HEPES 완충액에서 재현탁한다.
최종 지질 농도는 1.2 ㎎/㎖이다.
이 혼합물을 5분간 와동시킨 다음 초음파기(브랜슨 초음파 2210)를 이용해 5분간 "초음파처리"하여, 결국 +4℃에서 24시간 동안 수화시켜 저장한다.
생성된 분산액을 또다시 5 내지 10분간 "초음파처리"하여(소니피어 브랜슨 450) 리포솜을 형성한다.
원심 분리 후, 용액을 세공 직경이 0.22 μ인 필터(Millex GS, Millepore)상에서 여과하고 +4℃에서 저장한다.
BGSC 또는 BGTC를 함유한 리포솜의 크기를 레이저 회절 장치(Autosizer 4700, Malvern Instruments)를 이용해 조사한다. 이 조사는 다수의 다중양식 분석에서 50 nm의 직경을 의미하는 이에 상응하는 하나의 피크를 보여준다.
3- 세포 배양
형질감염 실험에 이용되는 대부분의 세포주 원(종 및 조직)에 관해서는 표 1에 나타나 있다.
HeLa 세포주(P Briand, ICGM Paris)의 세포는 경부 상피 기원의 인간 종양에서 유도된다.
NIH 3T3(C Lagrou, Institut Pasteur, Lille) 세포는 마우스 섬유아세포이다.
NB2A 세포주(C. Gouget, Paris)는 마우스 신경아세포종에서 유도된다.
AtT-20 및 PC12 세포를 제외한 모든 세포를 10% 태 송아지 혈청(FCS; GIBCO), 100 단위/㎖(GIBCO)의 페니실린 및 100 μg/㎖의 스트렙토마이신(GIBCO)으로 보충된 둘베코 변형 배지(DMEM, GIBCO)에서 배양한다.
AtT-20 세포를 10% 태 송아지 혈청으로 보충된 DMEM/F12(GIBCO)에서 배양한다.
PC12 세포를 10% FCS 및 5% 말 혈청으로 보충된 DMEM에서 배양한다.
모든 세포를 5% CO2를 지닌 습한 대기하에 플라스틱 접시(Falcon)상에서 배양시켜 둔다.
4- 플라스미드
플라스미드 pRSV-Luc(O. BENSAUDE, ENS, Paris) 및 pRSV-nlsLacZ를 이. 콜라이(E. coli)에서 증폭하고 표준 기술에 의해 CsCl 구배상에 정제하여 제조한다. 플라스미드 pRSV-nlsLacZ 및 플라스미드 pRSV-Luc에서, 이. 콜라이 Lac Z 유전자 및 핵 위치시그널 서열 및 루시퍼라제 유전자는 각각 LTR/RSV(라우스 육종 바이러스)의 전사 조절하에 놓인다. 플라스미드 pXL2774는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 통제하에 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함한다.
5- 시험관 내에서 형질감염에 대한 프로토콜
형질감염 하루 전, 2 X 105세포를 웰(Falcon 6-웰 평판)마다 침착시킨다.
각 웰은 상이한 세포주를 함유한다.
따라서, 형질감염 하루 전, 세포는 반유착상태이다.
플라스미드 DNA(5 ㎍) 및 원하는 양의 비스-구아니디늄 지질 각각을 FCS-무 DMEM 250 ㎕에서 희석하고 와동시킨다. 약 5분 후, 이 두 용액을 실온에서 15분간 배양한다. 형질감염 혼합물을 무-혈청 배지로 세척된 세포(웰당 0.5 ㎖)에 첨가한다. 37℃에서 4 내지 6시간 동안 배양한 후, 혈청을 지닌 배지 1㎖를 형질감염 혼합물을 제거함이 없이 각 웰에 첨가한다. 형질감염 24 시간 후, 배지를 1 ㎖의 신선한 배양 배지로 교체한다. 세포를 형질감염 2일 후 수거하여 루시퍼라제의 발현을 관측한다.
대조 형질감염을 시판용 형질감염제를 이용해 수행한다.
- 리포폴리아민 트랜스펙탐(JR Behr, Strabourg, France)을 알콜 용액에서 최적 트랜스펙탐/DNA 이온 전하비 6-8에서 이용한다.
