SK283575B6 - Zlúčeniny amidíniového typu, farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, a ich použitie - Google Patents

Zlúčeniny amidíniového typu, farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, a ich použitie Download PDF

Info

Publication number
SK283575B6
SK283575B6 SK1182-98A SK118298A SK283575B6 SK 283575 B6 SK283575 B6 SK 283575B6 SK 118298 A SK118298 A SK 118298A SK 283575 B6 SK283575 B6 SK 283575B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
pharmaceutical composition
transfection
nucleic acid
bgtc
amidinium
Prior art date
Application number
SK1182-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK118298A3 (en
Inventor
Jean-Marie Lehn
Pierre Lehn
Jean-Pierre Vigneron
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26232562&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK283575(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from FR9602604A external-priority patent/FR2745569B1/fr
Priority claimed from FR9609557A external-priority patent/FR2751972B1/fr
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique
Publication of SK118298A3 publication Critical patent/SK118298A3/sk
Publication of SK283575B6 publication Critical patent/SK283575B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Amidíniové deriváty všeobecného vzorca (I), kde R1 je derivát cholesterolu a každá skupina R2 a R3 je nezávisle atóm vodíka alebo skupina vzorca (II), kde každá skupina R4 a R5 je nezávisle atóm vodíka alebo skupina vzorca (III). Farmaceutické prostriedky s ich obsahom je možné využiť pri génovej terapii na prenos terapeutických génov na bunky.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka nových zlúčenín amidíniového typu vrátane najmä guanidíniových zlúčenín, farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú a ich aplikácií.
Doterajší stav techniky
Dokument J. K. Guy-Caffrey et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 270, no. 52, December 29, 1995, str. 31391 - 31396, opisuje použitie polyaminolipidov obsahujúcich conjugáty spermidínu alebo spermínu spojené prostredníctvom karbamátovej väzby s cholesterolom na zvýšenie bunkovej absorpcie olígonukleotidov.
Dokument K. Jayaraman et al., Nucleosides and Nucleotides, vol. 14, no. 3-5, str. 951 - 955 opisuje použitie spermíncholesterolu a spermidíncholesterolu na zvýšenie bunkovej absorpcie olígonukleotidov.
Spis WO 96/01840 sa týka katiónových lipidov obahujúcich jeden alebo dva argininy, lyzíny alebo omitíny, ktoré sú spojené s lipofilnou skupinou. Tieto zlúčeniny sa môžu používať na transfekciu nukleových kyselín alebo peptidov.
Patentový spis WO 96/18372 opisuje katiónové amfifilné zlúčeniny s rôznou štruktúrou, ktoré umožňujú intracelulárne prenášanie biologicky aktívnych molekúl, ako je DNA a môžu sa použiť v génovej terapii.
Podstata vynálezu
Teraz sa zistilo, že zlúčeniny amidíniového typu sú vhodné ako transfekčné činidlá. Predkladaný vynález preukazuje, že použitím týchto zlúčenín dochádza k neočakávanej účinnosti transfekcie a preukazuje aj zníženú bunkovú toxicitu zlúčenín podľa vynálezu. Tieto faktory umožňujú použiť zlúčeniny podľa vynálezu v génovej terapii.
Predložený vynález sa presnejšie týka zlúčenín všeobecného vzorca (1) a ich soli
R.2 r yr'o—r’ (I1, kde
R1 je derivát cholesterolu,
R2 a R3 sú nezávisle od seba atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (II), kde aspoň jedna zo skupín R2 a R3 je iná ako atóm vodíka,
-í(CH2)n-N-VR5 :I:1, kde n a m sú, nezávisle od seba a rozdielne pri skupinách R2 a R3, celé číslo 0 až 4,
R4 a R5 sú nezávisle od seba atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (III), pričom aspoň jedna zo skupín R4 a R5 je iná ako atóm vodíka,
-ÍCHzlp—(X)r
(III) )
kde p a q sú nezávisle od seba celé číslo 0 až 4 a r sa rovná 0 alebo 1, kde r sa rovná 1
X je skupina NH a x sa potom rovná 1
X je atóm dusíka a x sa potom rovná 2 a je možné, že p, q a r sa menia nezávisle medzi skupinami R4 a R5.
Ako výhodná podskupina sa môže v rámci predloženého vynálezu uviesť zlúčenina všeobecného vzorca (I), kde R2 a R3 sú nezávisle od seba atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (IV) <CH, >-<χ(IV) ^4 m 2 « ' NH2 kde n, m a p sú definované a R4 je atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca(V)
— (CH:) — (NHJ-C.IV) r XNHkde q a r sú definované, a je možné, že m, n, p, q a r sa nezávisle menia medzi rôznymi skupinami R2 a R3.
Tieto nové zlúčeniny všeobecného vzorca (I) je možné pripraviť vo forme nejedovatých a farmaceutický prijateľných solí. Medzi nejedovaté soli patria soli s anorganickými kyselinami (kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná alebo kyselina dusičná) alebo soli s organickými kyselinami (kyselina octová, kyselina propiónová, kyselina jantárová, kyselina malcínová, kyselina hydroxymaleínová, kyselina benzoová, kyselina fumarová, kyselina metánsulfónová alebo kyselina šťaveľová), alebo soli s anorganickými zásadami (hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lítny alebo hydroxid vápenatý) alebo soli s organickými zásadami (terciáme amíny, ako je trietylamín, piperidín alebo benzylamín).
Medzi reprezentatívne zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, ktoré sa môžu zvlášť uviesť, patria zlúčeniny nasledujúcich všeobecných vzorcov:
(H2N)2 +C-NH-(CH2)2-NH-COO-R'VI, [rH2Nj2 +C-NH-(CH;)J[(H2N)-C'-NH-(CH2)4]-N-COO-R' VII, [(H2N)2+C-NH-(CH2)2]2-N-(CH2)2-NH-COO-R'VIII, [(H2N)2T-(CH2)2]2-N-COO-R‘IX, [[(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N-COO-R'x, kde R1 má uvedený význam.
Ako reprezentatívne príklady nárokovaných guanidiniových a amidíniových zlúčenín je možné uviesť zvlášť zlúčeniny uvedených vzorcov (VII), (VIII) a (IX), kde R1 je cholesterylová skupina. Tieto tri zlúčeniny budú v tomto poradí neskôr označené názvom BGSC (bis guanidino spermidin cholesterol) a BGTC (bis guanidino tren cholesterol) a BADC (bis amidinium dietylentriamin cholesterol bishydrochlorid).
Nárokované zlúčeniny sú veľmi výhodné najmä z liečebného hľadiska pre svoju nejedovatú povahu a amfifilné vlastnosti. Kvôli týmto vlastnostiam sa môžu použiť najmä na komplexáciu nukleových kyselín s perspektívou ich bunkovej transfekcie. Tieto zlúčeniny sa môžu preto výhodne použiť v génovej liečbe.
Zlúčeniny (Vil) (BGSC) a (VIII) (BGTC) sú najvýhodnejšie na in vivo génový prenos. Tieto dve zlúčeniny tvoria komplex s DNA a chránia proti degradácii spôsobenej zmenami pH v priebehu prenosu na bunky, ktoré sa majú liečiť.
Vynález sa preto týka farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú najmenej jednu zlúčeninu podľa predlože neho vynálezu. Vo výhodnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu je zlúčeninou bisguanidinospermidíncholesterol (BGSC) a v inom výhodnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu je zlúčeninou bisguanidínotrencholesterol (BGTC).
Hlavným predmetom génovej liečby je korigovať genetické ochorenia spojené s nedostatočnou a/alebo abnormálnou expresiou, čo je nedostatočná alebo nadmerná expresia jednej alebo viacerých nukleových kyselín. Je snaha korigovať tento typ genetickej poruchy pomocou bunkovej expresie klonovaných génov in vivo alebo in vitro.
Navrhlo sa niekoľko spôsobov pre intracelulárne dodanie tohto typu genetickej informácie. Jeden zo spôsobov, ktorý sa bežne používa, je založený na použití chemických alebo biochemických vektorov. Syntetické vektory majú dve hlavné funkcie: spojenie DNA, ktorá sa má transfekovať, a podporu jej bunkového pripojenia a jej priechod cez plazmatickú membránu a, pokiaľ je to vhodné, cez dve bunkové membrány. Na tento účel sa určili pozitívne nabité katiónové lipidy, ako je N-[l-(2, 3-dioleyloxy)propyl]-Ν,Ν,Ν-trimetylamóniumchIorid (DOTMA). Výhodne interagujú vo forme lipozómov alebo malých mechúrikov spontánne s DNA, ktorá je v tejto časti záporne nabitá, pri vzniku komplexov lipid-DNA, ktoré sú schopné spojenia s bunkovou membránou a umožňujú intracelulárne dodanie DNA. V špecifickom prípade DOTMA však dobrá schopnosť transfekcie zostáva spojená s poruchou v biologickom odbúravaní a toxickým charakterom proti bunkám.
