WO2023190170A1 - 核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法 - Google Patents

核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法 Download PDF

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悠太 中井
英万 秋田
浩揮 田中
遊 櫻井
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Definitions

  • Patent No. 4919397 Patent No. 4598908 Patent No. 6093710 International Publication No. 2017/218704 International Publication No. 2021/060440
  • Patent Document 5 discloses that lipid nanoparticles that do not contain nucleic acids are prepared in an acidic buffer, further added with a cryoprotectant, lyophilized, and then rehydrated with an aqueous solution containing nucleic acids. It has been shown that lipid nanoparticles can be easily and efficiently encapsulated in lipid nanoparticles. However, since the above technique requires a freeze-drying step, there is room for improvement in terms of simplicity.
  • w in X 3 is 1 or 2.
  • X 3 is an imidazolidylene group
  • X 3 is a piperazylene group.
  • R 2a may be the same as or different from R 2b , but preferably R 2a is the same group as R 2b .
  • Y a and Y b are each independently an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, or a urea bond, preferably each independently an ester bond, an amide bond, or a carbamate bond, and more preferably each Independently, it is an ester bond or an amide bond, most preferably each an ester bond.
  • the direction of the bond between Y a and Y b is not limited, but when Y a and Y b are ester bonds, preferably -Z a -CO-O-R 2a - and -Z b -CO-O-R 2b It exhibits a structure of -.
  • aromatic rings contained in aromatic compounds having 3 to 16 carbon atoms include benzene rings, naphthalene rings, anthracene rings for aromatic hydrocarbon rings, imidazole rings, pyrazole rings, oxazole rings for aromatic heterocycles, Isoxazole ring, thiazole ring, isothiazole ring, triazine ring, pyrrole ring, furanthiophene ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, pyrazine ring, pyridine ring, purine ring, pteridine ring, benzimidazole ring, indole ring, benzofuran ring, quinazoline ring, phthalazine ring, quinoline ring, isoquinoline ring, coumarin ring, chromone ring, benzodiazepine ring, phenoxazine ring, phenothiazine ring, acrid
  • each R 4 may be the same or different.
  • R 3a may be the same as or different from R 3b , but preferably R 3a is the same group as R 3b .
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group);
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 3 carbon atoms and having 1 tertiary amino group (e.g., -N(CH 3 )-); or a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 tertiary amino group (e.g., piperidylene group);
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 6 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group);
  • Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond;
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 6 to 12 carbon atoms, one aromatic ring, and optionally
  • fat-soluble vitamins having a hydroxyl group examples include retinol, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciferol, colcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotachysterol, tocopherol, and tocotrienol.
  • the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group is preferably tocopherol.
  • the protection or deprotection reaction of the functional group is carried out using known reagents and methods (for example, the reagents and methods described in GREENE'S PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 4th edition, WILEY-INTERSCIENCE EM), or by methods known in the art. It is carried out according to the method described in the example.
  • PEG Lipid PEG lipid coats the surface of lipid nanoparticles with hydrophilic polyethylene glycol (PEG), and can be used as a stabilizer by suppressing aggregation between particles, or as a stabilizer for interactions between biological components and particles when administered to living organisms.
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG region can be of any molecular weight. In some embodiments, the PEG region has a molecular weight of 200-10,000 Da and can be linear or branched.
  • an acidic buffer containing nucleic acids As the aqueous solution containing nucleic acids, it is preferable to use an acidic buffer containing nucleic acids.
  • a buffer having a buffering effect in an acidic region can be used, preferably an acidic buffer having a buffering effect in a pH range of 1 to 6.5, more preferably a pH of 3 to 6.5.
  • the acidic buffers used in the preparation of lipid nanoparticles include the same acidic buffers as those exemplified above, such as MES buffer, malic acid buffer, phthalic acid buffer, and maleic acid buffer. , succinate buffer, tartrate buffer, citrate buffer, and the like.
  • lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids it is possible to introduce nucleic acids into cells not only in vitro but also in vivo. That is, by administering lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids to a subject, the lipid nanoparticles reach and contact target cells, and the nucleic acids encapsulated in the lipid nanoparticles are introduced into the cells in vivo. Ru.
  • the particle solution (total lipid 20mM, 15 ⁇ L) was mixed with a solution containing luciferase-encoding mRNA (CleanCap (registered trademark) FLuc mRNA - (L-7602)) (nucleic acid concentration 1.5 ⁇ g/135 ⁇ L, buffer conditions MES (pH 6), 135 ⁇ L) and diluted under stirring conditions using a vortex mixer, and incubated at room temperature for 60 minutes, 30 minutes, 15 minutes, 10 minutes, 5 minutes, or 1 minute using an aluminum block incubator. 150 ⁇ L of PBS was added to the solution after incubation to obtain nucleic acid-encapsulated nanoparticles.
  • luciferase-encoding mRNA CleanCap (registered trademark) FLuc mRNA - (L-7602)
  • Comparative Example 1 Method for Preparing Lyophilized Product
  • SS-OP was used as the ionic lipid
  • DOPC, Chol, and DMG-PEG2000 were used as other lipids.
  • the molar ratio of SS-OP:DOPC:Chol used was 52.5:7.5:40, and 1.5 mol% of DMG-PEG2000 was used with respect to the total of SS-OP, DOPC, and Chol.
  • Comparative Example 2 Method for Preparing Lyophilized Product
  • SS-OP was used as the ionic lipid
  • DOPC, Chol, and DMG-PEG2000 were used as other lipids.
  • the molar ratio of SS-OP:DOPC:Chol used was 52.5:7.5:40, and 1.5 mol% of DMG-PEG2000 was used with respect to the total of SS-OP, DOPC, and Chol.
  • the obtained nucleic acid-encapsulated nanoparticles or the nucleic acid-encapsulated nanoparticles prepared in Comparative Example 1 using the freeze-drying technique were applied to mice (Balb/c, 6 weeks old, female), and the gene expression activity in the liver was measured using GloMax 20/ 20 Evaluated with Luminometer.
  • Each nucleic acid-encapsulated nanoparticle was administered to mice through the tail vein at a dose of 0.05 mg/kg.
  • the liver was removed and the expression level of luciferase protein was evaluated.
  • higher gene expression activity in the liver was observed in the liquid formulation and the frozen-thawed version compared to the nucleic acid-encapsulated nanoparticles produced by freeze-drying technology (see Figure 18).
  • the particle solution (total lipid 20mM, 15 ⁇ L) (liquid) was mixed with a solution containing luciferase-encoding mRNA (CleanCap® FLuc mRNA - (L-7602)) (nucleic acid concentration 3 ⁇ g/135 ⁇ L, buffer condition MES (pH 6)). , 135 ⁇ L) under stirring conditions using a vortex mixer while diluting, and incubated at 37° C. for 5 minutes using an aluminum block incubator. 150 ⁇ L of PBS was added to the solution after incubation to obtain nucleic acid-encapsulated nanoparticles.

Abstract

本発明は、任意の核酸を高効率且つ簡便に封入可能な核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法を提供する。以下の工程を含む、核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法： ａ)イオン性脂質、ステロールおよびPEG脂質を含むアルコール溶液とｐＨ１～６．５に緩衝作用を有する酸性緩衝液を混合し、核酸を含まない脂質ナノ粒子の懸濁液を調製する工程、および ｂ)工程aで得られた脂質ナノ粒子の懸濁液を凍結乾燥することなく、核酸を含み、任意にアルコール０～２５ｖ／ｖ％を含む水溶液と混合し、任意に混合物を０～９５℃で０～６０分間インキュベートして、核酸内封脂質ナノ粒子を得る工程。

Description

核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法
　本発明は核酸を含まない脂質ナノ粒子を調製した後に核酸を加える工程を含む核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法に関する。
　ｓｉＲＮＡなどのオリゴ核酸を用いた核酸治療やｍＲＮＡやｐＤＮＡ等を用いた遺伝子治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められている。
　四級アミンを有するカチオン性脂質を用いたカチオン性のリポソームは正に帯電しているため、負に帯電した核酸と静電相互作用によってコンプレックス（リポプレックス）を形成することができ、細胞内に核酸を送達することができる。さらに四級アミンが核酸と静電相互作用することを利用して、核酸を含まないカチオン性リポソームの凍結乾燥組成物を作製し、核酸の水溶液で再水和することでもリポプレックスを形成させることができるため、遺伝子導入試薬としても利用できることが示されている（例えば、特許文献１および２参照）。
　しかしながら、このような方法で作製されたリポプレックスは粒子径の制御が困難であり、また正に帯電したカチオン性脂質に由来する細胞毒性が問題となる。
　このため、酸性条件では正に帯電し、中性付近では電荷を持たない三級アミンを分子内に有するイオン性脂質を用いた脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、またはＬＮＰという）が開発され、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアとなっている（例えば、非特許文献１参照）。
　三級アミンを分子内に有するイオン性脂質用いた脂質ナノ粒子としては、イオン性脂質に分解性基を付与した例もある（例えば、特許文献３参照）。
　このように様々な非ウイルスキャリアが開発されているが一般に核酸は不安定な化合物であることから、製剤としての安定性には未だ課題がある。
特許第４９１９３９７号公報 特許第４５９８９０８号公報 特許第６０９３７１０号公報 国際公開第２０１７／２１８７０４号 国際公開第２０２１／０６０４４０号
Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　６：２７１－２８１，　１９９９ Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　４１，　１２９１－１２９４（２０１８）
　ところで、製剤としての安定性を高める方法のひとつとして核酸を内封した脂質ナノ粒子を凍結乾燥し、使用時に再水和して脂質ナノ粒子を再構成する試みがなされている（特許文献４および非特許文献２）。
　これらの方法は特定の核酸を内封した脂質ナノ粒子の保存安定性を高める方法としては有用であるが、任意の核酸をより簡便に脂質ナノ粒子に内封する方法としては課題がある。
　任意の核酸を簡便に脂質ナノ粒子に内封する方法としては、特許文献１および２記載の方法のように、核酸を含まない凍結乾燥組成物を作製した後に核酸の水溶液で再水和する方法が挙げられる。
　しかしながら、三級アミンを分子内に有するイオン性脂質を用いて得られる脂質ナノ粒子は調製後の表面電荷が弱負電荷から中性であることから核酸と静電相互作用せず、特許文献１および２で開示されている核酸を含まない凍結乾燥組成物を作製した後に核酸の水溶液で再水和する方法では核酸内封脂質ナノ粒子を調製することができない。
　この点、特許文献５には、核酸を含まない脂質ナノ粒子を酸性バッファー中で調製し、さらに凍結保護剤を加えて凍結乾燥した後、核酸を含む水溶液で再水和することで任意の核酸を高効率且つ簡便に脂質ナノ粒子に内封できることが示されている。
　しかしながら、上記の技術では凍結乾燥工程が必要であることから、簡便性の点では改善の余地がある。
　本発明は、上記課題に鑑み、従来技術では達成し得なかった任意の核酸を高効率且つ簡便に封入可能な核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題に鑑み鋭意努力した結果、核酸を含まない脂質ナノ粒子を酸性バッファー中で調製し、核酸を含む水溶液を添加することで任意の核酸を高効率且つ簡便に脂質ナノ粒子に内封できることを見出した。さらに本方法で調製した脂質ナノ粒子を用いて細胞への遺伝子導入実験を行ったところ、意外にも従来技術と比較して遺伝子導入効率が高まることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下の内容を包含する。
［１］　以下の工程を含む、核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
ａ)イオン性脂質、ステロールおよびPEG脂質を含むアルコール溶液とｐＨ１～６．５に緩衝作用を有する酸性緩衝液を混合し、核酸を含まない脂質ナノ粒子の懸濁液を調製する工程、および
ｂ)工程aで得られた脂質ナノ粒子の懸濁液を凍結乾燥することなく、核酸を含み、任意にアルコール０～２５ｖ／ｖ％を含む水溶液と混合し、任意に混合物を０～９５℃で０～６０分間インキュベートして、核酸内封脂質ナノ粒子を得る工程。
［２］　工程bの後に以下の工程ｃを含む、［１］に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
ｃ)透析、限外ろ過または希釈によって、得られた核酸内封脂質ナノ粒子の外水相を中性緩衝液に交換する工程。
［３］　工程aにおいて、核酸を含まない脂質ナノ粒子を－８０～０℃で凍結後、０～９５℃で融解する工程をさらに含む［１］又は［２］に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法。
［４］　工程aにおいて、脂質ナノ粒子の懸濁液の調製後に透析、限外ろ過または希釈によって、外水相をｐＨ１～６．５に緩衝作用を有する別の酸性緩衝液に交換する工程をさらに含む［１］～［３］のいずれか一つに記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法。
［５］　工程aにおいて、アルコール溶液がリン脂質をさらに含む、［１］～［４］のいずれか一項に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法。
［６］　イオン性脂質が式（１）で表される化合物である［１］～［５］のいずれか一つに記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（３）：
　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（３）
　（式（３）中、
　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
　　ａは２～１０の整数を表す。）
で表される基を表す。）。
［７］　イオン性脂質が式（２）で表される化合物である［１］～［５］のいずれか一つに記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
（式中、
　Ｘは、３級窒素を一つ以上含む含窒素脂肪族基を表し、
　Ｒ１は、炭素数が８以下の脂肪族炭化水素基を表し、
　Ｌ１は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、Ｎ－アルキルカルバメート結合、カーボネート結合またはウレア結合を表し、
　ｋは、０または１を表し、
　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して炭素数が２～５のアルキレン基を表し、
　Ｌ２は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、カーボネート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　Ｒ２は、炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
　Ｙは、（ｉ）ヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を一つ以上含み、且つ（ｉｉ）前記２価の基の芳香環上にエステル結合およびカーボネート結合からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む基を有し、且つ（ｉｉｉ）炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基、およびステロール誘導体の残基からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む基を表す。）。
［８］　［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法で製造した核酸内封脂質ナノ粒子と細胞とを生体外において接触させる工程を含む、当該核酸を当該細胞内に導入する方法。
［９］　［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法で製造した核酸内封脂質ナノ粒子を生体へ投与する工程を含む、当該核酸を標的細胞内に導入する方法。
［１０］　［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法を含む医薬品組成物の製造方法。
　本発明の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法では、核酸を含まない脂質ナノ粒子を調製した後に凍結乾燥することなく核酸水溶液を添加するので、任意の核酸を内封した脂質ナノ粒子を高効率且つ簡便に製造することができる。また、本発明の製造方法を用いて調製した核酸内封脂質ナノ粒子は、従来技術と比較して核酸導入効率が高く、細胞や生体での遺伝子導入に有利であり、特に、医薬品組成物として有用である。
