CA2248186C - Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux dérivés d'amidinium de formule (I) dans laquelle: R1 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino-NR'R", R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule (II) dans laquelle R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule (III). La présente invention concerne en outre des compositions pharmaceutiques correspondantes utiles notamment en thérapie génique pour le transfert de gènes thérapeutiques dans des cellules.

Description

COMPOSES APPARENTES A LA FAMILLE DES AMIDINIUMS, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT ET LEURS
APPLICATIONS
La présente invention concerne de nouveaux composés apparentés à la famille des amidiniums dont en particulier les guanidiniums, des compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à des composés de formule générale I et leurs sels O

~O-R1 dans laquelle:
- Rl représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment fun de (autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22, R2 et R3 représentent indépendamment fun de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale II avec au moins fun d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène, _ L (CH2)n-iV'~5 dans laquelle:
- n et m représentent indépendamment fun de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4,

2 - R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule Ill, où au moins R4 ou R5 est différent de l'hydrogène NHa - ( CHa )p ( X )r CHa )- C~
q NHa x dans laquelle p et q représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à 0 ou 1, quand r est égal à 1 X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2 et avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5.
A titre de sous-famille préférée, on citera plus particulièrement dans le cadre de la présente invention les composés de formule générale I dans laquelle R2 ou R3 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement de formule IV
NI-i2 _' C ( ~~ )n ~ m ( CHI p~ N
dans laquelle IV
n, m et p sont définis comme précédemment et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule

3 NHa - ( CHa ) - (NHr- Cy NHa P
V
avec p et r définis comme précédemment, et avec m, n, p, q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3.
Ces nouveaux produits de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec !es acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléfique, hydroxymaléique, benzôique, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine).
A titre représentatif des composés selon l'invention on peut plus particulièrement citer les composés de sous-formules générales suivantes:
(H~N)~'' C- NH - (CH2)~ -NH -COO- Rl VI
[(H~N)2+ C- NH - (CH~)3 ] [(H~N)~ C+- NH - (CH2)a ] -N-COO - RI VII
[(H~N)~+ C- NH - (CH~)~ ] ~- N-( CH~2 -NH -COO- R1 VIII
[(HZN)2t C- (CHa)a ] ~ N - COO ~ R1 IX
[ [(HzN)~+ C- (CH2)z ] a- N-( CH~)2] ZN - COO - R1 X
dans lesquelles Rl possède la définition précédente.

4 A titre représentatif des guanidiniums et amidiniums revendiqués, on peut plus particulièrement citer les composés des sous formules précédentes VII ,VIII et IX
avec Rl y représentant un groupement cholestéryle. Les trois composés seront respectivement identifiés ci-après sous la désignation BGSC ( Bis Guanidino Spermidine Cholesterol ) et BGTC ( Bis Guanidino Tren Cholesterol) et BADC
(bis chlorhydrate de Bis Amidinium Diéthylènetriamine Cholesterol ).
Les composés revendiqués sont tout particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique pour leurs caractères non toxiques et leur propriétés amphiphiles.
Compte -tenu de ces qualités, il peuvent notamment être utilisés pour la complexation d'acides nucléiques dans la perspective d'une transfection cellulaire de ceux-ci. Ces composés peuvent donc être avantageusement employés en thérapie génique.
Les composés VII (BGSC) et VIII (BGTC) sont tout particulièrement avantageux pour le transfert de gène in vivo. Ces deux composés se complexent avec l'ADN et le protègent contre la dégradation due aux variations de pH lors du transport vers la cellule à traiter.
L'invention concerne donc une composition pharmaceutique qui comprend au moins un composé selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré de (invention le composé est le Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC) et dans un autre mode préféré le composé est le Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC).
La thérapie génique a pour principal objectif de corriger des maladies génétiques associées à un défaut d'expression et/ou une expression anormale, c'est à
dire déficiente ou excessive, d'un ou plusieurs acides nucléiques. On tente de suppléer à ce type d'anomalies génétiques par le biais de l'expression cellulaire in vivo ou in vitro de gènes clonés.
Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposëes pour la délivrance intracellulaire de ce type d'information génétique. L'une des technologies actuellement mises en oeuvre, repose précisément sur (emploi de vecteurs chimiques ou biochimiques. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter (ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers Ia membrane plasmique et, Ie cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires.
Des lipides cationiques chargés positivement comme le chlorure de N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA) ont ainsi ëté proposés.

5 Avantageusement, ils interagissent, sous la forme de liposomes ou de petites vésicules, spontanément avec de l'ADN, qui est lui chargé négativement, pour former des complexes lipides-ADN, capables de fusionner avec les membranes cellulaires, et permettent ainsi la délivrance intracellulaire de l'ADN. Toutefois, dans le cas particulier du DOTMA, sa bonne efficacité au niveau de la transfection demeure malheureusement associée à un défaut de biodégradabilité et un caractère toxique à
(égard des cellules.
Depuis le DOTMA, d'autres lipides cationiques ont été développés sur ce modèle de structure : groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer". Parmi ceux-ci, on peut plus particulièrement citer ceux comprenant à
titre de groupement lipophile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à titre de groupement amino, un groupement d'ammonium quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques.
De part leur structure chimique et leur caractère biodégradable, les composés revendiqués répondent précisément aux exigences requises pour un vecteur de transfection d'acides nucléiques.
La présente invention vise donc également toute application de ces nouveaux composés dans la transfection in vitro, ex vivo et/ou in vivo de cellules et notamment pour la vectorisation d'acides nucléiques. Elle se rapporte en particulier à
toute composition pharmaceutique comprenant, outre au moins un composé selon (invention, un acide nucléique.
Dans les compositions de la présente invention, (acide nucléique associé à au moins un composé revendiqué peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un

6 acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences oligonucléotidiques ou polynucléotidiques d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN
génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou serai-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils comportent de préférence un gène thérapeutique.
Un autre objet de (invention porte donc sur une composition pharmaceutique contenant en outre un acide nucléique. Préférentiellement cet acide nucléique est soit un acide désoxyribonucléique soit un acide ribonucléique. Dans un mode préféré
de réalisation de l'invention l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.
Au sens de (invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou (expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.

