JP2016510729A - 薬剤のデリバリーのためのジスルフィド化合物 - Google Patents

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Abstract

下記式（Ｉ）の化合物である。この式中、部分 Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、本明細書に定義されている。また、このような化合物および薬剤から形成されるナノコンプレックス、ならびにタンパク質および生還元性化合物から形成されるナノコンプレックスもまた、開示される。

Description

関連出願の参照
本願は、２０１３年２月２８日付で提出された、米国仮出願第６１／７７０，６５７号の優先権を主張し、当該出願の内容は参考で本明細書中に引用される。
背景
治療効果を得るために、薬剤を標的部位にデリバリーする必要がある。酵素による分解を受けやすいまたは細胞膜を通過して細胞内の標的に到達できない薬剤をデリバリーすることはチャレンジである。
公知のデリバリー方法としては、標的特異的ベヒクルの使用がある。Place et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 1, e15 (2012)を参照。デリバリーベヒクルの例としては、リポソーム、ポリマー、及び無機ナノ粒子がある。Gonzles-Toro et al., Journal of American Chemical Society, 134, 6964-67 (2012)を参照。しかしながら、これらのベヒクルは、しばしば、毒性があるまたは不十分である。Sun et al., Bioconjugate Chemistry, 23, 135-40 (2012); and Akinc et al., Molecular Therapy, 17, 872-79 (2009)を参照。
標的部位に薬剤をデリバリーするための有効でかつ安全なベヒクルを開発する必要がある。
要約
本発明は、特定の脂質様化合物が薬剤のデリバリーに使用される有効でかつ安全なベヒクルであるという発見に基づくものである。
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
を有する脂質様化合物を特徴とする。
この式において、親水性頭部であり、必要であれば正に荷電してもよい、Ａは、下記：
であり、この際、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、およびＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり、およびＺは、Ｃ１−Ｃ２０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２４の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、１価のヘテロアリール基、または下記：
であり；Ｒ１およびＲ４は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；Ｒ２およびＲ５は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｃ１−Ｃ２０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；Ｒ３およびＲ６は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；疎水性尾部である、下記：
およびやはり疎水性尾部である、下記：
は、８〜２４炭素原子を有し；ならびにリンカーである、Ｘ、およびやはりリンカーである、Ｙは、下記：
であり、この際、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、およびｔは、それぞれ独立して、１〜６であり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、またはＲ５に直接結合する、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ７、およびＬ９は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８、およびＬ１０は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｅであり；Ｖは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ならびにＲｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、およびＲｉは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−１０のオキシ脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基である。
上記脂質様化合物のサブセットとしては、Ａが下記：
であり、ＲａおよびＲａ’が、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；ならびにＺが、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であるものがある。
本発明の脂質様化合物によっては、Ｒ１およびＲ４が、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６（例えば、Ｃ１−Ｃ４）の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６（例えば、Ｃ１−Ｃ４）の２価のヘテロ脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ３の全炭素数が１２〜２０（例えば、１４〜１８）であり、Ｒ５およびＲ６の全炭素数がまた１２〜２０（例えば、１４〜１８）であり、ならびにＸおよびＹが、それぞれ独立して、下記：