緩衝液が内封率へ与える影響を評価した図である。 緩衝液が粒子径へ与える影響を評価した図である。 スクロース濃度およびインキュベート温度が内封率へ与える影響を評価した図である。インキュベート温度を℃で示す。 スクロース濃度およびインキュベート温度が粒子径へ与える影響を評価した図である。インキュベート温度を℃で示す。 スクロース濃度およびインキュベート温度がｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性へ与える影響を評価した図である。インキュベート温度を℃で示す。 インキュベート時間が内封率へ与える影響を評価した図である。 インキュベート時間が粒子径へ与える影響を評価した図である。 インキュベート時間がｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性へ与える影響を評価した図である。 図８の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。 緩衝液のｐＨが内封率へ与える影響を評価した図である。 緩衝液のｐＨが粒子径へ与える影響を評価した図である。 緩衝液の塩濃度が内封率へ与える影響を評価した図である。 緩衝液の塩濃度が粒子径へ与える影響を評価した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品との内封率を比較した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品との粒子径を比較した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品とのｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性を比較した図である。 図１６の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品とのｉｎ　ｖｉｖｏ活性を比較した図である。 混合比および混合様式が内封率へ与える影響を評価した図である。 混合比および混合様式が粒子径へ与える影響を評価した図である。 混合比および混合様式がｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性へ与える影響を評価した図である。 緩衝液が内封率へ与える影響を評価した図である。 緩衝液が粒子径へ与える影響を評価した図である。 インキュベート温度が内封率へ与える影響を評価した図である。 インキュベート温度が粒子径へ与える影響を評価した図である。 インキュベート温度がｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性へ与える影響を評価した図である。 インキュベート時間が内封率へ与える影響を評価した図である。 インキュベート時間が粒子径へ与える影響を評価した図である。 インキュベート時間がｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性へ与える影響を評価した図である。 緩衝液のｐＨが内封率へ与える影響を評価した図である。 緩衝液のｐＨが粒子径へ与える影響を評価した図である。 緩衝液のｐＨがｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性へ与える影響を評価した図である。 ｍＲＮＡ混合時ｐＨと各ｐＨにおけるＺｅｔａ電位の関係を示す図である。 緩衝液の塩濃度が内封率へ与える影響を評価した図である。 緩衝液の塩濃度が粒子径へ与える影響を評価した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品との内封率を比較した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品との粒子径を比較した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品とのｉｎ　ｖｉｖｏ活性を比較した図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子とマイクロ流路で作成した核酸内封ナノ粒子（ＭＦ）との内封率を比較した図である。 マイクロ流路で作成した核酸内封ナノ粒子（ＭＦ）における発現分布を示す図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子における発現分布を示す図である。 本発明の核酸内封ナノ粒子と凍結乾燥品とのｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性を比較した図である。
　以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明は、核酸を含まず、イオン性脂質、ステロールおよびPEG脂質を含む脂質溶液をｐＨ１～６.５に緩衝作用を有する酸性緩衝液と混合して、核酸を含まない脂質ナノ粒子を調製した後に、核酸水溶液を添加することで核酸内封脂質ナノ粒子を製造する方法に関する。
　脂質ナノ粒子とは、両親媒性脂質の親水基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味する。「両親媒性脂質」とは、親水性を示す親水性基、および疎水性を示す疎水性基の両方を有する脂質のことを意味する。両親媒性脂質としては、例えば、イオン性脂質、リン脂質、PEG脂質等を挙げることができる。
　本発明に用いられる脂質ナノ粒子は、膜の構成物質としてイオン性脂質、ステロールおよびPEG脂質を含有し、さらにリン脂質を含有してもよい。脂質ナノ粒子の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の粒子径は、脂質ナノ粒子の製造方法により、適宜調整することができる。本発明おいて、粒子径とは、動的光散乱法により測定した平均粒子径（個数平均）を意味する。
　本発明において、「総脂質」は脂質の総量を意味する。脂質としては、イオン性脂質、ステロール、PEG脂質、リン脂質が挙げられる。
　本発明において、「核酸を含まず」または「核酸を含まない」とは、実質的に核酸を含まないことを意味し、核酸の含有量が検出限界以下であることを意味する。
　本発明において、「核酸内封脂質ナノ粒子」とは、脂質ナノ粒子の内部に核酸が封入された脂質ナノ粒子を意味する。
イオン性脂質
　本発明に利用できるイオン性脂質としては、三級アミノ基と疎水基から構成されており、脂質ナノ粒子を構成可能なものであればよい。
　イオン性脂質の具体例としては、１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ－４－（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－［１，３］－ｄｉｏｘｏｌａｎｅ（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ｈｅｐｔａｔｒｉａｃｏｎｔａ－６，９，２８，３１－ｔｅｔｒａｅｎ－１９－ｙｌ－４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔａｎｏａｔｅ（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭＣ３という）、ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ－９－ｙｌ　８－（（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）（８－（ｎｏｎｙｌｏｘｙ）－８－ｏｘｏｏｃｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｏｃｔａｎｏａｔｅ（Ｌｉｐｉｄ５）、ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ－９－ｙｌ　８－（（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）（６－ｏｘｏ－６－（ｕｎｄｅｃｙｌｏｘｙ）ｈｅｘｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｏｃｔａｎｏａｔｅ（Ｌｉｐｉｄ８）、下記式（１）または式（２）の化合物が挙げられ、好ましくは下記式（１）または式（２）の化合物、ＤＯＤＭＡ、ＭＣ３、Ｌｉｐｉｄ５、Ｌｉｐｉｄ８であり、最も好ましくは下記式（１）または式（２）の化合物である。
　式（１）
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（３）：
　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（３）
　（式（３）中、
　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
　　ａは２～１０の整数を表す。）
で表される基を表す。）で表される化合物。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～２である。炭素数１～６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、好ましくはそれぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基であり、最も好ましくはそれぞれエチレン基である。
　Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基中の炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基の好ましい具体的な構造は、Ｘ１で示される。
　Ｘ１のＲ５は炭素数１～６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基中の炭素数は、好ましくは４～５である。炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基としては、具体的にはアジリジレン基、アゼチジレン基、ピロリジレン基、ピペリジレン基、イミダゾリジレン基、ピペラジレン基であり、好ましくはピロリジレン基、ピペリジレン基、ピペラジレン基であり、最も好ましくはピペリジレン基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ２で示される。
　Ｘ２のｐは１または２である。ｐが１のときＸ２はピロリジレン基であり、ｐが２のときＸ２はピペリジレン基である。好ましくは、ｐは２である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が２の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ３で示される。
　Ｘ３のｗは１または２である。ｗが１のときＸ３はイミダゾリジレン基であり、ｗが２のときＸ３はピペラジレン基である。
　ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基である。
　炭素数８以下のアルキレン基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基に含まれる炭素数は、好ましくは６以下であり、最も好ましくは４以下である。炭素数８以下のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができ、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
　本明細書中、「炭素数８以下のオキシジアルキレン基」とは、エーテル結合を介したアルキレン基（アルキレン－Ｏ－アルキレン、言い換えると「アルキレンオキシアルキレン基」）であって、二つ存在するアルキレン基の炭素数の合計が８以下の基を意味する。ここで、二つ存在するアルキレンは同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。炭素数８以下のオキシジアルキレン基としては、具体的にはオキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジ（トリメチレン）基（即ち、トリメチレンオキシトリメチレン基）、オキシジ（テトラメチレン）基（即ち、テトラメチレンオキシテトラメチレン基）等を挙げることができる。好ましくは、オキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジ（トリメチレン）基であり、最も好ましくはオキシジエチレン基である。
　Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合であり、好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合またはカーバメート結合であり、より好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合またはアミド結合であり、最も好ましくはそれぞれエステル結合である。ＹａおよびＹｂの結合の向きは制限されないが、ＹａおよびＹｂがエステル結合の場合、好ましくは、－Ｚａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ａ－および－Ｚｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ｂ－の構造を呈する。
　ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。該芳香族化合物に含まれる炭素数は好ましくは６～１２であり、最も好ましくは６～７である。また、該芳香族化合物に含まれる芳香環は、好ましくは一つである。
　炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環の種類として、芳香族炭化水素環については、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、芳香族ヘテロ環についてはイミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フランチオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができ、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環であり、最も好ましくは、ベンゼン環である。
　芳香環は置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。
　ＺａおよびＺｂの好ましい具体的な構造としては、Ｚ１が挙げられる。
　式中、ｓは０～３の整数を表し、ｔは０～３の整数を表し、ｕは０～４の整数を表し、ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。
　Ｚ１のｓは、好ましくは０～１の整数であり、より好ましくは０である。
　Ｚ１のｔは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは１である。
　Ｚ１のｕは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０～１の整数である。
　Ｚ１のＲ４は、該イオン性脂質の合成過程における反応を阻害しない、炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環（ベンゼン環）の置換基である。該置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。Ｒ４が複数個存在する場合、各Ｒ４は同一であっても異なっていてもよい。
　ＺａはＺｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＺａはＺｂと同一の基である。
　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１である。
　ｎａはｎｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ｎａはｎｂと同一である。
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（３）：
　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（３）
　（式（３）中、
　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
　　ａは２～１０の整数を表す。）
で表される基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基であり、最も好ましくはそれぞれ独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基とは、水酸基を有する脂溶性ビタミンの水酸基が＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－または＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－に置き換えられた構造を有する基を表す。＊は脂溶性ビタミンとの結合位置を表す。水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基とは、水酸基を有するステロール誘導体の水酸基が＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－または＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－に置き換えられた構造を有する基を表す。＊はステロール誘導体との結合位置を表す。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。
　水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロール等が挙げられ、好ましくはコレステロール、またはコレスタノールである。
　炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していてもよい。該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合および炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１２～２２であり、より好ましくは１３～１９であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基またはアルケニル基が含まれる。炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ペンタコシル基、ヘキサコシル基、ヘプタコシル基、オクタコシル基、ノナコシル基、トリアコンチル基、テトラコンチル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。
　本発明の一態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂで表される炭素数１～４０（好ましくは炭素数１２～２２）の脂肪族炭化水素基は脂肪酸由来である。この場合、脂肪酸由来のカルボニル炭素は式（１）中の－ＣＯ－Ｏ－に含まれる。脂肪族炭化水素基の具体例としては、脂肪酸としてリノール酸を用いた場合ではヘプタデカジエニル基となり、脂肪酸としてオレイン酸を用いた場合ではヘプタデセニル基となる。
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂにおけるシクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基は、アルキル鎖中に少なくとも一つのシクロプロパン環を有する、炭素数３～４０のアルキル基を意味する。アルキル基の炭素数３～４０はシクロプロパン環の炭素数を含まない。該アルキル基が有するシクロプロパン環の数は、好ましくは一つである。Ｒ３ａおよびＲ３ｂにおけるシクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基は、好ましくは式（４）：
（式（４）中、ｂおよびｃはそれぞれ独立して整数であり、ｂおよびｃの合計が２～３９である。）
で表される基である。好ましくは、ｂは１～２０の整数であり、ｃは１～１９の整数である。ｂはより好ましくは２～１８の整数であり、さらに好ましくは３～１７の整数であり、さらにより好ましくは４～１２の整数である。ｃはより好ましくは３～１５の整数であり、さらに好ましくは３～１１の整数であり、さらにより好ましくは３～９の整数である。式（４）で表される基としては、例えば、７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル等が挙げられる。
　式（３）において、Ｒ９で表される炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していてもよい。該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合および炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは８～２０であり、より好ましくは９～１９であり、さらに好ましくは１３～１９であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基またはアルケニル基が含まれ、より好ましくはアルキル基である。炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－エチルノニル基、１－ブチルノニル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、３－オクチルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。
　式（３）において、ａは好ましくは３～９の整数であり、より好ましくは３～７の整数であり、さらに好ましくは５～７の整数であり、最も好ましくは５または７である。
　Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。
　本発明の一態様において、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、ＸａはＸｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一であり、ＺａはＺｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　式（１）で表されるイオン性脂質（本明細書中「イオン性脂質（１）」と略称することがある）の好適な例としては、以下のイオン性脂質が挙げられる。
［イオン性脂質（１－１）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　ｎａおよびｎｂがそれぞれ独立して、０または１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
［イオン性脂質（１－２）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～４のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～３であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数６以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が６～１２であり、１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　ｎａおよびｎｂがそれぞれ独立して、０または１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１３～１９の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
［イオン性脂質（１－３）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～２のアルキレン基（即ち、メチレン基またはエチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、Ｘ１：
（式中、Ｒ５は炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）である。）、またはＸ２：
（式中、ｐは１または２である。）
であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数４以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、Ｚ１：
（式中、ｓは０～１の整数であり、ｔは０～２の整数であり、ｕは０～２の整数（好ましくは０）であり、ｕ個のＲ４は、それぞれ独立して置換基を表す。）
であり；
　ｎａおよびｎｂがそれぞれ独立して、０または１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１３～１７の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
　イオン性脂質（１）の具体例として、以下のＯ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍ、Ｂ－２、Ｂ－２－５、ＴＳ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐ４Ｃ２を挙げることができる。
　また、イオン性脂質（１）の具体例として、ＷＯ２０２１／１９５５２９Ａ２に記載のＬｉｐｉｄ１からＬｉｐｉｄ２０を挙げることができる。
　イオン性脂質（１）は、公知の方法（例えば、ＷＯ２０１９／１８８８６７Ａ１（ＵＳ２０２１／００２３００８Ａ１）、ＵＳ９７０８６２８Ｂ２、ＷＯ２０２１／１９５５２９Ａ２に記載の方法）によって製造することができる。
　式（２）
（式中、
　Ｘは、３級窒素を一つ以上含む含窒素脂肪族基を表し、
　Ｒ１は、炭素数が８以下の脂肪族炭化水素基を表し、
　Ｌ１は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、Ｎ－アルキルカルバメート結合、カーボネート結合またはウレア結合を表し、
　ｋは、０または１を表し、
　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して炭素数が２～５のアルキレン基を表し、
　Ｌ２は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、カーボネート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　Ｒ２は、炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
　Ｙは、（ｉ）ヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を一つ以上含み、且つ（ｉｉ）前記２価の基の芳香環上にエステル結合およびカーボネート結合からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む基を有し、且つ（ｉｉｉ）炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基、およびステロール誘導体の残基からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む基を表す。）
で表される化合物。
　好ましいＸの一例は、下記一般式（５）で表すことができる。
　Ｒα－Ｎ（Ｒβ）－　（５）
（式中、
　Ｒαは、脂肪族炭化水素基であり、
　Ｒβは、脂肪族炭化水素基、窒素以外のヘテロ原子を一つ以上含む脂肪族基、または３級アミンを一つ以上含む脂肪族基であり、または
　ＲαおよびＲβは、結合して３～８員の含窒素脂環を形成してもよい）
　より好ましいＸとしては、ジアルキルアミノ基（前記ジアルキルアミノ基の二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して１～８である）、３～６員のヘテロ原子を有していてもよい環状アミノ基、または－Ｎ（Ｒa）－Ｒｂであり、
　Ｒａは、炭素数が１～８のアルキル基であり、
　Ｒｂは、－（ＣＨ２）ｑ－Ｏ－Ｒｃであり、
　Ｒｃは、水素または炭素数が１～８のアルキル基であり、
　ｑは、２～４の整数である。
　ジアルキルアミノ基中の二つのアルキル基の炭素数は、好ましくは、それぞれ独立して１～５であり、より好ましくは、それぞれ独立して１～４である。上記のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状または環状のいずれでもよい。
　具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、シクロペンチル基等を挙げることができる。好ましくは、それぞれ独立してメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、より好ましくはそれぞれ独立してメチル基またはエチル基である。
