JP2002501762A

JP2002501762A - 還元性条件に感受性のトランスフェクション用組成物、該組成物を含有する医薬組成物及びそれらの用途

Info

Publication number: JP2002501762A
Application number: JP2000530060A
Authority: JP
Inventors: ビイク，ゲラルド; デユベルトレ，カトリーヌ; ピタール，ブリユノ; シエルマン，ダニエル
Original assignee: アバンテイス・フアルマ・エス・アー
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-28
Publication date: 2002-01-22
Also published as: AU759197B2; KR20010081924A; EP1049793A2; HUP0101393A3; CA2318512A1; NO20003880L; DE69927669T2; WO1999038821A3; AU4384300A; BR9907269A; CN1289371A; DE69927669D1; NO20003880D0; HUP0101393A1; US6521252B1; ATE306556T1; CA2318512C; EP1049793B1; WO1999038821A2; IL137247A0

Abstract

(57)【要約】本発明は細胞に核酸を導入する新規な導入剤に関する。本発明の導入剤の特徴は、還元性条件に感受性の１つまたは複数のジスルフィド結合を有することである。本発明はまた、有益な核酸を様々な種類の細胞に試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘｖｉｖｏ）で導入するためのこのような導入剤を含有する組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は細胞に核酸を導入するための新規な核酸導入剤に関する。より詳細に
は本発明の導入剤は、還元性条件に感受性の１つまたは複数のジスルフィド結合
を含むことを特徴とする。これらの新規な導入剤は有益な核酸を多様な種類の細
胞にｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで導入するために
有用である。

【０００２】バイオテクノロジーの発達に伴って、核酸を細胞に効果的に導入する手段が必
要になった。例えば、組換えタンパク質を産生するため、または、実験室で遺伝
子発現の調節、遺伝子のクローニングまたはＤＮＡに関する他の任意の操作を研
究するために、核酸をｉｎｖｉｔｒｏで細胞に導入する必要がある。また、例
えば、トランスジェニック動物の作製、ワクチンの製造、標識方法または治療方
法の研究などの場合には、核酸をｉｎｖｉｖｏで細胞に導入する必要がある。
更に、骨髄移植法、免疫治療法、または、生体から採取した細胞に遺伝子を導入
し後で生体に戻す操作を含むようなその他の方法では、核酸をｅｘｖｉｖｏで
細胞に導入する必要がある。

【０００３】ベクターの効率が所望の用途及び対象細胞の種類次第で異なることが観察され
たので、細胞への核酸導入を改善するために今日まで開発された種々の合成ベク
ターはかなりの構造的多様性を有している。ベクターの効率はその構造に大きく
依存する。

【０００４】現在までに開発された合成ベクターのうちでカチオン性脂質は重要な地位を占
めている。この種のベクターは、核酸と相互作用するカチオン性極性部分と、形
成された複合体を外部媒体から保護し得る疎水性脂質部分とから成る。脂質の例
としては、モノカチオン性脂質（ＤＯＴＭＡ；Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標
））、リポポリアミン、特にジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧ
Ｓ）または欧州特許出願ＥＰ３９４１１１にその製法が記載されたパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン−５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥ
Ｓ）があり、また、国際特許出願ＷＯ９６／１７８２３及びＷＯ９７／１８１８
５に引用されたカチオン性脂質がある（これらの特許出願の記載内容は参照によ
って本発明に含まれるものとする）。

【０００５】カチオン性脂質がトランスフェクションを促進し得る特性を有することは多く
の研究によって証明された。しかしながら現在では、別の有益な特性を更に付加
し得る新規な構造をもつカチオン性脂質の開発が必要であると考えられている。
即ち、特に膜障壁を突破し易いカチオン性脂質が要望されている。何故なら、実
際のトランスフェクション効率に不利に作用する多くの障害が存在するからであ
る。特に顕著な障害は、核酸が生体膜を貫通して細胞区画に侵入するのが難しい
ことである（“ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｒｒｉｅ
ｒｓｔｏＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｂｙａＣａｔｉｏｎｉｃＬｉ
ｐｉｄ”，Ｚａｂｎｅｒ，Ｊら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，Ｎｏ．３
２，１８９９７−１９００７）。本発明はこの技術的難題の解決を提案する。

【０００６】従って本発明は、核酸に非共有的に結合し得る少なくとも１つのカチオン性親
水性領域と少なくとも１つの脂肪親和性領域とを含む核酸導入剤であって、これ
らの領域がいわゆる“スペーサー”アームを介して互いに連結されており、核酸
導入剤が更に、還元によって脂肪親和性領域が部分分解されるように配置されて
いるかまたは該核酸導入剤が対称形であるときには還元によって該核酸導入剤を
二等分するように配置されている少なくとも１つのジスルフィド結合を含む新規
な核酸導入剤に関する。

【０００７】これらの導入剤は、カチオン性親水性部分の作用によって核酸との複合体を有
効に形成し得る。この相互作用によって核酸が強力に圧縮される。脂肪親和性領
域は脂質膜から形成された粒子を被覆することによってこのイオン性相互作用を
外部媒体に不感受性にする。

【０００８】ベクターとして望ましいこれらの特性に加えて、本発明の導入剤は極めて有利
な界面活性特性を有している。これらは、１つまたは複数のジスルフィド結合が
存在するので還元性細胞媒体中で膜の不安定化剤であるポリアミノ化アルキル鎖
型分子が生成されることによる。即ち、ジスルフィド結合は酸化性媒体中では安
定な共有結合を形成でき、還元性媒体中では以下の式：Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ→Ｘ−ＳＨ＋ＨＳ−Ｙに従って分割され得る。

【０００９】この型の構造は例えばアミノ酸としてシステインを含む幾つかのタンパク質で
も観察され、タンパク質の三次元構造に関与し、従ってタンパク質の生物活性に
関与する。またジスルフィド結合は、標的ドメインを活性ドメインに連結する目
的で、いくつかのキメラタンパク質、特にイムノトキシンには既に導入されてい
る。

【００１０】本文中で使用された“還元性媒体”なる用語は、天然の還元性媒体、例えば細
胞内媒体、より特定的には細胞質、特にエンドソームを意味する。天然条件を表
す人工の還元性媒体は、例えば０．１％−２０％のジチオトレイトール（ＤＴＴ
）を含む媒体である。

【００１１】逆に、“酸化性媒体”なる用語は、周囲の酸素に接触しており還元剤を含有し
ない任意の媒体、特に細胞外媒体を意味する。代表的な酸化性媒体は、例えば１
５０ｍＭの等張塩化ナトリウム溶液または５％ブドウ糖を含有する溶液から成る
。

【００１２】出願人は全く予想外にも、非還元性媒体中の核酸の複合体形成能力に全く影響
を及ぼすことなく１つまたは複数のジスルフィド結合を特にカチオン性脂質型の
核酸導入用合成ベクターに導入できることを知見した。出願人はまた、これらの
ベクターの核酸導入特性が維持され、改善さえも可能であることを知見した。更
に、形成された複合体は還元性媒体中、特に細胞中で分解して界面活性分子を生
成し、その結果としてより多量の核酸が細胞転写装置に接近可能になる。

【００１３】本文中で使用された“界面活性”なる用語は、生体膜に侵入し生体膜を不安定
化する特性をもつ任意の両親媒性分子を意味する。両親媒性界面活性粒子はリン
脂質二重層に侵入し脂質及びタンパク質を溶解させることによって膜を破壊する
能力を有している（ＬａＣｅｌｌｕｌｅ，Ｅｄ．ＶｉｇｏｔｅｔＤｅｃａ
ｒｉｅ，１９８８，ｐｐ．５８１−５８３）。

【００１４】本発明の導入剤の別の利点はその固有毒性が弱められていることにある。即ち
、導入剤は細胞内の還元性条件に感受性のジスルフィド結合の処で分解されるの
で、従来の導入ベクターで観察された毒性作用を生じない。更に、膜透過が改善
されるので、核酸／導入剤複合体の使用量を減少させることができ、毒性に関し
ても有利な結果が得られる。

【００１５】最後に、出願人はまた、導入剤が十分な脂肪親和性を有しており且つ導入剤が
適正量で使用されるときには導入特性が有意に改善されることを知見した。より
詳細には、これらの導入剤の脂肪親和性の増加またはステロイド由来鎖の導入に
よって得られる主要な利点の１つは血清抵抗の改善であることを知見した。

【００１６】本発明の導入剤は２つの型の構造を有し得る。双方の構造の違いはその技術的
効果に全く影響しない。第一の型の構造は以下のごとく示される：カチオン性親水性領域−スペーサー−脂肪親和性領域このような構造中では１つまたは複数のジスルフィド結合が、脂肪親和性領域
に配置されており、還元されたときに両親媒性界面活性粒子を生成する。

【００１７】第二の型の構造は以下のごとく示される：

【００１８】

【化１】

【００１９】この場合には１つまたは複数のジスルフィド結合が、還元されたときに導入剤
を対称な２つの部分に二等分するように配置されている。即ち２つのスペーサー
部分の間に配置されている。

【００２０】本文中に使用された“カチオン性親水性部分”なる用語は、生理的ｐＨ即ちｐ
Ｈ５−８の範囲で総体的に正電荷を有しており更に核酸結合特性を有している任
意の親水性分子を意味する。この結合は特に、例えばイオン相互作用のような非
共有結合型の結合である。好ましくは、本発明の導入剤中に存在するカチオン性
親水性領域はポリアミンまたポリアミノグアニジンである。

【００２１】有利な変形によれば、カチオン性親水性領域は以下の一般式：

【００２２】

【化２】〔式中、ｍは２以上の整数、ｌは１以上の整数、ｍは２つのアミンの異なる炭素
基の間で異なる値をとり得る〕で示される。好ましくはｍは２−６の範囲（両端
値を含む）であり、ｌは１−５の範囲（両端値を含む）である。より好ましくは
、ポリアミン領域はスペルミンによって表される。