Po DOTMA sa vyvinuli iné katiónové lipidy na rovnakom modeli štruktúry: lipofilná skupina kombinovaná s aminoskupinou pomocou tzv. „spojovacej“ ruky. Medzi tieto zlúčeniny patria najmä zlúčeniny, ktoré obsahujú ako lipofílnú skupinu dve mastné kyseliny a derivát cholesterolu a ďalej, pokiaľ je to vhodné, obsahujú ako aminoskupinu kvartérnu amóniovú skupinu. Ako reprezentatívne zlúčeniny tejto skupiny katiónových lipidov sa môžu uviesť DOTAP, DOBT alebo ChOTB.
Na základe chemickej štruktúry a ich biologickej rozložiteľnosti spájajú nárokované zlúčeniny podľa predloženého vynálezu dobre požiadavky potrebné pre transfekčný vektor nukleových kyselín.
Predložený vynález sa preto tiež týka akéhokoľvek použitia týchto nových zlúčenín pri in vitro, ex vivo a/alebo in vivo transfekcii buniek a najmä pri vektorizácii nukleových kyselín. Predložený vynález sa týka najmä akýchkoľvek farmaceutických prostriedkov obsahujúcich nukleové kyseliny spolu s najmenej jednou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu.
V prostriedkoch podľa predloženého vynálezu sa môže nukleová kyselina kombinovať s najmenej jednou nárokovanou zlúčeninou buď deoxyribonukleová kyselina alebo ribonukleová kyselina. Môžu to byť oligonukleotidové alebo polynuklcotidovc sekvencie prírodného alebo umelého pôvodu a najmä genomická DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridná sekvencia alebo syntetické alebo polysyntetické sekvencie. Tieto nukleové kyseliny môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho alebo vírusového pôvodu a podobne. Výhodne obsahujú terapeutické gény.
Iný predmet podľa predloženého vynálezu sa týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ďalej nukleovú kyselinu. Výhodne je táto nukleová kyselina deoxyribonukleová kyselina alebo ribonukleová kyselina. Vo výhodnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu obsahuje nukleová kyselina terapeutický gén.
Na účely podľa predloženého vynálezu sa terapeutickým génom rozumie zvlášť akýkoľvek gén kódujúci pro teínový produkt, ktorý má terapeutický účinok. Takto kódovaným proteínovým produktom môže byť proteín, peptid a podobne. Proteínový produkt môže byť homologický vzhľadom na cieľovú bunku (to znamená produkt, ktorý sa normálne vylučuje v cieľovej bunke, pokiaľ bunka nevykazuje žiadnu chorobnú zmenu). V tomto prípade umožňuje expresia proteínu napríklad kompenzáciu nedostatočnej expresie v bunkách alebo expresiu proteínu, ktorý je neaktívny alebo málo aktívny z dôvodu modifikácie alebo alternatívne nadmernú exprimáciu uvedeného proteínu. Terapeutické gény môžu tiež kódovať mutant bunkového proteínu, ktorý má zvýšenú stabilitu, modifikovanú aktivitu a podobne. Proteínový produkt môže tiež byť heterológny vzhľadom na cieľovú bunku. V tomto prípade môže napríklad dopĺňať alebo poskytovať činnosť, ktorá je v bunke nedostatočná, čo umožňuje ničenie chorobných zmien alebo stimuláciu imunitnej odpovede.
Medzi terapeutickými produktmi na účely podľa predloženého vynálezu sa môžu uviesť najmä enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF a podobne (FR 92/03120), rastové faktory, neuroprenášače alebo ich prekurzory alebo syntetické enzýmy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin a podobne, dystrofín alebo minidystrofín (FR 91/11947), proteín CFTR spojený s cystickou fibrózou, gény potláčajúce nádory, p53, Rb, RaplA, DCC, krv a podobne (FR 93/04745), gény kódujúce faktory obsiahnuté v zrazeninách: faktor VII, VIII a IX, gény obsiahnuté v oprave DNA, sebavražedné gény (thymidínkináza, cytozín deamináza), gény pre hemoglobín alebo iné nosičové proteíny, gény zodpovedajúce proteínom obsiahnutým v metabolizme tukov, alipoproteínový typ vybratý zo súpravy, ktorá obsahuje apolipoproteíny A-I, A-II, A-1V, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzýmy, ako je napríklad lipoproteinlipáza, pečeňová lipáza, lecitíncholesterolacyl- transferáza, 7-alfacholesterolhydroxyláza, fosfatáza fosfatidovej kyseliny, alebo alternatívne proteíny na prenos lipidov, ako je proteín na prenos esterov cholesterolu a proteín na prenos fosfolipidov, proteín pre väzbu HDL alebo alternatívne receptory vybrané napríklad z LDL receptorov, receptorov pre zvyšky chylomikrónov a lapače receptorov a podobne.
Terapeutická nukleová kyselina môže byť tiež gén alebo protizmyslová sekvencia, ktoré expresiou v cieľovej molekule umožňujú kontrolu génov alebo transkripciu bunkovej mRNA. Tieto sekvencie je možné napríklad prepísať v cieľovej bunke na RNA komplementárne k bunkovej mRNA, a tak blokovať ich transláciu na proteín podľa postupu opísaného v patente EP 140 308. Terapeutické gény môžu tiež obsahovať sekvenciu kódujúcu ribozómy, ktoré sú schopné selektívne ničiť cieľovú RNA (EP 321 201).
Ako je uvedené, nukleová kyselina môže tiež obsahovať jeden alebo viac génov kódujúcich antigénny peptid schopný vyvolať imunitnú odpoveď u človeka alebo zvierat. V tomto špecifickom uskutočnení predložený vynález poskytuje prípravu buď vakcíny alebo imunoterapeutickej liečby aplikovanej na človeka alebo zviera, najmä proti mikroorganizmom, vírusom alebo rakovine. Toto uskutočnenie môžu reprezentovať najmä antigénne peptidy špecifické pre Epstein-Barrov vírus, vírus HIV, vírus hepatitídy B (EP 185 573), vírus pseudobesnoty, vírus tvoriaci syncícium (symplazmu) alebo iné vírusy alebo alternatívne antigénne peptidy špecifické pre nádory.
Nukleová kyselina výhodne obsahuje tiež sekvenciu umožňujúcu expresiu terapeutického génu a/alebo génu kódujúceho antigénny peptid v bunke alebo požadovanom orgáne. Môžu to byť sekvencie, ktoré sú prírodné zodpoved né za expresiu uvažovaného génu, keď tieto sekvencie sú schopné pôsobiť v nakazených bunkách. Môžu to byť tiež sekvencie iného pôvodu (zodpovedné za expresiu iných proteínov) alebo dokonca syntetické. Môžu to byť najmä sekvencie podporujúce eukaryotické alebo vírusové gény. Napríklad to môžu byť podporné sekvencie odvodené od genómu bunky, ktorú je žiadúce nakaziť. Podobne môžu byť podporujúce sekvencie odvodené od genómu vírusu. V tomto ohľade môžu byť napríklad uvedené promótory E1A, MLP, CMV a RSV génov a podobne. Ďalej môžu byť tieto expresné sekvencie modifikované pridaním aktivačnej alebo regulačnej sekvencie a podobne. Promótor môže byť stimulujúci alebo potláčajúci.
Ďalej môžu nukleové kyseliny obsahovať, najmä proti prúdu terapeutického génu, signálne sekvencie terapeutického produktu syntetizovaného sekrečnou cestou cieľovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť signálna sekvencia terapeutického produktu, ale môže to tiež byť iná funkčná signálna sekvencia alebo umelá signálna sekvencia. Nukleová kyselina môže tiež obsahovať signálnu sekvenciu riadiacu terapeutický produkt syntetizovaný pre určitú časť bunky.
Katiónové lipidy opísané podľa predloženého vynálezu, a najmä BGTC a BGSC, sú schopné tvoriť komplex s DNA a predstavujú výhodnú alternatívu vírusových vektorov na prenos nukleových kyselín, ktoré sú terapeuticky zaujímavé, in vitro, ex vivo alebo in vivo. Pre chemické vlastnosti guanidíniových skupín, najmä pre ich vysoké pKa, sú tieto katiónové lipidy schopné chrániť molekulu DNA proti degradácii spôsobenej zmenami pH. Výsledky uvedené v príkladoch ukazujú, že tieto zlúčeniny umožňujú transfekciu mnohých bunkových typov s veľkou účinnosťou. Účinnosť transfekcie závisí najmä od pomeru katiónový lipid/DNA vo vytvorenom komplexe. Pomer medzi dvoma zlúčeninami, ktorý je zvlášť vhodný na transfekciu, tvorí 6 až 8 guanidíniových skupín na jednu fosfátovú skupinu DNA.