7 Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, Ies hormones, Ies lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR26885141, facteurs de croissance, Ies neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, Ies facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS, HARP/pléiotrophine, etc Ia dystrophine ou une rninidystrophinè (~'R268I7.86) , la protéine CFTR associée à Ia mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs :
p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, e.~c (FR2704234.) , les gênes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de (ADN, Ies gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), Ies gènes de (hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, Ia lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholesterol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylornicrons-remnants et les récepteurs.scavenger.etc.
L'acide nuclëique thérapeutique peut également être un gëne ou une séquence antisens. dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler (expression de gènes ou Ia transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par

8 exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN
cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou (animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, (invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à (animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B
(EP 185 573), du viras de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus, d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou (organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sant susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de (expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du

9 génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. II peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Par ailleurs, l'acide nuclëique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Les lipides cationiques décrits dans la présente invention, et, en particulier, le BGTC et le BGSC, sont capables de se complexer avec fADN, et représentent une alternative avantageuse aux vecteurs viraux pour le transfert d'acides nucléiques d'intérêt thérapeutique, in vitro, ex vivo ou in vivo. Du fait des propriétés chimiques des groupes guanidinium, et en particulier de leur pKa élevé, ces lipides cationiques sont capables de protéger les molécules d'ADN contre les dégradations dues aux variations de pH. Les résultats présentés dans les exemples montrent que ces composés permettent la transfection de nombreux types cellulaires, avec une grande efficacité. L'efficacité de la transfection dépend en particulier du rapport lipide cationique / ADN dans les complexes formés. Un rapport entre les deux composés particulièrement favorable pour la transfection consiste à avoir 6 à 8 groupes guanidinium pour un groupe phosphate sur l'ADN.

L'efficacité de transfection des complexes lipide cationique /DNA peut en outre être améliorée par addition de lipide neutre, et formation de liposomes cationiques.
Ces liposomes sont formés par un complexe entre le lipide cationique et le lipide neutre. Celui-ci peut être choisi parmi 5 - la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), - l'oléoyl-palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), - le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine - leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois;
- les phosphatidylglycérols,

10 - les diacylglycérols, - les glycosyldiacylglycérols, - les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), - les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) - et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).
On utilise préférentiellement la DOPE.
Préférentiellement, le composé de l'invention et le lipide neutre sont présents dans un rapport compris entre 1 et 5, plus préférentiellement 2 et 4. En outre le rapport lipide total (composé de l'invention plus lipide neutre) sur DNA est avantageusement choisi de sorte que le rapport net de charges positives soit compris entre 2 et 5. Particulièrement avantageusement, le rapport est de 3 environ.
L'invention concerne donc également toute composition pharmaceutique comprenant un composé selon (invention, un lipide neutre et un acide nucléique.
Préférentiellement le composé selon l'invention est choisi parmi le BGTC et le BGSC.

11 Tout aussi préférentiellement le lipide neutre est la DOPE. L'acide nucléique est soit un acide désoxyribonucléique soit un acide ribonucléique. Préférentiellement (acide nucléique comporte un gène thérapeutique.
Outre cette application des dérivés d'amidinium revendiqués, il est également possible d'envisager leur valorisation dans les applications suivantes:
interférence au niveau d'interactions entre acides nucléiques et protéines résultant dans une inhibition ou stimulation de certains processus par exemple de régulation d'expression génétique ou d'activité enzymatique ( polymérase, transcriptase, etc....), complexation sélective d'espèces anioniques pour leur extraction, leur élimination ou leur détection à l'aide de sondes/électrodes à membrane par exemple, utilisation comme rêactif de laboratoire pour effectuer des opérations de transfection in vitro, etc.
En conséquence, la présente invention a également pour objet toute application thérapeutique des dérivés d'amidinium tels que décrits précédemment, soit directement, soit au sein de compositions pharmaceutiques.
De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent également un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sénim physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
La présente invention sera plus complètement décrite à (aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
FIGURES
Figure 1 . Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BGSC et BGTC.

12 Figure 2 . Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BADC.
Figure 3 : Mesure de l'efficacité de transfection en fonction du rapport composé
lipidique/ADN.
Figure 4 : Mesure de l'efficacité de transfection en fonction du rapport lipides totaux / ADN.
Figure 5 : Mesure de l'effet sérum sur l'efficacité de transfection de cellules HepG2 (5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) et 293 (SD). Barres grises : Présence de sérum; Barres vides : transfections en absence de sérum pendant 2h.
Figure b : Photographies de cryosections de trachées marines montrant l'expression de gène reporter dans l'épithélium de (appareil respiratoire après transfection in vivo avec des liposomes BGTC/DOPE. (bA) et (bB) : Détection de l'expression de la beta-galactosidase dans des cellules transfectées, localisées à la surface de fépithelium (bA) et dans les glandes sous mucosales (bB); (bC) :
Détection des cellules exprimant la beta-galactosidase dans les glandes sous-mucosales par marquage à fimmunoperoxidase en utilisant un anticorps monoclonal anti-beta galactosidase; (bD) : détection des cellules exprimant la luciférase dans les glandes sous-mucosales par marquage à fimmunoperoxidase en utilisant un anticorps polyclonal anti-luciférase; (bE) : coloration à fimmunoperoxidase: contrôle négatif effectué en absence d'anticorps.
Figure 7 : Mesure de (efficacité de transfert de gènes in vivo par injection intraveineuse d'un complexe ADN/BGTC-liposome.
Figure 8 : Mesure de l'efficacité de transfert de gènes in vivo par injection intrapéritonéale d'un complexe ADN/BGTC-liposome.
A- PRÉPARATION DE DÉRIVES SELON L'INVENTION
MATÉRIEL ET MÉTHODES