　３～６員のヘテロ原子を有していてもよい環状アミノ基とは、アミノ基の置換基が結合して環を形成しており、上記の環を形成する原子の数が３～６個であり、酸素などのヘテロ原子を含んでいてもよい基を意味する。３～６員のヘテロ原子を有していてもよい環状アミノ基は、好ましくは５または６員のヘテロ原子を有していてもよい環状アミノ基、より好ましくは６員のヘテロ原子を有していてもよい環状アミノ基である。環状アミノ基としては、環が窒素原子およびメチレン基（－ＣＨ２－）のみから形成されているアミノ基が好ましく、その中に酸素原子を含んでいてもよい。具体的には、１－ピロリジニル基、１－ピペリジル基、モルホリノ基（４－モルホリニル基）であり、好ましくは、１－ピペリジル基、モルホリノ基である。
　Ｒ１における炭素数が８以下の脂肪族炭化水素基としては、アルキレン基、アルケニレン基、またはアルキニレン基であることが好ましく、アルキレン基またはアルケニレン基であることがより好ましい。
　炭素数が８以下のアルキレン基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。上記のアルキレン基の炭素数は、好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。炭素数が８以下であるアルキレン基は、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、より好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）である。
　炭素数が８以下のアルケニレン基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。上記のアルケニレン基の炭素数は、好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。炭素数が８以下であるアルケニレン基は、好ましくはプロペニレン基（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－）、ブテニレン基、イソプロペニレン基、イソブテニレン基、ペンテニレン基、またはヘキセニレン基であり、より好ましくはプロペニレン基（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－）、ブテニレン基、イソプロペニレン基、またはイソブテニレン基である。
　Ｌ１は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、Ｎ－アルキルカルバメート結合、カーボネート結合またはウレア結合であり、好ましくは、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、Ｎ－メチルカルバメート結合またはカーボネート結合である。
　本明細書中、Ｎ－アルキルカルバメート結合は、－ＮＲ１０－ＣＯ－Ｏ－または－Ｏ－ＣＯ－ＮＲ１０－を表し、Ｒ１０は、炭素数が１～８のアルキル基を表す。炭素数が１～８のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状または環状のいずれでもよい。上記のアルキル基の炭素数は、好ましくは１～６であり、より好ましくは１～４である。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、シクロペンチル基等を挙げることができる。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。
　ｋは、０または１を表す。ここで、ｋが０であるとは、Ｒ１－Ｌ１が存在しないこと、即ち、ＸとＲｘが直接結合することを意味する。ｌ、ｍ、ｎ等が０である場合も、同様の意味である。
　ＲｘおよびＲｙについての炭素数が２～５のアルキレン基としては、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。上記のアルキレン基の炭素数は、好ましくは２～４であり、より好ましくは２である。
　具体的には、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり、好ましくはエチレン基またはトリメチレン基であり、より好ましくはエチレン基である。
　Ｌ２は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、カーボネート結合、エーテル結合またはウレア結合であり、好ましくはエステル結合またはアミド結合であり、より好ましくはエステル結合である。
　Ｒ２は、炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在しない。Ｒ２が存在しないとは、Ｌ２とＹが直接結合することを意味する。
　Ｒ２における炭素数が８以下のアルキレン基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。上記のアルキレン基の炭素数は、好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。炭素数が８以下であるアルキレン基は、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、より好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）である。
　ＲａおよびＲｃにおける炭素数が１～８のアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。上記のアルキル基の炭素数は、好ましくは１～６であり、より好ましくは１～４である。炭素数が１～８であるアルキル基としては、具体的にメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基等を挙げることができる。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。
　好ましいＹの一例は、下記一般式（６）で表すことができる。
（式中、
　Ｒ３は、炭素数が８以下のアルキレン基を表し、
　Ｌ３は、エステル結合またはカーボネート結合を表し、
　Ｓ１は、水素、炭素数が１～８のアルキル基、－Ｒｅ－Ｌａ－Ｒ７’、または－Ｒｅ－Ｌａ－Ｚ’－Ｌｂ－Ｒ７’を表し、
　Ｓ２は、－Ｒｅ’－Ｌａ－Ｒ７’’または－Ｒｅ’－Ｌａ－Ｚ’’－Ｌｂ－Ｒ７’’を表し、
　ＲｅおよびＲｅ’は、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基を表し、
　Ｌａは、エステル結合またはカーボネート結合を表し、
　Ｌｂは、エステル結合またはカーボネート結合を表し、
　ｌは、０または１を表し、
　Ｚ、Ｚ’およびＺ’’は、それぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、且つヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　Ｌｘは、エステル結合またはカーボネート結合を表し、
　Ｒ４は、炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
　Ｒ５は、水素または炭素数が１～８のアルキル基を表し、
　Ｓ３は、－Ｒ６’－Ｌ４’－Ｒ７’’’を表し、
　ｍは、０または１を表し、
　Ｒ６およびＲ６’は、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
　Ｌ４およびＬ４’は、それぞれ独立してエステル結合またはカーボネート結合を表し、
　Ｒ７、Ｒ７’、Ｒ７’’およびＲ７’’’は、それぞれ独立して炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基、または－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒｆを表し、
　Ｒｆは、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基または水酸基を有するステロール誘導体の残基を表し、およびｐは、２または３を表し、
　ｎは、０または１を表す。
　Ｒ４は、炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在しない。Ｒ４が存在しないとは、Ｒ５およびＳ３が結合する炭素原子とＬｘが直接結合することを意味する。
　Ｒ６およびＲ６’は、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在しない。Ｒ６が存在しないとは、ｍ＝０のとき、ＬｘとＬ４が直接結合することを意味し、ｍ＝１のとき、Ｒ５およびＳ３が結合する炭素原子とＬ４が直接結合することを意味する。Ｒ６’が存在しないとは、Ｒ４およびＲ５が結合する炭素原子とＬ４’が直接結合することを意味する。
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６’、ＲｅおよびＲｅ’における炭素数が８以下のアルキレン基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。上記のアルキレン基の炭素数は、好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。炭素数が８以下であるアルキレン基は、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、より好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）である。
　Ｒ５およびＳ１における炭素数が１～８のアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。上記のアルキル基の炭素数は、好ましくは１～６であり、より好ましくは１～４である。炭素数が１～８であるアルキル基としては、具体的にメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基等を挙げることができる。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。
　Ｌｘ、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ４’、ＬａおよびＬｂは、エステル結合またはカーボネート結合であり、好ましくは、エステル結合ある。
　Ｚ、Ｚ’およびＺ’’は、それぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、且つヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。ここで、２価の基とは、上記の芳香族化合物から二つの水素原子を除くことによって得られる構造を有する２価の基を意味する。上記の芳香族化合物の炭素数は好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～７である。また、上記の芳香族化合物の芳香環の数は、好ましくは１である。Ｚ、Ｚ’およびＺ’’は、それぞれ同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｚ、Ｚ’およびＺ’’は同一である。
　上記の芳香族化合物の芳香環としては、芳香族炭化水素環または芳香族ヘテロ環のいずれでもよい。芳香族炭化水素環としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環等を挙げることができる。芳香族ヘテロ環としては、例えば、イミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フランチオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができる。上記の芳香族化合物の芳香環は、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環またはアントラセン環であり、より好ましくはベンゼン環である。
　上記の芳香族化合物の芳香環は置換基を有してもよい。置換基としては、例えば、炭素数が２～４のアシル基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数が２～４のカルバモイル基、炭素数が２～１８のアシルオキシ基、炭素数が２～４のアシルアミノ基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数が１～４のアルキルスルファニル基、炭素数が１～４のアルキルスルホニル基、炭素数が６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数が１～４のアルキル基、炭素数が１～４のウレイド基、炭素数が１～４のアルコキシ基、炭素数が６～１０のアリール基、炭素数が６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができる。上記の置換基の好ましい例としては、アセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基、フェノキシ基等を挙げることができる。
　Ｚ、Ｚ’およびＺ’’は、好ましくはそれぞれ独立して、式（７）：
（式中、
　ｔは、０～３の整数を表し、
　ｕは、０～３の整数を表し、
　ｖは、０～４の整数を表し、および
　ｖ個のＲ８は、それぞれ独立して置換基を表し、
　＊は、Ｌ３またはＬａとの結合位置を表す。）
　ｔは、好ましくは０または１であり、より好ましくは１である。
　ｕは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０である。
　ｖは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０または１であり、さらに好ましくは０である。
　Ｒ８としては、例えば、炭素数が２～４のアシル基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数が２～４のカルバモイル基、炭素数が２～１８のアシルオキシ基、炭素数が２～４のアシルアミノ基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数が１～４のアルキルスルファニル基、炭素数が１～４のアルキルスルホニル基、炭素数が６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数が１～４のアルキル基、炭素数が１～４のウレイド基、炭素数が１～４のアルコキシ基、炭素数が６～１０のアリール基、炭素数が６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができる。Ｒ８の好ましい例としては、アセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基、ヘプタノイルオキシ基、オクタノイルオキシ基、ノナノイルオキシ基、デカノイルオキシ基、ウンデカノイルオキシ基、ドデカノイルオキシ基、トリデカノイルオキシ基、テトラデカノイルオキシ基、ペンタデカノイルオキシ基、ヘキサデカノイルオキシ基、ヘプタデカノイルオキシ基、オクタデカノイルオキシ基、オクタデセノイルオキシ基、オクタデカジエノイルオキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基、フェノキシ基等を挙げることができる。Ｒ８が複数存在する場合、複数のＲ８は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
　Ｒ７、Ｒ７’、Ｒ７’’およびＲ７’’’は、それぞれ独立して炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基または－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒｆを表し、Ｒｆは、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基または水酸基を有するステロール誘導体の残基を表し、およびｐは、２または３を表す。Ｒ７、Ｒ７’、Ｒ７’’およびＲ７’’’は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
　本明細書中、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基とは、脂溶性ビタミンの水酸基から水素原子を除くことによって得られる構造を有する１価の基を表す。また、水酸基を有するステロール誘導体の残基とは、ステロール誘導体の水酸基から水素原子を除くことによって得られる構造を有する１価の基を表す。
　炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。上記の脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１２～３７であり、より好ましくは１３～３７であり、さらに好ましくは１５～３７である。
　上記の脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。上記の脂肪族炭化水素基が不飽和脂肪族炭化水素基である場合、その不飽和結合の数は、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個である。不飽和結合は、炭素－炭素二重結合または炭素－炭素三重結合のいずれでもよいが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくはアルキル基またはアルケニル基である。
　炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基としては、例えば、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ヘンエイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ヘンエイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基、１－ドデシルトリデシル基、１－テトラデシルペンタデシル基、１－ヘキサデシルヘプタデシル基、１－オクタデシルノナデシル基等を挙げることができる。
　炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基は、好ましくはウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ヘンエイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ヘンエイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基、１－ドデシルトリデシル基、１－テトラデシルペンタデシル基、１－ヘキサデシルヘプタデシル基、１－オクタデシルノナデシル基であり、特に好ましくはペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ヘプタデセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ヘンエイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基、１－ドデシルトリデシル基、１－テトラデシルペンタデシル基、１－ヘキサデシルヘプタデシル基、１－オクタデシルノナデシル基である。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。
　水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール等を挙げることができる。水酸基を有するステロール誘導体は、好ましくはコレステロール、またはコレスタノールである。
　Ｒｆは、好ましくは水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基である。ｐは、好ましくは２である。
　ｌ、ｍ、ｎは、０または１を表す。好ましいｌ、ｍ、ｎの組み合わせとしては、
　　ｌ＝０、ｍ＝０、ｎ＝０
　　ｌ＝０、ｍ＝０、ｎ＝１
　　ｌ＝０、ｍ＝１、ｎ＝１
　　ｌ＝１、ｍ＝０、ｎ＝０
であり、特に好ましくは
　　ｌ＝０、ｍ＝０、ｎ＝０
　　ｌ＝０、ｍ＝１、ｎ＝１
　　ｌ＝１、ｍ＝０、ｎ＝０
である。
　式（２）で表されるイオン性脂質（本明細書中「イオン性脂質（２）」と略称することがある）の好適な例としては、以下のイオン性脂質が挙げられる。
　Ｘは、ジアルキルアミノ基（前記ジアルキルアミノ基の二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して１～８である）、３～６員のヘテロ原子を有していてもよい環状アミノ基、または－Ｎ（Ｒａ）－Ｒｂを表し、
　Ｒａは、炭素数が１～８のアルキル基を表し、
　Ｒｂは、－（ＣＨ２）ｑ－Ｏ－Ｒｃを表し、
　Ｒｃは、水素または炭素数が１～８のアルキル基を表し、
　ｑは、２～４の整数であり；
　Ｒ１は、炭素数が６以下のアルキレン基、または炭素数が６以下のアルケニレン基であり；
　Ｌ１は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合またはカーボネート結合であり
　ｋは、０または１であり；
　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して炭素数が２～４のアルキレン基であり；
　Ｌ２は、エステル結合またはアミド結合であり；
　Ｒ２は、炭素数が６以下のアルキレン基であるか、または存在せず；
　Ｙが式（Ｙ）：
（式中、
　Ｒ３は、炭素数が６以下のアルキレン基を表し、
　Ｌ３は、エステル結合を表し、
　Ｓ１は、水素、炭素数が１～８のアルキル基、－Ｒｅ－Ｌａ－Ｒ７’、または－Ｒｅ－Ｌａ－Ｚ’－Ｌｂ－Ｒ７’を表し、
　Ｓ２は、－Ｒｅ’－Ｌａ－Ｒ７’’または－Ｒｅ’－Ｌａ－Ｚ’’－Ｌｂ－Ｒ７’’を表し、
　ＲｅおよびＲｅ’は、それぞれ独立して炭素数が６以下のアルキレン基を表し、
　Ｌａは、エステル結合を表し、
　Ｌｂは、エステル結合を表し、
　ｌは、０または１を表し、
　Ｌｘは、エステル結合またはカーボネート結合を表し、
　Ｒ４は、炭素数が６以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
　Ｒ５は、水素または炭素数が１～８のアルキル基を表し、
　Ｓ３は、－Ｒ６’－Ｌ４’－Ｒ７’’’を表し、
　ｍは、０または１を表し、
　Ｒ６およびＲ６’は、それぞれ独立して炭素数が６以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
　Ｌ４およびＬ４’は、共にエステル結合を表し、
　Ｒ７、Ｒ７’、Ｒ７’’およびＲ７’’’は、それぞれ独立して炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基、または－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒｆを表し、
　Ｒｆは、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基または水酸基を有するステロール誘導体の残基を表し、およびｐは、２または３を表し、
　ｎは、０または１を表す。）
で表される基であり；
　Ｚ、Ｚ’およびＺ’’は、それぞれ独立して、式（Ｚ）：
（式中、
　ｔは、０または１の整数を表し、
　ｕは、０～２の整数を表し、
　ｖは、０～２の整数を表し、および
　ｖ個のＲ８は、それぞれ独立して炭素数が２～４のアシル基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数が２～４のカルバモイル基、炭素数が２～１８のアシルオキシ基、炭素数が２～４のアシルアミノ基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数が１～４のアルキルスルファニル基、炭素数が１～４のアルキルスルホニル基、炭素数が６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数が１～４のアルキル基、炭素数が１～４のウレイド基、炭素数が１～４のアルコキシ基、炭素数が６～１０のアリール基、または炭素数が６～１０のアリールオキシ基を表す。）
で表される基である；
イオン性脂質（２）。
　イオン性脂質（２）の好ましい具体例としては、後記する製造例１～製造例４６に記載の化合物が挙げられるが、本発明がこれにより限定して解釈されるものではない。製造例１～製造例４６に記載の化合物は、それぞれ化合物１～化合物４６と称する。
　イオン性脂質（２）は、好ましくは、これらからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくは、化合物５、７、８、９、１０、１１、１５、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、および４２からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、さらに好ましくは、化合物５、７、８、９、１０、１１、１５、２１、２２、２４、３１、３２、３４、３５、および３６からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、最も好ましくは、化合物３１又は化合物３４である。
　次にイオン性脂質（２）の製造方法について説明する。
　イオン性脂質（２）は、－Ｓ－Ｓ－（ジスルフィド）結合を有している。そのため、イオン性脂質（２）の製造方法としては、
　（Ａ）Ｘ－（Ｒ１－Ｌ１）ｋ－ＲＸ－ＳＨで表されるチオールおよびＨＳ－Ｒｙ－Ｌ２－Ｒ２－Ｙで表されるチオールを製造した後、これらを酸化およびカップリングする方法、並びに
　（Ｂ）－Ｓ－Ｓ－結合を含む出発化合物に、必要な部分を順次合成していき、最終的にイオン性脂質（２）を得る方法
等が挙げられる。イオン性脂質（２）の製造方法は、好ましくは、（Ｂ）の方法である。
　以下、（Ｂ）の方法を説明するが、イオン性脂質（２）の製造方法は、これに限定されない。
　以下の製造方法における各工程で用いられた原料、試薬および得られた化合物は、それぞれ塩を形成していてもよい。このような塩としては、例えば、前述の本発明の化合物における塩と同様のものが挙げられる。
　各工程で得られた化合物が遊離化合物である場合には、公知の方法により、目的とする塩に変換することができる。逆に各工程で得られた化合物が塩である場合には、公知の方法により、遊離体または目的とする他の種類の塩に変換することができる。
　各工程で得られた化合物は反応液のままか、または粗生成物として得た後に、次反応に用いることもできる。あるいは、各工程で得られた化合物を、反応混合物から抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　各工程の原料や試薬の化合物が市販されている場合には、市販品をそのまま用いることができる。
　各工程の反応において、反応時間は、特に記載の無い場合、通常１分～４８時間、好ましくは１０分～２２時間である。
　各工程の反応において、反応温度は、特に記載が無い場合、通常－７８℃～３００℃、好ましくは－７８℃～１５０℃である。
　各工程の反応において、試薬は、特に記載が無い場合、基質に対して０．５当量～２０当量、好ましくは０．８当量～８当量が用いられる。試薬を触媒として使用する場合、試薬は基質に対して０．００１当量～１当量、好ましくは０．０１当量～０．４当量が用いられる。試薬が反応溶媒を兼ねる場合、試薬は溶媒量が用いられる。
　各工程の反応において、特に記載が無い場合、これらの反応は、無溶媒、あるいは適当な溶媒に溶解または懸濁して行われる。溶媒の具体例としては、実施例に記載されている溶媒、あるいはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、テトラヒドロフラン、トルエン、シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトン、水などが挙げられる。上記溶媒は、二種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
　各工程の反応において塩基を用いる場合、実施例に記載されている塩基、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、イミダゾール、ピペリジン、ナトリウムエトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、水素化リチウムなどが挙げられる。
　各工程の反応において酸または酸性触媒を用いる場合、実施例に記載されている酸や酸性触媒、あるいは塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体などが挙げられる。