Účinnosť transfekcie komplexov katiónový lipid/DNA sa môže ďalej zlepšiť pomocou pridania neutrálneho lipidu a tvorbou katiónových lipozómov. Tieto lipidy sa pripravia pomocou komplexácie medzi katiónovým lipidom a neutrálnym lipidom. Neutrálne lipidy sú vybrané zo skupiny, ktorú tvoria:
- dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE),
- oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamín (POPE),
- distearoyl, dipalmitoyl, dimirystoyl fosfatidyletanolamín,
- ich deriváty', ktoré sú 1 až 3 krát N-metylované,
- fosfatidylglyceroly,
- diacylglyceroly,
- glykozyldiacylglyceroly,
- cerebrozidy (ako sú najmä galaktocerebrozidy),
- sfingolipidy (ako sú najmä sfingomyelíny) a
- asialogangliozidy (ako sú najmä asialo GM1 a GM2).
Výhodne sa používa DOPE.
Výhodne je zlúčenina podľa predloženého vynálezu a neutrálny lipid prítomný v pomere 1 až 5, výhodnejšie 2 až 4.
Ďalej pomer úplný lipid (zlúčenina podľa predloženého vynálezu plus neutrálny lipid) k DNA je výhodne vybraný tak, že čistý pomer kladných nábojov je medzi 2 a 5. Zvlášť výhodný je pomer 3.
Predložený vynález sa týka tiež akýchkoľvek farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeninu podľa predloženého vynálezu, neutrálny lipid a nukleovú kyselinu. Výhodne je zlúčenina podľa predloženého vynálezu vybraná z BGTC a BGSC. Rovnako výhodne je neutrálnym lipidom DOPE. Nukleová kyselina je buď deoxyribonukleová kyselina alebo ribonukleová kyselina. Nukleová kyselina výhodne obsahuje terapeutický gén.
Na použitie nárokovaných amidíniových derivátov je tiež možné použiť v nasledujúcich aplikáciách: interferenciu pri interakcii medzi nukleovou kyselinou a proteínom s dosiahnutím inhibície alebo stimulácie určitého procesu, napríklad regulácie genetickej expresie alebo enzymatickej aktivity (polymerázy, transkriptázy a podobne), selektívnu komplexáciu aniónových druhov pri ich extrakcii, ich odstránenie alebo ich detekciu napríklad pomocou membrány elektróda/sonda, použitie ako laboratórneho činidla na uskutočňovanie in vitro transfekčných operácií a podobne.
Predmetom podľa predloženého vynálezu je tiež terapeutická aplikácia amidíniových derivátov, ako je opísané, buď priamo alebo vo farmaceutických prostriedkoch.
Farmaceutické prostriedky výhodne obsahujú farmaceutický prijateľné vehikulá na injekčné podávanie prostriedkov, najmä na priame injekčné podávanie v množstve vhodnom pre orgán, alebo na podávanie miestnym spôsobom (na pokožku a/alebo sliznicu). Prostriedky môžu byť najmä vo forme izotonických, sterilných roztokov alebo v suchej forme, výhodne sušené pri mraze, ktoré sa pri podávaní v závislosti od druhu rozpustia v sterilnej vode alebo vo fyziologickej solanke a získa sa roztok na injekčné podávanie.
Predložený vynález bude ďalej podrobnejšie opísaný pomocou nasledujúcich príkladov a obrázkov, ktoré sú iba ilustratívne a predložený vynález neobmedzujú.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Schematicky zobrazuje postup na prípravu BGSC a BGTC.
Obrázok 2: Schematicky zobrazuje postup na prípravu BADC.
Obrázok 3: Meranie účinnosti transfekcie ako funkcie pomeru lipidná zlúčenina/DNA.
Obrázok 4: Meranie účinnosti transfekcie ako funkcie pomeru úplné lipidy/DNA.
Obrázok 5: Meranie vplyvu séra na účinnosť transfekcie HepG2 (5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) a 293 (5D). Šrafované stĺpce: prítomnosť séra; prázdne stĺpce: transfekcia bez prítomnosti séra 2 hodiny.
Obrázok 6: Fotografie kryosekcií priedušnice myši ktoré ukazujú expresiu génu v epiteli dýchacích ciest po in vivo transfekcii lipozómami BGTC/DOPE. (6A) a (6B): detekcia expresie beta-galaktozidázy v transfekovaných bunkách umiestnených na povrchu epitelu (6A) a v žľaze pod sliznicou (6B); (6C): detekcia bunky vylučujúcej betagalaktozidázu v žľaze pod sliznicou pomocou imunoperoxidázového značenia s použitím antibetagalktozidázovej monoklonálnej protilátky; (6D): detekcia bunky vylučujúcej luciferázu v žľaze pod sliznicou pomocou imunoperoxidázového značenia s použitím antiluciferázovej polyklonálnej protilátky; (6E): zafarbenie imunoperoxidázy: negatívna kontrola uskutočňovaná bez prítomnosti protilátok.
Obrázok 7: Meranie účinnosti prenosu génov in vivo pomocou vnútrožilovej injekcie komplexu DNA/BGTC-lipozóm.
Obrázok 8: Meranie účinnosti prenosu génov in vivo pomocou intraperitoneálnej injekcie komplexu DNA/BGTC-lipozóm.
Príklady uskutočnenia vynálezu
A. Príprava derivátov podľa predloženého vynálezu Látky a spôsoby
1. Fyzikálne meranie
Protónové spektrá nukleárnej magnetickej rezonancie (’H NMR) sa zaznamenali na spektrometri Bruker AC200. Chemické posuny sú vyjadrené v ppm vzhľadom na TMS.
2. Chromatografia na silikagéli
Chromatografia na tenkej vrstve (TLC) sa uskutočňovala na silikagélových doskách Merck 0,2 mm hrubých.
Kolónová chromatografia sa uskutočňovala na silikagéli Merck 60 s veľkosťou častíc 0,040 až 0,063 mm.
Príklad 1
Príprava quanidinospermidíncholesterolu BGSC
L Príprava di-Bockarbamátu (1)
Roztok cholesterylchloroformiátu (0,9 g, 2 mmol) a trietylamínu (0,214 g, 2 mmol) v dichlórmetáne (40 ml) sa pridá k roztoku ’N^N-Bocj-spermidinu (0,690 g, 2 mmol) v dichlórmetáne (20 ml). Po 5 hodinách zohrievania do varu sa zmes premyje vodou (2 x 50 ml), suší sa nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa odparí. Surový produkt sa čistí pomocou chromatografie na silikagéli pri elúcii zmesou dichlórmetán/metanol 95/5 a získa sa surový karbamát (1,3 g, 86 %).
’H NMR μ (deuterochloroform, 200 MHz); 0,5 - 2,5 (m, štruktúra cholesterylu, Boe signál a centrálne CH2 skupiny zo spermidínu), 3,1 - 3,3 (m, 8H, N-CH2), 4,50 (m, 1H, 5,37) (d, 1H, H6).
2. Príprava aminokarbamátu (2)
Zlúčenina (1) (1,3 g) sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu a k chladenému roztoku (ľadový kúpeľ) sa pridajú 2 ml čerstvo destilovanej kyseliny trifluóroctovej a odstránia sa tak chrániace skupiny BOC. Po 3 hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa pridá 50 ml IN hydroxidu sodného a zmes sa extrahuje dichlórmetánom. Organické vrstvy sa premyjú vodou, sušia sa nad síranom sodným a odparia a získa sa surový aminokarbamát (2) (0,945 g, 98 %).
'H NMR μ (deuterochloroform, 200 MHz); 0,5 - 2,5 (m, štruktúra cholesterylu a centrálnych skupín zo spermidínu),
2,7 (m, 4H, CH2-N-CO-), 3,25 (široký m, 4H, N-CH2), 4,49 (m, 1H, H3a), 5,35 (d, 1H, HĎ)
3. Príprava BGSC
Surový karbamát (2) (0,94 g) sa rozpustí v 30 ml zmesi tetrahydrofurán:metanol 85/15. Potom sa pridá lH-pyrazolkarboxamidín (0,495 g, 3,4 mmol) a diizopropyletylamín (0,436, 3,4 mmol) v 30 ml zmesi tetrahydrofurámmetanol 85/15. Po 18 hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa pomaly pridá 250 ml dietyléteru a získaná zrazenina sa oddelí zliatím. Surová zlúčenina sa trikrát suspenduje v diéty létere a oddelí sa zliatím a získa sa surový GSC (0,570 g, 47 %).
‘H NMR μ (perdeuterodimetylsulfoxid, 200 MHz); 0,5 - 2,5 (m, štruktúra cholesterylu a centrálnej skupiny CH2),
3,1 (m, 8H, N-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6); 7,2 (široký s, 8H, NH2+), 7,8 (s, 2H, NH).
Elementárna analýza pre C37H67N7O2. 2HC1: vypočítané: C 62,15; H 9,67; N 13,71; nájdené: C 62,28; H 9,81; N 13,15.