13 1. Mesures physiques Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton ( RMN 1H ) ont été
enregistrés sur un spectromètre Bruker AC200. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au TMS.
2. Chromatosraphies sur silice .Les chromatographies sur couche mince lCCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d'épaisseur .Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,040-0,063mm.
EXEMPLE 1:
PREPARATION DU GUANIDINO SPERMIDINE CHOLESTEROL
BGSC
-1; Préparation du Di-Boc carbamate (1) On ajoute une solution de chloroformate de cholesteryle(0,9g, 2mmo1) et de Et3N (0,2148, 2mmo1) dans CHzCI~ (40m1) à une solution de 'N,BN-Bocz-spermidine (0,6908, 2mmol) dans CHZC12 (20m1). Après reflux pendant 5 heures, le mélange est lavé à l'eau (2x50m1), séché sur NazS04 et le solvant est ëvaporé. Le produit brut est purifié par chromatographie sur un gel de silice utilisant CHZCI?JMeOH 95/5 comme éluant pour donner du pur carbamate (1,38, 86%).
'H NMR. 8lCDCl;t 200 Mhz) ; 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl, Boc signal et groupes centraux CH2 depuis le spermidine), 3,1-3,3(m, 8H, N-CHZ), 4,50(m,lH,H~), 5,37(d,lH,H6).
- 2. Préparation de I'aminocarbamate(2)

14 On dissout le composé (1) (1,3g) dans 20m1 de CHZC12 et l'on ajoute à cette solution refroidie (lit de glace) 2m1 de CF3COZH fraîchement distillé pour libérer les groupes protecteurs BOC. Après agitation à température ambiante pendant 3 heures, on ajoute 50m1 de 'N NaOH et le mélange est extrait avec CHZC12 Les couches organiques sont lavées à l'eau, séchées sur NazS04 et évaporées pour obtenir l'aminocarbamate (2) brut (0,945g, 98%).
'H NMR 8(CDC13 200 Mhz) ; 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl et groupes centraux depuis le spermidine), 2,7(m, 4H, CHZ-N-CO-), 3,25 (large m,4H,N-CHz), 4,49(m,lH,H~), 5,35(d,lH,H6).
3.- Synthèse du BGSC.
On dissout le carbamate (2) brut (0,94g) dans 30m1 de THF/MeOH 85/15. Puis on ajoute du IH-pyrazolecarboxamidine (0,495g, 3,4mmo1) et du düsopropylethylamine (0,436, 3,4mmol) dans 30m1 de THF/MeOH 85/15. Après agitation à température ambiante pendant I8 heures on ajoute lentement 250 ml de diethylether et on sépare le précipité obtenu par décantation. Le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation pour donner du GSC pur (0,570g, 47%).
1H NMR 8(DMSO d6) 200 MHz ; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl et CHz central), 3,1(m, 8H, N-CHZ), 4,3(m,lH,H~,,), 5,3(d,lH,H6) ; 7,2 (large s, 8H,NHz+), 7,8{s,2H,NH), Anal. Calc. pour C~,H6,N,02,2HC1,C,62,15 ; H,9,67 ; N,13,71.
Résultat d'analyse élémentaire: C,62,28 ; H,9,81 ; N,13,15.
EXEMPLE 2:
PREPARATION DU GUANIDINO TREN CHOLESTEROL BGTC
l.préparation de l'Aminocarbamate (S) On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (1,8g, 4mmol) dans 100 ml de CHZCIz à une saturation de tris(2-aminoethyl)amine(TREN) (11,68 g, 80 mmol) dans 400 ml de CHZCIz. Après agitation à température ambiante pendant deux heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3x100m1) et après 5 séchage sur NaZS04 on évapore le solvant. On isole (5) sous forme de trihydrochloride de la manière suivante : on dissout le produit brut dans lOml de MeOH et l'on ajoute goutte à goutte une solution saturée de HCl methanolique (Sml) ; le précipité
obtenu est séparé par décantation et, pour obtenir un composé pur, est mis en suspension trois fois dans MeOH et séparé par décantation. Après séchage sous vide le trihydrochloride 10 (6) pur est obtenu (1,71g, 64%).
1H NMR 8(CDCIz + ~CD~OD. 200MHz). 0,5-2,4(m, structure de cholesteryl), 2,5(m,2H,CHzNHCO), 2,8(large s,4H,+HN-CHZ), 3,06(large s,4H,CH2NH3+), 3,20(m,2H,''HN-CHz), 4,4(m,lH,H~), 5,3(d,lH,H6), Anal. Calc. pour C~,H~N40z,3HC1 ;C,61,10 ; H,9,80 ; N,8,38. Résultat : C,61,25 ; H,9,96 ;
N,8,22.

15 2- Préparation du B.GTC
On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (2,24g, 5mmol) dans 100m1 de CHZCIZ à une large saturation de tris(2-aminoéthyl)amine(TREN)(29,2g, 200mmol) dans 250m1 de CHZCI2. Après agitation à
température ambiante pendant 2 heures, on libère l'amine inerte par lavage à
l'eau (3x100m1) et après séchage sur NaaS04, le solvant est évaporé. Le produit brut (3,2g) est dissous dans THF/MeOH 50/50 (20m1) ; puis l'on ajoute au mélange du 1H-pyrazole-1-carboximidine (1,465g,lOmmol) et du düsopropylamine (1,3g, l0mmol).
Après agitation à température ambiante pendant 18 heures, on ajoute du diethylether et le précipité obtenu est séparé par décantation. Afin d'obtenir un échantillon pur, le composé brut est nus en suspension trois fois dans du diethylether et séparê
par décantation (2,15g), 60% après séchage sous vide.
1H NMR(DMSOd6. 200MHz) ; 0,5-2(m, structure du cholesteryl), 2,2(m,2H,N-CHZ), 2,6(large s,4H,N-CHI), 3.0(d,2H,N-CHZ), 3,2(large s,4H),

16 4,3(m,lH,H~), 5,3(d,lH,H6), 7,3(large s,BH,NH2+), (7,8(large s,2H,NH). Anal.
Calc.
pour C~H~N802,2HC1 ; C,60,39 ; H,9,57 ; N,15,65. Résultat : C,60,38 ; H,9,67 ;
N,15,56.
EXEMPLE 3:
PREPARATION DU BIS-CHLORHYDRATE DE BIS AMIDINIUM
BA D.
l.Préparation du dinitrile On ajoute une solution de chloroformate de cholestéryle (8,97g; 20mmo1.) dans du CH2C12 (100m1) goutte à goutte à une solution d'iminopropionitriIe (2,468, 20mmo1.) et Et3N ( 2.02 g, 20 mmol dans du CHZC12 (100m1). Après agitation à
la température ambiante, pendant 6 heures, on lave à Peau (2x 100m1) et sèche sur Na2S04. Le solvant est évaporé et le produit brut (10,5g) est recristallisé
dans le méthanol. (8,59g; 80%).
1H NMR 8(CDCIz. 200MHz). 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl), 2,7 (m, 4H;
-CHZCN), 3,62 (m, 4H, -CH2-N-), 4,50 (m,lH,H~), 5,39(d,lH,H6).
2. Préparation du dithioamide Dans une solution du dinitrile, préparé comme décrit précédemment, ( 0,3248, 6mmol.) et de diéthylamine ( 0,8848; l2mmol) dans du DMF (30m1), maintenue à
50°C, on fait barboter pendant 2 heures un léger courant de HzS. On verse la solution bleue sur de la glace et on sépare le précipité ainsi obtenu par filtration.
On dissout ce produit brut dans du CHZCh et lave à l'eau (2x50m1). Après séchage sur Na2S04, le solvant est évaporé et le produit obtenu recristallisé deux fois dans du méthanol (1,868; 51,5%).
1H NMR(DMSOd6. 200MHz) ; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl>, 2,67(t,4H,N-CHZ), 3,50(t,4H,S=C-CHZ), 4,3(m,IH,H~),5,33(d,lH,H6).