【００２３】別の好ましいポリアミン領域は、国際特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載の
以下の一般式：

【００２４】

【化３】〔式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、互いに独立に水素原子または基−（ＣＨ_２）_ｑ −ＮＲＲ′を示し、ｑは異なる基Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の間で独立に１、２、３、
４、５及び６のいずれかを表し、Ｒ及びＲ′は互いに独立に水素原子または基−
（ＣＨ_２）_ｑ−ＮＨ_２を表し、但しｑは前記と同義であり、ｍ及びｎは互いに独
立に０−６の範囲の整数を表し、但し、ｎが１よりも大きいときはｍは種々の値
でよく、Ｒ_３は上記一般式に定義された種々の基を表す〕で示される。

【００２５】本発明の導入剤に存在する脂肪親和性領域は少なくとも１つの脂肪質脂肪族鎖
と、１つまたは複数の別の脂肪族鎖、１つまたは複数のステロイド誘導体、天然
もしくは合成の脂質または任意にこれらの組合せとから成り、好ましくはラメラ
相または六方相を形成し得る。これらの構造の特徴は、層間または管間の間隔が
脂肪質脂肪族鎖または脂質の極性部分の長さに依存していることである。

【００２６】本文中で使用された“脂肪質脂肪族鎖”なる表現は、任意に飽和及び／または
フッ素化した炭素原子数１０−２２の分枝状または直鎖状のアルキル鎖を意味す
る。炭素原子数１２−２２の鎖が好ましい。より特定的にはＣ_１２、Ｃ_１３、Ｃ _１４、Ｃ_１６、Ｃ_１８、Ｃ_１９などの脂肪族基、特に基（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３、
（ＣＨ_２）_１２ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_１３ＣＨ_３及び（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３が好ま
しい。

【００２７】脂肪親和性領域がステロイドの誘導体を含むとき、ステロイドの誘導体は好ま
しくはコレステロール、コリン酸及びコレステリルアミンから選択される。

【００２８】好ましい実施態様においては、脂肪親和性領域が少なくとも２つの脂肪質脂肪
族鎖から成る。より好ましくは、脂肪親和性領域が２つまたは３つの脂肪質脂肪
族鎖から成る。

【００２９】本発明の別の有利な変形によれば、脂肪親和性部分が１つの脂肪質脂肪族鎖と
１つのステロイド誘導体とから成る。

【００３０】本発明の導入剤が対称形構造を有するとき、分子の対称部分の各々が少なくと
も１つの脂肪質脂肪族鎖を含む。

【００３１】カチオン性親水性領域と脂肪親和性領域とはいわゆる“スペーサー”アームを
介して互いに連結されている。スペーサーの非限定例は、当業者に公知の加水分
解性官能基を含む任意の酸基またはアミン基である。好ましくはスペーサー領域
が脂肪族鎖または芳香族鎖を含む。好ましくはスペーサー領域が例えばアミド基
、カーバメート基、エステル基、エーテル基または芳香環から選択される。

【００３２】本発明の導入剤は１つまたは複数のジスルフィド結合を含む。この結合の数は
導入剤の構造及び所望の特性に従って当業者が決定する。導入剤が１つまたは２
つのジスルフィド結合、より好ましくは１つのジスルフィド結合を含むのが有利
である。導入剤の内部で（１つまたは複数の）ジスルフィド結合は種々の場所に
配置され得る。その位置は結合の数及び導入剤の構造に依存する。

【００３３】第一の実施態様において、ジスルフィド結合は、その還元が脂肪親和性領域を
部分分解し、その結果として細胞内に両親媒性界面活性分子を生じさせるように
配置されている。これらの部分分解は特に、脂肪親和性領域が複数の脂肪族鎖を
有するときは１つの脂肪族鎖の破壊に対応し、脂肪親和性領域が１つのステロイ
ド由来鎖を有するときは該ステロイド由来鎖の破壊に対応する。脂肪質脂肪族鎖
の破壊という表現は、鎖の完全な消滅を意味するか、または、鎖が部分的に消滅
し残余部分が存在するが余りにも短いので脂肪質鎖（少なくとも１０炭素原子の
長さ）を構成できないことを意味する。このような分解によって複合体の一体性
が破壊され、複合体は徐々に崩壊して解離要素になり、その要素の少なくとも１
つが両親媒性界面活性分子である。複合体の分解は顕微鏡観察または電気泳動に
よって容易に確認できる。

【００３４】別の変形において、ジスルフィド結合は、その還元が導入剤を二等分するよう
に対称形構造をもつ導入剤の２つのスペーサーアームの間に配置されている。

【００３５】本発明の好ましい導入剤は、 −カチオン性親水性領域としてポリアミンまたはポリアミノグアニジンを含んで
おり、 −脂肪親和性領域として少なくとも２つの脂肪質脂肪族鎖を含むかまたは少なく
とも１つのステロイド由来鎖と１つの脂肪質脂肪族鎖とを含んでおり、 −その還元が、１つの脂肪質脂肪族鎖を破壊するか、または、導入剤がステロイ
ド由来鎖を含むときは該ステロイド由来鎖を破壊するジスルフィド結合とを含ん
でいる。

【００３６】特に有利な形態の本発明の導入剤は、１つのポリアミン領域と、その少なくと
も２つが脂肪鎖であるような少なくとも３つの脂肪族鎖と、還元性媒体中で１つ
の脂肪族鎖を破壊する１つのジスルフィド結合とを含む。

【００３７】特に有利な形態の別の導入剤は、１つのポリアミン領域と１つの脂肪質脂肪族
鎖と１つのステロイド由来鎖と還元性媒体中でステロイド由来鎖を破壊する１つ
のジスルフィド結合とを含む。

【００３８】特に有利な別の導入剤は、対称な２つのリポポリアミンと還元性媒体中で２つ
のリポポリアミンを二等分する１つのジスルフィド結合とを含む。

【００３９】このような導入剤を実施例で説明する。非限定例として以下の化合物を挙げる
ことができる：

【００４０】

【化４】

【００４１】

【化５】

【００４２】本発明の別の目的は、上記に定義の導入剤と少なくとも１つの核酸とを含む組
成物に関する。好ましくは、導入剤及び核酸は、導入剤の正電荷と核酸の負電荷
との比が０．１−５０の範囲になるような量で存在する。この比は使用される導
入剤、核酸及びトランスフェクション対象細胞の種類に従って当業者が容易に調
節できる。好ましくはこの比は、核酸１μｇあたり本発明の導入剤３−１２ナノ
モルの範囲、より好ましくは核酸１μｇあたりトランスフェクション剤３−９ナ
ノモルの範囲である。

【００４３】本発明の“核酸”はデオキシリボ核酸でもよくまたはリボ核酸でもよい。核酸
は天然配列でもよく人工配列でもよい。特に、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＤＮＡ（ｍＤＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲ
ＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ハイブリッド配列または合成もしくは
半合成の修飾もしくは非修飾のオリゴヌクレオチド配列でよい。これらの核酸は
、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどに由来し得る。核酸は当業者に公知の
任意の技術、特に、バンクスクリーニング、化学合成、または、バンクスクリー
ニングによって得られた配列を化学的もしくは酵素的に修飾するような混成方法
によって得られる。核酸は化学的に修飾され得る。即ち核酸は、偽核酸（ＰＮＡ
）、種々の化学結合によって修飾されたオリゴヌクレオチド（例えばホスホロチ
オエートまたはメチルホスホネート）でもよく、または、官能化オリゴヌクレオ
チド、即ち異なる特性構造をもつ１つまたは複数の分子に結合したオリゴヌクレ
オチドでもよい。

【００４４】特にデオキシリボ核酸に関して考察すると、これらは一本鎖でも二重鎖でもよ
く、短いオリゴヌクレオチドでもより長い配列でもよい。より特定的には核酸が
プラスミド、ベクター、エピソーム、発現カセット、などから成るのが有利であ
る。これらのデオキシリボ核酸は、治療有効遺伝子、転写もしくは複製の調節配
列、修飾もしくは非修飾のアンチセンス配列、他の細胞成分への連結領域、など
を含み得る。

【００４５】好ましくは、核酸に含まれている１つまたは複数の治療有効遺伝子がターゲッ
ト細胞中で活性の１つまたは複数のプロモーター及び１つの転写ターミネーター
のコントロール下に配置されている。

【００４６】本文中に使用された“治療有効遺伝子”なる表現は特に、治療効果を有するタ
ンパク質産物をコードする任意の遺伝子を意味する。この遺伝子でコードされて
いるタンパク質産物はタンパク質、ペプチドなどである。このタンパク質産物は
ターゲット細胞にホモロガスでもよい（即ち、ターゲット細胞が疾病を全く有し
ていないときにターゲット細胞中で正常に発現されている産物）。この場合、タ
ンパク質の発現は例えば、細胞中の不十分な発現を解消し、修飾が原因で不活性
化または微活性化したタンパク質の発現を高め得る。治療用遺伝子はまた、安定
性の強化、活性の修飾などを獲得した細胞タンパク質の突然変異体をコードし得
る。タンパク質産物はまた、ターゲット細胞にヘテロロガスでもよい。この場合
、発現されたタンパク質は例えば、該細胞で欠失している活性を補完または付与
することによって細胞の疾病防御または免疫応答の増進などに役立つ。

【００４７】本発明の定義に包含される治療有効物質としては特に、酵素、血液誘導体、ホ
ルモン、リンホカイン〔インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（フ
ランス特許ＦＲ９２／０３１２０）〕、成長因子、神経伝達物質またはそれらの
前駆体または合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭ
Ｆ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィンなど
）、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（フランス特許ＦＲ９１／１１９
４７）、膵線維症関連のＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑制遺伝子〔ｐ５３、Ｒｂ、
Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ、など（フランス特許ＦＲ９３／０４７４５）
〕、凝血関与因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子）をコードする遺伝子、ＤＮＡ
修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ
）、ヘモグロビン及び別の運搬タンパク質の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ、Ｊ及びａｐｏ（ａ）から選択されたアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関
与するタンパク質に対応する遺伝子、リポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、
レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、７アルファコレステロール
ヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼのような代謝酵素、コレス
テロールエステル運搬タンパク質、リン脂質運搬タンパク質のような脂質運搬タ
ンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質、ＬＤＬ受容体、キロミクロンレムナント受容
体、スカベンジャー受容体から選択された受容体、などがある。