であることを特徴とする。
ＸおよびＹの特定の例としては、下記：
があり、この際、ｍは２〜６である。
本明細書において、「脂肪族」ということばは、飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖の、非環状、環状、または多環の炭化水素部分を意味する。例としては、以下に制限されないが、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、及びシクロアルキニレン部分が挙げられる。「アルキル」または「アルキレン」ということばは、メチル、メチレン、エチル、エチレン、プロピル、プロピレン、ブチル、ブチレン、ペンチル、ペンチレン、ヘキシル、ヘキシレン、ヘプチル、ヘプチレン、オクチル、オクチレン、ノニル、ノニレン、デシル、デシレン、ウンデシル、ウンデシレン、ドデシル、ドデシレン、トリデシル、トリデシレン、テトラデシル、テトラデシレン、ペンタデシル、ペンタデシレン、ヘキサデシル、ヘキサデシレン、ヘプタデシル、ヘプタデシレン、オクタデシル、オクタデシレン、ノナデシル、ノナデシレン、イコシル、イコシレン、トリアコンチル(triacontyl)、及びトリアコンチレン(triacotylene)などの、飽和の、直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を意味する。「アルケニル」または「アルケニレン」ということばは、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３及び-ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−などの、少なくとも１つの２重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を意味する。「アルキニル」または「アルキニレン」ということばは、下記：
などの、少なくとも１つの３重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を意味する。「シクロアルキル」または「シクロアルキレン」ということばは、シクロヘキシル及びシクロヘキシレンなどの、飽和の環状の炭化水素部分を意味する。「シクロアルケニル」または「シクロアルケニレン」ということばは、シクロヘキセニル、シクロヘキセニレンなどの、少なくとも１つの２重結合を含む非芳香族の環状の炭化水素部分を意味する。「シクロアルキニル」または「シクロアルキニレン」ということばは、シクロオクチニル及びシクロオクチニレンなどの、少なくとも１つの３重結合を含む非芳香族の環状の炭化水素部分を意味する。
「ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic)」ということばは、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ、及びＧｅから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を有する脂肪族部分を意味する。
本明細書における「オキシ脂肪族」ということばは、−Ｏ−脂肪族を意味する。オキシ脂肪族の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられる。
本明細書における「アリール」ということばは、Ｃ６単環、Ｃ１０２環、Ｃ１４３環、Ｃ２０４環、またはＣ２４５環の芳香環系を意味する。アリール基の例としては、フェニル、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、アントラセニル、アントラセニレン、ピレニル、及びピレニレンが挙げられる。本明細書における「ヘテロアリール」ということばは、１以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＳｅなど）を有する芳香族の５〜８員の単環系、８〜１２員の２環系、１１〜１４員の３環系、及び１５〜２０員の４環系を意味する。ヘテロアリール基の例としては、フリル、フリレン、フルオレニル、フルオレニレン、ピロピル、ピロリレン、チエニル、チエニレン、オキサゾリル、オキサゾリレン、イミダゾリル、イミダゾリレン、ベンズイミダゾリル、ベンズイミダゾリレン、チアゾリル、チアゾリレン、ピリジル、ピリジリレン、ピリミジニル、ピリミジニレン、キナゾリニル、キナゾリニレン、キノリニル、キノリニレン、イソキノリニル、イソキノリニレン、インドリル、及びインドリレンが挙げられる。
特記しない限り、本明細書に記載される脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシ脂肪族、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、置換部分及び非置換部分双方を包含する。シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールに存在しうる置換基としては、以下に制限されないが、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ２−Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンアミノ、アリールスルホンアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルイミノ、アリールイミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンイミノ、アリールスルホンイミノ、ヒドロキシル、ハロゲン(halo)、チオ(thio)、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ(thio)、アリールチオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アシルアミノ、アミノアシル、アミノチオアシル、アミド、アミジノ、グアニジン、ウレイド(ureido)、チオウレイド(thioureido)、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、アシル、チオアシル、アシルオキシ、カルボキシル、及びカルボン酸エステルが挙げられる。