3. Préparation du bis-iodure de dithioamidate A une solution de dithioamide (0,6038; lmmol) dans de l'acétone (20mI), on ajoute de (iodure de méthyle (2ml) et on laisse reposer à la température ambiante pendant 48 heures. On filtre le précipité obtenu (0,7418; 83,5%). Ce produit est utilisé
directement sans purification annexe.
4. Préparation du bis chlorhydrate de bis amidinium BADC.
Dans une suspension au reflux du bis-iodure (0,7418; 0,83mmo1.), tel qu'obtenu précédemment, dans de fisopropanol (lOml) on fait barbotter un courant de NH3 pendant 2 heures puis on continue de chauffer au reflux 4 heures supplémentaires.
On évapore l'isopropanol et le résidus est repris dans du méthanol (lOml).
Après passage de cette solution sur une résine échangeuse d'ions basique, on fait passer un courant d'acide chlorhydrique dans féluant et on évapore à sec. Le bis chlorhydrate ainsi obtenu, est dissous dans le minimum d'éthanol { environ 5ml). On filtre un léger insoluble et on rajoute au filtrat un large excès d'éther diéthylique. On obtient une poudre que fon filtre et fon sèche (320mg; 60%). Une recristallisation dans fisopropanol permet d'isoler le produit attendu, sous une forme analytiquement pure.
1H NMR(DMSOd6, 200MHz) ; 0,5-2,6(m, structure du cholesteryl et-CHZ-amidinium), 3,57 (s, large 4H, N-CHro) 4,3(m,lH,H~),5,3(d,lH,H6), 8,64 (s, large;
2H; NHa), 9,07 (s; large; 1H; NH), 9,18 (s; large; 2H).
Anal. Cal. Pour C34H~NqOa, 2HCl: C, 65,25. H, 9,32; N, 8,94. Résultat C, 65,40. H, 9,87; N, 9,55.
B: UTILISATION DE DERIVES SELON L'INVENTION POUR LE
TRANSFERT DE GENES IN VITRO ET IN VIVO
MATERIELS ET METHODES
1- Les essais de transfection qui suivent sont effectués avec du BGSC et du BGTC préparés selon les protocoles décrits dans les exemples 1 et 2.

2 - Preparation des l~sgmes Un mélange de lipide cationique et de DOPE (dans un rapport molaire de 3/2) dans du chloroforme (CHCl3) est évaporé sous vide et remis en suspension dans une solution de tampon HEPES 20 mM à PH ?,4, sous une atmosphère N2.
La concentration finale en lipide est de 1,2 mg/ml.
Le mëlange est vortexë pendant 5 mn, puis « soniqué » pendant 5 mn avec .un sonificateur (Branson Ultrasonic 2210), enfin stocké a + 4°C pendant 24 h pour hydratation.
La dispersion résultante est « soniquée » de nouveau (Sonifier Branson 450) pendant 5 à 10 mm pour former des liposomes.
Aprês centrifugation, la solution est filtrëe sur un filtre de diamètre de pore 0.22p, (Millex GS, Millepore) et stockée à + 4°C.
La taille des liposomes contenant BGSC ou BGTC a été étudiée à l'aide d'un appareil à diffraction laser (Autosizer 4?00, Malvern Instruments). Cette étude montre un pic unique correspondant à un diamètre moyen de 50nm en analyse multimodale par nombres.
3 - Cultures cellulaires L'origine (espèce et tissus) de la plupart des lignées cellulaires utilisées pour les expériences de transfection est donnée dans le tableau I.
Les cellules de la lignée cellulaire HeLa (P Briand, ICGM Paris) sont dérivées d'un carcinome humain d'origine épitheliale cervicale.
Les cellules NIH 3T3 (C Lagrou, Institut Pasteur, Lille) sont des fibroblastes de souris.
* (marques de co~~unexce) La lignée cellulaire NB2A (C. Gouget, Paris) est derivée d'un neuroblastome de souris.
Toutes les cellules à l'exception des cellules AtT-20 et PC12, ont été
cultivées dans du milieu Dulbecco modifié (DMEM, GIBCO) complementé avec 10 % de sérum de veau fetal (FCS; GIBCO), de la pénicilline à 100 unités/ml (GIBCO) et de la streptomycine (GIBCO) à 100~g/ml.
Les cellules AtT-20 ont été cultivées dans du DMEM/F12 (GIBCO) complementé avec 10 % de sérum de veau fetal.
Les cellules PC12 ont été cultivées dans du DMEM complementé avec 10 %
FCS et 5 % de sérum de cheval.
Toutes les cellules ont été maintenues en culture dans des boîtes plastiques (Falcon) sous atmosphère humide à 5 % de C02.
4 - Plasmides Les plasmides pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris), et pRSV-nlsLacZ
ont été amplifiés dans E. Coli et préparés par purification sur gradient CsCI
par des techniques standard. Dans le plasmide pRSV-nlsLacZ, et le plasmide pRSV-Luc, le gène LacZ d'E.coli et sa séquence signal de localisation nucléaire et le gène luciférase sont respectivement sous le contrôle transcriptionnel du LTR/RSV (Rous Sarcoma Virus). Le plasmide pXL2774 comporte le gène codant pour la luciférase sous contrôle du promoteur du cytomégalovirus (CMV).
5 - Protocole dg transfection in vitro Le jour précédent la transfection 2 X 105 cellules sont déposées par puits (plaques à 6 puits Falcon).
Chaque puits contient une lignée cellulaire différente.
Ainsi au jour de la transfection les cellules sont a demi confluentes.