【００４８】治療有効核酸はまた、ターゲット細胞中で発現することによって遺伝子の発現
または細胞ｍＲＮＡの転写をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列
でもよい。このような配列は例えば欧州特許ＥＰ１４０３０８に記載の技術に従
ってターゲット細胞に細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡとして転写され、細胞ｍＲＮ
Ａがタンパク質に翻訳されることを阻止する。治療用遺伝子はまた、ターゲット
ＲＮＡを選択的に破壊し得るリボザイムをコードする配列を含む（欧州特許ＥＰ
３２１２０１）。

【００４９】上記に指摘したように、核酸は更に、ヒトまたは動物の体内で免疫応答を誘発
し得る抗原性ペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むこともできる
。この特定実施態様によれば本発明は、特に微生物、ウイルスまたは癌を対象と
するヒトまたは動物用のワクチンまたは免疫治療方法を提供し得る。特に、エプ
スタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂウイルス（欧州特許ＥＰ１
８３５７３）、偽狂犬病ウイルス、“合胞体形成ウイルス”及びその他のウイル
スに特異的または腫瘍特異的な抗原性ペプチドがコードされている（欧州特許Ｅ
Ｐ２５９２１２）。

【００５０】好ましくは核酸は更に、治療有効遺伝子及び／または抗原性ペプチドをコード
する遺伝子を所望の細胞中または生物体内で発現させ得る配列を含む。該配列は
、考察中の遺伝子の発現を担当する天然配列が感染細胞中で機能し得るときには
この天然配列でよい。また、（合成タンパク質も含めて別のタンパク質の発現を
担当する）異なる起原の配列でもよい。特に、真核細胞遺伝子またはウイルス遺
伝子のプロモーター配列でもよい。例えば、感染対象細胞のゲノムに由来のプロ
モーター配列でもよい。また、ウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列でも
よい。このような配列の例は、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなどの遺伝子の
プロモーター配列である。更に、これらの発現配列を、活性化配列、調節配列な
どの付加によって修飾し得る。配列はまた、誘導プロモーターでもよく抑制プロ
モーターでもよい。

【００５１】更に、核酸はまた、合成された治療用産物をターゲット細胞の分泌経路に案内
するシグナル配列を特に治療有効遺伝子の上流に含み得る。このシグナル配列は
治療用産物の天然のシグナル配列でもよいが、任意の別の機能性シグナル配列ま
たは人工のシグナル配列でもよい。核酸はまた、合成された治療用産物を細胞の
特定区画に案内するシグナル配列を含み得る。

【００５２】組成物は更に、導入剤／核酸複合体に結合し、複合体のトランスフェクション
能力を改善し得るアジュバントを含み得る。

【００５３】この観点から本発明組成物は１種または複数の中性脂質をアジュバントとして
含み得る。導入剤の正電荷と核酸の負電荷との比が小さいときにはこのような組
成物が特に有利である。実際、中性脂質の添加はヌクレオリピド粒子の形成を促
進し、膜を不安定化することによって細胞内侵入を助けることが判明した。

【００５４】より好ましくは本発明の範囲内で使用される中性脂質は２つの脂肪質鎖をもつ
脂質である。

【００５５】生理的条件下で両イオン性もしくはイオン的に無電荷の天然もしくは合成の脂
質を使用するのが特に有利である。脂質は特に、ジオレイルホスファチジルエタ
ノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレイルパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、−パルミトイル、−コレステリル、−ミ
リストイルホスファチジルエタノールアミン及び１−３回Ｎ−メチル化されたそ
れらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール
、セレブロシド（特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴ脂質（特にスフィン
ゴミエリン）またはアシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）
から選択される。これらの種々の脂質は当業者に公知の従来技術を用いた合成に
よって得られてもよく、または、器官（例えば脳）もしくは卵から抽出されても
よい。特に天然脂質は有機溶媒を用いて抽出できる（ＬｅｈｎｉｎｇｅｒＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙも参照）。

【００５６】より最近に出願人は、国際特許出願ＷＯ９６／２５５０８に記載の化合物のよ
うな核酸の縮合に直接または間接に関与する化合物をアジュバントとして使用す
るのが特に有利であることも証明した。リポポリアミンを主成分とするトランス
フェクション用組成物の内部に存在するこのような化合物は、組成物のトランス
フェクション活性に全く不利益を与えることなく該組成物の使用量をかなり削減
できるので、毒物学的に有利な結果を与える。核酸の縮合に関与する化合物とい
う表現は、核酸を直接または間接に圧縮する化合物を意味すると理解されたい。
より正確には、この化合物はトランスフェクトすべき核酸に直接作用してもよく
、または、核酸の縮合に直接関与する付加化合物に作用してもよい。好ましくは
化合物が核酸に直接作用する。特に予備圧縮剤は任意のポリカチオンでよく、例
えばポリリシンでよい。好ましい実施態様によれば、核酸の縮合に関与するアジ
ュバントは全部または一部がプロタミン、ヒストン、ヌクレオリン及び／または
その誘導体の１つから誘導され得る。このようなアジュバントはまた全部または
一部がモチーフ数２−１０個のペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／
または（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され得る。本発明化合物の構造中でこれら
のモチーフは連続的に反復されてもまたは不連続的に反復されてもよい。従って
これらのモチーフは１つもしくは複数のアミノ酸のような生化学的リンクまたは
化学的リンクによって隔てられていてもよい。

【００５７】本発明組成物は、好ましくは１当量の核酸に対して０．０１−２０当量（重量
／重量）、より好ましくは０．５−５当量のアジュバントを含み得る。

【００５８】本発明組成物はまた、核酸複合体を細胞表面の受容体またはリガンドに案内し
得る１つまたは複数のターゲッティング要素を含み得る。例えば本発明組成物は
、細胞表面分子に対する１つもしくは複数の抗体、または、インスリン、トラン
スフェリン、葉酸もしくは他の任意の成長因子、サイトカインまたはビタミンの
ような膜受容体の１つもしくは複数のリガンドを含み得る。好ましくは組成物は
、特定多糖類を細胞の表面または隣接の細胞外マトリックスにターゲッティング
させるための修飾または非修飾のレクチンを含み得る。ＲＧＤモチーフのタンパ
ク質、タンデム構造のＲＧＤモチーフを含む環状または非環状ノペプチド、ポリ
リシンペプチドも使用し得る。より最近には、特定細胞に対する選択性を有して
おりこれらの細胞に対するインターナリゼーションを有効に促進し得るという利
点をもつ天然もしくは合成のリガンドペプチドが記載された（Ｂａｒｙら，Ｎａ
ｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２，１９９６，２９９−３０５）。これらのター
ゲッティング剤は一般に、考察中のカチオン性トランスフェクション剤にコンジ
ュゲートされる。

【００５９】本発明はまた、１つまたは複数の別の公知の核酸トランスフェクション剤を含
む上記に定義の任意の組成物を包含する。特に、欧州特許ＥＰ３９４１１１また
は国際特許出願ＷＯ９６／１７８２３もしくはＷＯ９７／１８１８５に記載の物
質が挙げられる（これらの特許及び特許出願は参照によって本発明に含まれるも
のとする）。

【００６０】本発明のまた別の目的は、細胞に核酸を導入するために上記の定義の導入剤を
使用することである。

【００６１】本発明の導入剤を含む組成物は、外用、皮膚、経口、経直腸、膣内、非経口、
鼻孔内、静脈内、皮下、眼内、経皮、気管内、腹腔内、などの経路で投与する製
剤として調製され得る。好ましくは本発明の医薬組成物は、特に対象器官に直接
注射する注射剤を調製するためまたは外用（皮膚及び／または粘膜）経路で投与
するために、医薬として許容されるビヒクルを含有する。より特定的にはビヒク
ルは、無菌等張溶液または乾燥組成物、特に必要に応じて滅菌水もしくは生理的
血清を加えて注射可能溶液を復元し得る凍結乾燥組成物である。注射に使用され
る核酸の用量及び投与回数は種々のパラメーター、特に使用される投与形態、対
象となる疾病、発現させるべき遺伝子または所望の治療期間などに応じて適宜選
択される。特に投与形態に関しては、組織もしくは循環経路に組成物を直接注入
してもよく、または、培養細胞を組成物で処理し、処理した培養細胞を注入もし
くは移植によって体内に戻してもよい。

【００６２】本発明は更に、（１）核酸を上記に定義の導入剤に接触させて核酸／導入剤複
合体を形成させる段階と、（２）前項（１）で形成された複合体を細胞に接触させる段階と、から成る細胞内への核酸導入方法に関する。

【００６３】１つまたは複数の公知の別の核酸トランスフェクション剤及び／または１種ま
たは複数のアジュバントを含む組成物の場合には、段階（１）の前に、種々のト
ランスフェクション剤を接触させる段階及び／またはトランスフェクション剤を
１種または複数のアジュバントに接触させる段階を用いる。