一方、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシ脂肪族、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、及びアルキニレンに存在しうる置換基としては、Ｃ１−Ｃ１０アルキルを除く上記すべての置換基がある。シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールはまた、相互に融合していてもよい。
上記脂質様化合物としては、化合物自体、さらには該当する場合にはこれらの塩及び溶媒和物がある。例えば、塩は、アニオンおよび脂質様化合物の正に荷電した基（例えば、アミノ）の間に形成されてもよい。適当なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、トシレート(tosylate)、酒石酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩、及びマレイン酸塩が挙げられる。同様にして、塩は、カチオンおよび脂質様化合物の負に荷電した基（例えば、カルボキシレート）の間に形成されてもよい。適当なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、及びテトラメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムカチオンが挙げられる。脂質様化合物はまた、４級窒素原子を含む上記塩を包含する。溶媒和物は、脂質様化合物および製薬上許容できる溶媒の間に形成されるコンプレックス(complex)を意味する。製薬上許容できる溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが挙げられる。
本発明の他の態様は、製薬上許容できる担体および上記脂質化合物の一つから形成されるナノコンプレックス(nanocomplex)および薬剤(pharmaceutical agent)を含む薬剤組成物に関する。本組成物において、ナノコンプレックスは、５０〜５００ｎｍ（例えば、５０〜３００ｎｍおよび５０〜１８０ｎｍ）の粒径を有し；上記薬剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、サッカリドまたはこれらの組み合わせであり；さらに上記化合物は、非共有相互作用(non-covalent interaction)、共有結合、または双方を介して上記薬剤に結合する。
薬剤組成物における担体は、組成物の活性成分と適合し（好ましくは、活性成分を安定化でき）、処置される患者に有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。１以上の可溶化剤を、活性のあるグリコシド化合物のデリバリーのための製薬賦形剤として使用してもよい。他の担体の例としては、コロイド酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃ １０が挙げられる。
「薬剤」ということばは、病気の医療診断、治療(cure)、処置(treatment)、または予防への使用を対象とした化学物質を意味する。
「小分子」ということばは、オリゴペプチド、オリゴ糖、及びオリゴヌクレオチドなどの、８００ダルトン未満（例えば、５００ダルトン未満）の分子量を有する有機化合物を意味する。
「ペプチド」または「タンパク質」ということばは、天然のまたは非天然のアミノ酸がアミド結合で一緒に連結した、８００ダルトン以上の分子量を有するポリマーを意味する。これらのポリマーは双方とも、化学的に修飾されてもよい。「核酸」ということばは、８００ダルトン以上の分子量を有する、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって一緒に連結したポリマーを意味する。これらのポリマーは双方とも、化学的に修飾されてもよい。タンパク質修飾の例としては、ＰＥＧ化(PEGylation)及び本明細書に包含されるリジン残基のアミン基のカルボキシル化がある。より詳細には、タンパク質またはペプチドのカルボキシル化は、ｃｉｓ−アコニット酸無水物を用いることによってなされうる。Lee et al., Angewandte Chemie International Edition, 48, 5309-12 (2009); Lee et al., Angewandte Chemie International Edition, 49, 2552-55 (2010); およびMaier et al., Journal of the American Chemical Society, 134, 10169-73 (2012)を参照。
「非共有相互作用(non-covalent interaction)」ということばは、非共有結合を意味し、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、及び疎水性相互作用を包含する。