　各工程において、官能基の保護または脱保護反応は、公知の試薬および方法（例えば、ＧＲＥＥＮＥ’Ｓ　ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ＩＮ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第４版、ＷＩＬＥＹ－ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥＭに記載されている試薬および方法）、あるいは実施例に記載された方法に準じて行われる。
　アルコールなどの水酸基やフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、テトラヒドロピラニルエーテル、メトキシメチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ－メトキシベンジルエーテル、ｔ－ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ－ブチルジフェニルシリルエーテルなどのエーテル型保護基；酢酸エステルなどのカルボン酸エステル型保護基；メタンスルホン酸エステルなどのスルホン酸エステル型保護基；ｔ－ブチルカルボネートなどの炭酸エステル型保護基などが挙げられる。
　保護基の除去は、例えば、酸、塩基、紫外光、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、Ｎ－メチルジチオカルバミン酸ナトリウム、テトラブチルアンモニウムフルオリド、酢酸パラジウム、トリアルキルシリルハライドを使用する方法や還元法など、公知の方法を用いて行うことができる。
　各工程において、カーボネート化反応、あるいはカルバメート化反応を行う場合、使用される試薬としては、炭酸 Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）、クロロぎ酸４－ニトロフェニル（ｐＮＰＣｌ）などと塩基（塩基性塩類、有機塩基類など）が挙げられる。カーボネート化を行う場合、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの添加剤をさらに加えてもよい。
　各工程において、メシル化反応を行う場合、使用される試薬としては、塩化メタンスルホニルと塩基（塩基性塩類、有機塩基類など）が用いられる。
　各工程において、エステル化反応、アミド化反応、あるいはウレア化反応を行う場合、使用される試薬としては、酸クロリドなどのハロゲン化アシル体、酸無水物、活性エステル体など活性化されたカルボン酸類が挙げられる。カルボン酸の活性化剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系縮合剤、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）などのトリアジン系縮合剤、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、あるいはこれらの組み合わせなどが挙げられる。カルボジイミド系縮合剤を用いる場合、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの添加剤をさらに反応に加えてもよい。
　各工程において、アミノ化などの求核置換反応を行う場合、試薬としては、求核剤（アミン類など）と塩基（塩基性塩類、有機塩基類など）が用いられる。ヨウ化カリウム（ＫＩ）やテトラブチルアンモニウムヨージド（ＴＢＡＩ）などの添加剤をさらに反応に加えてもよい。
　イオン性脂質（２）は、例えば、以下の製法によって製造することができる。また、イオン性脂質（２）の塩は、無機酸、有機酸との適切な混合により得ることができる。
　製法Ａ：ｋ＝１, ｌ＝０, ｍ＝０, ｎ＝０であり、ＲｘおよびＲｙがともにエチレン基のとき
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　製法Ｂ：ｋ＝１, ｌ＝０, ｍ＝１, ｎ＝１であり、ＲｘおよびＲｙがともにエチレン基のとき
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　製法Ｃ：ｋ＝１, ｌ＝１, ｍ＝０, ｎ＝０であり、ＲｘおよびＲｙがともにエチレン基であり、Ｓ１が水素またはアルキル基のとき
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　製法Ｄ：ｋ＝０, ｌ＝０, ｍ＝０, ｎ＝０であり、ＲｘおよびＲｙがともにエチレン基のとき
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　上記の式中、Ｆ１～Ｆ１０はそれぞれ独立して、反応性官能基を表し、Ｐ１～Ｐ４はそれぞれ独立して、保護基を表す。
　具体的な製造方法を、後述の製造例１～４６に記載する。当業者であれば、適宜原料を選択し、製造例１～４６に記載する方法に準じて反応を行うことにより、所望のイオン性脂質（２）を製造することができる。
リン脂質
　リン脂質は脂質ナノ粒子の脂質膜構成成分として用いることができる。
　リン脂質の例としては、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン（ＰＳ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＡ）、またはこれらのリゾ体があり、
具体的には、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬｏＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）があり、これらのＰＣを適宜ＰＥ，ＰＳ，ＰＧ，ＰＡに変換したものを用いることができる。
　本発明に用いるリン脂質として好ましくは、ＰＣまたはＰＥであり、さらに好ましくはＤＯＰＣ，ＤＳＰＣ，ＤＥＰＣ，ＰＯＰＣ，ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン），ＰＯＰＥ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）であり、特に好ましくはＤＯＰＣ，ＤＳＰＣ，ＤＥＰＣである。
ステロール
　ステロールは脂質ナノ粒子の脂質膜の流動性を調節する成分として用いることができる。ステロールの例としては、コレステロール、ラノステロール、フィトステロール、ジモステロール、ジモステノール、デスモステロール、スティグマスタノール、ジヒドロラノステロール、および７－デヒドロコレステロールがあり、好ましくはコレステロール、ラノステロール、フィトステロールであり、さらに好ましくはコレステロールである。
ＰＥＧ脂質
　ＰＥＧ脂質は、脂質ナノ粒子の表面を親水性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆し、粒子同士の凝集を抑制することによる安定化剤や、生体に投与した際に生体成分と粒子の相互作用を抑制するために用いられる。
　ＰＥＧ領域は任意の分子量のものであり得る。いくつかの態様において、ＰＥＧ領域は、２００～１０，０００Ｄａの分子量を有し、直鎖であっても分岐であってもよい。
　ＰＥＧ脂質の例としてはＰＥＧ－リン脂質およびＰＥＧ－セラミド、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール、ＰＥＧ－コレステロールがあり、好ましくはＰＥＧの分子量が１，０００～１０，０００のジアシルグリセロールＰＥＧであり、さらに好ましくは、ＰＥＧの分子量が１，０００～１０，０００のジミリストイルグリセロールＰＥＧまたはジステアロイルグリセロールＰＥＧである。
酸性緩衝液
　酸性領域に緩衝作用がある緩衝液を用いることができる。具体的にはHCl/KCl緩衝液、p-トルエンスルホン酸/同Na塩緩衝液、酒石酸/NaOH緩衝液、クエン酸/NaOH緩衝液、フタル酸HK/HCl緩衝液、グリシン/HCl緩衝液、trans-アコニット酸/NaOH緩衝液、ギ酸/ギ酸Na緩衝液、クエン酸/クエン酸Na緩衝液、3,3-ジメチルグルタル酸/NaOH緩衝液、3,3-ジメチルグルタル酸/NaOH/0.1M NaCl緩衝液、フェニル酢酸/同Na塩緩衝液、酢酸/酢酸Na緩衝液、コハク酸/NaOH緩衝液、フタル酸HK/NaOH緩衝液、カコジル酸Na/HCl緩衝液、マレイン酸HNa/NaOH緩衝液、マレイン酸/Tris/NaOH緩衝液、リン酸緩衝液、KH2PO4/NaOH緩衝液、イミダゾール/HCl緩衝液、s-コリジン (2,4,6-トリメチルピリジン)/HCl緩衝液、トリエタノールアミンHCl/NaOH緩衝液、5,5-ジエチルバルビツール酸Na/HCl緩衝液、N-メチルモルホリン/HCl緩衝液、ピロリン酸Na/HCl緩衝液、MES緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ADA緩衝液、PIPES緩衝液、ACES緩衝液、HEPES、BES、ビストリス緩衝液、ビストリスプロパン緩衝液、無水炭酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、MOPS、MOPSO、TESが挙げられる。
　好ましくはｐＨ１～６.５、より好ましくはｐＨ３～６．５に緩衝作用を有する酸性緩衝液であり、酒石酸/NaOH緩衝液、クエン酸/NaOH緩衝液、フタル酸HK/HCl緩衝液、グリシン/HCl緩衝液、trans-アコニット酸/NaOH緩衝液、ギ酸/ギ酸Na緩衝液、クエン酸/クエン酸Na緩衝液、3,3-ジメチルグルタル酸/NaOH緩衝液、3,3-ジメチルグルタル酸/NaOH/0.1M NaCl緩衝液、フェニル酢酸/同Na塩緩衝液、酢酸/酢酸Na緩衝液、コハク酸/NaOH緩衝液、フタル酸HK/NaOH緩衝液、カコジル酸Na/HCl緩衝液、マレイン酸HNa/NaOH緩衝液、マレイン酸/Tris/NaOH緩衝液、リン酸緩衝液、KH2PO4/NaOH緩衝液、MES緩衝液、リンゴ酸緩衝液、フタル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ビストリス緩衝液、グリシルグリシン緩衝液などが挙げられ、さらに好ましくはリンゴ酸緩衝液またはMES緩衝液である。
脂質ナノ粒子の調製方法
　本発明の方法において、イオン性脂質、ステロールおよびPEG脂質を含むアルコール溶液とｐＨ１～６．５に緩衝作用を有する酸性緩衝液を混合することによって、核酸を含まない脂質ナノ粒子の懸濁液が調製される。脂質ナノ粒子を調製するために、任意の組織化を誘導する操作を用いることができる。アルコールとしては、例えば、エタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等が挙げられる。
　脂質ナノ粒子を調製するための「組織化を誘導する操作」としては、例えば、マイクロ流路又はボルテックスを用いたアルコール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結－融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられ、好ましくはマイクロ流路又はボルテックスを用いたアルコール希釈法であり、さらに好ましくはマイクロ流路を用いたアルコール希釈法である。マイクロ流路を用いたアルコール希釈法での粒子調製は例えばＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行うことができる。調製した脂質ナノ粒子は限外ろ過、透析、希釈等の操作によって外水相の緩衝液を交換することができる。好ましい態様において、脂質ナノ粒子の懸濁液の調製後、限外ろ過、透析、希釈等の操作によって、外水相をｐＨ１～６．５（好ましくはｐＨ３～６．５）に緩衝作用を有する別の酸性緩衝液に交換することができる。また、脂質ナノ粒子の懸濁液に単糖、糖アルコール、二糖、オリゴ糖、多糖等の糖類を添加することができる。糖類としては、好ましくは二糖であり、さらに好ましくはスクロースである。糖類の濃度は、最終濃度として、好ましくは０～３２０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０～１６０ｍｇ／ｍＬである。
脂質ナノ粒子の保管条件
　核酸を含まない脂質ナノ粒子は、０℃～５０℃の温度範囲にて液体として保管してもよく、－８０℃～０℃の範囲で凍結して保管してもよい。
　液体として保管する場合の保管温度は、構成成分の安定性の観点から、好ましくは０℃～３０℃であり、さらに好ましくは０℃～１０℃であり、最も好ましくは０℃～５℃である。
　凍結して保管する場合の保管温度は、構成成分の安定性の観点から、好ましくは－８０℃～－１０℃であり、さらに好ましくは－８０℃～－２０℃である。
　凍結して保管した場合は、使用時に０℃～１００℃で融解させて使用する。構成成分の安定性の観点から、融解温度は好ましくは０℃～９５℃であり、より好ましくは０℃～５０℃であり、さらに好ましくは０℃～３０℃であり、最も好ましくは０℃～１０℃である。
　凍結および融解は大気圧下で実施することが好ましい。
核酸添加工程
　核酸添加工程は、前工程で調製した核酸を含まない脂質ナノ粒子を凍結乾燥することなく、核酸を含む水溶液と混合して、核酸内封脂質ナノ粒子を調製する工程である。
　なお、「凍結乾燥することなく」とは、核酸を含まない脂質ナノ粒子の調製工程の直後に、核酸添加工程を実施することを意味する。核酸を含まない脂質ナノ粒子の調製工程は、核酸を含まない脂質ナノ粒子を液体として保管すること、または核酸を含まない脂質ナノ粒子を凍結して保管し、融解することを含む。
　核酸の量は脂質ナノ粒子に含まれる総脂質と核酸の比が例えば総脂質/核酸＝１～１０００nmol/μg、好ましくは総脂質/核酸＝５０～５００nmol/μgの核酸を含む水溶液を加え、ピペッティングやボルテックスによって混合することで核酸内封脂質ナノ粒子を調製することができる。また、核酸内封率を高めるためにアルコールを添加することができ、アルコールとしてはメタノール、エタノール、n-ブタノール、t-ブタノールを用いることができ、好ましくはエタノールである。核酸を含む水溶液中のアルコールの濃度は好ましくは０～５０ｖ／ｖ％、より好ましくは０～３０ｖ／ｖ％、さらに好ましくは０～２５ｖ／ｖ％である。また、さらに核酸添加工程では核酸内封効率を高めるために、液体状又は凍結体状の核酸を含まない脂質ナノ粒子に核酸を含む水溶液、さらにまたはアルコールを加えた後にインキュベーションすることができる。インキュベーションの条件は例えば０～１００℃で０～１２０分間であり、好ましくは０～９５℃で０～６０分間である。
　核酸を含む水溶液としては、核酸を含む酸性緩衝液を用いることが好ましい。酸性緩衝液としては、酸性領域に緩衝作用がある緩衝液を用いることができ、好ましくはｐＨ１～６.５、より好ましくはｐＨ３～６．５に緩衝作用を有する酸性緩衝液である。具体的には、脂質ナノ粒子の調製に用いる酸性緩衝液として前記で例示したものと同じ酸性緩衝液が挙げられ、例えば、MES緩衝液、リンゴ酸緩衝液、フタル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。
外水相を中性緩衝液に交換する工程
　核酸添加工程で得られた核酸内封脂質ナノ粒子の外水相を中性緩衝液に交換することにより、核酸導入剤として使用可能な核酸内封脂質ナノ粒子を調製することができる。
　外水相を中性緩衝液に交換する方法としては、透析、限外ろ過または希釈による方法が挙げられる。
　中性緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Tris-HCl緩衝液、ADA, PIPES, PIPES sesquisodium, ACES, MOPS, BES, MOPSO, TES, HEPES, TAPSO, POPSO, HEPSOなどが挙げられる。中性緩衝液のｐＨは６～８である。
　本発明の方法で調製した核酸内封脂質ナノ粒子を細胞へ接触させることにより、生体内及び／又は生体外において該核酸を該細胞内へ導入することができる。従って、本発明は生体内及び／又は生体外において該核酸を該細胞内へ導入する方法を提供するものである。
　本発明の方法により、任意の核酸を細胞内へ導入することができる。核酸の種類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリン又はピリミジン塩基のＮ－グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）、又は特殊な結合を有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を持つヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらに該核酸は、例えば、公知の修飾の付加された核酸、当該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、分子内ヌクレオチド修飾された核酸、非荷電結合（例えば、メチルスルホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カーバメート等）を持つ核酸、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を持つ核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有している核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を持つ核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性を持つ金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を持つ核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。
　本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＣｐＧオリゴ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
　本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
　本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
　本発明の方法で製造した核酸内封脂質ナノ粒子は、例えば疾患の予防および／又は治療を目的として、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）投与することができる。従って、本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／又は治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸などが挙げられる。
　本発明の方法で製造した核酸内封脂質ナノ粒子は、核酸等を特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療薬や、ＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子の発現を抑制する核酸医薬品などに有用である。従って、本発明は医薬品組成物の製造方法を提供するものである。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の粒子径は、脂質ナノ粒子の製造方法により、適宜調整することができる。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子の表面電位（ゼータ電位）は、特に制限は無いが、好ましくは－１５～＋１５ｍＶ、さらに好ましくは－１０～＋１０ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面電位がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用であるが、正の表面電荷は、細胞内において送達核酸との相互作用によるキャリアからの核酸の放出の抑制や、ｍＲＮＡと送達核酸との相互作用によるタンパク質の合成が抑制される可能性がある。表面電荷を上記の範囲内に調整することにより、この問題を解決し得る。表面電荷の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏなどのゼータ電位測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の表面電荷は、脂質ナノ粒子の構成成分の組成により、調整することができる。
　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において核酸を内封した脂質ナノ粒子と細胞とを接触させる工程を以下において具体的に説明する。
　細胞は当該脂質ナノ粒子との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。脂質ナノ粒子との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
　当該接触時の培養液は、血清含有培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は３０重量％以下が好ましく、２０重量％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、当該脂質ナノ粒子と細胞との接触が阻害される可能性がある。
　当該接触時の細胞密度は、特には限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４～１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
　このように調製された細胞に、例えば、上述の核酸が内封された脂質ナノ粒子の懸濁液を添加する。該懸濁液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の脂質ナノ粒子の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り特には限定されないが、脂質濃度として、通常１～３００ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０～２００ｎｍｏｌ／ｍＬであり、核酸の濃度として、通常０．０１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５～１０μｇ／ｍＬである。
　上述の懸濁液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１～９６時間の範囲であり、好ましくは０．２～７２時間の範囲であり、より好ましくは０．５～４８時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
　上述の培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、又は培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は、血清又は栄養因子を含むことが好ましい。
　また、上述の通り、核酸を内封した脂質ナノ粒子を用いることで、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、核酸を内封した脂質ナノ粒子を対象へ投与することにより、該脂質ナノ粒子が標的細胞へ到達・接触し、生体内で該脂質ナノ粒子に内封された核酸が細胞内へ導入される。該脂質ナノ粒子を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることができる。核酸を内封した脂質ナノ粒子の投与対象としては、好ましくはヒト又は他の哺乳動物である。
　標的細胞の種類は特に限定されず、核酸を内封した脂質ナノ粒子を用いることで、種々の組織（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組組織、リンパ節、腫瘍等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。
　核酸および／または核酸以外の化合物が導入された脂質ナノ粒子の対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物など）への投与方法は、標的細胞へ該脂質ナノ粒子が到達・接触し、該脂質ナノ粒子に導入された化合物を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。該脂質ナノ粒子の投与量は、化合物の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子を核酸導入剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
　該核酸導入剤が研究用試薬として提供される場合、当該本発明の核酸導入剤は、核酸を内封した脂質ナノ粒子をそのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、水溶性溶媒（例えば、リンゴ酸緩衝液、等）、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ｔｅｒｔ－ブタノールなど）もしくは水溶性溶媒と有機溶媒との混合液等）との無菌性溶液もしくは懸濁液を用いて提供され得る。本発明の核酸導入剤は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことが出来る。
　また、該核酸導入剤が医薬として提供される場合、当該本発明の核酸導入剤は、核酸を内封した脂質ナノ粒子をそのままで用いて、あるいは医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とともに用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として、好ましくは非経口剤（より好ましくは、注射剤）として製造することができる。
　本発明の核酸導入剤は、成人用に加えて、小児用の製剤とすることもできる。
　以下に本発明の実施例について更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されない。
　以下の実施例等では、式（１）または式（２）で示されるイオン性脂質を、上述の表に記載の名称で示した。核酸内封脂質ナノ粒子を「核酸内封ナノ粒子」と称することがある。また、以下の実施例等において使用する略号の意味は、それぞれ以下の通りである。
Ｃｈｏｌ：コレステロール
ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００）
ＤＯＰＣ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＤＳＰＣ：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＤＥＰＣ：１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＭＥＳ：２－モルホリノエタンスルホン酸
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＤＤＷ：脱イオン蒸留水
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＩＰＡ：２－プロパノール
ＤＨＰ：３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン
ＰＰＴＳ：ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム
ＴＨＰ：２－テトラヒドロピラニル
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＴ－ＭＭ：４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物
ＤＳＣ：炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）
ＥＤＣ：１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＢＡＩ：テトラブチルアンモニウムヨージド
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＮＰＭ：４－フェニルモルホリン
ＭｓＣｌ：塩化メタンスルホニル
Ｍｓ：メタンスルホニル
ｐＮＰＣｌ：クロロぎ酸４－ニトロフェニル