【００６４】本発明の導入剤／核酸複合体は、一方がミセルまたは六方ラメラ相の形態の本
発明のトランスフェクション剤を含み他方がトランスフェクトすべき核酸を含む
２つの溶液を等容量で混合することによって形成される。数秒間で複合体が形成
される。複合体は、核酸に添加される脂質の量次第で、負電荷もしくは正電荷を
有するかまたは中性である（ＰｉｔａｒｄＢ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４，ｐｐ．１４４１２−１４４１７，１９９
７年１２月）。これらの複合体のサイズは直径５０−３００ｎｍの範囲である（
準弾性光拡散及び透過型電子顕微鏡観察による測定）。更に、複合体の形態は電
荷比Ｒ（カチオン性脂質によって付与される正電荷と核酸によって付与される負
電荷との比）に伴って変化する。例えば、負電荷をもつ複合体は核酸分子で包囲
されている。逆に、正電荷をもつ複合体は表面にカチオン性脂質を有している。
中性複合体はコロイド的に不安定である。従って出願人は、十分な量の非イオン
性界面活性剤を添加することによって複合体を安定化できることを示した。好ま
しい界面活性剤の特定例は、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルコール、ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル、または、樹状ベンジルポリエーテル
ヘッドをもつＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である。

【００６５】細胞と複合体とを接触させるためには、細胞を該複合体とインキュベーション
するか（ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏ使用の場合）、または、複合体
を生物体に注入する（ｉｎｖｉｖｏ使用の場合）。例えば１０^６細胞あたり０
．０１−１０００μｇの核酸の存在下でインキュベーションを行うのが好ましい
。ｉｎｖｉｖｏ投与のためには、核酸を０．０１−１０ｍｇの範囲の用量で使
用し得る。

【００６６】本発明の導入剤は、一次細胞または樹立細胞系に核酸を導入するために特に有
利に使用され得る。このような細胞としては、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞
（ニューロン、星状膠細胞、神経膠細胞）、肝細胞、造血細胞（リンパ球、ＣＤ
３４、樹状細胞など）、上皮細胞、などがあり、細胞は分化形態でもよくまたは
多能形態（前駆体）でもよい。

【００６７】従って本発明は、本発明化合物に結合された疾病治療用核酸のｉｎｖｉｖｏ
、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ投与から成る特に有利な疾病の治療方
法を提供する。より特定的には本発明方法は、タンパク性物質または核性物質の
欠損または欠失を原因とする疾病に適用され得る。投与される核酸は上記タンパ
ク性物質をコードしているかまたは上記核性物質を含有している。

【００６８】上記の内容に加えて本発明は更に、別の特徴及び利点を有している。これらの
特徴及び利点は図面及び実施例に関する以下の記載から明らかであろう。しかし
ながらこれらの実施例及び図面は本発明の代表例であり本発明の範囲を限定しな
いことを理解されたい。特に、出願人は本発明の導入剤の製造に使用できる種々
の処理プロトコル及び反応中間体を非限定的に示した。これらのプロトコル及び
中間生成物に基づいて同じ化合物を製造するための類似の方法を想到することは
当業者にはもちろん容易であろう。

【００６９】実施例実施例１：本発明の導入剤の化学合成Ａ．材料 −トリエチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、ジオクタデシルアミ
ン、Ｎα，Ｎα′−ジＢｏｃシスチン及びＢＯＰ反応体は市販品を使用する。

【００７０】アミルアミン、オクタデシルアミン、ペンタンチオール、ドデカンチオール、
オクタデカンチオール及びチオコレステロールも市販品を使用する。

【００７１】 −ＢｏｃＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＢｏｃ（ＣＨ_２）_４ＮＢｏｃ（ＣＨ_２）_３ＮＢｏ
ｃＣＨ_２ＣＯ_２Ｈは、国際特許出願ＷＯ９７／１８１８５及びＢｙｋＧ．，Ｆ
ｒｅｄｅｒｉｃＭ．，ａｎｄＳｃｈｅｒｍａｎＤ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎＬｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８，ｐｐ．３２１９−３２２２に発表され
た論文に記載の処理モードに従って実験室で合成した。

【００７２】Ｂ．方法（ａ）分光分析プロトンのＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルをＢｒｕｃｋｅｒ分光計２５０及
び４００ＭＨｚで記録した。

【００７３】（ｂ）クロマトグラフィー技術ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、オートサンプラーＡＳ−
２０００Ａ、ポンプＬ−６２００Ａ、２２０ｎｍのＵＶデテクタＬ４０００及
び演算積分器Ｄ２５００を備えたＨＩＴＡＣＨＩの装置で行う。カラムは、ＡＰ
ＰＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳから販売されている３ｃｍ長さ、４．６ｃｍ
直径のステンレススチールカラムを使用する。移動相はトリフルオロ酢酸を加え
た水及びアセトニトリルであり、固定相はＡｑｕａｐｏｒｅブチル７ミクロンで
ある。流速は１−４ｍｌ／分の範囲とする。

【００７４】薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲルで被覆した２０×２０のア
ルミニウムプレートで行う。

【００７５】（ｃ）分取ＨＰＬＣ精製 −使用した装置は、Ｕ．Ｖ．検出可能な勾配モードの液相クロマトグラフィー
集成装置である。この連続分取装置は：ポンプＡ：５０ＳＣヘッドを備えたＧＩＬＳＯＮモデル３０５；ポンプＢ：５０ＳＣヘッドを備えたＧＩＬＳＯＮモデル３０３；射出ポンプ：２５ＳＣヘッドを備えたＧＩＬＳＯＮモデル３０３；圧力モジュール：ＧＩＬＳＯＮモデル８０６；ミキサー：２３ｍｌヘッドを備えたＧＩＬＳＯＮモデル８１１Ｃ；ＵＶデテクタ：分取セルを備えており２２０ｎｍに調整したＧＩＬＳＯＮモデ
ル１１９；分画コレクタ：架台Ｎｏ．２１を備えたＧＩＬＳＯＮモデル２０２；積分器：ＳＨＩＭＡＤＺＵモデルＣ−Ｒ６Ａ；カラム：ＶＹＤＡＣモデル２１４ＴＰ１０２２として市販されている長さ２５
ｃｍ、直径２．２ｃｍのステンレススチールカラムＣ４（１０ｍｍ）；から構成されている。

【００７６】 −精製すべき物質の溶液を射出ポンプによって流速１５ｍｌ／分でカラムに充
填する。移動相は水とアセトニトリルから成る。

【００７７】Ｃ．化学合成（ａ）ジスルフィド結合によって還元可能な脂肪質鎖をもつ導入剤これらの分子は一般構造：

【００７８】

【化６】を有している。

【００７９】これらの分子を以下の手順で構築した：

【００８０】

【化７】

【００８１】以下の非限定実施例でこれらの導入剤を説明する：化合物（Ｉ）：Ｒ_１＝（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３；Ｒ_２＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３；Ｒ _３＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〔調製物３．１〕化合物（ＩＩ）：Ｒ_１＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３；Ｒ_２＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３；Ｒ_３＝Ｈ〔調製物３．２〕化合物（ＩＩＩ）：Ｒ_１＝（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３；Ｒ_２＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ _３；Ｒ_３＝Ｈ〔調製物３．３〕化合物（ＩＶ）：Ｒ_１＝（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３；Ｒ_２＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３；Ｒ_３＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〔調製物３．４〕化合物（Ｖ）：Ｒ_１＝コレステリル；Ｒ_２＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３；Ｒ_３＝Ｈ
〔調製物３．５〕。

【００８２】段階１調製物１．１：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３〕−ＯＨＮα，Ｎα′−ジＢｏｃシスチン（６．８１ミリモル）をジメチルホルムアミ
ド（２０ｃｍ^３）に溶解させる。この溶液に、トリエチルアミン（５８．１ミリ
モル）及び１−ペンタンチオール（６．８１ミリモル）を順次加える。混合物を
室温で２時間撹拌する。トリエチルアミンを蒸発させ、次いで濃縮物を０．５Ｍ
の硫酸カリウム溶液（ＫＨＳＯ_４）（３００ｃｍ^３）に加える。沈殿した生成物
を１００ｃｍ^３のクロロホルムで３回抽出する。有機相を集めて無水硫酸マグネ
シウムで乾燥し、次いでクロロホルムを蒸発させる。乾燥した抽出物をジエチル
エーテル（１００ｃｍ^３）で可溶化し、次いで５０ｃｍ^３の飽和炭酸ナトリウム
（ＮａＨＣＯ_３）溶液で３回抽出する。水相を集めて０．５ＭのＫＨＳＯ_４溶液
（３５０ｃｍ^３）をｐＨ＝３まで添加することによって中和する。沈殿した生成
物を１００ｃｍ^３のクロロホルムで３回抽出する。有機相を集めて５０ｃｍ^３の
飽和塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で２回洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥する。回転蒸発器でクロロホルムを蒸発させる。得られた生成物をシリ
カカラムでクロロホルム／メタノール（９／１容量／容量）混合物によって溶出
させる。２．３１ミリモルの生成物が得られる。即ち、収率は３４％である。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６３（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１）。

【００８３】調製物１．２：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕−ＯＨＮα，Ｎα′−ジＢｏｃシスチン（６．８１ミリモル）をジメチルホルムアミ
ド（２０ｃｍ^３）に溶解させる。この溶液に、トリエチルアミン（５８．１ミリ
モル）及び１−オクタデカンチオール（６．８１ミリモル）を順次加える。混合
物を４０℃で２時間撹拌する。回転蒸発器でトリエチルアミンを蒸発させ、次い
で濃縮物を０．５ＭのＫＨＳＯ_４溶液（３００ｃｍ^３）に加える。沈殿した生成
物を１００ｃｍ^３のクロロホルムで３回抽出する。有機相を集めて無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、次いでクロロホルムを蒸発させる。乾燥した抽出物をジエチ
ルエーテル（１００ｃｍ^３）で可溶化し、次いで５０ｃｍ^３の飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で３回抽出する。エーテル相を１００ｃｍ^３の０．５ＭのＫＨＳＯ_４溶液で
２回撹拌することによって酸性化し、５０ｃｍ^３の飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄
する。エーテル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで回転蒸発器で蒸発乾
固する。得られた粗生成物を石油エーテル中で晶出させる。１．３６ミリモルの
生成物が得られる。即ち、収率は２０％である。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６７（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
１７．８０分。