L'ADN plasmidique (5pg) et la quantité désirée de lipide bis-guanidinium ont été chacun dilués dans 2501 de DMEM sans FCS et vortexé. Après environ 5 min les deux solutions ont été laissées à incuber à température ambiante pendant l5min. Le mélange de transfection est alors ajouté aux cellules (0,5 ml par puits) qui ont été
5 lavées avec un milieu sans sérum. Après 4 à 6 heures d'incubation à
37°C, 1 ml de milieu avec sérum est ajouté dans chaque puits sans que l'on enlève le mélange de transfection. 24 heures après la transfection, le milieu est remplacé par 1 ml de milieu de culture frais. Les cellules sont recueillies 2 jours après la transfection pour mesurer l'expression de la luciferase.
10 Des transfections témoins ont été faites en utilisant des agents de transfections commercialisés - la lipopolyamine Transfectam ~ (JP Behr, Strasbourg, France) a été utilisée en solution alcoolique à un rapport optimum de charges ioniques Transfectam ~/DNA 6-8.
15 - la Lipofectin ~ (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, France) qui est une formulation de liposomes ayant pour lipide neutre la DOPE et pour lipide cationique le DOTMA. (N [ 1 (2,3-dioleyloxy) propyl]-N, N, N- trimethylammonium chloride).
Les complexes ADN/Liposomes ont été obtenus dans les conditions standard recommandées par le fabricant.
20 - des cellules ont été transfectées par précipitation au phosphate de calcium.
(Keown, W.A., Campbell, C.R. ; Kucherlapati, R.S. (1990) Methods in Enzymology ;
Academic Press : New York, 185, 527-537).
6 - Mesure de la luciferase pour les transfections réalisées in vitro L'activité luciferase est mesurée 48 heures après transfection en utilisant une variante la procédure de De Wet et al. (De Wet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R.
& Subramani, S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-?37.) - on retire le milieu de culture - les cellules sont lavées avec une solution saline de tampon phosphate froid - puis elles sont lysées par incubation dans 250 ~.1 de tampon de lyse (25mM
triphosphate pH7;8, 8 mM MgCl2, 1mM dithiotreitol, 15 % de glycerol et 1 % de triton X-100).
- on obtient un lysat clair après élimination des matériaux insolubles par centrifugation (l5mm a + 4°C) dans une microcentrifugeuse.
- un Aliquot (20p.1) d'extrait cellulaire est dilué dans 100p.I de tampon de Iyse auquel on ajoute 9p,1 d'ATP 25 mM (sigma) et 20p.1 de luciferine 25mM (sigma).
- les échantillons sont placés dans un luminométre (Lurmei LB950I Berthold, Nashua, NH) et on mesure l'émission lumineuse pendant 10 secondes.
L'étalonnage de la courbe RLU/Luciferase a été fait en utilisant differentes dilutions de luciferase de luciole purifiée (sigma) et montre que la partie linéaire de la courbe va de 10° a 10' RLU (relative Iight units).
La concentration en protéine a été mesurée par le test BCA (acide bicinchoninique) en utilisant la secumalbumïne bovine comme tëmoin.
Les données pour l'activité luciférase sont exprimées en RLU/mg de protéine.
7 - PrQtocol~d'injection in vivo au niveau des voies respiratoires de souri Les souris utilisées sont des souris mâles OFl (poids 30g) issues de Iffa-Credo (Lyon, France). Des liposomes cationiques BGTC/DOPE (rapport molaire 3:2) sont utilisés. Le mélange de transfection est obtenu à partir de 10~.g d'ADN
plasmidique (dans10u1 eau), 20p.1 de liposomes cationiques dans un milieu Hepes 20mM (pH
7.4), à une concentration lipidique totale de 5mg%ml. Les agrëgats ADN/lipides ainsi formés possèdent un rapport charge de Tordre de 6.
* (marque de cc~rerce ) Aprês anesthésie des souris avec du pentobarbital, le mélange de transfection (30~,I) est injecté dans les voies respiratoires par instillation intratrachéeale via une canule insérée dans le lumen trachéal. 48h après l'instillation les animaux sont sacrifiés par overdose de pentobarbital et les poumons et trachées prélevés pour analyse.
$- Coloration à fX-ga_1 Pour doser (expression de la beta-galactosidase d'E.coli dans les cultures primaires, on imprègne les cellules pendant 15 minutes à 4°C avec une solution de paraformaldéhyde à 4% et on les incube ensuite avec de fX-gal de substrat beta-galactosidase chromogénique (Sigma). La coloration bleue des noyaux des cellules transfectées est dosëe par microscopie par luminescence.
9-Dosage des cellules X-gaI au niveau des voiesrespiratoires transfectées in viv Pour la détection des cellules X-gal au niveau des voies respiratoires, les poumons et trachées sont traités lh dans du paraforrnaldehyde à 4%, immergés ensuite toute une nuit dans du PBS contenant 30% de sucrose, puis incorporés dans un milieu de congélation et congelés à l'azote liquide. Des sections de cryostats de 5~.
sont ensuite colorées pour l'activité de ~3-galactosidase par incubation toute une nuit avec du réactif X-gal (Sigma).
10- Dosage de la luciferase au niveau des voies respiratoires transfectées in vivo Pour doser l'activité luciférase à l'issue des transfections in vivo, des fragments de tissus sont mis en présence de 30,1 de tampon de lyse (25mM Tris-phosphate pH7.8, ImM dithiothreitol (DTT), 15% glycerol et 1% Triton X-100), lysés en environ lmin avec un homogéniseur (Polylabo, Strasbourg, France) et conservés sur glace. Après centrifugation, 20,1 de lysat ést utilisé pour le dosage.
L'activité
luciferase est exprimée en RLU par mg de protéine.
*(marque de commerce) 11- Protocole d'immunohistochimie Des cryosections d'échantillons de poumons et trachées sont incubées lh avec soit des anticorps marins monoclonaux anti- (3-galactosidase d'E coli à 5~g/ml (Genzyme, Cambridge, MA) ou des anticorps de lapin polyclonaux 1:400 dilution (Promega).
La protéine (3-galactosidase d'Escherichia coli est dosée par coloration à
fimmunoperoxidase en utilisant un anticorps secondaire anti Ig de souris marqué à la biotine (Boehringer) et un conjugué streptavidin-POD (Boehringer). La protéine luciferase est dosée par coloration à fimmunoperoxidase en utilisant un anticorps de chèvre anti-lapin (ICN Biomedicals, Inc) et le système peroxidase-antiperoxidase de lapin (PAP) (Dako Glostrup, Denmark). Les sections sont examinées par microscopie luminescente. Des contrôles négatifs sont effectuées sans anticorps.
EXEMPLE 4:
TRANSFECTIONS IN VITRO A DES RAPPORTS AGENT DE
TRANSFECTION /ADN DIFFERENTS
Afin d'optimiser (efficacité de transfection obtenue avec des agrégats BGTC/ADN, la demanderesse a étudié (influence du rapport BGTC/ADN sur le taux de transfection dans 3 types différents de cellules de mammifères connus pour leur relative sensibilité au méthodes de transfection classique. Les résultats sont présentés en figure 3.
Des expériences de transfection ont donc été réalisées avec des fibroblastes marins 3T3 des cellules ëpithéliales humaines HeLa et des neuroblastomes de souris NB2A. Au cours de ces expériences une certaine quantité fixe de plasmide pRSV-Luc a été mise en contact avec des quantités variables de BGTCen solution. Pour déterminer la fourchette de rapport à étudier la demanderesse est partie du principe qu'un ~g d'ADN équivaut à 3 nm de phosphate chargé négativement et que seulement deux groupes guanidinium sont chargés positivement au pH neutre de formation des agrégats et de transfection. On mesure l'activité luciférase 48h après la transfection.
L'expression de la luciférase est maximale pour des agrégats contenant de 6 (cellules HeLa) à 8 (cellules 3T3, NB2A) groupes guanidinium pour un groupe phosphate de l'ADN c'est à dire des agrégats ayant une charge positive importante.