- 리포펙틴(Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, France)은 중성 지질, DOPE 및 양이온 지질, DOTMA를 지닌 리포솜 제형이다.(N[1(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드).
DNA/리포솜 복합체가 제조자가 추천한 표준 조건하에서 수득된다.
- 세포를 칼슘 포스페이트 침전에 의해 형질감염시킨다(문헌[참조: Keown, W. A., Campbell, C.R.; Kucherlapati, R.S. (1990) Methods in Enzymology; Academic Press: New York, 185, 527-537]).
6- 시험관 내에서 수행된 형질감염을 위한 루시퍼라제의 측정
루시퍼라제 활성을 De Wet et al 과정의 변형을 이용하여 형질감염 48시간 후 측정한다(문헌[참조: De Wet, J. R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R. & Subramani, S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737]).
- 배양 배지를 제거하고
- 세포를 콜드 포스페이트 완충액의 식염수로 세척한 다음
- 이를 용해 완충액(25 mM 트리포스페이트 pH 7; 8.8 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨, 15% 글리세롤 및 1% 트리톤 X-100) 250 ㎕에서 배양하여 용해시킨다.
- 맑은 용해물을 미세원심분리기에서 원심분리(15 ㎜ a +4℃)에 의해 불용성인 물질을 제거한 후 수득한다.
- 세포 추출물(20 ㎕)을 용해 완충액 100 ㎕에서 희석하고 여기에 25 mM ATP(sigma) 9 ㎕ 및 25 mM 루시페린(sigma) 20 ㎕를 첨가한다.
- 샘플을 광도계(Lurmet LB9501 Berthold, Nashua, NH)에 놓고 10 동안 빛 방출을 측정한다.
RLU/루시퍼라제 곡선의 눈금 매김을 정제된 파리 루시퍼라제(sigma)의 다양한 희석액을 이용해 측정하고 곡선의 직선 부위가 104내지 107RLU(상대적인 광 단위)에서 유래됨을 보여준다.
단백질 농도를 대조군으로 소 혈청 알부민을 이용해 BCA(비신코닌산) 시험에 의해 측정한다.
루시퍼라제 활성 자료는 RLU/㎎ 단백질로 표현된다.
7- 마우스 호흡기 수준에서 생체 내 주사용 프로토콜
사용된 마우스는 Iffa-Credo(Lyon, France)에서 얻어진 수컷 OF1 마우스(체중 30 g)이다. 양이온 리포솜 BGTC/DOPE(몰비 3 : 2)를 사용한다. 형질감염 혼합물을 총 지질 농도 5 ㎎/㎖에서, 플라스미드 DNA(10 ㎕ 물 중) 10 ㎍, 20 mM Hepes 배지(pH 7.4) 중 양이온 리포솜 20 ㎕에서 수득한다. 이렇게 형성된 DNA/지질 응집체는 6의 전하비를 가진다.
마우스를 펜토바르비탈을 이용해 마취시킨 후, 형질감염 혼합물(30 ㎕)을 기관 루멘으로 삽입된 캐뉼러를 경유한 내기관 적하에 의해 호흡기로 주사한다. 적하 48시간 후, 이 동물을 과량의 펜토바르비탈로 치사시키고 분석을 위해 폐 및 기관을 적출한다.
8- X-gal 염색
1차 배양시 이. 콜라이 베타-갈락토시다제의 발현을 측정하기 위해, 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 4℃에서 15분간 함침시킨 다음 색소원 베타-갈락토시다제 기질 X-gal(Sigma)과 함께 배양한다. 형질감염된 세포핵의 청색을 루미네센스 현미경으로 측정한다.
9- 생체 내에서 형질감염된 호흡기 수준에서 X-gal 세포의 측정
호흡기 수준에서 X-gal 세포를 검출하기 위해, 폐 및 기관을 4% 파라포름알데히드에서 1시간 동안 처리한 다음 30% 수크로스를 함유한 PBS에서 밤새 함침시키고, 냉동 배지로 혼입하고 액체 질소로 얼린다. 5 μ의 저온조 절편을 X-gal 시제(Sigma)와 밤새 배양함으로써 β-갈락토시다제 활성에 대해 염색한다.