Príklad 2
Príprava quanidinotrencholesterolu (5)
1. Príprava aminokarbamátu
Roztok cholesterylchloroformiátu (1,8 g, 4 mmol) v 100 ml dichlórmetánu sa pomaly pridá k roztoku tris (2-aminoetyl)-amínu (TREN) (11,68 g, 80 mmol) v 400 ml dichlórmetánu. Po dvoch hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa inertný amín odstráni premytím vodou (3 x 100 ml) a po sušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odparí. Zlúčenina (5) sa izoluje vo forme trihydrochloridu nasledujúcim spôsobom: surový produkt sa rozpustí v 10 ml metanolu a prikvapká sa nasýtený metanolický roztok (5 ml) kyseliny chlorovodíkovej; získaná zrazenina sa oddelí zliatím a získaná čistá zlúčenina sa trikrát suspenduje v metanole a oddelí zliatím. Po sušení vo vákuu sa získa čistý trihydrochlorid (6) (1,71 g, 64 %).
'H NMR μ (deuterochloroform + perdeuterometanol, 200 MHz); 0,5 - 2,4 (m, štruktúra cholesterylu), 2,5 (m, 2H, CH2NHCO), 2,8 (široké s, 4H, +HN-CH2), 3,06 (široké s, 4H, CH2NH3+), 3,20 (m, 2H, ®HN-CH2), 4,4 (m, 1H, H3n), 5,3 (d, 1H, H6).
Elementárna analýza pre C34H62N4O2.3HC1: vypočítané: C 61,10; H 9,80; N 8,38;
nájdené; C 61,25; H 9,96; N 8,22,
2. Príprava BGTC
Roztok cholesterylchloroformiátu (2,24 g, 5 mmol) v 100 ml dichlórmetánu sa pomaly pridá k roztoku tris(2-aminoetyl)-amínu (TREN) (29,2 g, 200 mmol) v 250 ml dichlórmetánu. Po 2 hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa inertný amín odstráni premytím vodou (3 x 100 ml) a potom sa organický roztok suší nad síranom horečnatým, rozpúšťadlo sa odparí. Surový produkt (3,2 g) sa rozpustí v zmesi tetrahydrofurámmetanol 50/50 (20 ml); potom sa k zmesi pridá lH-pyrazol-l-karboximidín (1,465 g, 10 mmol) a diizopropylamín (1,3 g, 10 mmol). Po 18 hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa pridá dietyléter a získaná zrazenina sa oddelí zliatím. Na získanie čistej vzorky sa surová zlúčenina suspenduje trikrát v dietyléteri a oddelí sa zliatím (2,15 g) 60 %) po sušení vo vákuu.
’H NMR μ (perdeuterodimetylsulfoxid, 200 MHz); 0,5 - 2 (m, štruktúra cholesterylu), 2,2 (m, 2H, N-CH2), 2,6 (široké s, 4H, N-CH2), 3,0 (d, 2H, N-CH2), 3,2 (široké s, 4H), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 7,3 (široké s, 8H, NH2+), 7,8 (široké s, 2H, NH).
Elementárna analýza pre C36H66NgO2.2HCl: vypočítané: C 60,39; H 9,57; N 15,65;
nájdené: C 60,38; H 9,67; N 15,56.
Príklad 3
Príprava bisamidíniumbishydrochloridu BACD
1. Príprava dinitrilu
Roztok cholesterylchloroformiátu (8,97 g; 20 mmol) v dichlórmetáne (100 ml) sa prikvapká k roztoku iminopropionitrilu (2,46 g, 20 mmol) a trietylamínu (2,02 g, 20 mmol) v dichlórmetáne (100 ml). Po 6 hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa reakčná zmes premyje vodou (2 x 100 ml) a suší sa nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odparí a surový produkt (10,5 g) sa rekryštalizuje z metanolu (8,59 g; 80 %).
’H NMR μ (deuterochloroform, 200 MHz); 0,5 - 2,5 (m, štruktúra cholesterylu), 2,7 (m, 4H; -CH2CN), 3,62 (m, 411, -CH2-N-), 4,50 (m, 1H, H3a), 5,39 (d, 1 H, H6).
2. Príprava ditioamidu
Slabý prúd sírovodíka sa 2 hodiny prebubláva roztokom dinitrilu pripraveného tak, ako je opísané (0,324 g, 6 mmol) a dietylamínu (0,884 g; 12 mmol) v dimetylformamide (30 ml), teplota sa udržiava na 50 °C. Modrý roztok sa naleje na ľad a získaná zrazenina sa oddelí fdtráciou. Surový produkt sa rozpustí v dichlórmetáne a premyje vodou (2 x 50 ml). Po sušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odparí a získaný produkt sa rekryštalizuje dvakrát z metanolu (1,86 g; 51,5 %).
'H NMR μ (perdeuterodimetylsulfoxid, 200 MHz); 0,5 -
2.5 (m, štruktúra cholesterylu), 2,67 (t, 4H; N-CH2), 3,50 (t, 4H, S=C-CH2), 4,3 (m, 1H, H3o), 5,33 (d, 1H, H6).
3. Príprava ditioamidátu bisjodidu
Metyljodid (2 ml) sa pridá k roztoku ditioamidu (0,603 g; 1 mmol) v acetóne (20 ml) a zmes sa nechá stáť pri laboratórnej teplote 48 hodín. Získaná zrazenina sa odfiltruje (0,741 g; 83,5 %). Tento produkt sa použije priamo bez ďalšieho čistenia.
4. Príprava bisamidíniumbishydrochloridu BADC
Prúd amoniaku sa pri teplote varu prebubláva 2 hodiny cez suspenziu bisjodidu (0,741 g; 0,83 mmol), ktorý sa získa tak, ako je uvedené, v izopropanole (10 ml), a potom pokračuje zohrievanie do varu ďalšie 4 hodiny. Izopropanol sa odparí a zvyšok sa prevedie do metanolu (10 ml). Roztok sa prefiltruje cez zásaditú ionexovú živicu, potom sa rozpúšťadlom nechá prechádzať prúd kyseliny chlorovodíkovej a roztok sa odparí do sucha. Takto získaný bishydrochlorid sa rozpustí v minimálnom objeme etanolu (asi 5 ml). Svetlá nerozpustná látka sa odfiltruje a k filtrátu sa pridá veľký prebytok dietyléteru. Získa sa prášok, ktorý sa odfdtruje a suší (320 mg; 60 %). Rekryštalizácia z izopropanolu umožní izolovať očakávaný produkt v analyticky čistej forme.
'H NMR μ (perdeuterodimetylsulfoxid, 200 MHz); 0,5 -
2.6 (m, štruktúra cholesterylu a -CH2-amidínia), 3,57 (s, široké 4H, N-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1 H, H6), 8,64 (s, široké; 2H; NH2), 9,07 (s; široké; 1H, NH), 9,18 (s, široké; 2H).
Analýza pre C34H5f,N4O2.2HCl: vypočítané: C 65,25; H 9,32; N 8,94; nájdené: C 65,40; II 9,87; N 9,55.
B. Použitie derivátov podľa predloženého vynálezu na in vitro a in vivo prenos génov
Látky a spôsoby
- Transfekčné testy uvedené neskôr sa uskutočňujú s BGSC a BGTC, ktoré sa pripravia podľa postupu opísaného v príkladoch 1 a 2.
- Príprava lipozómov
Zmes katiónového lipidu a DOPE (v molámom pomere 3/2) v chloroforme (CHC13) sa odparí vo vákuu a v dusíkovej atmosfére sa suspenduje v 20 mM HEPES pufrovacom roztoku s pH 7,4.
Koncentrácia úplného lipidu je 1,2 mg/ml.
Zmes sa 5 minút mieša a potom sa na ňu pôsobí ultrazvukom (sonikuje) 5 minút pomocou ultrazvukového prístroja (sonikátor) (Branson Ultrasonic 2210), nakoniec sa skladuje pri + 4 °C 24 hodín pri hydratácii.
Vzniknutá disperzia sa znova sonikuje (Sonikátor Branson 450) 5 až 10 minút pri vzniku lipozómov.
Po odstredení sa roztok filtruje na filtri s veľkosťou pórov 0,22 pm (Millex GS, Millepore) a skladuje pri + 4 °C.
Veľkosť lipozómov obsahujúcich BGSC alebo BGTC sa skúma pomocou laserového difrakčného prístroja (Autosizer 4700, Malvem Instruments). Tento test vykáže jeden pík zodpovedajúci strednému priemeru 50 nm pri mnohých multimodálnych analýzach.
- Bunkové kultúry
Zdroje (druhy a tkanivá) väčšiny bunkových kmeňov použitých na transfekčné pokusy sú uvedené v tabuľke I.