実施例１　緩衝液の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰ及びＭＣ３をそれぞれ用いた。イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた場合の脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５であり、イオン性脂質としてＭＣ３を用いた場合の脂質組成はモル比で、ＭＣ３：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含むＭＥＳ（ｐＨ５）、フタル酸（ｐＨ５）、マレイン酸（ｐＨ５）、コハク酸（ｐＨ５）、ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ５）、ＤＬ－酒石酸（ｐＨ５）、あるいはクエン酸（ｐＨ５）の緩衝液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、ＭＥＳ、フタル酸、マレイン酸、コハク酸、ＤＬ－リンゴ酸、ＤＬ－酒石酸、あるいはクエン酸の緩衝液すべてでｍＲＮＡが内封され、内封率の差はみられなかった（表３、図１および図２参照）。粒子径をＺ－Ａｖｅ（Ｚ－平均）およびＮｕｍｂｅｒ　Ｍｅａｎ（個数平均）で示す（以下も同様）。
実施例２　スクロース濃度およびインキュベート温度の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた。脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液またはＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒをスクロース最終濃度０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬあるいは３２０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を４℃で保管したもの（以下、液剤ともいう）あるいは、粒子溶液を－８０℃で凍結した後、４℃で融解したもの（以下、凍結融解粒子ともいう）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ５）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、それぞれのスクロース濃度の混合物について、アルミブロック型インキュベータを用いて、液剤サンプルは９５℃、７５℃、５５℃、３５℃、室温で５分インキュベーションした。そのうち、スクロース濃度が１６０ｍｇ／ｍＬのものは、加えて、氷上で５分インキュベーションしたサンプルをおいた。凍結融解粒子は９５℃、３５℃、室温で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、いずれのインキュベート温度においてもｍＲＮＡは内封され、内封率の差はみられなかった。また、いずれのスクロース濃度においてもｍＲＮＡは内封され、内封率の差はみられなかった。得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径は、９５℃でインキュベートをしたものは大きく、他の温度（７５℃、５５℃、３５℃あるいは室温）での粒子径の差はみられなかった（表４、図３および図４参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。１６時間後、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を評価した。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）を１００μＬ加え、５分間振盪し細胞を溶解し、発光量をＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーターで定量した。結果として、いずれのインキュベート温度においてもルシフェラーゼタンパク質の導入が確認され、ｉｎ　ｖｉｒｏ活性の差はみられなかった。また、凍結融解粒子では液剤に比べ高い活性がみられた（図５参照）。
実施例３　インキュベーション時間の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた。脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて室温で６０分、３０分、１５分、１０分、５分あるいは１分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。あるいは、比較のため、先に粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）にＰＢＳを１５０μＬ加え、その後に最終濃度が１．５μｇ／３００μＬとなるようにルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（同上）を加えた。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、いずれのインキュベート時間においてもｍＲＮＡは内封され、内封率の差はみられなかった。また、先に粒子溶液にＰＢＳを加えたもの（ＰＢＳ→ｍＲＮＡ）では、低い内封率が得られた（図６および図７参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。培地中には０．１ｍＭとなるようルシフェリンを添加し、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を経時的に評価した。核酸内封ナノ粒子とルシフェリンを含む培地中で培養されたＨｅＬａ細胞をインキュベータ型ルミノメーター（Ｋｒｏｎｏｓ）へ設置し、１時間ごとに２分間の累積発光量を計測した。結果として、インキュベート時間によって、核酸導入効率は変化しなかった。また、先に粒子溶液にＰＢＳを加えたもの（ＰＢＳ→ｍＲＮＡ）では、核酸導入効率が低かった（図８および図９参照）。
実施例４　ｐＨの影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰ、ＳＳ－ＯＣ、ＭＣ３あるいはＤＯＤＡＰを用い、さらにＳＳ－ＯＰあるいはＳＳ－ＯＣを用いた場合はその他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用し、ＭＣ３あるいはＤＯＤＡＰを用いた場合はその他の脂質としてＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰあるいはＳＳ－ＯＣ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰあるいはＳＳ－ＯＣ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。また、使用したＭＣ３あるいはＤＯＤＡＰ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のモル比は５０：１０：３８．５：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、それぞれのｐＨとイオン性脂質の組み合わせの混合物について、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡ
の内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、ＳＳ－ＯＰ、ＭＣ３はｐＨ６まで封入され、ｐＨ６．５，ｐＨ７で内封率が低下した。一方で、ＳＳ－ＯＣ、ＤＯＤＡＰはｐＨ５.５まで封入され、ｐＨ６，ｐＨ６．５，ｐＨ７で内封率が低下した（図１０および図１１参照）。
実施例５　塩濃度の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰおよびＭＣ３をそれぞれ用いた。イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた場合の脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５であり、イオン性脂質としてＭＣ３を用いた場合の脂質組成はモル比で、ＭＣ３：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＮａＣｌを０ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭあるいは３００ｍＭ含むＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、それぞれの塩濃度とイオン性脂質の組み合わせの混合物について、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、緩衝液の塩濃度が上昇するとともにｍＲＮＡの内封率が減少した（図１２および図１３参照）。
実施例６：混合比および混合様式の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた。脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液あるいは粒子溶液をＭＥＳ（ｐＨ６）の緩衝液で希釈した溶液（脂質濃度３００ｎｍｏｌ／１５μＬ、３００ｎｍｏｌ／７５μＬあるいは３００ｎｍｏｌ／１３５μＬ）と、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　―　（Ｌ―７６０２））を含むＭＥＳ（ｐＨ６）の緩衝液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、３μｇ／７５μＬあるいは３μｇ／１５μＬ）を、ボルテックスミキサーによる攪拌条件下で、あるいはピペッティングの後タッピングによって、希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、ボルテックスミキサーによる攪拌条件下では、いずれの混合比率の場合にも高い内封率が得られたが、ピペッティングの後タッピングによって混合した際は、核酸水溶液のかさが少ないほど、内封率が低下した（図１９、図２０および図２１参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。１３時間後、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を評価した。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）を１００μＬ加え、５分間振盪し細胞を溶解し、発光量をＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーターで定量した。結果として、ボルテックスミキサーによる攪拌条件下ではｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性の差はみられなかったが、ピペッティングの後タッピングによって混合し、かつ、核酸水溶液のかさが少ない場合はｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性が低下した（図２１参照）。
実施例７　緩衝液の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰ及びＭＣ３をそれぞれ用いた。イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた場合の脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５であり、イオン性脂質としてＭＣ３を用いた場合の脂質組成はモル比で、ＭＣ３：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含むＭＥＳ（ｐＨ５）、フタル酸（ｐＨ５）、マレイン酸（ｐＨ５）、コハク酸（ｐＨ５）、ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ５）、ＤＬ－酒石酸（ｐＨ５）、あるいはクエン酸（ｐＨ５）の緩衝液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、ＭＥＳ、フタル酸、マレイン酸、コハク酸、ＤＬ－リンゴ酸、ＤＬ－酒石酸、あるいはクエン酸の緩衝液すべてでｍＲＮＡが内封され、内封率の差はみられなかった（図２２および図２３参照）。
実施例８　インキュベート温度の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた。脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液またはＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒをスクロース最終濃度０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬあるいは３２０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ５）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて、９５℃、７５℃、５５℃あるいは３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、いずれのインキュベート温度においてもｍＲＮＡは内封され、内封率の差はみられなかった。得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径は、高温でインキュベートをするほど粒子径が大きくなる傾向がみられた（図２４および図２５参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。１３時間後、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を評価した。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）を１００μＬ加え、５分間振盪し細胞を溶解し、発光量をＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーターで定量した。結果として、いずれのインキュベート温度においてもルシフェラーゼタンパク質の導入が確認され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性の差はみられなかった（図２６参照）。
実施例９　インキュベート時間の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた。脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて室温で６０分、３０分、１５分、１０分、５分あるいは１分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。あるいは、比較のため、先に粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）にＰＢＳを１５０μＬ加え、その後に最終濃度が１．５μｇ／３００μＬとなるようにルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（同上）を加えた。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、いずれのインキュベート時間においてもｍＲＮＡは内封され、内封率の差はみられなかった。また、先に粒子溶液にＰＢＳを加えたもの（ＰＢＳ→ｍＲＮＡ）では、低い内封率が得られた（図２７および図２８参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。１３時間後、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を評価した。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）を１００μＬ加え、５分間振盪し細胞を溶解し、発光量をＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーターで定量した。結果として、いずれのインキュベート時間においてもルシフェラーゼタンパク質の導入が確認され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性の差はみられなかった。また、先に粒子溶液にＰＢＳを加えたもの（ＰＢＳ→ｍＲＮＡ）では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性の低下がみられた（図２９参照）。
実施例１０　ｐＨの影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰ、ＳＳ－ＯＣ、ＭＣ３あるいはＤＯＤＡＰを用い、さらにＳＳ－ＯＰあるいはＳＳ－ＯＣを用いた場合はその他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用し、ＭＣ３あるいはＤＯＤＡＰを用いた場合はその他の脂質としてＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰあるいはＳＳ－ＯＣ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰあるいはＳＳ－ＯＣ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。また、使用したＭＣ３あるいはＤＯＤＡＰ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のモル比は５０：１０：３８．５：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、それぞれのｐＨとイオン性脂質の組み合わせの混合物について、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、ＳＳ－ＯＰ、ＳＳ－ＯＣ、ＭＣ３、ＤＯＤＡＰのいずれも、ｐＨ６まで封入され、ｐＨ６．５およびｐＨ７で内封率が低下した（図３０および図３１参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子のうち、ＳＳ－ＯＰを用いて作成した粒子を、ＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。１３時間後、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を評価した。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）を１００μＬ加え、５分間振盪し細胞を溶解し、発光量をＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーターで定量した。結果として、ｐＨ６の時に最も高いｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性を示し、ｐＨ６．５ではやや活性が低下し、その他ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ７では低い活性を示した（図３２参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子のうち、ＳＳ－ＯＰを用いて作成した粒子のＺｅｔａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌを解析した。Ｚｅｔａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌは、それぞれＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５あるいはｐＨ７）を使用し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた電気泳動光散乱法にて測定した。結果として、ｐＨ５、ｐＨ５．５で作成した粒子は、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７で作成した粒子と比べ、低ｐＨ環境下で、より高い値を示した（図３３参照）。
実施例１１　塩濃度の影響
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰおよびＭＣ３をそれぞれ用いた。イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用いた場合の脂質組成はモル比で、ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：７．５：４０：１．５であり、イオン性脂質としてＭＣ３を用いた場合の脂質組成はモル比で、ＭＣ３：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＮａＣｌを０ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭあるいは３００ｍＭ含むＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、それぞれの塩濃度とイオン性脂質の組み合わせの混合物について、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、緩衝液の塩濃度が上昇するとともにｍＲＮＡの内封率が減少する傾向があった（図３４および図３５参照）。
実施例１２　イオン性脂質種の影響
　イオン性脂質としてＬＮ－８１（後記の製造例の化合物３４）を用いた。脂質組成はモル比で、ＬＮ-８１：ＤＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：１７．５：３０：１およびＬＮ－８１：ＤＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝６０：５：３５：１である。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ５．０）２４００μＬおよび脂質のエタノール溶液８００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を３：１、総流速を４ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を３０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　液剤または凍結融解粒子を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含むＭＥＳ（ｐＨ６）の緩衝液（核酸濃度１１．１μｇ／１８０μＬ、１８０μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液１００μＬを分注し、そこへＰＢＳを１０１０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、ｍＲＮＡが内封された（表５参照）。
比較例１　凍結乾燥体の調製方法
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。得られた溶液を、２００μＬずつマイティバイアルへ入れ、凍結乾燥し凍結乾燥体を得た。
　凍結乾燥体を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度２μｇ／２００μＬ、ＤＤＷに溶解）により溶解させた。この混合物を、アルミブロック型インキュベータを用いて９５℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを２００μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
比較例２　凍結乾燥体の調製方法
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。得られた溶液を、２００μＬずつマイティバイアルへ入れ、凍結乾燥し凍結乾燥体を得た。
　凍結乾燥体を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度４μｇ／２００μＬ、ＤＤＷに溶解）により溶解させた。この混合物を、アルミブロック型インキュベータを用いて９５℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを２００μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
比較例３　凍結乾燥体の調製方法
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１６ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。得られた溶液を、２００μＬずつマイティバイアルへ入れ、凍結乾燥し凍結乾燥体を得た。
　凍結乾燥体を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度４μｇ／２００μＬ、ＤＤＷに溶解）により溶解させた。この混合物を、アルミブロック型インキュベータを用いて７５℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを２００μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
試験例１　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を４℃で保管したもの（液剤）あるいは粒子溶液を－８０℃で凍結した後、４℃で融解したもの（凍結融解粒子）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ５）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて９５℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子、あるいは比較例１で作成した凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、液剤および凍結融解したものにおいて、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と同等のｍＲＮＡの内封率が得られた。また、核酸内封ナノ粒子の粒子径は、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と比較して、小さいものが得られた（図１４および図１５参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子あるいは比較例１で作成した凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価したＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとして９６ウェル平底透明プレートへ播種した。得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．０２μｇ／４μＬとなるように添加した。培地中には０．１ｍＭとなるようルシフェリンを添加し、発光量を用いてルシフェラーゼタンパク質の導入量を経時的に評価した。核酸内封ナノ粒子とルシフェリンを含む培地中で培養されたＨｅＬａ細胞をインキュベータ型ルミノメーター（Ｋｒｏｎｏｓ）へ設置し、１時間ごとに２分間の累積発光量を計測した。結果として、液剤および凍結融解したものにおいて、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と比較して、高い核酸導入効率が得られた（図１６および図１７参照）。
試験例２　Ｉｎ　ｖｉｖｏ活性 
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）を４℃で保管したもの（液剤）あるいは粒子溶液を－８０℃で凍結した後、４℃で融解したもの（凍結融解粒子）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度１．５μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ５）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて９５℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子あるいは比較例１で作成した凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、６週齢、メス）に作用させ、肝臓における遺伝子発現活性をＧｌｏＭａｘ　２０／２０　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで評価した。マウスの尾静脈から各核酸内封ナノ粒子を０．０５ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与から６時間後、肝臓を摘出しルシフェラーゼタンパク質の発現量を評価した。結果として、液剤および凍結融解したものにおいて、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と比較して、高い肝臓における遺伝子発現活性がみられた（図１８参照）。