さらに、タンパク質および生還元性化合物(bioreducible compound)から形成されるナノコンプレックス(nanocomplex)を含む薬剤組成物が本発明の概念に含まれる。当該薬剤組成物において、上記ナノコンプレックスは、５０〜５００ｎｍの粒径を有し；上記生還元性化合物は、ジスルフィド疎水性部分(disulfide hydrophobic moiety)、親水性部分、ならびに上記ジスルフィド疎水性部分および上記親水性部分を結合するリンカーを含み；さらに上記タンパク質は、非共有相互作用(non-covalent interaction)、共有結合、または双方を介して上記生還元性化合物に結合する。
特定の実施形態では、ジスルフィド疎水性部分は、１以上の−Ｓ−Ｓ−基および８〜２４炭素原子を含むヘテロ脂肪族基であり；上記親水性部分は、１以上の親水性基および１〜２０炭素原子を含む脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、上記親水性基は、それぞれ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアミノ、テトラアルキルアンモニウム、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート(carboxylate)、カルバメート(carbamate)、カルバマイド(carbamide)、カーボネート(carbonate)、ホスフェート(phosphate)、ホスファイト(phosphite)、スルフェート(sulfate)、スルファイト(sulfite)、またはチオスルフェート(thiosulfate)であり；さらに上記リンカーは、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ１−６のアルキレン、下記：
であり、この際、上記変数は、上記と同様の定義である。
ＸおよびＹの特定の例としては、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ１−Ｃ６のアルキレン、下記：
がある。
本発明の１以上の実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、下記説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。
詳細な説明
本発明の脂質様化合物は、上記式（Ｉ）に示されるように、それぞれ、（ｉ）親水性頭部、Ａ；（ｉｉ）疎水性尾部、Ｒ２−Ｓ−Ｓ−Ｒ３；および（ｉｉｉ）リンカー、Ｘを含む。必要であれば、これらの化合物は、第２の疎水性尾部、Ｒ５−Ｓ−Ｓ−Ｒ６および第２のリンカー、Ｙを含む。
親水性頭部は、１以上の親水性官能基、例えば、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、アミド、エステル、エーテル、カルバメート(carbamate)、カーボネート(carbonate)、カルバマイド(carbamide)、およびホスホジエステルを含む。これらの基は、水素結合を形成でき、必要であれば、正にまたは負に帯電する。
親水性頭部の例としては、下記がある。
他の例としては、Akinc et al., Nature Biotechnology, 26, 561-69 (2008)およびMahon et al., 米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号に記載されるものがある。
疎水性尾部は、ジスルフィド結合及び８〜２４炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖の、非環状または環状の、芳香族または非芳香族の炭化水素部分である。炭素原子の１以上が、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ、及びＧｅ等の、ヘテロ原子に置換されてもよい。尾部は、必要であれば、要約の項に記載される１以上の基で置換されてもよい。このジスルフィド結合を有する脂質様化合物は生還元性(bioreducible)でありうる。
例としては、下記がある。
リンカーについては、リンカーは、親水性頭部及び疎水性尾部を連結する。リンカーは、親水性または疎水性、極性または非極性である化学基、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、アミノ、アルキレン、エステル、アミド、カルバメート(carbamate)、カルバマイド(carbamide)、カーボネート(carbonate)、ホスフェート(phosphate)、ホスファイト(phosphite)、スルフェート(sulfate)、スルファイト(sulfite)、またはチオスルフェート(thiosulfate)であってもよい。例としては、下記がある。
本発明の具体的な脂質様化合物を下記に示す。
本発明の脂質様化合物は、当該分野において既知の方法によって調製できる。Wang et al., ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012); Manoharan, et al., 国際特許出願公開 ＷＯ ２００８／０４２９７３号；およびZugates et al., 米国特許第８，０７１，０８２号を参照。
以下に示される経路により、これらの脂質様化合物の合成を例示する。
Ｌａ、Ｌａ’、Ｌｂ、及びＬｂ’は、それぞれ、Ｌ１−Ｌ１０の１つであってもよい；Ｗａ及びＷｂは、それぞれ独立して、ＷまたはＶである；さらに、ＲａおよびＲ１〜Ｒ６、ならびにＬ１〜Ｌ１０、Ｗ、及びＶは、上記と同様の定義である。
上記具体的な合成経路において、アミン化合物、即ち、化合物Ｄは、臭化物、Ｅ１及びＥ２と反応して、化合物Ｆを形成し、その後、この化合物ＦをＧ１およびＧ２双方とカップリングして、最終産物、即ち、化合物Ｈを得る。この化合物（上記に示す）中の２重結合の一方または双方を１つまたは２つの１重結合に還元して、本発明の異なる脂質様化合物を得てもよい。