Bunky bunkového kmeňa HeLa (P. Briand, ICGM Paríž) sú odvodené od ľudskej rakoviny pochádzajúcej z krčného epitelu. Bunky NIH 3T3 (C. Lagrou, Pasteurov inštitút, Lille) sú fibroblasty myší.
Bunkový kmeň NB2A (C. Gouget, Paríž) je odvodený od neuroblastómu myši.
Všetky bunky okrem buniek AtT-20 a PC 12 sa kultivujú v modifikovanom médiu Dulbecco (DMEM, GIBCE) doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom (FCS, GIBCO), penicilínom so 100 jednotkami/ml (GIBCO) a streptomycínom (GIBCO) so 100 pg/ml.
Bunky AtT-20 sa kultivujú v DMEM/F12 (GIBCO) doplnenom o 10 % fetálneho séra teliat.
Bunky PC 12 sa kultivujú v DMEM doplnenom 10 % FCS a 5 % sérom koní.
Všetky bunky sa udržiavajú v kultúre v plastových miskách (Falcon) vo vlhkej atmosfére s 5 % oxidu uhličitého.
- Plazmidy
Plazmidy pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paríž) a pRSV-nlsLacZ sa namnožia v E. Coli a pripravia sa čistením na CsCl gradiente pomocou štandardnej techniky. V plazmide pRSV-nlsLacZ a plazmide pRSV-Luc je gén E. Coli LacZ a jeho sekvencia jadrového lokalizačného signálu a gén luciferázy v tomto poradí pod transkripčnou kontrolou LTR/RSV („Rous sarcoma vírus“). Plazmid pXL2774 obsahuje gén kódujúci luciferázu pod kontrolou promótora cytomegalovírusu (CMV).
- Postup in vitro transfekcie
Jeden deň pred transfekciou sa 2 x 105 buniek uloží do každej jamky šesťjamkovej dosky Falcon.
Každá jamka obsahuje iný bunkový kmeň.
V deň transfekcie sú teda bunky semikonfluentné.
Plazmid DNA (5 pg) a požadované množstvo bisguanidíniumlipidu sa vždy zriedi 250 μΐ FCS bez DMEM a premieša. Asi po 5 minútach sa dva roztoky nechajú inkubovať 15 minút pri laboratórnej teplote. Transfekčná zmes sa potom pridá k bunkám (0,5 ml na jamku), ktoré sa premyli médiom bez séra. Po 4 až 6 hodinách inkubácie pri 37 °C sa bez odstránenia transfekčnej zmesi do každej jamky pridá 1 ml média so sérom. Po 24 hodinách po transfekcii sa médium nahradí 1 ml čerstvého kultivačného média. Bunky sa izolujú 2 dni po transfekcii a odmeria sa expresia luciferázy.
Kontrolná transfekcia sa uskutočňovala s použitím komerčne dostupných transfekčných činidiel:
- lipopolyamín Transfectam® (JP Behr, Strasbourg, Francúzsko) sa použil v alkoholickom roztoku v optimálnom pomere Transfectam®/DNA iónový menič 6-8.
- Lipofectin® (Life Technologies Inc., Cergy pontoise, Francúzsko), ktorý je lipozomovým prostriedkom obsahujúcim ako neutrálny lipid DOPE a ako katiónový lipid DOTMA. (N-[l-(2, 3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamóniumchlorid).
- Komplex DNA/lipozóm sa získa v štandardných podmienkach doporučených výrobcom.
- Bunky sa transfekujú pomocou precipitácie fosforečnanom vápenatým. (Keown, W. A., Cambell, C. R., Kucherlapati, R. S., (1990) Methods in Enzymology; Academic Press: Ncw York, 185, 527 - 537).
- Meranie luciferázy na transfekciu uskutočňovanú in vitro
Aktivita luciferázy sa merala 48 hodín po transfekcii s použitím variantu postupu opísaného v De Wet a kol. (De Wet J. R., Wood K. V., DeLuca M., Helinski D. R., a Subramami S. (1987) Mol. Celí. Biol. 7,725 - 737).
- odstráni sa kultivačné médium,
- bunky sa premyjú soľným roztokom studeného fosfátového pufra,
- potom sa lyžujú inkubáciou v 250 μΐ lyzovacieho pufra (25mM trifosfát pH 7; 8,8 mM chlorid horečnatý, 1 mM ditiotreitol, 15 % glycerol a 1 % tritón X-100).
- Po odstránení nerozpustných látok pomocou odstredenia (15 mm, 4 °C) v mikroodstredivke sa získa číry lyzát,
- alikvotný diel (20 μΐ) bunkového extraktu sa zriedi v 100 μΐ lyzovacieho pufru, ku ktorému sa pridá 9 μΐ 25 mM ATP (Sigma) a 20 μΐ 25 mM luciferínu (Sigma).
- vzorky sa umiestnia do luminometra (Lurmet LB9501 Berthold, Nashua, NH) a 10 sekúnd sa meria emisia svetla.
Kalibrácia krivky RLU/luciferáza sa uskutočňuje s použitím rôznych zriedení čistej luciferázy zo svetlušiek (Sigma) a zistí sa, že lineárna časť krivky sa pohybuje od 104 až 107 RLU (relatívna svetelná jednotka).
Koncentrácia proteínu sa meria pomocou BCA (bicínchonínová kyselina) testu s použitím hovädzieho sérového albumínu ako kontroly.
Údaje na aktivitu luciferázy sú vyjadrené v RLU/mg proteínu.
- Postup in vivo injektáže na úrovni dýchacích ciest myší
Použitými myšami sú samice OF1 myší (hmotnosť 30 g) získané od Iffa-Credo (Lyon, Francúzsko). Použijú sa katiónové lipozómy BGTC/DOPE (molárny pomer 3 : 2). Transfekčná zmes sa získa z 10 pg plazmidu DNA (v 10 μΐ vody), 20 μΐ katiónového lipozómu v 20 mM média Hepes (pH 7,4), pri koncentrácii úplného lipidu 5 mg/ml. Agregáty DNA/lipid takto pripravené majú pomer náboja rádu 6.
Po anestézii myši pomocou pentobarbitalu sa transfekčná zmes (30 pl) injektuje do dýchacích ciest pomocou intratracheálneho nakvapkania pomocou kanyly vloženej do dýchacej dutiny. 48 hodín po nakvapkaní sa zviera usmrtí pomocou predávkovania pentobarbitalom a pľúca a priedušnice sa vyberú na analýzu.
- farbenie pomocou X-gal
Na meranie expresie E. coli betagalaktozidázy v primárnej kultúre sa bunky napúšťali 15 minút pri 4 °C 4 % roztokom paraformaldehydu a potom sa inkubovali s chromofénnym betagalaktozidázovým X-gal substrátom (Sigma). Modrá farba jadier transfekovaných buniek sa merala pomocou luminiscenčnej mikroskopie.
- Meranie X-gal buniek na úrovni dýchacích ciest transfekovaných in vivo
Na detekciu buniek na úrovni dýchacích ciest sa pľúca a priedušnice podrobili 1 hodinu pôsobeniu formaldehydu, potom sa ponorili na noc do PBS obsahujúceho 30 % sacharózy, potom sa uložili do mraziaceho média a zmrazili kvapalným dusíkom. Zmrznuté časti 5 μ sa potom farbili na aktivitu β-galaktozidázy pomocou inkubácie s činidlom X-gal (Sigma) cez noc.
- Meranie luciferázy na úrovni dýchacích ciest transfekovaných in vivo
Na meranie aktivity luciferázy na konci in vivo transfekcie sa časti tkaniva vystavili 30 μΐ lyzovacieho pufra (25 mM trisfosfát pH 7,8, 1 mM ditiotreitol (DTT), 15 % glycerol a 1 % tritón X-100), lyžovali sa asi 1 minútu v homogenizéri (Polylabo, Strasbourg, Francúzsko) a skladovali sa v ľade. Po odstredení sa 20 pl lyzátu použilo na meranie. Aktivita luciferázy je vyjadrená v RLU na mg proteínu.
- Imunohistochemický postup
Zmrazené časti vzoriek pľúc a priedušnice sa 1 hodinu inkubovali buď s myšou monoklonálnou protilátkou anti-E. coli β-galaktozidázou pri 5 pg/ml (Genzyme, Cambridge, MA) alebo s králičou polyklonálnou protilátkou pri zriedení 1 : 400 (Progema).
Escherichia coli β-galaktozidázový proteín sa meral pomocou farbenia imunoperoxidázou s použitím biotínom značenej sekundárnej protilátky anti-myší Ig (Boehringer) a konjugátu streptavidín-POD (Boehringer). Luciferázový proteín sa meral pomocou farbenia imunoperoxidázou s použitím protilátky kozieho séra proti králičiemu séru (ICN Biomedicals, Inc) a králičieho systému peroxidáza-antiperoxidáza (PAP) (Dáko Glostrup, Dánsko). Sekcie sa testovali pomocou luminiscenčnej mikroskopie. Negatívna kontrola sa uskutočňovala bez protilátky.