10- 생체 내에서 형질감염된 호흡기 수준에서 루시퍼라제의 측정
생체 내에서 형질감염 마지막에 루시퍼라제 활성을 측정하기 위해, 조직 분획을 용해 완충액(25 mM 트리스-포스페이트 pH 7.8m 1mM 디티오트레이톨(DTT), 15% 글리세롤 및 1% 트리톤 X-100) 30 ㎕에 놓아두고, 균질화기(Polylabo, Strasbourg, France)로 약 1분간 용해시킨 후 아이스상에 저장한다. 원심 분리 후, 용해액 20 ㎕를 측정에 이용한다. 루시퍼라제 활성은 RLU/단백질 ㎎으로 표시된다.
11- 면역조직화학 프로토콜
폐 및 기관 샘플의 냉동 절편을 5 ㎍/㎖의 쥐 모노클로날 항체 항-이.콜라이 β-갈락토시다제(Genzyme, Cambridge, MA) 또는 토끼 폴리클로날 항체 1 : 400 희석액(Promega)을 이용해 1시간 동안 배양한다.
이. 콜라이 β-갈락토시다제 단백질을 바이오틴-표지 2차 항체 항-마우스 Ig(Boehringer) 및 스트렙타비딘-POD 접합체(Boehringer)를 이용해 면역퍼록시다제로 염색하여 측정한다. 루시퍼라제 단백질을 항-토끼 염소 항체(ICN Biomedical, Inc) 및 토끼 퍼록시다제-항퍼록시다제(PAP) 시스템(Dako Glostrup, Denmark)을 이용해 면역퍼록시다제로 염색하여 측정한다. 이 절편을 루미네센스 현미경으로 조사한다. 음성 대조군을 항체없이 수행한다.
실시예 4
상이한 형질감염제/DNA 비에서 시험관 내 형질감염
BGTC/DNA 응집체를 이용해 수득된 형질감염 효율을 최적화하기 위해, 본 출원인은 종래의 형질감염법에 대해 비교적 민감한 것으로 알려진 3가지 상이한 포유동물 세포 형태에서 형질감염시의 BGTC/DNA 비에 대한 영향을 조사했다. 결과는 도 3에 수록되어 있다.
형질감염 실험을 쥐 섬유아세포 3T3 인간 내피 세포 HeLa 및 마우스 신경아세포 NB2A를 이용해 수행한다. 이 실험 동안, 고정된 양의 플라스미드 pRSV-Luc를 용액중 다양한 양의 BGTC와 접촉시킨다. 연구될 비의 범위를 결정하기위해, 본 출원인은 DNA 1 ㎍이 3 nm의 음으로 하전된 포스페이트와 동일하고 단지 두가지 구아니디늄 그룹이 응집체의 형성 및 형질감염을 위해 중성 pH에서 양으로 하전된다는 원리에서 출발했다. 루시퍼라제 활성을 형질감염 48시간 후 측정한다. 루시퍼라제의 발현은 DNA의 한 포스페이트 그룹에 대해 6개(HeLa 세포) 내지 8개(3T3 및 NB2A 세포)의 구아니디늄 그룹을 함유하는 응집체, 즉, 높은 양전하를 지닌 응집체의 경우에 최대이다.
실시예 5
시험관 내에서 상이한 세포 유형을 이용한 형질감염
양이온 지질 중간체에 의한 유전자 전달은 중간 산물을 요구하지 않을 뿐만 아니라 광범위의 상이한 조직 및 유기체 세포를 형질감염시킬 수 있기 때문에 매력적인 형질감염 기술이다. 형질감염제로서 BGTC의 효율 정도를 조사하기 위해, 다양한 기원의 여러 세포주를 시험한다. 결과는 하기 표 1에서 나타내고 있다. 전하비는 최대 효율을 위해 6 내지 8에서 선택된다. 비교를 위해, 한편으로는, 동일한 주의 세포를 리포폴리아민을 이용하고 다른 한편으로는 칼슘 포스페이트를 이용해 형질감염시킨다. 결과는 BGTC가 일반적으로 트랜스펙탐만큼 효율적이고 칼슘 포스페이트보다는 2배 더 효율적임을 보여준다.