本発明の他の脂質様化合物は、上記合成経路や当該分野において知られている他の経路を介して他の適当な出発材料を用いて調製されてもよい。上記方法は、脂質様化合物を最終的に合成するために適当な保護基を付加するまたは除去する別の工程を含んでもよい。加えて、様々な合成工程を別の配列(sequence)または順番(order)で行って、所望の材料を得てもよい。適用できる脂質様化合物を合成するのに使用できる合成化学変換及び保護基法(synthetic chemistry transformations and protecting group methodologies)（保護および脱保護）は、当該分野において知られており、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (2ndEd., VCH Publishers 1999); P. G. M. Wuts and T. W. Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis (4thEd., John Wiley and Sons 2007); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (2nd ed., John Wiley and Sons 2009)およびこれに続く版がある。
特定の脂質様化合物は、非芳香族２重結合及び１以上の不斉中心を有していてもよい。ゆえに、当該化合物は、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシス−またはトランス−異性体として存在してもよい。すべてのこのような異性体が包含される。
上述したように、これらの脂質様化合物は、薬剤のデリバリーに有用である。これらの化合物は、インビトロアッセイによって薬剤をデリバリーする際の有効性について予めスクリーニングされた後、動物実験及び臨床試験によって確かめられることができる。また、他の方法は当業者には明らかであろう。
いずれかの理論に拘束されないが、本脂質様化合物は、コンプレックス、例えば、ナノコンプレックスや微粒子を形成することによって薬剤のデリバリーを促進する。このような脂質様化合物の親水性頭部は、正にまたは負に帯電して、反対の電荷を有する薬剤の部分に結合し、その疎水性部分が薬剤の疎水性部分に結合する。いずれかの結合は、共有結合または非共有結合であってもよい。
上記コンプレックスは、Wang et al., ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012)等の文献に記載の方法を用いて調製できる。通常、コンプレックスは、脂質様化合物及び薬剤を、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）等の緩衝液中でインキュベートすることによって得られる。
さらに、本発明は、有効量の上記コンプレックス（例えば、ナノコンプレックス）を必要とする患者に投与する方法を包含する。「有効量」とは、処置される患者に治療効果を与えるのに必要なコンプレックスの量を意味する。有効量は、当業者には認識されるように、処置される病気のタイプ、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療のための処置との併用の可能性によって、異なるであろう。
本発明の方法を実施するために、上記コンプレックスを含む組成物を、非経口で、経口で、経鼻的に、直腸内に、局所的に、または口腔に投与できる。本明細書中で使用される「非経口」ということばは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、さらには適当な輸注技術を意味する。
滅菌注射用組成物は、１，３−ブタンジオールにおける溶液等の、非毒性の非経口で許容できる希釈剤または溶剤における溶液または懸濁液であってもよい。使用できる許容できるベヒクルや溶剤の中には、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、固定油が、溶剤または懸濁媒体として従来使用される（例えば、合成モノまたはジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の、脂肪酸が、注射剤の調製に使用でき、特にポリオキシエチレン化された型の、オリーブ油またはヒマシ油等の、天然の製薬上許容できる油もまた同様にして使用できる。また、これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤を含んでもよい。ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）若しくはスパン（Ｓｐａｎ）等の他の一般的に使用される界面活性剤または製薬上許容できる固体、液体、または他の投与形態の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤若しくはバイオアベイラビリティ促進剤もまた、配合目的で使用されうる。
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンならびに水性懸濁液、分散液および溶液などの経口投与が許容できる投与形態であってもよい。錠剤の場合には、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウム等の滑剤もまた一般的に添加される。カプセル形態での経口投与では、使用できる希釈剤としては、ラクトースや乾燥コーンスターチがある。水性懸濁液またはエマルジョンを経口投与する場合には、活性成分を乳化剤または懸濁化剤と組み合わせて油相中に懸濁または溶解することができる。必要であれば、特定の甘味剤、風味剤、または着色剤を添加してもよい。
鼻エアロゾルまたは吸入用組成物を、製剤処方の分野で既知の技術に従って調製してもよい。例えば、このような組成物を、ベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを促進するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該分野において既知の他の可溶化剤若しくは分散剤を用いて、生理食塩水における溶液として調製してもよい。