Príklad 4
Transfekcia in vitro pri rôznom pomere transfekčného činidla/DNA
Aby sa optimalizovala účinnosť transfekcie dosiahnutá s agregátmi BGTC/DNA, študoval sa vplyv pomeru BGTC/DNA na rýchlosť transfekcie pri 3 rôznych typoch buniek cicavcov, ktoré sú známe svojou citlivosťou na bežné postupy transfekcie. Výsledky sú uvedené na obrázku 3.
Transfekčné pokusy sa teda uskutočňovali s myšími fibroblastmi 3T3, ľudskými bunkami epitelu HeLa a myšími neuroblastómami NB2A. V priebehu týchto testov sa určité pevné množstvo plazmidov pRSV-Luc uviedlo do kontaktu s rôznymi množstvami BGTC v roztoku. Aby sa určil rozsah pomeru, ktorý má byť študovaný, vyšlo sa z princípu, že jeden pg DNA je ekvivalentný 3 nm negatívne nabitého fosfátu a že len dve guanidíniové skupiny sú pozitívne nabité pri neutrálnom pH na vznik agregátu a na transfekciu. Aktivita luciferázy sa merala 48 hodín po transfekcii. Expresia luciferázy je maximálna pre agregáty obsahujúce 6 (bunky HeLa) až 8 (3T3 a NB2A bunky) guanidíniových skupín na jednu fosfátovú skupinu DNA, teda agregáty majúce veľký kladný náboj.
Príklad 5
Transfekcia in vitro rôznymi typmi buniek
Prenos génov pomocou intermediácie katiónových lipidov je zaujímavou transfekčnou technikou nielen preto, že nevyžaduje medziprodukty, ale tiež preto, že umožňuje transfekovať veľmi širokú škálu buniek rôznych tkanív a organizmov. Na štúdium miery účinnosti BGTC ako transfekčného činidla sa testovalo niekoľko bunkových kmeňov rôzneho pôvodu. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1 neskôr. Pomer náboja pre maximálnu účinnosť sa určil medzi 6 až 8. Na porovnanie sa bunky rovnakých kmeňov transfekovali s použitím lipopolyamínu na jednej strane a fosforečnanu vápenatého na druhej strane. Výsledky ukazujú, že BGTC je bežne účinný ako Transfectam a dvakrát účinnejší ako fosforečnan vápenatý.
Tabuľka 1
Expresia luciferázy na rôznych kmeňoch buniek cicavcov pomocou BGTC, fosforečnanu vápenatého a Transfecta-
RLU/πικ bunkovvch proteínov
Druhy Bunkové kmene Tkanivo BGTC Fosforečnan vápenatí Transfectam ®
Človek A549 Rakovina pľúc 4x10* 7x10* 3.1x10*
Opica COS-7 Ľadviny transformovane SV40 2,1x10 3,7x10* 8,4x10*
Pes MDCK-I Ľadvinv 4.5x10* 2.2x10’
Krysa RIN-nt5F Nádorové bunky ostrovčekov rakoviny pankreasu 2.810 2x10* 3.3x10*
ROS Os eo šatkám 4.0x10“ 4.5x10* 2.3x10*
PCI2 Fenochromocvlôm 3x10' 1.7x10’ 6x10*
Mvi AtT-20 Nádor mozgovej žľazy 2x10 SxlO* 3x10
Všetky transfekcie sa uskutočňovali najmenej dvakrát (n>2).
Príklad 6
Transfekcia in vitro v prítomnosti neutrálneho lipidu
Zlúčenina BGSC je menej rozpustná vo vodnom médiu ako zlúčenina BGTC, použili sme BGSC vo forme lipozómov v prítomnosti neutrálneho lipidu DOPE (dioleylfosfatidyl-etanolamín). Prostriedky sa pripravia v molámom pomere 3/2. Druhý prostriedok obsahujúci BGTC sa pripraví s DOPE v rovnakých podmienkach.
6.1 Určenie pomeru úplný lipid/DNA
Najprv sa určil pomer lipid/DNA počas transfekčného experimentu na bunkách HeLa. Získaná krivka je uvedená na obrázku 4. Optimálna transfekcia sa získa pre pomery BGSC lipozómy/DNA v rozsahu 1,5 až 5 s centrom na 2,5 až 3. Guanidíniová skupina sa protónuje pri neutrálnom pH, najlepšie agregáty BGDC-DOPE/DNA majú kladný náboj okolo 3 (obrázok 4).
Najlepšie pomery BGSC-DOPE/DNA sú preto nižšie ako pomery získané s agregátmi typu BGTC/DNA (medzi 6 a 8). Transfekcia v prítomnosti katiónových lipozómov sa uľahčuje v prítomnosti DOPE a pomocou jeho fuzogénnych vlastností.
6.2 Transfekcia rôznych bunkových kmeňov pomocou katiónových lipozómov
Transfekčné pokusy sa uskutočňovali na rôznych bunkových kmeňoch s použitím prostriedkov katiónových lipozómov BGSC-DOPE a BGTC-DOPE v molámom pomere 3/2. Pomer náboja guanidínium lipid/fosfát DNA je asi 2,5 (~3) pre tieto dvojgénové prenosové systémy. Transfekcia Lipofectinom slúži ako kontrola. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2 neskôr.
Výsledky ukazujú, že deriváty cholesterolu s guanidíniovými skupinami vo forme katiónových lipozómov sú minimálne rovnako účinné na transfekciu ako Lipofectin. Tieto výsledky môžu byť samozrejme na každý bunkový kmeň optimalizované.
Tabuľka 2
Expresia luciferázy v rôznych eukaryotických bunkových kmeňoch transfekovaných pomocou BGSC/DOPE lipozómov, BGTC/DOPE lipozómov a Lipofectinu
RLU/iriq celulárnych proteínov
Bunkové kmene BGSC lipazómy BGTC lipozómy Lipofectin®
HeLa 4,6 x 10* 7,7 x 10’ 3,3 X 10’
A 549 6 x 10a 2 x 10B 4 x L0e
COS-7 ND 1,4 X 10’ 9,5 X 10*
MDCK-1 1 X 10e 7 X 10’ 1,9 x 10*
ROS ND 9 X 10’ 6 x 10’
NB2 A* 1,5 x 10’ 1,4 X 10’ ND
NIH 3T3* 7 x 10e 1,5 X 10’ ND
Všetky transfekcie sa uskutočňovali najmenej trikrát (n>3).
a: znamená meranie pri RLU aktivity luciferázy pre 100 pg/500 pg úplného lyzátu (n>4).
Príklad 7
Testovanie účinku prítomnosti sérových proteínov na účinnosť prenosu génu in vitro
Väčšina transfekčných prostriedkov založených na katiónových lipidoch má zníženú účinnosť v prítomnosti séra. Cieľom tohto príkladu je testovať citlivosť zlúčenín podľa predloženého vynálezu na pôsobenie séra.
7.1 Prostriedky katiónových lipidov
Lipidy opísané v predloženom vynáleze sa rozpúšťajú v etanole.
i) Roztoky „lipozómov“ sa získavajú v prítomnosti DOPE nasledujúcim spôsobom: DOPE (AVANTI) v roztoku v chloroforme sa pridá k roztoku lipidu v etanole v molámom pomere katiónový lipid/DOPE 3/2. Po odparení do sucha sa zmes prevedie do vody a zohrieva sa 30 minút na 50 °C;
ii) Roztoky „miciel“ sa získajú podľa postupu opísaného pre prípravu „lipozómov“, ale roztok DOPE sa nahradí chloroformom.
Roztoky sa všetky upravia na 10 mM katiónového lipidu.
7.2 Nukleová kyselina
Použitou nukleovou kyselinou je plazmid pXL 2774.
7.3 Zmesi cytofektantov (príprava tesne pred použitím)
DNA sa zriedi na 20 pgúnl v 150 mM chloride sodnom a rôzne prostriedky katiónového lipidu sa zriedia vo vode na 40, 80, 120 a 160 μΜ. Rovnaké objemy roztokov DNA a lipidu sa zmiešajú a získa sa pomer v nmol/pg DNA 2, 4, 6 a 8 v tomto poradí; koncentrácia soľanky je 75 mM.
7.4 Transfekcia
Bunky sa kultivujú vo vhodných podmienkach v 24 jamkovej mikrotitračnej doske (2 cm2/jamka) a pri exponenciálnom raste sa transfekujú a z 50-70 % sa zlejú. Bunky sa dvakrát premyjú 500 μΐ média bez sérových proteínov a kultivujú sa znovu buď v médiu bez séra (transfekcia bez prítomnosti séra) alebo v úplnom médiu (transfekcia s prítomnosťou séra) a k bunkám (3 jamky/stav lipid-DNA) sa pridá zmes cytofektantu (0,5 pg DNA/jamka).