【００８４】調製物１．３：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−コレステロール〕−ＯＨチオコレステロールを用いて調製物１．２と同じ手順で合成する。５８％の収
率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５９（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
１９．１６分。

【００８５】調製物１．４：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−ＯＨ１−ドデカンチオールを用いて室温で調製物１．２と同じ手順で合成する。４
０％の収率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６９（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
１３．２３分。

【００８６】段階２調製物２．１：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３〕−Ｎ〔（Ｃ
Ｈ_２）_１７ＣＨ_３〕_２１．１で得られた生成物（１．１５ミリモル）をジクロロメタン（１０ｃｍ^３）に溶解し、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（２．８６ミリモル）、ジオクタ
デシルアミン（１．１５ミリモル）及びＢＯＰ（１．２７ミリモル）を添加する
。混合物を２時間撹拌し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣによって追跡する。

【００８７】回転蒸発器でジクロロメタンを蒸発させる。“粗生成物”をクロロホルム（１
００ｃｍ^３）に入れ、次に、５０ｃｍ^３の０．５ＭのＫＨＳＯ_４で３回、次いで
５０ｃｍ^３の飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で３回、最後に５０ｃｍ^３の飽和ＮａＣｌ溶
液で２回、連続的に洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで
回転蒸発器でクロロホルムを蒸発させる。６４％の収率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９０（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
２５．９６分。

【００８８】調製物２．２：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕−ＮＨ（
ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３調製物１．４で得られた生成物を出発反応体として使用して調製物２．１と同
じ手順で合成する。９７％の収率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８９（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
２４．８４分。

【００８９】調製物２．３：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−ＮＨ（
ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３調製物１．４で得られた生成物を出発反応体として使用して調製物２．１と同
じ手順で合成する。８６％の収率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９０（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
２２．２２分。

【００９０】調製物２．４：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−Ｎ〔（
ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕_２ジオクタデシルアミンと調製物１．４で得られた生成物とを出発反応体として
使用して調製物２．１と同じ手順で合成する。８５％の収率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９０（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１）。

【００９１】調製物２．５：ＮＨＢｏｃＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−コレステロール〕−ＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３オクタデシルアミンと調製物１．３で得られた生成物とを出発反応体として使
用して調製物２．１と同じ手順で合成する。９０％の収率が得られる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８８（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
２６．９８分。

【００９２】段階３調製物３．１〔化合物（Ｉ）〕：ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（
ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ−〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３〕−Ｎ〔（Ｃ
Ｈ_２）_１７ＣＨ_３〕_２調製物２．１の生成物にトリフルオロ酢酸（１０ｃｍ^３）を添加する。溶液を
１．５時間撹拌し、ＢＯＣの開裂をＨＰＬＣによって追跡する。トリフルオロ酢
酸を蒸発させ、痕跡量を除去するために５ｃｍ^３のジエチルエーテルで３回蒸発
させる。

【００９３】乾燥した抽出物を１０ｃｍ^３のジクロロメタンに溶解し、次いでＮ−エチルジ
イソプロピルアミン（３．３４ミリモル）、ＢｏｃＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＢｏｃ（
ＣＨ_２）_４ＮＢｏｃ（ＣＨ_２）_３ＮＢｏｃＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ（０．６４４ミリモル
）及びＢＯＰ（０．７０８ミリモル）を添加する。混合物を２時間撹拌し、反応
をＴＬＣ及びＨＰＬＣによって追跡する。

【００９４】回転蒸発器でジクロロメタンを蒸発させる。粗生成物をクロロホルム（１００
ｃｍ^３）に入れ、次に、５０ｃｍ^３の０．５ＭのＫＨＳＯ_４で３回、５０ｍｌの
飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で３回、最後に５０ｃｍ^３の飽和ＮａＣｌ溶液で２回、連
続的に洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで回転蒸発器で
クロロホルムを蒸発させる。

【００９５】乾燥した抽出物にトリフルオロ酢酸（１０ｃｍ^３）を添加する。溶液を１．５
時間撹拌し、ＢＯＣの開裂をＨＰＬＣによって追跡する。トリフルオロ酢酸を蒸
発させ、痕跡量を除去するために５ｃｍ^３のジエチルエーテルで３回蒸発させる
。得られた粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製する。必要な画分を集めて凍結
乾燥する。０．０８１ミリモルの生成物が塩の形態で得られる。即ち、収率は１
１％である。

【００９６】ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１７．７９分； ^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ_３）_２ＳＯｄ６，δ，ｐｐ
ｍ）：０．９０（ｍｔ，９Ｈ：２つのオクタデシルアミノのＣＨ_３及びペンチル
ジスルファニルのＣＨ_３）；１．１５−１．５０（ｍｔ，６４Ｈ：２つのオクタ
デシルアミノの一方の１５ＣＨ_２及び他方のオクタデシルアミノの１５ＣＨ_２）
；１．４７（ｍｔ，２Ｈ：２つのオクタデシルアミノの一方の１ＣＨ_２）；１．
５５−１．７５（ｍｔ，４Ｈ：２つのオクタデシルアミノの一方の１ＣＨ_２及び
ペンチルジスルファニルの１ＣＨ_２）；１．６５（ｍｆ，４Ｈ：ブチルの２つの
中央ＣＨ_２）；１．８５−２．０５（ｍｔ，４Ｈ：２つのプロピルの中央ＣＨ_２）；２．７０−２．８５（ｍｔ，１Ｈ：システインのＣＨ_２Ｓの１Ｈ）；２．７
８（ｍｔ，２Ｈ：ペンチルジスルファニルのＳＣＨ_２）；２．８５−３．５０（
ｍｔ：ブチルの２ＮＣＨ_２−２つのプロピルの２ＮＣＨ_２−システインのＣＨ_２Ｓの他方のＨ及び２つのオクタデシルアミノのＮＣＨ_２）；３．８０（ｓｌａ
ｒｇｅ，２Ｈ：グリシルアミノのＮＣＨ_２ＣＯＮ）；５．０７（ｍｔ，１Ｈ：シ
ステインのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；９．０５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ：システイン
のＣＯＮＨ）；７．９５−８．８５及び８．９０−９．１５（それぞれ２ｍｆ及
びｍｆｌａｒｇｅ：ＮＨ及びＮＨ_２に対応するＨ）ＭＨ^＋＝９６９。

【００９７】調製物３．２〔化合物（ＩＩ）〕：ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ
（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ−〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕−ＮＨ
（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３調製物２．２で得られた生成物を出発物質として調製物３．１に記載の手順で
合成する。塩の形態の生成物が収率３１％で得られる。

【００９８】ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１５．６３分； ^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ_３）_２ＳＯｄ６，δ，ｐｐ
ｍ）；０．８９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ：オクタデシルアミノのＣＨ_３及び
オクタデシルジスルファニルのＣＨ_３）；１．１５−１．４５（ｍｔ，６０Ｈ：
オクタデシルアミノの１５ＣＨ_２及びオクタデシルジスルファニルの１５ＣＨ_２）；１．４２（ｍｔ：オクタデシルアミノのＣＨ_２の１つ）；１．５５−１．７
０（ｍｔ，２Ｈ：オクタデシルジスルファニルのＣＨ_２の１つ）；１．６６（ｍ
ｆ，４Ｈ：ブチルの２つの中央ＣＨ_２）；１．８５−２．０５（ｍｔ，４Ｈ：２
つのプロピルの中央ＣＨ_２）；２．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：オクタデ
シルジスルファニルのＳＣＨ_２）；２．８５−３．１０（ｍｔ，１４Ｈ：ブチル
の２ＮＣＨ_２−２つのプロピルの２ＮＣＨ_２−オクタデシルアミノのＮＣＨ_２の
１Ｈ及びシステインのＣＨ_２Ｓの１Ｈ）；３．１０（ｄｄ，Ｊ＝１３．５及び６
Ｈｚ，１Ｈ：システインのＣＨ_２Ｓの他方のＨ）；３．１８（ｍｔ，１Ｈ：オク
タデシルアミノのＮＣＨ_２の他方のＨ）；３．８２（ＡＢｖｅｒｙｎａｒｒ
ｏｗ，２Ｈ：グリシルアミノのＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．６０（ｍｔ，１Ｈ：シス
テインのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．２７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ：オクタデ
シルアミノのＣＯＮＨ）；８．９０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ：システインの
ＣＯＮＨ）；７．９５−８．８２及び９．０７（３ｍｆ：ＮＨ及びＮＨ_２に対応
するＨ）ＭＨ^＋＝８９９。

【００９９】調製物３．３〔化合物（ＩＩＩ）〕：ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４Ｎ
Ｈ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ−〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−Ｎ
Ｈ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３調製物２．３で得られた生成物を出発物質として調製物３．１に記載の手順で
合成する。塩の形態の生成物が収率２６．５％で得られる。

【０１００】ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１２．３６分； ^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ_３）_２ＳＯｄ６，δ，ｐｐ
ｍ）：０．９０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ：オクタデシルアミノのＣＨ３及び
ドデシルジスルファニルのＣＨ_３）；１．１５−１．５０（ｍｔ，４８Ｈ：オク
タデシルアミノの１５ＣＨ_２及びドデシルジスルファニルの９ＣＨ_２）；１．４
３（ｍｔ：オクタデシルアミノの１ＣＨ_２）；１．５５−１．７０（ｍｔ，２Ｈ
：ドデシルジスルファニルの１ＣＨ_２）；１．６５（ｍｆ，４Ｈ：ブチルの２つ
の中央ＣＨ_２）；１．８５−２．０５（ｍｔ，４Ｈ：２つのプロピルの中央ＣＨ _２）；２．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ドデシルジスルファニルのＳＣＨ _２）；２．８０−３．０５（ｍｔ，１４Ｈ：ブチルの２ＮＣＨ_２−２つのプロピ
ルの２ＮＣＨ_２−オクタデシルアミノのＮＣＨ_２の１Ｈ及びシステインのＣＨ_２Ｓの１Ｈ）；３．１１（ｄｄ，Ｊ＝１３．５及び６Ｈｚ，１Ｈ：システインのＣ
Ｈ_２Ｓの他方のＨ）；３．１７（ｍｔ，１Ｈ：オクタデシルアミノのＮＣＨ_２の
他方のＨ）；３．８３（ＡＢｎａｒｒｏｗ，２Ｈ：グリシルアミノのＮＣＨ_２ＣＯＮ）；４．６０（ｍｔ，１Ｈ：システインのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．２５
（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ：オクタデシルアミノのＣＯＮＨ）；８．９９（ｄ
，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ：システインのＣＯＮＨ）；７．９６−８．８４及び９
．０９（３ｍｆ：ＮＨ及びＮＨ_２に対応するＨ）ＭＨ^＋＝８１５。