試験例３　Ｉｎ　ｖｉｖｏ活性
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）（液剤）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子、あるいは比較例２、比較例３で作成した凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、液剤において、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と同等のｍＲＮＡの内封率が得られた。また、核酸内封ナノ粒子の粒子径は、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と比較して、小さいものが得られた（図３６および図３７参照）。図３６、図３７および図３８において、脂質ナノ粒子の調製時の総流速が１ｍＬ／分である比較例２を「凍結乾燥(FR=1)」と表示し、総流速が１６ｍＬ／分である比較例３を「凍結乾燥(FR=16)」と表示する。
　得られた核酸内封ナノ粒子あるいは比較例２、比較例３で作成した凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、６週齢、メス）に作用させ、肝臓における遺伝子発現活性をＩＶＩＳ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍで評価した。マウスの尾静脈から各核酸内封ナノ粒子を０．１ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与から６時間後、撮影しルシフェラーゼタンパク質の発現量を評価した。結果として、液剤において、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と比較して、高い肝臓における遺伝子発現活性がみられた（図３８参照）。
試験例４　Ｉｎ　ｖｉｖｏ活性
　イオン性脂質としてＳＳ－ＯＰを用い、さらに、その他の脂質としてＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用した。使用したＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比は５２．５：７．５：４０であり、ＳＳ－ＯＰ、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を用いた。
　酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）２１００μＬおよび脂質のエタノール溶液３００μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液：脂質のエタノール溶液の流量比を７：１、総流速を１ｍＬ／分、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製した。回収物へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を９０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を用いて１５ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って約５００μＬまで濃縮した。以上の操作を２回行い、濃縮で得られた混合物をすべてＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、さらにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）３０００μＬ加えた後、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，５分）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。スクロース溶液を最終濃度１６０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、粒子溶液とした。
　粒子溶液（総脂質２０ｍＭ、１５μＬ）（液剤）を、ルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ　－　（Ｌ－７６０２））を含む溶液（核酸濃度３μｇ／１３５μＬ、バッファー条件ＭＥＳ（ｐＨ６）、１３５μＬ）とボルテックスミキサーによる攪拌条件下で希釈しながら混合し、アルミブロック型インキュベータを用いて３７℃で５分インキュベーションした。インキュベーション後の溶液へＰＢＳを１５０μＬ加え、核酸内封ナノ粒子を得た。
　得られた核酸内封ナノ粒子（液剤）、あるいはマイクロ流路で作成した核酸内封ナノ粒子（ＭＦ）（核酸を含有するＭＥＳバッファー（２０ｍＭ，ｐＨ６．５）と脂質のエタノール溶液を用いて、同じ脂質組成で作成したＬＮＰ）の粒子径、Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｄＩ）、ｍＲＮＡの内封率を解析した。粒子径とＰｄＩはＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を用いた動的光散乱法にて測定した。ｍＲＮＡの内封率はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより測定した。結果として、液剤において、マイクロ流路で作成した核酸内封ナノ粒子と同等のｍＲＮＡの内封率が得られた（図３９参照）。
　得られた核酸内封ナノ粒子（液剤）あるいはマイクロ流路で作成した核酸内封ナノ粒子（ＭＦ）をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、６週齢、メス）に作用させ、各臓器（肝臓、心臓、脾臓、腎臓および肺）における遺伝子発現活性をＩＶＩＳ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍで評価した。マウスの尾静脈から各核酸内封ナノ粒子を０．１ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与から６時間後、解剖後、撮影しルシフェラーゼタンパク質の発現量を評価した。結果として、液剤において、マイクロ流路で作成した核酸内封ナノ粒子と比較して、同等の発現分布がみられた（図４０および図４１参照）。
試験例５　実施例１２の粒子のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性
　実施例１２で得られた核酸内封ナノ粒子あるいは比較例１で作成した凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子をＨｅＬａ細胞に作用させ核酸導入効率を評価した。ＨｅＬａ細胞をＤ－ＭＥＭ培地（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液添加）中で３×１０４ｃｅｌｌｓ／６００μＬとして４８ウェル平底透明プレートへ播種した。翌日、培地にルシフェリンカリウムを添加したあとに、得られた核酸内封粒子を培地中の核酸濃度が０．１２μｇ／６０μＬとなるように添加し、Kronos HTにて２４時間のルシフェラーゼタンパク質の導入量を
評価した。結果として、凍結乾燥技術による核酸内封ナノ粒子と比較して、液剤や凍結融解粒子は高い核酸導入効率が得られた。また、液剤と凍結融解粒子を比較すると、凍結融解粒子の方が、核酸導入効率が高かった。一方、組成としては、ＬＮ-８１：ＤＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５２．５：１７．５：３０：１で作成した液剤が最も高い核酸導入効率を示した（図４２参照）。
イオン性脂質（２）の製造
　表６に、以下の製造例で製造したイオン性脂質の名称と構造を示す。
［製造例１］化合物１の合成
　化合物１を以下の合成経路で製造したが、本発明は、このような合成経路に限定されない。
＜中間体１の合成＞
　４―ヒドロキシフェニル酢酸（７５．０ｇ）およびＰＰＴＳ（１２．４ｇ）をジクロロメタン４００ｇに室温で溶解させ、得られた溶液を１０～２０℃まで冷却した。そこへ、ＤＨＰ（２０７ｇ）をジクロロメタン１００ｇに溶解することによって得られた溶液を滴下により加えた後、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を１０～２０℃に冷却し、ＤＭＡＰ（３０．１ｇ）を加えて、クエンチを行った。クエンチ後の溶液に２－プロパノール５９０ｇを加えた後、１０～２０℃まで冷却した。冷却後の溶液に、４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液９８．８ｇおよびイオン交換水３０７ｇの溶液を滴下により加え、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液をエバポレーターにより濃縮し、ジクロロメタンおよび２－プロパノールを留去した。得られた濃縮物を、クロロホルム７５０ｇで２回洗浄した後、６Ｎ塩酸を加えて、ｐＨ５．０の溶液を得た。得られた溶液を、クロロホルム７５０ｇで２回抽出した後、有機層を、硫酸ナトリウム７５．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、９８．２ｇの中間体１を得た。
＜中間体２の合成＞
　中間体１（１０．２ｇ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィド（９．９９ｇ）およびＤＭＡＰ（１．０６ｇ）をクロロホルム１５３ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（１２．４ｇ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水１０２ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム５．１ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、得られた粗生成物をカラムで精製することで、９．０１ｇの中間体２を得た。
＜中間体３－ａの合成＞
　中間体２（３５０ｍｇ）、ジメチルグリシン塩酸塩（１４４ｍｇ）、トリエチルアミン（１４３ｍｇ）およびＤＭＡＰ（２３．０ｍｇ）をクロロホルム５．２５ｍＬに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（２７０ｍｇ）を加えて室温で２時間反応させた。反応溶液を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）３．５ｇ、７重量％重曹水３．５ｇ、２０重量％食塩水３．５ｇの順に洗浄した後、硫酸ナトリウム１７５ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、３７８ｍｇの中間体３－ａを得た。
＜中間体４－ａの合成＞
　中間体３－ａ（３６３ｍｇ）を３．２７ｇのＴＨＦに溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）１３．１ｇを加えて室温で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム５．４５ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、そのｐＨを６．０に調整した後、ｐＨ調整後の水層をクロロホルム５．４５ｇで抽出した。有機層に硫酸ナトリウム１８０ｍｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１８７ｍｇの中間体４－ａを得た。
＜化合物１の合成＞
　中間体４－ａ（１８７ｍｇ）、２－ヘキシルデカン酸（１２８ｍｇ）およびＤＭＡＰ（１２．０ｍｇ）をクロロホルム２．８１ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（１４４ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水１．８７ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム９３．０ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、得られた粗生成物をカラムで精製することで１５９ｍｇの化合物１を得た。
＜化合物１の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｍ、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、２２Ｈ）、１．６９－１．７５（ｍ、２Ｈ）、２．３６（ｓ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．１９（ｓ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３４－４．４２（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２］化合物２の合成
＜化合物２の合成＞
　中間体４－ａおよび２－デシルドデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物２を合成した。
＜化合物２の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、３４Ｈ）、１．６９－１．７５（ｍ、２Ｈ）、２．３６（ｓ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．１９（ｓ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３４－４．４２（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３］化合物３の合成
＜化合物３の合成＞
　中間体４－ａおよび２－テトラデシルヘキサデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物３を合成した。
＜化合物３の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５０Ｈ）、１．６９－１．７５（ｍ、２Ｈ）、２．３６（ｓ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．１９（ｓ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３４－４．４２（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例４］化合物４の合成
＜中間体３－ｂの合成＞
　４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩を用いたこと以外は製造例１と同様にして、下記式で表される中間体３－ｂを合成した。
＜中間体４－ｂの合成＞
　中間体３－ｂを用いたこと以外は製造例１と同様にして、下記式で表される中間体４－ｂを合成した。
＜化合物４の合成＞
　中間体４－ｂを用いたこと以外は製造例１と同様にして、化合物４を合成した。
＜化合物４の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｍ、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、２２Ｈ）、１．６９－１．８２（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例５］化合物５の合成
＜化合物５の合成＞
　中間体４－ｂおよび２－デシルドデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物５を合成した。
＜化合物５の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、３４Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例６］化合物６の合成
＜化合物６の合成＞
　中間体４－ｂおよび２－ドデシルテトラデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物６を合成した。
＜化合物６の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、４２Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例７］化合物７の合成
＜化合物７の合成＞
　中間体４－ｂおよび２－テトラデシルヘキサデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物７を合成した。
＜化合物７の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５０Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例８］化合物８の合成
＜化合物８の合成＞
　中間体４－ｂおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物８を合成した。
＜化合物８の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例９］化合物９の合成
＜化合物９の合成＞
　中間体４－ｂおよび２－オクタデシルエイコサン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物９を合成した。
＜化合物９の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、６６Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１０］化合物１０の合成
＜中間体５の合成＞
　中間体２（５．１０ｇ）、４－ブロモ酪酸（２．５２ｇ）およびＤＭＡＰ（３３５ｍｇ）をクロロホルム７６．５ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（３．９４ｇ）を加えて２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水５１．０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム２．５５ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、６．０７ｇの中間体５を得た。
＜中間体６－ａの合成＞
　ジエチルアミン（２５８ｍｇ）をＴＨＦ　１．０４ｇに室温で溶解させた。そこへ、中間体５（２３０ｍｇ）をＴＨＦ　７８０ｍｇに溶解することによって得られた溶液を滴下により加えた後、５０℃で１５時間反応させた。反応溶液にクロロホルム３．４５ｇを加えた後、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２．３０ｇ、７重量％重曹水２．３０ｇ、２０重量％食塩水２．３０ｇの順に洗浄した。硫酸ナトリウム１３０ｍｇを加えて脱水した後、硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し１３０ｍｇの中間体６－ａを得た。
＜中間体７－ａの合成＞
　中間体６－ａを用いて製造例１の中間体４－ａと同様の方法で、中間体７－ａを合成した。
＜化合物１０の合成＞
　中間体７－ａおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１の化合物１と同様の方法で、化合物１０を合成した。
＜化合物１０の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．００（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２８－２．６０（ｍ、９Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１１］化合物１１の合成
＜中間体６－ｂの合成＞
　ピペリジンを用いたこと以外は製造例１０と同様にして、下記式で表される中間体６－ｂを合成した。
＜中間体７－ｂの合成＞
中間体６－ｂを用いたこと以外は製造例１０と同様にして、下記式で表される中間体７－ｂを合成した。
＜化合物１１の合成＞
　中間体７－ｂおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１０と同様の合成経路で、化合物１１を合成した。
＜化合物１１の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、６０Ｈ）、１．４５－１．６０（ｍ、４Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２０－２．５０（ｍ、８Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１２］化合物１２の合成
＜中間体６－ｃの合成＞
ジプロピルアミンを用いたこと以外は製造例１０と同様にして、下記式で表される中間体６－ｃを合成した。
＜中間体７－ｃの合成＞
中間体６－ｃを用いたこと以外は製造例１０と同様にして、下記式で表される中間体７－ｃを合成した。
＜化合物１２の合成＞
　中間体７－ｃおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１０と同様の合成経路で、化合物１２を合成した。
＜化合物１２の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９２（ｍ、１２Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、６２Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２８－２．６０（ｍ、９Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１３］化合物１３の合成
＜化合物１３の合成＞
　中間体２と３－（ジメチルアミノ）－２－メチルプロピオン酸塩酸塩を出発原料として用いたこと以外は製造例８と同様の合成経路で、化合物１３を合成した。
＜化合物１３の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．１３（ｄ、３Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６８－１．７８（ｍ、２Ｈ）、２．１８－２．２２（ｍ、７Ｈ）、２．５２－２．７０（ｍ、３Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１４］化合物１４の合成
＜中間体８の合成＞
　３，４―ジヒドロキシフェニル酢酸（３．００ｇ）およびＰＰＴＳ（４４８ｍｇ）をジクロロメタン４０．０ｇに室温で溶解させ、得られた溶液を２０℃まで冷却した。そこへ、ＤＨＰ（７．５０ｇ）を滴下により加えた後、室温で２時間反応を行った。反応溶液を２０℃に冷却し、ＤＭＡＰ（１．０９ｇ）を加えて、クエンチを行った。クエンチ後の溶液に２－プロパノール４７．０ｇを加えた後、１０～２０℃まで冷却した。冷却後の溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３０．０ｇを滴下により加え、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液をエバポレーターにより濃縮し、ジクロロメタンおよび２－プロパノールを留去した。得られた濃縮物を、クロロホルム３０．０ｇで洗浄した後、６Ｎ塩酸を加えて、ｐＨ５．０の溶液を得た。得られた溶液を、クロロホルム３０．０ｇで抽出した後、有機層を、硫酸ナトリウム１．５０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、４．９８ｇの中間体８を得た。
＜中間体９の合成＞
　中間体８（８００ｍｇ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィド（５５０ｍｇ）およびＤＭＡＰ（５８．０ｍｇ）をクロロホルム１２．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（６８４ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水８．００ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム４００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、得られた粗生成物をカラムで精製することで、５３０ｍｇの中間体９を得た。
＜中間体１０－ａの合成＞
　中間体９（５２５ｍｇ）、ジメチルグリシン塩酸塩（１７１ｍｇ）、トリエチルアミン（１６９ｍｇ）およびＤＭＡＰ（２７．０ｍｇ）をクロロホルム７．９０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（３１９ｍｇ）を加えて室温で２時間反応させた。反応溶液を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）５．２５ｇ、７重量％重曹水５．２５ｇ、２０重量％食塩水５．２５ｇの順に洗浄した後、硫酸ナトリウム２５０ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、５５８ｍｇの中間体１０－ａを得た。
＜中間体１１－ａの合成＞
　中間体１０－ａ（５５０ｍｇ）を４．９５ｇのＴＨＦに溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）１９．８ｇを加えて室温で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム８．２５ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、そのｐＨを６．５に調整した後、ｐＨ調整後の水層をクロロホルム８．２５ｇで抽出した。その有機層に硫酸ナトリウム３００ｍｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、５０３ｍｇの中間体１１－ａを得た。
＜化合物１４の合成＞
　中間体１１－ａ（１９０ｍｇ）、オレイン酸（２８９ｍｇ）およびＤＭＡＰ（２４．０ｍｇ）をクロロホルム２．８５ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（２３４ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水１．９０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム１００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで２９１ｍｇの化合物１４を得た。
＜化合物１４の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．６９－１．８３（ｍ、６Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３６（ｓ、６Ｈ）、２．５０－２．５３（ｍ、４Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３４－４．４２（ｍ、４Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．１０－７．１７（ｍ、３Ｈ）
［製造例１５］化合物１５の合成
＜中間体１０－ｂの合成＞
　４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩を用いたこと以外は製造例１４と同様にして、下記式で表される中間体１０－ｂを合成した。
＜中間体１１－ｂの合成＞
　中間体１０－ｂを用いたこと以外は製造例１４と同様にして、下記式で表される中間体１１－ｂを合成した。
＜化合物１５の合成＞
　中間体１１－ｂおよびオレイン酸を用いて製造例１４と同様の合成経路で、化合物１５を合成した。