Keď sa bunky transfekujú „bez prítomnosti séra“, kultivačné médium sa doplní vhodným množstvom séra 2 hodiny po transfekcii.
Účinnosť transfekcie sa hodnotí pomocou merania expresie luciferázy podľa odporúčania uvedeného na použitie súpravy Progema (luciferázový testovací systém). Toxicita zmesi cytofektantu sa určí meraním koncentrácií proteínu v bunkovom lyzáte.
7.5 Výsledky (obrázok 5)
Výsledky získané so štyrmi bunkovými typmi (NIH3T3 - 293 - HepG2 - HeLa) ukazujú, že v testovacích podmienkach sú prostriedky vo forme „lipozómov“ účinnejšie ako prostriedky vo forme „micel“. Ďalej oproti tomu, čo sa pozorovalo u väčšiny cytofektantových prostriedkov obsahujúcich katiónové lipidy nemôže byť v podmienkach našej transfekcie demonštrovaný žiadny výrazný inhibičný účinok na BGTC vo forme „lipozómov“ alebo „miciel“ spojený s prítomnosťou séra.
Príklad 8
In vivo expresia transgénu v dýchacích cestách myši s BGTC/DOPE lipozómami
Na tento účel sa využili katiónové lipozómy BGTC/DOPE, Príprava agregátov DNA/lipozómy a podávanie sa uskutočňovalo tak, ako je opísané v látkach a spôsoboch.
X-gal bunky sa v epiteli dýchacích ciest pri liečených myšiach detegovali 48 hodín po transfekcii LacZ plazmidu do buniek pomocou BGTC/DOPE lipozómov. Výsledky sú uvedené na obrázku 6.
Väčšina transfekovaných buniek sa nachádzala v priedušnici a iba malé množstvo X-gal buniek sa našlo v sekundárnych dýchacích cestách. Tento typ rozdelenia bol už uvedený pri iných bunkových transfekciách.
Imunohistochémia sa ďalej uskutočňovala s účelom identiflkácie produktu uvedeného génu. Na úrovni povrchu epitelu (obrázok 6A) sa prevažne transfekovali maturované bunky. Tieto údaje ukazujú, žc katiónové lipozómy sú schopné indukovať transfekciu génov pri neproliferačných a úplne diferencovaných bunkách epitelu dýchacích ciest. Expresia transgénu sa tiež zisťovala v žľaze pod sliznicou (obrázok 6B). Detekcia pomocou imunologického označenia transfekovaných buniek s použitím monoklonálnej protilátky namierenej proti E.coli B-galaktozidáze potvrdzuje túto expresiu v žľaze pod sliznicou a na povrchu epitelu (obrázok 6D). Transgénna expresia sa tiež demonštruje v žľaze pod sliznicou pomocou imunoperoxidázového označenia protilátkou riadenou proti luciferázovému proteínu po transfekcii pRSV-Luc pomocou BGTC/DOP (obrázok 6D). Negatívna kontrola sa uskutočňovala bez protilátky (obrázok 6E).
Výsledky sú veľmi zaujímavé na génovú liečbu namierenú proti cystickej fibróze. Na liečbu tohto ochorenia je samozrejme potrebné zasiahnuť žľazu pod sliznicou, ktorá je hlavným miestom expresie CFTR v ľudských prieduškách.
Príklad 9
Kvantitatívne meranie účinnosti transfekcie BGTC/Dope in vivo
Na tento účel sa pľúca a priedušnica myši liečené BGTC/DOPE lipozómom a plazmidom pRSV-Luc s podmienkami opísanými v príklade 8 vyberú 48 hodín po transfekcii a aktivita luciferázy sa meria pomocou postupu opísaného v látkach a spôsoboch. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Vektory Aktivita luciferázy (RLU/ng proteínu)
BGTC/DOPE lipozómy: pRSV Luc pRSV-Lac Z 2,8 X 10' (priemer: 3x10* - 8x10’ 0
Jednoduchá DNA pRSV-Luc 0
Údaje demonštrujú účinnosť BGTC/DOPE lipozómov pre in vivo génovú transfekciu v dýchacích cestách.
Príklad 10
Génový prenos in vivo pomocou vnútrožilovej alebo intraperitoneálnej injekcie
Prostriedky katiónových lipidov a DNA sú opísané v príklade 7.
10.1 Vplyv dávky katiónových lipidov (obrázky 7 až 8)
Päť týždňov staré myši BalbC sa injektujú pomocou vnútrožilovej (chvostová žila) alebo intraperitoneálnej injekcie 200 μΙ transfekčnej zmesi v roztoku 37,5 mM chloridu sodného, 5 % glukózy a expresia luciferázy sa určí 24 hodín po transfekcii v pľúcach po vnútrožilovej injekcii a v pečeni a v slezine po intraperitoneálnej injekcii. Orgány sa vyberú a umiestnia do studeného lyzovacieho pufra (Promega E153A) doplneného inhibítormi proteázy (Boehringer 1697498) a homogenizujú sa v homogenizéri Heidolph DIAX600. Aktivita luciferázy sa určí v 14 000 g supematantu extraktu tkaniva.
Vnútrožilové injekcie
Každá myš dostala 50 pg DNA komplexovanej s rôznymi koncentráciami BGTC vo forme „lipozómov“. Pozorovaný optimálny pomer v nanomóloch katiónového lipidu/pg DNA je 9 (obrázok 7); pre dávky 900 nanomólov injektovaného BGTC sa nepozorovala žiadna toxicita.
Intraperitoneálne injekcie
BGTC vo forme „lipozómov“ sa injektoval so 100 pg DNA na myš. Maximálna expresia tak pre pečeň (obrázok 8B), ako aj pre slezinu (obrázok 8A) sa získala pre 1,5 nanomólu BGTC/pg DNA.
10.2 Kinetika expresie po vnútrožilovej injekcii
Určilo sa biologické rozloženie expresie luciferázy v 7 orgánoch ako funkcia času po injekcii 200 pl zmesi BGTC „lipozómov“/DNA v 37,5 mM chloridu sodného, 5 % glukózy (50 pg DNA a 9 nanomólov BGTC/pg DNA) do žily chvosta 5 týždňov starých BalbC myší. Výsledky sú vyjadrené v pikogramoch luciferázy extrahovanej na orgán vzhľadom na kalibračnú krivku s luciferázou označenou v kryštalizovanej forme. Hranica detekcie sa pohybuje v rozsahu 0,5 až 1 pikogramom luciferázy.
Ukázalo sa, že pri testovacích podmienkach sa maximálna expresia dosiahne 23 hodín po transfekcii pre 6 zo 7 testovaných orgánov, ktorými sú bránica, žalúdok, srdce, pľúca, pečeň a slezina. Expresia na úrovni pečene bola viac prematurovaná. Maximálna expresia sa získa na úrovni pľúc v hladine 0,5 nanogramu 23 hodín po transfekcii.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (22)

1. Zlúčenina amidíniového typu všeobecného vzorca (I) ajej soli
Aktivita luciferázy sa deteguje sústavne v homogenátoch priedušníc, ale nie v homogenátoch pľúc. Toto pozorovanie je v súlade s predchádzajúcimi výsledkami získanými v priebehu testovania rozdelenia buniek pozitívnych na X-gal. Treba poznamenať, že expresia luciferázy je priamo spojená s expresiou plazmidov, pretože sa v kontrolnej vzorke obsahujúcej LacZ plazmid nedeteguje žiadna aktivita. Kontrolou bola tiež transfekcia plazmidu uskutočňovaná bez vektora. Pri tomto kontrolnom teste nebola pozorovaná žiadna expresia luciferázy.
o
R?
kde
R1 je derivát cholesterolu,
R2 a R3 sú nezávisle od seba atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (II), pričom aspoň jedna zo skupín R2a R3 je iná ako atóm vodíka, kde n a m sú, nezávisle od seba a rozdielne pri skupinách R2 a R3, celé číslo 0 až 4,
R4 a R5 sú nezávisle od seba atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (III), pričom aspoň jedna zo skupín R4 a R5 je iná ako atóm vodíka (III), kde p a q sú nezávisle od seba celé číslo 0 až 4 a r sa rovná 0 alebo 1, kde r sa rovná 1
X je skupina NH a x sa potom rovná 1 alebo
X je atóm dusíka a x sa potom rovná 2 a je možné, že p, q a r sa mení nezávisle medzi skupinami R4 a R5.
2. Zlúčenina amidíniového typu podľa nároku 1, kde R2 a R3 sú nezávisle od seba atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (IV)
-(((¾ )n -n -t// < ch2)p-<\
NH2
NH2 kde
n. m a p sú definované a R4 je atóm vodíka alebo skupina všeobecného vzorca (V) — (CHz) — (NH)—Cľ (v), s r -sta kde q a r sú definované, a je možné, že m, n, p, q a r sa nezávisle menia medzi rôznymi skupinami R2 a R3.