| 종(Species) | 세포주 | 조직 | RLU/㎎ 세포 단백질 | ||
| BGTC | 칼슘 포스페이트 | 트랜스펙탐 | |||
| 인간 | A549 | 폐 암종 | 4 x 105 | 7 x 103 | 3.1 x 105 |
| 원숭이 | COS-7 | SV 40에 의해형질감염된 신장 | 2.1 x 107 | 3.7 x 105 | 8.4 x 106 |
| 개 | MDCK-1 | 신장 | 3 x 106 | 4.5 x 105 | 2.2 x 106 |
| 래트 | RIN-m5F | 췌장섬 종양세포 | 2 x 107 | 2 x 105 | 3.3 x 105 |
| ROS | 골육종 | 4.0 x 106 | 4.5 x 105 | 2.3 x 106 | |
| PC12 | 갈색세포종 | 3 x 107 | 1.7 x 105 | 6 x 106 | |
| 마우스 | AtT-20 | 하수체종 | 2 x 107 | 8 x 105 | 3 x 107 |
모든 형질감염을 최소 2회(n≥2) 수행한다.
실시예 6
시험관 내에서 중성 지질의 존재하에 형질감염
화합물 BGSC는 BGTC보다 수성 매질에서 덜 가용성이기 때문에, 본 출원인은 전자를 중성 지질 DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민)의 존재하에 리포솜의 형태로 사용한다. 제형을 3/2의 몰비로 제조한다. 이 때, BGTC를 함유하는 제 2 제형도 또한 동일한 조건하에 DOPE와 함께 제조될 수 있다.
6.1- 총 지질/DNA 비 결정
본 출원인은 우선 HeLa 세포에서 형질감염 실험동안 지질/DNA 비를 결정한다. 얻어진 곡선은 도 4에서 나타내고 있다. 최적 형질감염은 2.5 내지 3이 중심이 되는 1.5 내지 5의 BGSC 리포솜/DNA 비에서 얻어진다. 구아니디늄 그룹은 중성 pH에서 양자화되기 때문에, 최상의 BGSC-DOPE/DNA 응집체는 약 3의 양전하를 띤다(도 4).
최상의 BGSC-DOPE/DNA 비는 그 결과 BGTC/DNA 형의 응집체를 이용해 수득된 것보다 작다(6 내지 8). 양이온 리포솜의 존재하에 형질감염은 DOPE 및 융합원 특성의 존재로 인해 용이해 진다.
6.2- 양이온 리포솜에 의한 상이한 세포주의 형질감염
본 출원인은 상이한 세포주에서 3/2 몰비의 양이온 리포솜 BGSC-DOPE 및 BGTC-DOPE의 제형을 이용해 형질감염 실험을 수행했다. 지질의 구아니디늄/DNA의 인산의 전하비는 이러한 두 유전자 전달 시스템의 경우 약 2.5(∼3)이다. 리포펙틴을 이용한 형질감염은 대조군으로 작용한다. 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.
이러한 결과는 양이온 리포솜의 형태로 구아니디늄 그룹을 운반하는 콜레스테롤 유도체는 형질감염에 있어 적어도 리포펙틴으로서 효과적이다. 이러한 결과는 물론 각 세포주에 있어 최적일 수 있다.
| 세포주 | RLU/㎎세포 단백질 | ||
| BGSC 리포솜 | BGTC 리포솜 | 리포펙틴 | |
| HeLa | 4.6 x 106 | 7.7 x 106 | 3.3 x 106 |
| A 549 | 6 x 105 | 2 x 105 | 4 x 106 |
| COS-7 | ND | 1.4 x 107 | 9.5 x 106 |
| MDCK-1 | 1 x 106 | 7 x 106 | 1.9 x 106 |
| ROS | ND | 9 x 106 | 6 x 106 |
| NB2 Aa | 1.5 x 107 | 1.4 x 107 | ND |
| NIH 3T3a | 7 x 106 | 1.5 x 106 | ND |
| a: 100 ㎍/500 ㎍의 총 용균액의 경우 루시퍼라제 활성의 RLU의 평균 측정값(n≥4). |
모든 형질감염을 최소 3회(n≥3) 수행한다.