TRANSFECTIONS IN VITRO AVEC DiFFERENTS TYPES
CELLULAIRES.
Le transfert de gènes par (intermédiaire de lipides cationiques est une technique de transfection attractive non seulement du fait qu'elle ne nécessite pas d'intermédiaires mais aussi parce qu'elle permet de transfecter une très grande variété
de cellules de tissus et d'organismes différents. Pour étudier l'étendue de l'efficacité du BGTC comme agent de transfection plusieurs lignées cellulaires d'origines diverses ont été testées. Les résultats sont exposés dans le tableau 1 ci-après. Le rapport de charges a été choisi entre 6 et 8 pour une efficacité maximale. Afin d'établir une comparaison, des cellules des mêmes lignées ont également été transfectées en utilisant une lipopolyamine d'une part et d'autre part du phosphate de calcium. Les résultats montrent que le BGTC est normalement aussi efficace que le Transfectam et deux fois plus efficace que le phosphate de calcium.
Tableau I . Expression de la luciferase dans differentes lignées cellulaires de mammifèms transfectées soit par du BGTC, du phosphate de calcium ou du Transfectam ~.
IZLU/mg de protines cellulaires Espces Lignes Tissus BGTC Phosphate Transfectam~

cellulaire de Calcium Humain A549 Carcinome du 4 X 105 7 X 10 3,1 X 105 poumon Singe COS-7 Rein transform2,1 X 3,7 X 10' 8,4 X 10 par 10 Chien MDCK-1 Rein 3 X 4,5 X 10 2,2 X 10 Rat RIN-m5FCellule tumorale2 X 2 X 10' 3,3 X 10' d'ilot pancreatique10' ROS Osteosarcome 4,0 4,5 X 105 2,3 X lOb PC12 Pheochromocytome3 X 1,7 X IO' 6 X 106 IO' Souris AtT-20 Tumeur pituitaire2 X 8 X 10' 3 X 10' 10' Toutes les transfecdons ont été faites au moins deux fois (n?2).

TRANSFECTIONS IN VITRO EN PRÉSENCE D'UN LIPIDE NEUTRE
Le composé BGSC étant moins soluble en milieu aqueux que le BGTC la 5 demanderesse a utilisé le premier sous forme de liposomes en présence d'un lipide neutre la DOPE (dioléoylphosphatidyléthanolamine). Les formulations sont préparées dans un rapport molaire 3/2. Une deuxième préparation contenant cette fois ci du BGTC a également été préparée avec de la DOPE dans les mêmes conditions.
6.1 - Détermination du rapport lipide total / ADN.
10 La demanderesse a tout d'abord déterminé le rapport lipide/ ADN au cours d'une expérience de transfection sur des cellules HeLa. La courbe obtenue est représentée figure 4. Les optima de transfection sont obtenus pour des rapports liposomes BGSC/ADN compris entre 1.5 et 5 avec un centre à 2.5-3. Les groupes guanidinium étant protonés à pH neutre, les meilleurs agrégats BGSC-DOPE/ADN
15 ont une charge positive d'environ 3 (figure 4).
Les meilleurs rapports BGSC-DOPE/ADN sont donc inférieurs à ceux obtenus avec des agrégats de type BGTC/ADN (entre 6 et 8). La transfection en présence de liposomes cationiques est facilitée par la présence de DOPE et les propriétés fusogéniques de celle-ci.

WO 97/31935 ~ PCT/FR97100364 6.2 - Transfection de différentes lignées cellulaires par des liposomes cationiques.
La demanderesse a procédé à des expériences de transfection dans différentes lignées cellulaires en utilisant des formulations de liposomes cationiques BGSC-DOPE
et BGTC-DOPE dans des rapports molaires 3/2. Le rapport de charges guanidinium des lipides / phosphates de fADN est d'environ 2.5 (~3) pour ces deux systèmes de transfert de gènes. Une transfection avec la Lipofectin~ sert de témoin. Les résultats sont exposés dans le tableau 2 ci-dessous.
Ces résultats montrent que les dérivés du cholestérol portant des groupes guanidiniums sous forme de liposomes cationiques sont au moins aussi efficaces pour la transfection que la Lipofectin. Ces résultats peuvent bien entendu être optimisés pour chaque lignée cellulaire.
Tableau 2 Expression de la luciferase dans différentes li " ées cellulaires e arvotiaues transfectees au moyen de liposomes BGSC/DOPE de liposomes BGTC/DOPE et de L~fectin RLU/mg de protéines cellulaires Lignes liposomes liposomes BGTCLipofectin Cellulaires BGSC

HeLa 4,6 X 106 7,7 X 106 3,3 X 106 COS-7 ND 1,4 X 10' 9,5 X 106 MDCK-1 1 X 106 7 X 106 1,9 X 106 NB2 Aa 1,5 X 10' 1,4 X 10' ND

NIH 3T3a 7 X 106 1,5 X 106 ND

Toutes les transfections ont été faites au moins trois fois (n?3) e : mesure moyenne en RLU de l'activité luciferase pour 100~g/500~g de lysat total (n?4).