【０１０１】調製物３．４〔化合物（ＩＶ）〕：ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ
（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ−〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−Ｎ〔
（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕_２調製物２．４で得られた生成物を出発物質として調製物３．１に記載の手順で
合成する。塩の形態の生成物が収率３９％で得られる。

【０１０２】ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１９．７５分； ^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ_３）_２ＳＯｄ６，δ，ｐｐ
ｍ）：０．８７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，９Ｈ：２つのオクタデシルアミノのＣＨ _３及びドデシルジスルファニルのＣＨ_３）；１．１５−１．５０（ｍｔ，７８Ｈ
：２つのオクタデシルアミノの１５ＣＨ_２−他方のオクタデシルアミノの１５Ｃ
Ｈ_２及びドデシルジスルファニルの９ＣＨ_２）；１．４７（ｍｔ，２Ｈ：２つの
オクタデシルアミノの一方の１ＣＨ_２）；１．５０−１．７０（ｍｔ，４Ｈ：２
つのオクタデシルアミノの一方の１ＣＨ_２及びドデシルジスルファニルの１ＣＨ _２）；１．６８（ｍｆ，４Ｈ：ブチルの２つの中央ＣＨ_２）；１．８５−２．１
０（ｍｔ，４Ｈ：２つのプロピルの中央ＣＨ_２）；２．７７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈ
ｚ，２Ｈ：ドデシルジスルファニルのＳＣＨ_２）；２．８０（ｍｔ，１Ｈ：シス
テインのＣＨ_２Ｓの１Ｈ）；２．７０−３．５０（ｍｔ：ブチルの２ＮＣＨ_２−
２つのプロピルの２ＮＣＨ_２−システインのＣＨ_２Ｓの他方の１Ｈ及び２つのオ
クタデシルアミノのＮＣＨ_２）；３．８０（ｓ，ｌａｒｇｅ，２Ｈ：グリシルア
ミノのＮＣＨ_２ＣＯＮ）；５．０５（ｍｔ，１Ｈ：システインのＣＯＮＣＨＣＯ
Ｎ）；９．０７（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ：システインのＣＯＮＨ）；７．７５−
８．２０及び８．６５−９．２５（２ｍｆｌａｒｇｅ：ＮＨ及びＮＨ_２に対応
するＨ）ＭＨ^＋＝１０６７。

【０１０３】調製物３．５〔化合物（Ｖ）〕：ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（
ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ−〔Ｓ−Ｓ−コレステロール〕−ＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３調製物２．５で得られた生成物を出発物質とし、ＢＯＣの最終開裂に１０ｃｍ ^３のＴＦＡと０．５ｃｍ^３の水と０．５ｃｍ^３のチオアニソールと０．７５ｇの
フェノールとの混合物を使用する以外は調製物３．１と同じ手順で合成する。塩
の形態の生成物が収率５．６％で得られる。

【０１０４】ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１６．５９分； ^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ_３）_２ＳＯｄ６，温度３８
３Ｋ，δ，ｐｐｍ）：０．７４−１．０５（２ｓ，３Ｈ：それぞれコレステリル
の１８位のＣＨ_３及び１９位のＣＨ_３）；０．８０−０．９５（ｍｔ：オクタデ
シルアミノのＣＨ_３及びコレステリルの２６位のＣＨ_３、２７位のＣＨ_３及び２
１位のＣＨ_３に対応するＨ；１．７７（ｍｔ：ブチルの２つの中央ＣＨ_２に対応
する４Ｈ）；１．８５−２．１０（ｍｔ：２つのプロピルの２つの中央ＣＨ_２に
対応する４Ｈ）；２．９０−３．２５（ｍｔ：ブチルの２つのＮＣＨ_２−２つの
プロピルの２つのＮＣＨ_２−システインのＣＨ_２Ｓ及びオクタデシルアミノのＮ
ＣＨ_２に対応する１６Ｈ）；３．６３（ＡＢｎａｒｒｏｗ，２Ｈ：グリシルア
ミノのＮＣＨ_２ＣＯＮ）；４．６１（ｍｔ，１Ｈ：システインのＣＯＮＣＨＣＯ
Ｎ）；５．３９（ｍｔ，１Ｈ：コレステリルの６位のＣＨ）；７．６９（ｍｔ，
１Ｈ：オクタデシルアミノのＣＯＮＨ）；８．２５（ｍｆ，１Ｈ：システインの
ＣＯＮＨ）。コレステリル及びオクタデシルアミノのその他のすべてのプロトン
に関しては、対応するシグナルが０．６０−３．００ｐｐｍの範囲に出現する。

【０１０５】ＭＨ^＋＝１０１５。

【０１０６】（ｂ）ジスルフィド結合によって二等分可能な対称形導入剤一般構造：

【０１０７】

【化８】を有するこれらの分子を以下の手順で構築した：

【０１０８】

【化９】

【０１０９】

【化１０】

【０１１０】以下の実施例はこのような導入剤の１つを非限定的に説明する：化合物（ＶＩ
）：Ｒ_１＝（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３；Ｒ_２＝Ｈ。

【０１１１】段階１調製物１：〔ＮＨＢｏｃ−ＣＨ（ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３）ＣＨ_２−
Ｓ−〕_２Ｎα，Ｎα′−ジＢｏｃシスチン（０．５７ミリモル）をクロロホルム（１５
ｃｍ^３）に溶解させ、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（５．６７ミリモル）、
オクタデシルアミン（０．１０ミリモル）及びＢＯＰ（１．２４ミリモル）を加
える。混合物を２時間撹拌し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣによって追跡する。

【０１１２】回転蒸発器でクロロホルムを蒸発させる。“粗生成物”を酢酸エチル（１００
ｃｍ^３）に入れ、次に５０ｃｍ^３の０．５ＭのＫＨＳＯ_４で３回、次いで５０ｃ
ｍ^３の飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で３回、最後に５０ｃｍ^３の飽和ＮａＣｌ溶液で２
回、連続的に洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで回転蒸
発器で酢酸エチルを蒸発させる。０．３４６ミリモルの生成物が得られる。即ち
、収率は６９％である。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９４（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１）。

【０１１３】段階２調製物２〔化合物（ＶＩ）〕：〔ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（
ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯ−ＣｙＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕_２調製物１で得られた生成物にトリフルオロ酢酸（５ｃｍ^３）を加える。混合物
を１．５時間撹拌し、ＢＯＣの開裂をＨＰＬＣによって追跡する。トリフルオロ
酢酸を蒸発させ、痕跡量を除去するために５ｃｍ^３のジエチルエーテルで３回蒸
発させる。

【０１１４】乾燥した抽出物をジクロロメタン（２５ｃｍ^３）に溶解し、次いでＮ−エチル
ジイソプロピルアミン（３．４４ミリモル）、ＢｏｃＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＢｏｃ
（ＣＨ_２）_４ＮＢｏｃ（ＣＨ_２）_３ＮＢｏｃＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ（０．６９７ミリモ
ル）及びＢＯＰ（０．８６ミリモル）を添加する。混合物を２時間撹拌し、反応
をＴＬＣ及びＨＰＬＣによって追跡する。

【０１１５】回転蒸発器でジクロロメタンを蒸発させる。“粗生成物”を酢酸エチル（１０
０ｃｍ^３）に入れ、次に、５０ｃｍ^３の０．５ＭのＫＨＳＯ_４で３回、次いで５
０ｃｍ^３の飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で３回、最後に５０ｃｍ^３の飽和ＮａＣｌ溶液
で２回、連続的に洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで回
転蒸発器で酢酸エチルを蒸発させる。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９０（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ，９：１），ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝
２６．１６分。

【０１１６】乾燥した抽出物にトリフルオロ酢酸（５ｃｍ^３）を加える。混合物を１．５時
間撹拌し、ＢＯＣの開裂をＨＰＬＣによって追跡する。トリフルオロ酢酸を蒸発
させ、痕跡量を除去するために５ｃｍ^３のジエチルエーテルで３回蒸発させる。
得られた粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製する。必要な画分を集めて凍結乾
燥する。０．０９９ミリモルの生成物が塩の形態で得られる。即ち、収率は２８
．５％である。

【０１１７】ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１０．５５分； ^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ_３）_２ＳＯｄ６，δ，ｐｐ
ｍ）：０．９１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ：２つのオクタデシルアミノのＣＨ _３）；１．１０−１．４０（ｍｔ，６０Ｈ：２つのオクタデシルアミノの一方の
１５ＣＨ_２及び別のオクタデシルアミノの１５ＣＨ_２）；１．４３（ｍｔ，４Ｈ
：２つのオクタデシルアミノの１ＣＨ_２）；１．６４（ｍｆ，８Ｈ：２つのブチ
ルの２つの中央ＣＨ_２）；１．８５−２．１０（ｍｔ，８Ｈ：４つのプロピルの
中央ＣＨ_２）；２．８０−３．１５（ｍｔ，３２Ｈ：２つのブチルの２ＮＣＨ_２ −４つのプロピルの２ＮＣＨ_２−２つのオクタデシルアミノのＮＣＨ_２及び２つ
のシステインのＣＨ_２Ｓ）；３．８４（ｍｆ，４Ｈ：２つのグリシルアミノのＮ
ＣＨ_２ＣＯＮ）；４．６０（ｍｔ，２Ｈ：２つのシステインのＣＯＮＣＨＣＯＮ
）；８．２７（ｍｆ，２Ｈ：２つのオクタデシルアミノのＣＯＮＨ）；８．９５
（ｍｆ，２Ｈ；２つのシステインのＣＯＮＨ）；７．９７−８．８７及び９．１
５（３ｍｆ：ＮＨ及びＮＨ_２に対応するＨ）ＭＨ^＋＝１２２７。