실시예 7
시험관 내에서 유전자 전달 효율에 대한 혈청 단백질의 존재 효과 연구
양이온 지질에 기본한 대부분의 형질감염 조성물은 혈청 존재시 감소된 효율을 지닌다. 본 실시예의 목적은 혈청 효과에 대한 본 발명 화합물의 감도를 시험하는데 있다.
7.1 - 양이온 지질의 제형
본 발명에 기술된 지질은 에탄올에 용해된다.
i) "리포솜" 용액은 DOPE 존재하에 하기와 같이 수득된다: 클로로포름 용액 중 DOPE(AVANTI)를 에탄올, 3/2 몰비의 양이온 지질/DOPE 중 지질 용액에 첨가한다. 휘발시켜 건조상태로 만든 후, 이 혼합물을 물에 용해시켜 50℃에서 30분간 가열한다.
ii) "마이셀" 용액을 "리포솜" 생성을 위해 기술된 프로토콜에 따라 수득하는데 이때는 DOPE 용액을 클로로포름으로 대체한다.
이 용액을 10 mM의 양이온 지질에 맞춘다.
7.2- 핵산
사용된 핵산은 플라스미드 pXL2774이다.
7.3- 시토펙탄트 혼합물(사용전에 바로 제조)
DNA를 150 mM NaCl에서 20 ㎍/㎖로 희석하고 상이한 양이온 지질의 제형을 물에서 40, 80, 120 및 160 μM로 희석한다. DNA 및 지질 용액을 용적/용적으로 혼합하여, 각각 2, 4, 6 및 8 nmol/㎍ DNA비가 되게한다; 염 농도는 75 mM이다.
7.4- 형질감염
세포를 적절한 조건하에 24-웰 마이크로플레이트(2 ㎠/웰)에서 배양하고 지수함수로 생장하는 부위에서 형질감염시키면 50 내지 70% 융합된다. 세포를 무혈청 단백질의 500 ㎕ 배지에서 2회 세척하고 무-혈청 배지[혈청 부재하에 형질감염], 또는 완전 배지[혈청 존재하에 형질감염]에서 다시 생장시킨 다음 50 ㎕의 시토펙탄트 혼합물[0.5 ㎍ DNA/웰]을 세포[3 웰/조건 지질-DNA]에 첨가한다.
세포를 "혈청 부재"하에 형질감염시킬 경우, 생장 배지를 형질감염 2시간 후 적절한 양의 혈청으로 보충한다.
형질감염 효율을 Promega 키트[루시퍼라제 분석 시스템]의 사용시 제공된 추천에 따라 루시퍼라제의 발현을 측정하여 평가한다. 시토펙탄트 혼합물의 독성을 세포 용균액에서 단백질 농도를 측정하여 평가한다.
7.5- 결과(도 5)
4가지 세포 유형[NIH 3T3-293-HepG2-HeLa]을 이용해 얻어진 결과는 시험된 조건하에서, "리포솜" 형태의 제형이 "마이셀" 형태의 제형보다 좀더 효과적임을 보여주고 있다. 또한, 양이온 지질을 함유한 대부분의 시토펙탄트 제품을 이용해 관찰되는 것과는 대조적으로, "리포솜" 또는 "마이셀" 형태의 BGTC의 경우 혈청의 존재와 결합된 저해 효과는 형질감염 조건시 중요하지 않음을 입증할 수 있다.
실시예 8
BGTC/DOPE 리포솜을 이용한 마우스 호흡기에서 트랜스유전자의 생체내 발현
이를 위해, 본 출원인은 양이온 리포솜 BGTC/DOPE를 사용했다. DNA/리포솜 응집체의 생성 및 시행 프로토콜을 기재된 재료 및 방법으로 수행한다.
X-gal 세포를 BGTC/DOPE 리포솜에 의해 LacZ 플라스미드 세포로 형질감염시킨 48 시간 후 처리된 마우스의 호흡기 중 상피조직에서 검출한다. 결과는 도 6에 나타나 있다.
대부분의 형질감염 세포는 기관에 위치하고 몇몇 X-gal 세포만이 제 2 호흡기에서 관찰된다. 이러한 분포 유형은 기타 세포 형질감염에서 이미 보고되어 있다.