3. Zlúčenina amidíniového typu podľa nárokov 1 alebo 2, ktorá je jednou zo zlúčenín nasledujúcich všeobecných vzorcov:
(H2N)2 +C-NH-(CH2)2-NH-COO-R'VI, [(H2Nb,C-NH-(CH,)J[('H2N)2Ct-NH-(CH2)4]-N-CC)O-Rl VII, l(H2N)2lC-NH-(CH2)2];-N-(CH;)2-NH-COO-R1VIII, [(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-COO-R'IX, [[(H2N)2*C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N-COO-R'x, kde R1 má význam uvedený v nároku 1.
4. Zlúčenina amidíniového typu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 3, ktorá je vybraná z nasledujúcej skupiny [[(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2-N-COO-R1 [(H2N)2 +C-NH-(CH2)3] [(HjNjjC^NH-jCHjjJ-N-COO-R1 a [(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-COO-R', kde R1 je cholesterylová skupina.
5. Zlúčenina amidíniového typu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 4, ktorou je 3β-Ο-[Ν-(3-guanidinopropyl)-N-(4-guanidinobutyl]karbamoylcholesterol „BGSC“.
6. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 5, ktorou je 3P-O-[N-(N',N'-bis-(2-guanidinoetyl)-2-aminoetyl)-karbamoyl]cholesterol „BGTC“.
7. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje najmenej jednu zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.
8. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou je 3p-O-[N-(3-guanidinopropyl)-N-(4-guanidinobutyl]karbamoylcholesterol „BGSC“.
9. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou je 3β-Ο-[N-(N',N'-bis-(2-guanidinoetyl)-2-aminoetyl)-karbamoyl]cholesterol „BGTC“.
10. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z a sa tým, že podľa nároku 10, že nukleovou kysepodľa nároku 10, že nukleovou kysevyznačujúca sa tým, podľa nároku 14, že nukleovou kysepodľa nároku 14, ž e nukleovou kynárokov 7 až 9, vyznačujúc ďalej obsahuje nukleovú kyselinu.
11. Farmaceutická kompozícia vyznačujúca sa tým, linou je deoxyribonukleová kyselina.
12. Farmaceutická kompozícia vyznačujúca sa tým, linou je ribonukleová kyselina.
13. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 12, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gén.
14. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1, neutrálny lipid a nukleovú kyselinu.
15. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že zlúčenina je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 3p-O-[N-(N',N'-bis-(2-guanidinoetyl)-2-aminoetyl)-karbamoyl]cholesterol „BGTC“ a 3p-O-|N-(3-guatiidinopropyl)-N-(4guanidinobutyljkarbamo-ylcholesterol „BGSC“.
16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 14, že neutrálnym lipi domje l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamín „DOPE“.
17. Farmaceutická kompozícia vyznačujúca sa tým, linou je deoxyribonukleová kyselina.
18. Farmaceutická kompozícia vyznačujúca sa tým, selinou je ribonukleová kyselina.
19. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 a 18, vyznačujúca sa t ý m , žc nukleová kyselina obsahuje terapeutický gén.
20. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 19, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľné vehikulum pre prostriedky na injekčné podávanie.
21. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7ažl 9, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľné vehikulum na aplikáciu na pokožku a/alebo na sliznicu.
22. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, na prípravu farmaceutických kompozícií pre in vitro, ex vivo a/alebo in vivo transfekciu buniek.
9 výkresov
SK1182-98A 1996-03-01 1997-02-28 Zlúčeniny amidíniového typu, farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, a ich použitie SK283575B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9602604A FR2745569B1 (fr) 1996-03-01 1996-03-01 Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications
FR9609557A FR2751972B1 (fr) 1996-07-30 1996-07-30 Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications
PCT/FR1997/000364 WO1997031935A1 (fr) 1996-03-01 1997-02-28 Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK118298A3 SK118298A3 (en) 1999-02-11
SK283575B6 true SK283575B6 (sk) 2003-09-11

Family

ID=26232562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1182-98A SK283575B6 (sk) 1996-03-01 1997-02-28 Zlúčeniny amidíniového typu, farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, a ich použitie

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6143729A (sk)
EP (1) EP0888379B1 (sk)
JP (1) JP4271260B2 (sk)
KR (1) KR19990087372A (sk)
AT (1) ATE198599T1 (sk)
AU (1) AU723998B2 (sk)
BR (1) BRPI9707889B8 (sk)
CZ (1) CZ295225B6 (sk)
DE (1) DE69703878T2 (sk)
DK (1) DK0888379T3 (sk)
ES (1) ES2154453T3 (sk)
GR (1) GR3035205T3 (sk)
HU (1) HU228072B1 (sk)
IL (1) IL125926A (sk)
NO (1) NO311806B1 (sk)
PT (1) PT888379E (sk)
SK (1) SK283575B6 (sk)
WO (1) WO1997031935A1 (sk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6884430B1 (en) * 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
BR9909350A (pt) * 1998-04-02 2000-12-12 Aventis Pharma Sa Compostos, composição, utilização de um composto, e, processos para preparação dos compostos, para transferência de ácido nucleicos para as células e para tratamento de doenças por meio de administração de um ácido nucleico
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
DE10109898A1 (de) * 2001-02-21 2002-09-05 Novosom Gmbh Lipide mit veränderlicher Ladung
CA2446951C (fr) * 2001-05-14 2012-07-10 Gencell S.A. Derives lipidiques de polythiouree
FR2824557B1 (fr) * 2001-05-14 2003-08-29 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques de polythiouree
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
JP4202928B2 (ja) 2002-01-17 2008-12-24 アルファ ラバル コーポレート アクティエボラーグ 一体式熱交換器を有する浸水式蒸発器
JP4980893B2 (ja) * 2005-04-28 2012-07-18 日本曹達株式会社 新規なグアニジン化合物、製造方法及びそれらを含有する殺菌性組成物
EP2069500B1 (en) * 2006-10-04 2014-09-24 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
TW201019969A (en) * 2008-11-17 2010-06-01 Enzon Pharmaceuticals Inc Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1995014381A1 (en) * 1993-11-24 1995-06-01 Megabios Corporation Amphiphilic derivatives of guanidine
US5777153A (en) * 1994-07-08 1998-07-07 Gilead Sciences, Inc. Cationic lipids
US6071890A (en) * 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5811406A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes

Also Published As

Publication number Publication date
ES2154453T3 (es) 2001-04-01
BR9707889A (pt) 2000-01-04
DK0888379T3 (da) 2001-01-29
KR100452062B1 (sk) 2005-04-08
CZ295225B6 (cs) 2005-06-15
IL125926A0 (en) 1999-04-11
NO983691L (no) 1998-08-12
WO1997031935A1 (fr) 1997-09-04
PT888379E (pt) 2001-05-31
CZ277298A3 (cs) 1998-12-16
IL125926A (en) 2004-09-27
DE69703878T2 (de) 2001-04-26
EP0888379B1 (fr) 2001-01-10
BR9707889B1 (pt) 2010-03-23
HUP9902465A1 (hu) 1999-12-28
EP0888379A1 (fr) 1999-01-07
HU228072B1 (en) 2012-09-28
BRPI9707889B8 (pt) 2016-11-08
US6316422B1 (en) 2001-11-13
GR3035205T3 (en) 2001-04-30
AU1930497A (en) 1997-09-16
DE69703878D1 (de) 2001-02-15
NO983691D0 (no) 1998-08-12
US6143729A (en) 2000-11-07
AU723998B2 (en) 2000-09-07
HUP9902465A3 (en) 2009-10-28
NO311806B1 (no) 2002-01-28
JP4271260B2 (ja) 2009-06-03
SK118298A3 (en) 1999-02-11
KR19990087372A (ko) 1999-12-27
JP2000506136A (ja) 2000-05-23
ATE198599T1 (de) 2001-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5650096A (en) Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5935936A (en) Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules
JP4176831B2 (ja) トランスフェクション剤としてのリポポリアミン及びその医薬的使用
US5948767A (en) Cationic amphiphile/DNA complexes
US5767099A (en) Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5783565A (en) Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6107286A (en) Lipopolyamines as transfection agents and pharamaceutical uses thereof
US20080306153A1 (en) Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
AU731503B2 (en) Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
WO1998043994A1 (en) Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
SK283575B6 (sk) Zlúčeniny amidíniového typu, farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, a ich použitie
US5912239A (en) Imidazole-containing cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6331524B1 (en) Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy
CA2248186C (fr) Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications
MXPA98006892A (en) Compounds related to the amidinium family, pharmaceutical compositions containing them and their applications
JP2003516970A (ja) 両親媒性ポリアミン、その使用およびその合成方法
US20020013282A1 (en) Cationic amphipile compositions for interacelluar delivery of therapeutic molecules
MXPA97003928A (en) New transfection agents and their pharmaceutical applications

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20170228