ETUDE DE L'EFFET DE LA PRESENCE DE PROTEINES SERIOUES
SUR L'EFFICACITE DU TRANSFERT DE GENES IN VITRO
La plupart des compositions de transfection à base de lipides cationiques présentent une efficacité diminuée en présence de sénim. Cet exemple a pour objet de tester la sensibilité des composés de l'invention à (effet sérum.
7.1 - Formulations des lipides cationiques Les lipides décrits dans l'invention sont solubilisés dans de l'éthanol.
i) des solutions de « liposomes » sont obtenus en présence de DOPE comme suit : la DOPE (AVANTI) en solution dans le chloroforme est ajoutée aux solutions de lipide dans féthanol, dans un rapport molaire lipide cationique/DOPE de 3/2.
Après évaporation à sec les mixtures sont reprises dans l'eau et chauffées à
50°C pendant 30 minutes ;
ü) des solutions de « micelles » sont obtenues en suivant le protocole décrit pour l'obtention de « liposomes » mais la solution de DOPE est remplacée par du chloroforme.
Les solutions sont toutes ajustées à 10 mM en lipide cationique.
7.2 - Acide Nucléique L'acide nucléique utilisé est le plasmide pXL2774.
7.3 - Mélanges cytofectants (préparation extemporanée) WO 97/31935 PCT/FR9?/00364 L'ADN est dilué à 20 ~g/ml dans du NaCI 150 mM et les différentes formulations de lipide cationique sont diluées dans l'eau à 40, 80,120 et 160 ~.M. Les solutions d'ADN et de lipide sont mélangées volume à volume ce qui donne des ratios en nmoles/~g ADN respectivement de 2, 4, 6 et 8 ; la concentration saline est de 75 mM
7.4. - Transfections Les cellules sont cultivées dans les conditions appropriées en microplaques de 24 puits (2 cm2/puits) et sont transfectées alors qu'elles sont en phase exponentielle de croissance et à 50-70 % de la confluence. Les cellules sont lavées par 2 fois 500 pl de milieu dépourvu de protéines sériques et remises en croissance soit en milieu sans sérum [transfection en absence de sérum], soit en milieu complet [transfection en présence de sérum] et 50 ~.1 de mëlange cytofectant [0,5 pg ADN/puits] sont ajoutés aux cellules [3 puits/condition lipide-DNA].
Quand les cellules sont transfectées en « absence de sérum » le milieu de croissance est supplémenté par la quantité appropriée de sérum 2 heures après la transfection.
L'efficacité de transfection est évaluée par une mesure de l'expression de la luciférase selon les recommandations données pour l'utilisation du kit Promega [Luciferase Assay System]. La toxicité des mélanges cytofectants est estimée par une mesure des concentrations protéiques dans les lysats cellulaires.
7.5 - Résultats (Figure 5) Les résultats obtenus avec quatre types cellulaires [NIH3T3 - 293 - HepG2 -HeLa] montrent que, dans les conditions testées, les formulations sous forme de « liposomes » sont plus efficaces que celles sous forme de « micelles ». Par ailleurs, contrairement à ce qui est observé avec la plupart des préparations cytofectantes contenant des lipides cationiques, aucun effet inhibiteur significatif lié à
la présence de sérum pour le BGTC sous forme de « liposomes » ou de « micelles » n' a pu être mis en évidence dans nos conditions de transfection.

EXPRESSION IN VIVO DE TRANSGENE DANS LES VOIES
RESPIRATOIRES DE SOURIS AVEC DES LIPOSOMES BGTC/DOPE.
Pour ce faire, nous avons utilisë les liposomes cationiques BGTC/DOPE.
L'obtention des agrégats ADN/liposomes et le protocole d'administration sont effectués comme décrits en matériel et méthode.
Les cellules X-gal sont détectées dans l'épithelium des voies respiratoires des souris traitées 48h après transfection au niveau des cellules du plasmide LacZ
à (aide des liposomes BGTC/DOPE. Les résultats sont présentés en figure 6.
La plupart des cellules transfectées sont localisées dans la trachée et seules quelques cellules X-gal sont observées dans les voies respiratoires secondaires. Ce type de distribution a déjà été reporté dans d'autres transfections cellulaires.
Nous avons en outre effectué une imunohistochimie pour identifier le produit du gène reporter. Majoritairement, ce sont les cellules matures qui sont transfectées au niveau de la surface de l'épithélium (figure 6A). Ces données montrent que les liposomes cationiques sont capables d' induire la transfection de gènes dans des cellules non proliferatives et totalement différenciées de l'épithélium des voies respiratoires.
L'expression du transgène est également détectée dans les glandes sous-mucosales (figure 6B). La détection par marquage immunologique des cellules transfectées, en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre la (3-galactosidase d'E coli, confirme cette expression dans les glandes sous-mucosales et l'épithélium de surface (figure 6C). L'expression transgénique est également mise en évidence dans les glandes sous-mucosales par coloration à l'immunoperoxidase avec un anticorps dirigé contre la protéine luciferase après transfection de p RSV-Luc avec BGTC/DOP (figure 6D}.
Des contrôles négatifs sont effectuës sans anticorps (figure 6E).

Ces résultats sont d'un intérêt tout particulier pour la thérapie génique dirigée contre la muscavidose. En effet, pour traiter cette pathologie, il est nécessaire de cibler les glandes sous-mucosales qui sont le site principal de l'expression de la CFTR dans les bronches humaines.