면역조직화학도 또한, 리포터 유전자의 생성을 확인하기 위해 수행된다. 압도적으로, 이는 상피 표면 수준에서 형질감염된 성숙 세포이다(도 6A). 이러한 자료는 양이온 리포솜이 호흡기 상피의 비증식 및 완전 분화 세포에서 유전자의 형질감염을 유도할 수 있음을 보여준다. 트랜스유전자의 발현도 또한 하점막선에서 검출된다(도 6B). 형질감염 세포의 면역 표지의 검출은 이. 콜라이 β-갈락토시다제를 향한 모노클로날 항체를 이용해 하점막선 및 표면 상피에서의 이러한 발현을 확신시킨다(도 6D). 트랜스유전자 발현도 또한 하점막선에서 pRSV-Luc와 BGTC/DOP의 형질감염 후 루시퍼라제 단백질을 향한 항체의 면역퍼록시다제 염색에 의해 입증된다(도 6D).
음성 대조군을 항체없이 수행한다(도 6E).
이러한 결과는 낭포성 섬유증에 대한 유전자 치료에 매우 특히 흥미롭다. 실제로, 이러한 병리 치료를 위해, 인간 기관지에서 CFTR의 주요 발현 부위인 하부점막선을 목표로 정하는 것이 필요하다.
실시예 9
생체 내에서 BGTC/DOPE의 형질감염 효율의 양적 측정
이를 위해, 마우스의 폐 및 기관을 BGTC/DOPE 리포솜으로 처리하고 실시예 8에서 기술된 조건하에 플라스미드 pRSV-Luc를 형질감염 48 시간 후에 제거한 다음 루시퍼라제 활성을 재료 및 방법에 있어 기술된 프로토콜에 따라 측정한다.
결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
| 벡터 | 루시퍼라제 활성(RLU/㎎ 단백질) |
| BGTC/DOPE 리포솜:pRSV-LucpRSV-Lac Z | 2.8 x 105(평균: 3 x 104-8 x 105)0 |
| 네이키드 DNApRSV-Luc | 0 |
루시퍼라제 활성을 폐 균등질을 제외한 기관 균등질에서 체계적으로 검출한다. 이러한 관측값은 Xgal에 양성인 세포 분포의 관측동안 얻어진 이전의 결과와 일치한다. 루시퍼라제 발현은 어떠한 활성도 Lac Z 플라스미드를 함유한 대조군에서 검출될 수 없기 때문에 발현 플라스미드와 직접 관련된 것임을 알 수 있다. 대조군으로는, 벡터없이 수행된 플라스미드의 형질감염이다. 루시퍼라제 발현은 이러한 대조 분석에서는 관찰되지 않는다.
이러한 자료는 호흡기에서 생체 내 유전자 형질감염을 위한 BGTC/DOPE 리포솜의 효율을 입증한다.
실시예 10
정맥 또는 복강 주사에 의한 생체 내 유전자 전달
양이온 지질 및 DNA의 제형에 관해서는 실시예 7에서 기술하고 있다.
10.1- 양이온 지질의 투여 효과(도 7-8)
5-주간 자란 BalbC 마우스에 37.5 mM NaCl 용액, 5% 글루코스 중 200 ㎕의 형질감염 혼합물을 이용해 정맥내(꼬리 정맥) 또는 복강내 경로를 통해 주사하고 정맥 주사 후 폐, 및 복강 주사 후 간 및 비장에서 24 시간 후-형질감염을 관찰한다. 기관을 프로테아제 저해제[Boehringer 1697498]로 보충된 용해 완충액[Promega E153A] 중 콜드에서 제거하고 Heidolph DIAX600 분쇄기로 분쇄한다. 루시퍼라제 활성을 조직 추출물 중 14000 g 상등액에서 측정한다.
정맥 주사
각각의 마우스는 "리포솜" 형태의 다양한 농도의 BGTC와 합쳐진 50 ㎍의 DNA를 수용한다. 측정된 최적 비는 9 nmol 양이온 지질/㎍ DNA이다(도 7); 어떠한 독성도 주사된 900 nmol이하의 BGTC양에서는 측정될 수 없다.
복강 주사
"리포솜"의 형태의 BGTC를 100 ㎍ DNA/마우스로 주사한다. 간(도 8B) 및 비장(도 8A) 모두에서, 최적 발현은 1.5 nmol BGTC/㎍ DNA의 경우에 얻어진다.