＜化合物１５の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．６９－１．８３（ｍ、６Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．２６（ｓ、６Ｈ）、２．３３－２．５４（ｍ、４Ｈ）、２．５０－２．５３（ｍ、４Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３４－４．４２（ｍ、４Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．１０－７．１７（ｍ、３Ｈ）
［製造例１６］化合物１６の合成
＜中間体１２の合成＞
　中間体２（５．００ｇ）およびトリエチルアミン（２．７２ｇ）をクロロホルム１２５ｇに室温で溶解させた。得られた溶液に塩化メタンスルホニル（２．３１ｇ）を加えて２５℃で３時間反応させた。反応溶液を７重量％重曹水７５．０ｇで洗浄し、硫酸ナトリウム５．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで４．４２ｇの中間体１２を得た。
＜中間体１３－ａの合成＞
　中間体１２（６００ｍｇ）をジメチルアミン（２．０ｍｏｌ／Ｌ　ｉｎ　ＴＨＦ）５．４０ｇに溶解させ、ＴＢＡＩ（４９．０ｍｇ）を加えて、２５℃で２０時間反応させた。反応溶液にクロロホルム９．００ｇを加え、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）６．００ｇを用いて洗浄し、硫酸ナトリウム３００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、そのろ液をエバポレーターを用いて濃縮し、４７０ｍｇの中間体１３－ａを得た。
＜中間体１４－ａの合成＞
　中間体１３－ａを用いたこと以外は製造例１の中間体４－ａと同様にして、中間体１４－ａを合成した。
＜化合物１６の合成＞
　中間体１４－ａおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１の化合物１と同様の方法で、化合物１６を合成した。
＜化合物１６の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．２５（ｓ、６Ｈ）、２．５２－２．６０（ｍ、３Ｈ）、２．８０（ｔ、２Ｈ）、２．９０（ｔ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３５（ｔ、２Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１７］化合物１７の合成
＜中間体１３－ｂの合成＞
　中間体１２（６００ｍｇ）およびジエチルアミン（７７９ｍｇ）にＴＨＦ　４．２０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にＴＢＡＩ（４９．０ｍｇ）を加えて２５℃で３時間反応させた。反応溶液にクロロホルム９．００ｇを加え、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）６．００ｇを用いて洗浄し、硫酸ナトリウム３００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、そのろ液をエバポレーターを用いて濃縮し、下記式で表される中間体１３－ｂを４７３ｍｇ得た。
＜中間体１４－ｂの合成＞
　中間体１３－ｂを用いたこと以外は製造例１６と同様にして、下記式で表される中間体１４－ｂを合成した。
＜化合物１７の合成＞
　中間体１４－ｂおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１６と同様の合成経路で、化合物１７を合成した。
＜化合物１７の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．０３（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．５３－２．５７（ｍ、５Ｈ）、２．７５－２．８０（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．３５（ｔ、２Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例１８］化合物１８の合成
＜中間体１５－ａの合成＞
　シスタミン二塩酸塩（２２７ｍｇ）、ＤＩＰＥＡ（３９１ｍｇ）およびジメチルグリシン塩酸塩（１４１ｍｇ）をメタノール４．５４ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＤＭＴ－ＭＭ（８３７ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。その後、反応溶液に中間体１（２３９ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。反応溶液を濃縮した後、クロロホルム３．４０ｇを加え、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．０）２．２７ｇ、７重量％重曹水２．２７ｇ、２０重量％食塩水２．２７ｇの順に洗浄した。得られた溶液に硫酸ナトリウム１００ｍｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、７４８ｍｇの中間体１５－ａを粗生成物として得た。
＜中間体１６－ａの合成＞
　中間体１５－ａの粗生成物を用いたこと以外は製造例１の中間体４－ａと同様にして、中間体１６－ａを合成した。
＜化合物１８の合成＞
　中間体１６－ａおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１と同様の合成経路で、化合物１８を合成した。
＜化合物１８の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．７６－２．８２（ｍ、４Ｈ）、２．９５（ｓ、２Ｈ）、３．５０－３．６０（ｍ、６Ｈ）、６．３４（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．５０（ｓ、１Ｈ）
［製造例１９］化合物１９の合成
＜中間体１５－ｂの合成＞
　３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩を用いたこと以外は製造例１８と同様にして、下記式で表される中間体１５－ｂを合成した。
＜中間体１６－ｂの合成＞
　中間体１５－ｂを用いたこと以外は製造例１８と同様にして、下記式で表される中間体１６－ｂを合成した。
＜化合物１９の合成＞
　中間体１６－ｂおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１８と同様の合成経路で、化合物１９を合成した。
＜化合物１９の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．２８（ｓ、６Ｈ）、２．３３－２．３８（ｍ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、３Ｈ）、２．７６－２．８２（ｍ、４Ｈ）、３．５０－３．６０（ｍ、６Ｈ）、６．３４（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．５０（ｓ、１Ｈ）
［製造例２０］化合物２０の合成
＜中間体１５－ｃの合成＞
　４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩を用いたこと以外は製造例１８と同様にして、下記式で表される中間体１５－ｃを合成した。
＜中間体１６－ｃの合成＞
　中間体１５－ｃを用いたこと以外は製造例１８と同様にして、下記式で表される中間体１６－ｃを合成した。
＜化合物２０の合成＞
　中間体１６－ｃおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１８と同様の合成経路で、化合物２０を合成した。
＜化合物２０の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８０（ｍ、４Ｈ）、２．２５－２．３８（ｍ、８Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．７６－２．８２（ｍ、４Ｈ）、３．５０－３．６０（ｍ、６Ｈ）、６．３４（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．５０（ｓ、１Ｈ）
［製造例２１］化合物２１の合成
＜中間体１７－ａの合成＞
　中間体２（３９３ｍｇ）およびトリエチルアミン（２３５ｍｇ）にジクロロメタン７．１０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にＤＳＣ（５４１ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液中に残存したＤＳＣをろ過により除去した後、ろ液にＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（１１２ｍｇ）を加えて、２５℃で１時間反応を行った。反応後の溶液を０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５．９０ｇ、７重量％重曹水５．９０ｇ、２０重量％食塩水５．９０ｇの順で洗浄した後、硫酸ナトリウム２００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、４７２ｍｇの中間体１７－ａを得た。
＜中間体１８－ａの合成＞
　中間体１７－ａを用いたこと以外は製造例１の中間体４－ａと同様にして、中間体１８－ａを合成した。
＜化合物２１の合成＞
　中間体１８－ａおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１の化合物１と同様の方法で、化合物２１を合成した。
＜化合物２１の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．２２（ｓ、６Ｈ）、２．３８－２．４２（ｍ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．２６（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２２］化合物２２の合成
＜中間体１７－ｂの合成＞
　Ｎ，Ｎ－ジエチルエチレンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｂを合成した。
＜中間体１８－ｂの合成＞
　中間体１７－ｂを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｂを合成した。
＜化合物２２の合成＞
　中間体１８－ｂおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２２を合成した。
＜化合物２２の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．００（ｔ、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．４７－２．５７（ｍ、７Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２３］化合物２３の合成
＜中間体１７－ｃの合成＞
　Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｃを合成した。
＜中間体１８－ｃの合成＞
　中間体１７－ｃを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｃを合成した。
＜化合物２３の合成＞
　中間体１８－ｃおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２３を合成した。
＜化合物２３の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．３８－２．４２（ｍ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．７０（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２４］化合物２４の合成
＜中間体１７－ｄの合成＞
　Ｎ，Ｎ，Ｎ’－トリメチル－１，３－プロパンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｄを合成した。
＜中間体１８－ｄの合成＞
　中間体１７－ｄを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｄを合成した。
＜化合物２４の合成＞
　中間体１８－ｄおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２４を合成した。
＜化合物２４の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．３８－２．４２（ｍ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、７Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２５］化合物２５の合成
＜中間体１７－ｅの合成＞
　Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，４－ブタンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｅを合成した。
＜中間体１８－ｅの合成＞
　中間体１７－ｅを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｅを合成した。
＜化合物２５の合成＞
　中間体１８－ｅおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２５を合成した。
＜化合物２５の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．５０－１．６２（ｍ、４Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．２０－２．４２（ｍ、８Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．７０（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２６］化合物２６の合成
＜中間体１７－ｆの合成＞
　４－（２－アミノエチル）モルホリンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｆを合成した。
＜中間体１８－ｆの合成＞
　中間体１７－ｆを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｆを合成した。
＜化合物２６の合成＞
　中間体１８－ｆおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２６を合成した。
＜化合物２６の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．４０－２．４６（ｍ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．２６（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２７］化合物２７の合成
＜中間体１７－ｇの合成＞
　Ｎ，Ｎ－ジブチルエチレンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｇを合成した。
＜中間体１８－ｇの合成＞
　中間体１７－ｇを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｇを合成した。
＜化合物２７の合成＞
　中間体１８－ｇおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２７を合成した。
＜化合物２７の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８７－０．９３（ｍ、１２Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、６６Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．３９－２．５７（ｍ、７Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２８］化合物２８の合成
＜中間体１７－ｈの合成＞
　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチレンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｈを合成した。
＜中間体１８－ｈの合成＞
　中間体１７－ｈを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｈを合成した。
＜化合物２８の合成＞
　中間体１８－ｈおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２８を合成した。
＜化合物２８の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、０．９５－１．０３（ｄ、１２Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６０－１．８４（ｍ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－３．００（ｍ、６Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例２９］化合物２９の合成
＜中間体１７－ｉの合成＞
　Ｎ，Ｎ－ジエチル－Ｎ’－メチルエチレンジアミンを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１７－ｉを合成した。
＜中間体１８－ｉの合成＞
　中間体１７－ｉを用いたこと以外は製造例２１と同様にして、下記式で表される中間体１８－ｉを合成した。
＜化合物２９の合成＞
　中間体１８－ｉおよび２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例２１と同様の合成経路で、化合物２９を合成した。
＜化合物２９の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．００（ｔ、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．４７－２．５７（ｍ、７Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、７Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３０］化合物３０の合成
＜中間体１９の合成＞
　中間体２（５１０ｍｇ）およびＮＰＭ（６７０ｍｇ）にジクロロメタン５．１０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にｐＮＰＣｌ（６９０ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。この反応溶液にＤＭＡＰ（３３．０ｍｇ）および２－（ジメチルアミノ）エタノール（９７６ｍｇ）を加え、２５℃で６時間反応させた。反応後の溶液を０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５．１０ｇ、７重量％重曹水５．１０ｇ、２０重量％食塩水５．１０ｇの順に洗浄した後、硫酸ナトリウム２５０ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、２８７ｍｇの中間体１９を得た。
＜中間体２０の合成＞
　中間体１９を用いたこと以外は製造例１の中間体４－ａと同様にして、中間体２０を合成した。
＜化合物３０の合成＞
　中間体２０および２－ヘキサデシルオクタデカン酸を用いて製造例１の化合物１と同様の方法で、化合物３０を合成した。
＜化合物３０の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．２８（ｓ、６Ｈ）、２．５８－２．６１（ｍ、３Ｈ）、２．９１－２．９４（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２３（ｔ、２Ｈ）、４．３２－４．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３１］化合物３１の合成
＜中間体２１の合成＞
　中間体１８－ｂ（１．００ｇ）、２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン－５－カルボン酸（４４５ｍｇ）およびＤＭＡＰ（５７．０ｍｇ）をクロロホルム１５．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（６６８ｍｇ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水１０．０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム５００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで１．２５ｇの中間体２１を得た。
＜中間体２２の合成＞
　中間体２１（１．２５ｇ）をＴＨＦ　１１．３ｇに溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）４５．０ｇを加えて４０℃で２２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１８．８ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、そのｐＨを６．０に調整した後、水層をクロロホルム１８．８ｇで抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム６００ｍｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、９０８ｍｇの中間体２２を得た。
＜化合物３１の合成＞
　中間体２２（２００ｍｇ）、ミリスチン酸（１７５ｍｇ）およびＤＭＡＰ（１８．０ｍｇ）をクロロホルム３．００ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（１７５ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで１０６ｍｇの化合物３１を得た。
＜化合物３１の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３５（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３２］化合物３２の合成
＜化合物３２の合成＞
　中間体２２およびパルミチン酸を用いて製造例３１と同様の合成経路で、化合物３２を合成した。
＜化合物３２の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３５（ｍ、４８Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３３］化合物３３の合成
＜化合物３３の合成＞
　中間体２２およびステアリン酸を用いて製造例３１と同様の合成経路で、化合物３３を合成した。
＜化合物３３の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３５（ｍ、５６Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３４］化合物３４の合成
＜化合物３４の合成＞
　中間体２２およびオレイン酸を用いて製造例３１と同様の合成経路で、化合物３４を合成した。
＜化合物３４の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、５Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３５］化合物３５の合成
＜化合物３５の合成＞
　中間体２２およびリノール酸を用いて製造例３１と同様の合成経路で、化合物３５を合成した。
＜化合物３５の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、２８Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．７５－２．７８（ｍ、４Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、９Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３６］化合物３６の合成
＜中間体２３の合成＞
　中間体２（２．０ｇ）およびトリエチルアミン（１．２０ｇ）にジクロロメタン３６．０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にＤＳＣ（２．７５ｇ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液中に残存したＤＳＣをろ過により除去した後、ろ液にエタノールアミン（３９４ｍｇ）を加えて、２５℃で１時間反応を行った。反応後の溶液を０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）３０．０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム１．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．４１ｇの中間体２３を得た。
＜中間体２４の合成＞
　中間体２３（１．３５ｇ）およびトリエチルアミン（５９４ｍｇ）をクロロホルム２０．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液に塩化メタンスルホニル（５０５ｍｇ）を加えて室温で３時間反応させた。反応溶液を７重量％重曹水１５．０ｇで洗浄し、硫酸ナトリウム５００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．３４ｇの中間体２４を得た。
＜中間体２５の合成＞
　中間体２（１．３１ｇ）を、ＴＨＦ　１１．８ｇとＩＰＡ　１３．１ｇの混合溶媒に溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）４７．２ｇを加えて４０℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１９．７ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、中和した後、水層にクロロホルム１９．７ｇを加えて抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム３．０ｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、９３９ｍｇの中間体２５を得た。
＜中間体２６の合成＞
　中間体２５（９３０ｍｇ）、２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン－５－カルボン酸（３９３ｍｇ）およびＤＭＡＰ（５０．０ｍｇ）をクロロホルム１５ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（５９０ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水９．３０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム５００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで１．０６ｇの中間体２６を得た。
＜中間体２７の合成＞
　中間体２６（１．００ｇ）をＴＨＦ　９．００ｇとＩＰＡ　９．００ｇの混合溶媒に溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）４０．０ｇを加えて４０℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１５．０ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、中和した後、水層にクロロホルム１５．０ｇを加えて抽出した。有機層に硫酸ナトリウム５００ｍｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、７８５ｍｇの中間体２７を得た。