DOSAGE QUANTITATIF DE L'EFFICACITE DE TRANSFECTION
DE BGTC/DOPE IN VIVO
Pour ce faire, les poumons et la trachée de souris, traitées avec du liposome BGTC/DOPE et du plasmide pRSV-Luc dans les conditions décrites en exemple 8, 10 sont prélevées 48h après la transfection et l'activité luciférase dosée selon le protocole décrit dans matériel et méthode.
Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-après.
Tableau 3 VECTEURS ACTIVITE LUCIFERASE

(RLU/rn rotine) BGTC/DOPE Liposomes 2.8 x 105 pRSV-Luc (moyenne : 3 x 104 - 8 x 105) RSV-Lac Z 0 ADN nu RSV-Luc 0 L'activité luciférase est détectée de manière systématique dans les homogénats 15 de trachée mais pas dans ceux des poumons. Cette observation est en accord avec les résultats précédents obtenus lors de l'examen de la distribution des cellules positives à
l'Xgal. On note que l'expression luciferase est directement liée au plasmide d' expression puisque qu' aucune activité n' a pu être détectée dans le témoin contenant un plasmide LacZ. A titre témoin, il a été également été réalisé une transfection du plasmide sans vecteur. On n'observe dans cet essai témoin aucune expression de luciférase.
Ces données démontrent l'efficacité des liposomes BGTC/DOPE pour la transfection génique in vivo des voies respiratoires.

TRANSFERT DE GENE IN VIVO PAR INJECTION
INTRAVEINEUSE OU INTRAPERITONEALE
Les formulations des lipides cationiques et l'ADN sont décrits dans l'exemple 7.
10.1 - Effet Dose des lipides cationiques (figures 7-8) Les souris BalbC âgées de 5 semaines sont injectées par voie intraveineuse (veine queue) ou intrapéritonéale par 200 ~1 de mélange transfectant en solution dans du NaCI 37,5 mM, glucose 5% et l'expression de la luciférase est recherchée à

heures post-transfection dans le poumon après injection intraveineuse, et dans le foie et la rate après injection intrapéritonéale. Les organes sont prélevés à froid dans du tampon de lyse [Promega E153A] additionné d'inhibiteurs de protéase [Boehringer 1697498] et homogénéisés avec un broyeur Heidolph DIAX600. L'activité
luciférase est recherchée dans le surnageant 140008 des extraits tissulaires.
Injection intraveineuse Chaque souris reçoit 50 ~.g d' ADN complexé par différentes concentrations de BGTC sous forme de « liposomes ». Le rapport optimum en nanomoles lipide cationique/~g ADN observé est de 9 (figure 7); aucune toxicité n'a pu être mise en évidence pour des doses allant jusqu'à 900 nanomoles de BGTC injectées.
Injection intra~ritonéale Le BGTC sous forme de « liposomes » a été injecté avec 100 ~g d'ADN par souris. Aussi bien dans le foie (figure 8B) que dans la rate (figure 8A), le maximum d'expression est obtenu pour i,5 nanomoles BGTC/~,g d'ADN.
10.2 - Cinétique d'expression après injection intraveineuse Nous avons recherché la biodistribution de l'expression de la luciférase dans organes en tonction du temps suivant l'injection de 200 ~1 de mélange « liposomes »BGTC/ADN dans du NaCI 37,5 mM, glucose 5% [ 50 ~g ADN et 9 nanomoles BGTC/~,g ADN] dans la veine de la queue de souris BalbC âgées de 5 semaines. Les résultats sont exprimés en picogramme de luciférase extraite par organe suivant une courbe de calibration avec de la luciférase commercialisée sous forme cristallisée. La limite de détection se situe entre 0,5 et 1 picogramme de luciférase.
Nous mettons en évidence que, dans les conditions testées, le maximum d'expression est obtenu à 23 heures post-transfection pour 6 des 7 organes étudiés, à
savoir le diaphragme, le gastrocnémien, le coeur, le poumon, le rein et la rate.
L'expression au niveau du foie semble plus précoce. Le maximum d'expression est obtenu au niveau pulmonaire avec un taux de 0,5 nanogramme à 23 heures post-transfection.

Claims (22)

REVENDICATIONS

1. Composé de formule générale I ou un de ses sels dans laquelle:
- R1 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale II avec au moins l'un d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène, dans laquelle:
- n et m représentent indépendamment l'un de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4 - R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule III, où au moins R4 ou R5 est différent de l'hydrogène dans laquelle p et q représentent indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à 0 ou 1, quand r est égal à 1 X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2 avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5.

2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 et R3 y représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale IV

dans laquelle n, m et p étant tels que définis à la revendication 1 et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule V

avec p et r étant tels que définis à la revendication 1, et avec m, n, p, q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3.

3. Composé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un composé représenté par l'une des sous formules générales suivantes:

(H2N)2+C-NH-(CH2)2-NH-COO-R1 VI
[(H2N)2+C-NH-(CH2)3[(H2N)2+C-NH-(CH2)4]-N-COO-R1 VII
[(H2N)2+C-NH-(CH2)2]2- N-(CH2)2 -NH -COO- R1 VIII
[(H2N)2+C-(CH2)2]2 N-COO-R1 ou IX
[[(H2N)2+C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]N-COO- R1 X
dans lesquelles R1 est défini selon la revendication 1.

4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi [[(H2N)2+C-(CH2)2]2- N-(CH2)2]2N-COO-R1 [(H2N)2+C-NH-(CH2)3][(H2N)2+C-NH-CH2)4]-N-COO-R1 et [(H2N)2+C-(CH2)2]2N-COO-R1 dans lesquels R1 représente un groupement cholesteryle.

5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC).

6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC).

7. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, associé
à un acide nucléique.

8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7, caractérisée en ce que le composé est Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC).

9. Composition pharmaceutique selon la revendication 7, caractérisée en ce que le composé est Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC).

10. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.

11. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.

12. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.

13. Composition pharmaceutique comprenant un composé selon la revendication 1, un lipide neutre et un acide nucléique.

14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi le BGTC et le BGSC.

15. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que le lipide neutre est la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE).

16. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.

17. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.

18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.

19. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 7 à 18, caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.

20. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 7 à 18, caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses.

21. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la transfection in vitro, ex vivo et/ou in vivo de cellules.

22. Méthode de transfert d'acide nucléique dans des cellules comprenant la mise en contact dudit acide nucléique avec un composé selon la revendication 1, et l'incubation de mélange résultant avec lesdites cellules.