10.2 - 정맥 주사 후 발현 동역학
본 출원인은 시간의 함수로서 7개 기관에서 루시퍼라제 발현의 생물 분포를 측정한 다음 37.5 mM NaCl, 5% 글루코스 중 200 ㎕ BGTC "리포솜"/DNA 혼합물[50 ㎍ DNA 및 9 nmol BGTC/㎍ NaCl]을 5-주간 자란 BalbC 마우스의 꼬리 정맥에 주사한다. 결과는 결정 형태로 시판되는 루시퍼라제를 이용해 보정 곡선에 기본한 추출된 루시퍼라제 피코그램/기관으로 표시된다. 검출 한계는 0.5 내지 1 피코그램 루시퍼라제이다.
본 출원인은 시험된 조건하에, 최대 발현이 연구된 7 기관 중 6, 즉 횡격막, 비복근, 심장, 폐, 신장 및 비장의 경우 23 시간 후-형질감염이 얻어짐을 입증하고 있다. 간 수준에서의 발현은 다소 조숙하게 나타난다. 최대 발현은 23 시간 후-형질감염에서 0.5 나노그램 을 지닌 폐 수준에서 얻어진다.
Claims (23)
- 화학식 1의 화합물 및 이의 염.화학식 1화학식 2화학식 3상기식에서,R1은 콜레스테롤 유도체 또는 R' 및 R''가 서로 독립적으로 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 C12또는 C22지방족 라디칼을 나타내는 알킬아미노 -NR'R'' 그룹을 나타내고,R2 및 R3는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 2의 그룹을 나타내며, 이들 중 적어도 하나는 수소 원자가 아니며,n 및 m은 그룹 R2 및 R3간에 서로 독립적이고 상이하며, 정수 0 내지 4를 나타내며,R4 및 R5는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 3의 그룹을 나타내며,p 및 q는 서로 독립적으로 정수 0 내지 4를 나타내고 r은 0 또는 1이며, r이 1인 경우,X는 NH 그룹을 나타내고 그때 x는 1, 또는X는 질소 원자를 나타내고 그때 x는 2이며,p, q 및 r은 그룹 R4 및 R5간에 독립적으로 변할 수있다.
- 제 1 항에 있어서, R2 및 R3가 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 4의 그룹을 나타냄을 특징으로 하는 화합물.화학식 4화학식 5상기식에서,n, m 및 p는 앞서 정의한 바와 같고,R4는 수소 원자 또는 화학식 5의 그룹을 나타내며,q 및 r은 앞서 정의한 바와 같으며,m, n, p, q 및 r은 상이한 그룹 R2 및 R3간에 독립적으로 변할 수 있다.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바람직하게는 하기 화학식 중 하나로 표현되는 화합물임을 특징으로 하는 화합물.화학식 6화학식 7화학식 8화학식 9화학식 10상기 식에서,R1은 제 1 항에 따라 정의한 바와 같다.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,[[(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N - COO - R1[(H2N)2 +C-NH-(CH2)3] [(H2N)2 +C-NH-(CH2)4]-N-COO-R1 및[(H2N)2 +C-(CH2)2]2N-COO-R1으로부터 선택되고, R1이 콜레스테릴 그룹을 나타냄을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 비스 구아니디노 스퍼미딘 콜레스테롤(BGSC)임을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 비스 구아니디노 트렌 콜레스테롤(BGTC)임을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 화합물이 비스 구아니디노 스퍼미딘 콜레스테롤(BGSC)임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 화합물이 비스 구아니디노 트렌 콜레스테롤(BGTC)임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 또한, 핵산을 함유함을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 핵산이 리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 따른 화합물, 중성 지질 및 핵산을 포함하는 약학 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 화합물이 BGTC 및 BGSC로부터 선택됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 중성 지질이 DOPE임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 핵산이 리보핵산임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 7 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 가능한 제형을 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 7 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막에 적용하기 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 세포의 시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내 형질감염을 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
- 핵산을 제 1 항에 따른 화합물과 접촉시키고 생성된 혼합물을 세포와 함께 배양하는 것을 포함하는, 세포로의 핵산 전달방법.
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