＜中間体２８の合成＞
　中間体２７（７７０ｍｇ）、オレイン酸（８０２ｍｇ）およびＤＭＡＰ（６６．０ｍｇ）をクロロホルム１１．６ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（６４８ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水８．００ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム２．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで１．１５ｇの中間体２８を得た。
＜化合物３６の合成＞
　中間体２８（２５０ｍｇ）をＴＨＦ　２．５０ｇに溶解させ、２－（メチルアミノ）エタノール（１３７ｍｇ）およびＴＢＡＩ（１７．０ｍｇ）を加えて４０℃で８時間反応させた。その反応溶液にクロロホルム３．７５ｇを加え、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２．５０ｇ、７重量％重曹水２．５０ｇ、２０重量％食塩水２．５０ｇの順に洗浄した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで７９ｍｇの化合物３６を得た。
＜化合物３６の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３０－２．４０（ｍ、７Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、４Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．５８－３．６３（ｍ、４Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、５Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３７］化合物３７の合成
＜化合物３７の合成＞
　中間体２８および３－（メチルアミノ）－１－プロパノールを用いて製造例３６と同様の合成経路で、化合物３７を合成した。
＜化合物３７の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．７２（ｍ、６Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３０－２．４０（ｍ、７Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、４Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．５８－３．６３（ｍ、４Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、５Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３８］化合物３８の合成
＜中間体２９の合成＞
　中間体２（２．００ｇ）、（Ｅ）－４－ブロモクロトン酸（９７４ｍｇ）およびＤＭＡＰ（１３１ｍｇ）をクロロホルム３０．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（１．５４ｇ）を加えて２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水９．０ｍＬで洗浄した後、硫酸ナトリウム２．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、２．２６ｇの中間体２９を得た。
＜中間体３０の合成＞
　中間体２９（２．２５ｇ）を、ＴＨＦ　２０．２３ｇとＩＰＡ　２２．５ｇの混合溶媒に溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）８１．０ｇを加えて４０℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム３４．０ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、中和した後、水層にクロロホルム３４．０ｇを加えて抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム１．００ｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．５１ｇの中間体３０を得た。
＜中間体３１の合成＞
　中間体３０（１．４０ｇ）、２－ヘキサデシルオクタデカン酸（１．８０ｇ）およびＤＭＡＰ（７９．０ｍｇ）をクロロホルム２１．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（９２５ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液をエバポレーターにて濃縮し、中間体３１の粗生成物２．９８ｇを得た。
＜化合物３８の合成＞
　中間体３１の粗生成物５００ｍｇおよびジメチルアミン（２．０ｍｏｌ／Ｌ　ｉｎ　ＴＨＦ）２．３０ｇをＴＨＦ　５．００ｇに溶解させ、ヨウ化カリウム（０．１２　ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１０時間反応させた。不溶物をろ過により除去した後、ろ液にクロロホルム７．５０ｇを加え、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５．００ｇ、７重量％重曹水５．００ｇ、２０重量％食塩水５．００ｇの順に洗浄した。硫酸ナトリウム２５０ｍｇを加えて脱水した後、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで２７０ｍｇの化合物３８を得た。
＜化合物３８の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．２５（ｓ、６Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．０７（ｔ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．９７－６．００（ｍ、１Ｈ）、６．９５－７．０５（ｍ、３Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例３９］化合物３９の合成
＜化合物３９の合成＞
　ジエチルアミンを用いたこと以外は製造例３８と同様にして、化合物３９を合成した。＜化合物３９の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．０３（t、６Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．５０－２．５９（ｍ、５Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２３（ｔ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．９７－６．００（ｍ、１Ｈ）、６．９５－７．０５（ｍ、３Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例４０］化合物４０の合成
＜化合物４０の合成＞
　２－（エチルアミノ）エタノールを用いたこと以外は製造例３８と同様にして、化合物４０を合成した。
＜化合物４０の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．０３（t、３Ｈ）、１．２０－１．４５（ｍ、５８Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、２Ｈ）、２．５０－２．５９（ｍ、５Ｈ）、２．８８－２．９７（ｍ、４Ｈ）、３．２３（ｔ、２Ｈ）、３．５５－３．５８（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２８－４．３８（ｍ、４Ｈ）、５．９７－６．００（ｍ、１Ｈ）、６．９５－７．０５（ｍ、３Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例４１］化合物４１の合成
＜化合物４１の合成＞
　中間体１、４，４’－ジチオビスブタン－１－オールおよび４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩を出発原料として用いたこと以外は、製造例１と同様の合成経路で化合物４１を合成した。
＜化合物４１の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．２０－１．５０（ｍ、６４Ｈ）、１．６９－１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．３５（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５９（ｍ、１Ｈ）、２．５９－２．７０（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、２Ｈ）、４．２２－４．３３（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例４２］化合物４２の合成
＜中間体３２の合成＞
　ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィド（３３．２ｇ）、２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン－５－カルボン酸（２５．０ｇ）およびＤＭＡＰ（３．５０ｇ）をクロロホルム２５０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（４１．０ｇ）を加えて２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水９．０ｍＬで洗浄した後、硫酸ナトリウム２５．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで、２１．８ｇの中間体３２を得た。
＜中間体３３の合成＞
　中間体３２（１０．０ｇ）およびトリエチルアミン（７．１７ｇ）にジクロロメタン１８０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にＤＳＣ（１６．５ｇ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液中に残存したＤＳＣをろ過により除去した後、ろ液にＮ，Ｎ－ジエチルエチレンジアミン（５．００ｇ）を加えて、２５℃で１時間反応を行った。反応後溶液を０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ　４．０）１５０ｇ、７重量％重曹水１５０ｇ、２０重量％食塩水１５０ｇの順で洗浄した後、硫酸ナトリウム５．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１３．１ｇの中間体３３を得た。
＜中間体３４の合成＞
　中間体３３（１３．０ｇ）をＴＨＦ　４９．０ｇに溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）１９５ｇを加えて４０℃で３時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１２０ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、そのｐＨを７．０に調整した後、水層をクロロホルム１９５ｇで抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム６．５０ｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、５．０１ｇの中間体３４を得た。
＜中間体３５の合成＞
　中間体３４（５．００ｇ）、中間体１（６．０１ｇ）およびＤＭＡＰ（５９２ｍｇ）をクロロホルム７５．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（５．８１ｇ）を加えて２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水５０．０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム２．５０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、中間体３５の粗生成物６．２５ｇを得た。
＜中間体３６の合成＞
　中間体３５の粗生成物６．２５ｇをＴＨＦ　５６．３ｇに溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）２２５ｇを加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム９４．０ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、そのｐＨを６．０に調整した後、水層をクロロホルム９４．０ｇで抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム３．００ｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、３．７ｇの中間体３６を得た。
＜化合物４２の合成＞
　中間体３６（５００ｍｇ）、オレイン酸（４３６ｍｇ）およびＤＭＡＰ（３６．０ｍｇ）をクロロホルム７．５０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（３５２ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水５．００ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム２５０ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで４５３ｍｇの化合物４２を得た。
＜化合物４２の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８８（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、５Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）
［製造例４３］化合物４３の合成
＜化合物４３の合成＞
　中間体３６およびミリスチン酸を用いて製造例４２と同様の合成経路で、化合物４３を合成した。
＜化合物４３の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３５（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２（ｓ、１Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
［製造例４４］化合物４４の合成
＜中間体３７の合成＞
　中間体３４（１．６０ｇ）、中間体１（４．１９ｇ）およびＤＭＡＰ（１６５ｍｇ）をクロロホルム２４．０ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（１．９５ｇ）を加えて２５℃で２時間反応させた。反応溶液を２０重量％食塩水１６．０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム５００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで１．８５ｇの中間体３７を得た。
＜中間体３８の合成＞
　中間体３７（４５０ｍｇ）、オレイン酸（２４１ｍｇ）およびＤＭＡＰ（１９．０ｍｇ）をクロロホルム６．７５ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（２２３ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水４．５ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム２．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、中間体３８の粗生成物６７０ｍｇを得た。
＜中間体３９の合成＞
　中間体３８の粗生成物（６７０ｍｇ）をＴＨＦ　４．００ｇとＩＰＡ　４．００ｇの混合溶媒に溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）１６．２ｇを加えて４０℃で３時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１３．５ｇを加えて抽出した後、有機層に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）９．００ｇを加えて洗浄した。洗浄後の有機層に硫酸ナトリウム３００ｍｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで２４０ｍｇの中間体３９を得た。
＜化合物４４の合成＞
　中間体３９（１５０ｍｇ）、ラウリン酸（４１．０ｍｇ）およびＤＭＡＰ（５．０ｍｇ）をクロロホルム２．２５ｇに室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ（５３．０ｍｇ）を加えて２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水１．５０ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウム５０．０ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで１１６ｍｇの化合物４４を得た。
＜化合物４４の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８０－０．９２（ｍ、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、３６Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｔ、２Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．４０（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３６（ｍ、３Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
［製造例４５］化合物４５の合成
＜中間体４０の合成＞
　中間体１８－ｂ（３．００ｇ）およびＮＰＭ（３．４１ｇ）にジクロロメタン３０．０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にｐＮＰＣｌ（３．５１ｇ）を加えて、２５℃で１０時間反応させた。この反応溶液にＤＭＡＰ（１７０ｍｇ）および１，２－イソプロピリデングリコール（７．３７ｇ）を加え、２５℃で８時間反応を行った。反応溶液を７重量％重曹水３０．０ｇ、２０重量％食塩水３０．０ｇの順に洗浄した後、硫酸ナトリウム９．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、カラムで精製することで２．１６ｇの中間体４０を得た。
＜中間体４１の合成＞
　中間体４０（２．１６ｇ）をＴＨＦ　１１．３ｇに溶解させた後、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）４５．０ｇを加えて４０℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１９．０ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、そのｐＨを６．０に調整した後、水層をクロロホルム１９．０ｇで抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム１．２０ｇを加えて脱水し、硫酸ナトリウムをろ過により除去した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、８５０ｍｇの中間体４１を得た。
＜化合物４５の合成＞
　中間体４１およびオレイン酸を用いたこと以外は、製造例４２と同様の合成経路で化合物４５を合成した。
＜化合物４５の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３８（ｍ、４０Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．５０（ｍ、８Ｈ）、５．２８－５．３８（ｍ、６Ｈ）、６．９７－７．００（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［製造例４６］化合物４６の合成
＜化合物４６の合成＞
　中間体４１およびミリスチン酸を用いたこと以外は、製造例４２と同様の合成経路で化合物４６を合成した。
＜化合物４６の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８９（t、６Ｈ）、１．０４（ｔ、６Ｈ）、１．２５－１．３５（ｍ、３２Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．５５－１．６５（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｔ、４Ｈ）、２．５２－２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９２－２．９６（ｍ、４Ｈ）、３．２２－３．２６（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、２Ｈ）、４．３０－４．５０（ｍ、８Ｈ）、５．２８－５．３１（ｍ、２Ｈ）、６．９７－７．００（ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、２Ｈ）
［比較例］Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の合成
　特許文献３の製造例３に記載の合成経路にて合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ０．８８（ｔ、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４６Ｈ）、１．５４－１．７６（ｍ、１２Ｈ）、１．９４－２．０３（ｍ、１２Ｈ）、２．５２－２．５６（ｍ、４Ｈ）、２．６２－２．６６（ｍ、４Ｈ）、２．８０－２．８９（ｍ、８Ｈ）、３．５９（ｓ、４Ｈ）、４．１３（ｔ、４Ｈ）、５．３４－５．３７（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）
　本発明によると、高効率で核酸を細胞内へ導入することが可能であるので、核酸医薬や遺伝子治療、生化学実験に有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０２２－０５１９１３を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　以下の工程を含む、核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
    ａ)イオン性脂質、ステロールおよびPEG脂質を含むアルコール溶液とｐＨ１～６．５に緩衝作用を有する酸性緩衝液を混合し、核酸を含まない脂質ナノ粒子の懸濁液を調製する工程、および
    ｂ)工程aで得られた脂質ナノ粒子の懸濁液を凍結乾燥することなく、核酸を含み、任意にアルコール０～２５ｖ／ｖ％を含む水溶液と混合し、任意に混合物を０～９５℃で０～６０分間インキュベートして、核酸内封脂質ナノ粒子を得る工程。
  2. 　工程bの後に以下の工程ｃを含む、請求項１に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
    ｃ)透析、限外ろ過または希釈によって、得られた核酸内封脂質ナノ粒子の外水相を中性緩衝液に交換する工程。
  3. 　工程aにおいて、核酸を含まない脂質ナノ粒子を－８０～０℃で凍結後、０～９５℃で融解する工程をさらに含む請求項１又は２に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法。
  4. 　工程aにおいて、脂質ナノ粒子の懸濁液の調製後に透析、限外ろ過または希釈によって、外水相をｐＨ１～６．５に緩衝作用を有する別の酸性緩衝液に交換する工程をさらに含む請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法。
  5. 　工程aにおいて、アルコール溶液がリン脂質をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法。
  6. 　イオン性脂質が式（１）で表される化合物である請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
    （式（１）中、
    　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
    　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
    　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
    　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
    　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（３）：
    　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（３）
    　（式（３）中、
    　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
    　　ａは２～１０の整数を表す。）
    で表される基を表す。）。
  7. 　イオン性脂質が式（２）で表される化合物である請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法：
    （式中、
    　Ｘは、３級窒素を一つ以上含む含窒素脂肪族基を表し、
    　Ｒ１は、炭素数が８以下の脂肪族炭化水素基を表し、
    　Ｌ１は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、Ｎ－アルキルカルバメート結合、カーボネート結合またはウレア結合を表し、
    　ｋは、０または１を表し、
    　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して炭素数が２～５のアルキレン基を表し、
    　Ｌ２は、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、カーボネート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　Ｒ２は、炭素数が８以下のアルキレン基を表すか、または存在せず、
    　Ｙは、（ｉ）ヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を一つ以上含み、且つ（ｉｉ）前記２価の基の芳香環上にエステル結合およびカーボネート結合からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む基を有し、且つ（ｉｉｉ）炭素数が１０～３７の脂肪族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基、およびステロール誘導体の残基からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む基を表す。）。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で製造した核酸内封脂質ナノ粒子と細胞とを生体外において接触させる工程を含む、当該核酸を当該細胞内に導入する方法。
  9. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で製造した核酸内封脂質ナノ粒子を生体へ投与する工程を含む、当該核酸を標的細胞内に導入する方法。
  10. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を含む医薬品組成物の製造方法。
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