【０１１８】実施例２：本発明の導入剤の界面活性作用の評価本発明の導入剤が界面活性特性を有すること、即ち、膜を溶解させる能力をも
つことを示すのがこの実施例の目的である。

【０１１９】このために、生体膜に相当するｉｎｖｉｔｒｏモデルを使用する。即ち、リ
ポソームＥＰＣ／ＥＰＡ（卵ホスファチジルコリン／卵ホスファチジル酸，１０
：１）を使用する。生体膜と全く同様に、これらのリポソームの壁は２層リン脂
質からなり、従って同等の機能を有している。

【０１２０】これらのリポソームを調製するために、諸成分をクロロホルムに溶解し、次い
で回転蒸発器でクロロホルムを蒸発させる。得られた脂質フィルムを水に再分散
させ、次いで音波処理及び加熱によってリポソームを形成させる。

【０１２１】リポソームに添加した生成物の界面活性を、分光光度計で混濁度を測定するこ
とによって評価する。

【０１２２】第一の実験では、対照として使用する公知の市販の界面活性剤トリトンＸ−１
００を試験した。この場合、図１のグラフに示すようにリポソームが完全溶解す
る（１００％溶解度）。

【０１２３】第二の実験の被験物質は、１８個の炭素原子を含む脂肪質鎖にスペーサーを介
して連結されたポリアミンを含む両親媒性分子（化合物ＶＩＩ）である。この分
子は、本発明の化合物（ＩＩ）のジスルフィド結合の還元によって得られる。図
２のグラフは、この両親媒性分子をリポソームに添加したときに得られた結果を
示す。部分溶解が観察され、溶解度はトリトンＸ−１００の約３０％に相当する
。

【０１２４】最後に、対照カチオン性脂質ＲＥＦ、即ちジスルフィド結合非含有の化合物（
ＩＩ）の類似体を用いて同じ実験を行った。リポソーム膜の溶解は全く観察され
なかった。

【０１２５】結論としてこの実施例は、本発明の導入剤が還元性媒体中で界面活性作用をも
つ両親媒性分子を生じさせる能力を有すること、即ち、膜を溶解する能力を有す
ることを示す。この特性は極めて有利である。何故なら、本発明の導入剤がより
大量の核酸をより容易に細胞区画まで運搬でき、これによってトランスフェクシ
ョン効率を向上させるからである（これに関しては以下のトランスフェクション
実施例で示す）。

【０１２６】実施例３：遺伝物質をｉｎｖｉｔｒｏトランスフェクションするための本発明の生成物の使用この試験は、本発明の導入剤が構造中に（１つまたは複数の）ジスルフィド結
合を含んでいるにもかかわらずｉｎｖｉｔｒｏ細胞を有効にトランスフェクト
する能力を有することを示す。

【０１２７】Ａ．使用した遺伝物質国際特許ＷＯ９７／１０３４３に記載のプラスミドを使用した。この構築物ｐ
ＣＯＲｐＸＬ２７７４は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子をヒトサイトメ
ガロウイルスの極めて初期の遺伝子のプロモーター（ｈＣＭＶ−ＩＥ）下に含ん
でいる。核酸溶液を生理的血清（０．１５ＭのＮａＣｌ）で２０μｇ／ｍｌに希
釈する。

【０１２８】Ｂ．サイトフェクタント溶液（用時調製物）本発明に記載の生成物を４０−１６０μモルの範囲の濃度の水溶液とし、等容
量のＤＮＡ溶液と混合する。最終塩濃度は７５ミリモルである。

【０１２９】Ｃ．トランスフェクション細胞を２４ウェルのマイクロタイタープレートで適正な条件下で培養し（２ｃ
ｍ^２／ウェル）、単層集密度５０−７０％に達した対数増殖期にトランスフェク
ションを行う。

【０１３０】血清タンパク質を除去した０．５ｃｍ^３の培地で細胞を２回洗浄し、無血清培
地中で増殖を再開するか（血清非存在下のトランスフェクション）、完全培地中
で増殖を再開する（血清存在下のトランスフェクション）。０．０５ｃｍ^３のサ
イトフェクタント混合物（０．５μｇＤＮＡ／ウェル）を細胞に添加する（３ウ
ェル／ベクター−ＤＮＡ条件）。血清非存在下の細胞トランスフェクションの場
合には、トランスフェクションの２時間後に増殖培地に適量の血清を補充する。

【０１３１】トランスフェクションの４８時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｌｕｃｉｆｅ
ｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ）を使用説明書の指示通りに使用し、ルシ
フェラーゼの発現を測定することによってトランスフェクション効率を評価する
。細胞溶解液中のタンパク質濃度を測定することによってサイトフェクタント混
合物の毒性を評価する。

【０１３２】Ｄ．結果（ａ）ジスルフィド結合の還元によって二等分可能な対称形導入剤：化合物（
ＶＩ）（図３）ＨｅｐＧ２細胞系をトランスフェクトするためのＤＮＡベクターとして本発明
のこの生成物を使用し、対照カチオン性脂質ＲＥＦ（国際特許ＷＯ９７／１８１
８５に化合物（６）として記載されている）に比較した。

【０１３３】化合物（ＶＩ）はこの細胞系に対して対照カチオン性脂質ＲＥＦと同程度の毒
性を示した。血清タンパク質の非存在下で行われたトランスフェクションの場合
にＨｅｐＧ２細胞の生存率は１６０μＭのカチオン性脂質の用量で８０％であっ
た。

【０１３４】１μｇのＤＮＡに対して４−８ナノモルのカチオン性脂質という割合で最大ト
ランスフェクション効率が得られた。ＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクションの
場合には、化合物（ＶＩ）の使用によって得られたトランスジーンの発現は対照
カチオン性脂質ＲＥＦによって得られたトランスジーンの発現よりも増加してい
た（４倍）。

【０１３５】（ｂ）ジスルフィド結合によって連結された２つのＣ_１８アルキル鎖と第三の
アルキル鎖とから成る脂質部分をもつ導入剤：化合物（Ｉ）及び（ＩＶ）本発明に記載のこれらの２つの生成物は、１６０μＭのカチオン性脂質用量ま
ではＨｅＬａ細胞に対してもＨｅｐＧ２細胞に対しても有意な毒性を示さない。

【０１３６】対照カチオン性脂質ＲＥＦによって得られたトランスジーンの発現に比較した
場合、Ｃ_５の第三の脂質鎖が付加された化合物〔化合物（Ｉ）〕は血清タンパク
質の非存在下で同程度のトランスフェクション結果を生じ得る。逆に、第三の脂
質鎖がＣ_１２の化合物〔化合物（ＩＶ）〕は、同じトランスフェクション条件下
でトランスジーン発現の増加を示し、ＨｅＬａ細胞では約２倍、ＨｅｐＧ２細胞
では約９倍である（図４参照）。

【０１３７】更に血清タンパク質存在下のトランスフェクション実験では、第三のアルキル
鎖の付加によってカチオン性脂質の脂肪親和性が向上したときに得られる重要な
利点の１つが証明される。この実験で、血清タンパク質の存在に起因する有意な
阻害は全く生じない。従ってこれらの化合物はｉｎｖｉｖｏトランスフェクシ
ョンに使用できる導入剤の有力な候補である。

【０１３８】図５及び図６は化合物（Ｉ）及び（ＩＶ）のトランスフェクション効率をヒス
トグラムの形態で表す。

【０１３９】（ｃ）脂質部分が２つのＣ_１８アルキル鎖から成り、一方の鎖にジスルフィド
結合が連結している導入剤：化合物（ＩＩ）本発明に記載のこの生成物は使用された用量（１６０μＭのカチオン性脂質）
でＨｅｐＧ２細胞に対して有意な毒性を生じない。

【０１４０】血清タンパク質非存在下のトランスフェクションの場合、トランスジーンの発
現レベルは対照カチオン性脂質ＲＥＦの３倍になる（図７参照）。

【０１４１】更に、血清タンパク質の存在下ではトランスフェクションが顕著に増進されて
いる（４０倍）。従って、全く予想外であったが、血清の存在に起因する阻害作
用は全く生じない。図８は化合物（ＩＩ）のトランスフェクション効率をヒスト
グラムの形態で表す。

【０１４２】（ｄ）ジスルフィド結合によって連結されたステロイド由来鎖を含む脂質部分
を有している導入剤：化合物（Ｖ）（図９）本発明に記載のこの生成物は使用された用量（１６０μＭのカチオン性脂質）
でＨｅＬａ細胞またはＨｅｐＧ２細胞に対して有意な毒性を生じない。

【０１４３】アルキル鎖の代わりにコレステロールが結合しているとき、トランスジーンの
発現が極めて有意に促進され、更に、この場合、血清タンパク質の存在下で阻害
は全く認められなかった。従ってこの生成物はｉｎｖｉｔｒｏトランスフェク
ションに極めて有利に使用できると考えられる。

【０１４４】図３から図９の表及びヒストグラムに示した結果から以下の結論が得られる： −カチオン性脂質型の導入剤に挿入された（１つまたは複数の）ジスルフィド
結合は、ＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏトランスフェクションに使用される導入剤の
能力に不利な影響を与えないだけでなく、逆にトランスフェクション効率を向上
させる； −本発明の導入剤は使用された用量で毒性を示さない； −最後に、本発明の導入剤の脂肪親和性の増大は、血清に起因するトランスフ
ェクション阻害の少なくとも一部を解消し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】分光光度計で溶液の混濁度を測定することによって得られたトリトン−Ｘ１０
０中のリポソームＥＰＣ／ＥＰＡ（１０：１）の溶解度変化を表すグラフである
。横軸はトリトン−Ｘ１００の添加量（ｍＭ）を表す。縦軸はリポソーム含有溶
液の吸光度を表す。

【図２】分光光度計で溶液の混濁度を測定することによって得られた化合物（ＶＩＩ）
中のリポソームＥＰＣ／ＥＰＡ（１０：１）の溶解度変化を表すグラフである。
横軸は化合物（ＶＩＩ）の添加量（ｍＭ）を表す。縦軸はリポソーム含有溶液の
吸光度を表す。

【図３】血清非存在下のＨｅｐＧ２細胞への化合物（ＶＩ）のトランスフェクション活
性を、対照導入剤（以後の記載ではＲＥＦと呼ぶ）として式：Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２） _３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＧｌｙ〔（ＣＨ_２）_１７Ｃ
Ｈ_３〕_２のカチオン性脂質を用いた場合との比較によって表す。

【図４】血清の存在下及び非存在下のＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞への化合物（Ｉ
）及び化合物（ＩＶ）のトランスフェクション活性を対照カチオン性脂質ＲＥＦ
との比較によって表す。

【図５】補助脂質の非存在下または補助脂質ＤＯＰＥもしくはコレステロールの存在下
のＨｅＬａ細胞への化合物（Ｉ）のｉｎｖｉｔｒｏ導入活性を表すヒストグラ
ムである。縦軸はウェルあたりのルシフェラーゼの発現をｐｇで表す。横軸は化
合物（Ｉ）／ＤＮＡの比を１μｇのＤＮＡあたりの化合物のナノモルで表す。

【図６】補助脂質の非存在下または補助脂質ＤＯＰＥもしくはコレステロールの存在下
のＨｅＬａ細胞への化合物（ＩＶ）のｉｎｖｉｔｒｏ導入活性を表すヒストグ
ラムである。縦軸はウェルあたりのルシフェラーゼの発現をｐｇで表す。横軸は
化合物（ＩＶ）／ＤＮＡの比を１μｇのＤＮＡあたりの化合物のナノモルで表す
。

【図７】血清の存在下及び非存在下のＨｅｐＧ２細胞への化合物（ＩＩ）のトランスフ
ェクション活性を対照カチオン性脂質ＲＥＦとの比較によって表す。

【図８】補助脂質の非存在下または補助脂質ＤＯＰＥもしくはコレステロールの存在下
のＨｅＬａ細胞への化合物（ＩＩ）のｉｎｖｉｔｒｏ導入活性を表すヒストグ
ラムである。縦軸はウェルあたりのルシフェラーゼの発現をｐｇで表す。横軸は
化合物（ＩＩ）／ＤＮＡの比を１μｇのＤＮＡあたりの化合物のナノモルで表す
。

【図９】血清の存在下及び非存在下のＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞への化合物（Ｖ
）のトランスフェクション活性を対照カチオン性脂質ＲＥＦとの比較によって表
す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１２月１６日（１９９９．１２．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｃ 323/60 Ｃ０７Ｋ 5/062 Ｃ０７Ｋ 5/062 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＴ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者シエルマン，ダニエルフランス国、エフ−75012・パリ、リユ・エラール、10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸に非共有的に結合し得る少なくとも１つのカチオン性親
水性領域と少なくとも１つの脂肪親和性領域とを含む核酸導入剤であって、前記
領域がいわゆる“スペーサー”アームを介して互いに連結されており、前記核酸
導入剤が更に、還元によって脂肪親和性領域を部分分解させるように配置されて
いるかまたは前記核酸導入剤が対称形であるときは還元によって前記核酸導入剤
を二等分するように配置されている少なくとも１つのジスルフィド結合を含んで
いることを特徴とする核酸導入剤。
【請求項２】カチオン性親水性領域がポリアミンまたはポリアミノグアニ
ジンであることを特徴とする請求項１に記載の導入剤。
【請求項３】脂肪親和性領域が少なくとも１つの脂肪質脂肪族鎖と、１つ
または複数の脂肪族鎖、１つまたは複数のステロイド誘導体、天然もしくは合成
の脂質及び／またはこれらの任意の組合せとから成ることを特徴とする請求項１
に記載の導入剤。
【請求項４】脂肪親和性領域が少なくとも２つの脂肪質脂肪族鎖から成る
ことを特徴とする請求項３に記載の導入剤。
【請求項５】脂肪親和性領域が脂肪質脂肪族鎖とステロイド誘導体とから
成ることを特徴とする請求項３に記載の導入剤。
【請求項６】１つまたは複数の脂肪質脂肪族鎖が、任意に飽和及び／また
はフッ素化した炭素原子数１０−２２の分枝状または直鎖状のアルキル鎖である
ことを特徴とする請求項３に記載の導入剤。
【請求項７】ステロイド誘導体がコレステロール、コリン酸及びコレステ
リルアミンから選択されることを特徴とする請求項３に記載の導入剤。
【請求項８】いわゆる“スペーサー”アームがアミド基、カーバメート基
、エステル基、エーテル基及び／または芳香環から選択されることを特徴とする
請求項１に記載の導入剤。
【請求項９】１つまたは２個のジスルフィド結合を含むことを特徴とする
請求項１に記載の導入剤。
【請求項１０】その還元が脂肪質脂肪族鎖を破壊するように配置されたジ
スルフィド結合を含むことを特徴とする請求項１に記載の導入剤。
【請求項１１】その還元が脂肪親和性領域に存在するステロイド由来鎖を
破壊するように配置されたジスルフィド結合を含むことを特徴とする請求項１に
記載の導入剤。
【請求項１２】ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３Ｎ
ＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ〔Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３〕−Ｎ〔（ＣＨ_２）_１７ＣＨ _３〕_２（Ｉ）；ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ〔
Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕−ＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３（ＩＩ）；ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ〔
Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−ＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３（ＩＩＩ）；ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ〔
Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３〕−Ｎ〔（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕_２（ＩＶ）；ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙｓ〔
Ｓ−Ｓ−コレステロール〕−ＮＨ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３（Ｖ）；〔ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３ＮＨ（ＣＨ_２）_４ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＨ_２ＣＯＣｙＮ
Ｈ（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３〕_２（ＶＩ）；から選択されることを特徴とする請求項１に記載の導入剤。
【請求項１３】請求項１から１２のいずれか一項に記載の導入剤と少なく
とも１つの核酸とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】核酸がデオキシリボ核酸またはリボ核酸であることを特徴
とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】核酸が化学的に修飾されていることを特徴とする請求項１
３に記載の組成物。
【請求項１６】核酸がアンチセンスであることを特徴とする請求項１３に
記載の組成物。
【請求項１７】核酸が治療有効遺伝子を含むことを特徴とする請求項１３
に記載の組成物。
【請求項１８】更に、生理的条件で両イオン性であるかまたはイオン的に
無電荷の合成または天然の脂質から選択された１種または複数の中性脂質から成
るアジュバントを含むことを特徴とする請求項１３から１７のいずれか一項に記
載の組成物。
【請求項１９】１種または複数の中性脂質が、コレステロールであるか、
または、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレイルパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、
−パルミトイル、−コレステリル、−ミリストイル−ホスファチジルエタノール
アミン及び１−３回Ｎ−メチル化されたそれらの誘導体、ホスファチジルグリセ
ロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブ
ロシド）、スフィンゴ脂質（特にスフィンゴミエリン）またはアシアロガングリ
オシド（特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）の型の２つの脂肪質鎖をもつ脂質であ
ることを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】組成物が更にアジュバントを含み、前記アジュバントは、
全部または一部がヒストン、ヌクレオリン及び／またはプロタミンから誘導され
た化合物であるかまたはこのような化合物を含有しており、あるいは前記化合物
の全部または一部が、モチーフ数２−１０個で連続的もしくは不連続的に反復さ
れるペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／または（ＡＴＰＡＫＫＡＡ
）から構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】更に、ターゲッティング要素が導入剤に結合されているこ
とを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】前記ターゲッティング要素が、細胞表面分子に対する抗体
、インスリン、トランスフェリン、葉酸もしくは他の任意の成長因子、サイトカ
インまたはビタミンのような膜受容体のリガンド、修飾または非修飾のレクチン
、ＲＧＤモチーフを含むタンパク質、タンデム構造のＲＧＤモチーフを含む環状
または非環状のペプチド、ポリリシンペプチド、並びに、天然または合成のリガ
ンドペプチド、から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】更に、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルコール、ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテルまたは樹状ベンジルポリエーテルヘッ
ドをもつポリエチレングリコールを含む型の非イオン性界面活性剤を少なくとも
１つを含むことを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】細胞に核酸を導入するための請求項１から１２のいずれか
一項に記載の導入剤の使用。
【請求項２５】（１）必要な場合にはトランスフェクション剤を１種また
は複数の公知の別の核酸トランスフェクション剤及び／または１種または複数の
アジュバントに予め接触させた後、核酸を請求項１から１２のいずれか一項に記
載の導入剤に接触させて核酸／導入剤複合体を形成させる段階と、（２）前項（１）で形成された複合体を細胞に接触させる段階と、から成る細胞への核酸導入方法。
【請求項２６】必要な場合にはトランスフェクション剤を１種または複数
の公知の別の核酸トランスフェクション剤及び／または１種または複数のアジュ
バントに予め接触させた後、核酸を請求項１から１２のいずれか一項に記載の導
入剤に接触させて核酸／導入剤複合体を形成させることを特徴とする請求項１３
から２３のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
【請求項２７】請求項１３から２３のいずれか一項に記載の組成物の生体
内（ｉｎｖｉｖｏ）、生体外（ｅｘｖｉｖｏ）または試験管内（ｉｎｖｉ
ｔｒｏ）投与から成る疾病治療方法。