また、コンプレックスを含む組成物を、直腸投与用の坐剤の形態で投与してもよい。
下記特定の実施例は、単に詳細に説明するものであり、何であれ、残りの開示部分を制限するものではないと、解されるべきである。さらなる努力なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、十分本発明を利用できると、考えられる。本明細書に挙げられるすべての公報は、全体を参考で本明細書中に引用される。
実施例１：脂質様化合物の合成
８種の脂質様化合物を下記方法に従って調製した。
５ｍＬのテフロン（登録商標）コーティングされたガラス製スクリュー−トップバイアル(Telfon-lined glass screw-top vial)に、ジスルフィド結合を有するアクリレートを、アミンに１：２．４（アミン：アクリレート）のモル比で添加した。この混合物を９０℃で２日間攪拌した。冷却後、このようにして形成された脂質様化合物を、特記しない限り、精製せずに使用した、必要であれば、これをシリカゲルによるクロマトグラフィーを用いて精製し、プロトン核磁気共鳴によって特性を明らかにした。
上記方法に従って、化合物８０−Ｏ１４Ｂを、下記に示される構造を有する、Ｎ，Ｎ’−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン(N,N’-dimehtylpropane-1,3-diamine)及び２−（デシルジスルファニル）エチルアクリレート(2-(decyldisulfanyl)ethyl acrylate)を用いて調製した。
実施例２：脂質様化合物８０−Ｏ１６Ｂの合成
化合物８０−Ｏ１６Ｂを、２−（ドデシルジスルファニル）エチルアクリレート(2-(dodecyldisulfanyl)ethyl acrylate)（構造を下記に示す）を２−（デシルジスルファニル）エチルアクリレートの代わりに使用する以外は、実施例１に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例３：脂質様化合物８０−Ｏ１８Ｂの合成
化合物８０−Ｏ１８Ｂを、２−（テトラデシルジスルファニル）エチルアクリレート(2-(tetradecyldisulfanyl)ethyl acrylate)（構造を下記に示す）を２−（デシルジスルファニル）エチルアクリレートの代わりに使用する以外は、実施例１に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例４：脂質様化合物８７−Ｏ１４Ｂの合成
化合物８７−Ｏ１４Ｂを、２，２’−（３−アミノプロピルアザンジイル）ジエタノール(2,2'-(3-aminopropylazanediyl)diethanol)（構造を下記に示す）をＮ，Ｎ’−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンの代わりに使用する以外は、実施例１に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例５：脂質様化合物８７−Ｏ１６Ｂの合成
化合物８７−Ｏ１６Ｂを、２，２’−（３−アミノプロピルアザンジイル）ジエタノール(2,2'-(3-aminopropylazanediyl)diethanol)をＮ，Ｎ’−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンの代わりに使用する以外は、実施例２に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例６：脂質様化合物８７−Ｏ１８Ｂの合成
化合物８７−Ｏ１８Ｂを、２，２’−（３−アミノプロピルアザンジイル）ジエタノール(2,2'-(3-aminopropylazanediyl)diethanol)をＮ，Ｎ’−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンの代わりに使用する以外は、実施例３に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例７：脂質様化合物１−Ｏ１６Ｂの合成
化合物１−Ｏ１６Ｂを、Ｎ１，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン(N1,N3-dimethylpropane-1,3-diamine)（構造を下記に示す）をＮ，Ｎ’−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンの代わりに使用する以外は、実施例２に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例８：脂質様化合物１−Ｏ１８Ｂの合成
化合物１−Ｏ１８Ｂを、２−（テトラデシルジスルファニル）エチルアクリレート(2-(tetradecyldisulfanyl)ethyl acrylate)を２−（ドデシルジスルファニル）エチルアクリレートの代わりに使用する以外は、実施例７に記載の全く同じ方法に従って、調製した。
実施例９〜４５：ナノコンプレックス組成物の調製
実施例１〜８のいずれかで調製された脂質様化合物を、１ｍｇ／ｍＬの濃度で酢酸ナトリウム溶液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。必要であれば、コレステロール及び１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)（「ＤＯＰＥ」）をも含ませた。タンパク質またはｓｉＲＮＡを得られた混合物に仕込んで、室温で１５分間インキュベートした。脂質様化合物溶液及びタンパク質またはｓｉＲＮＡの重量比は、６：１、２０：１、または４０：１である。このようにして調製されたナノコンプレックス組成物、即ち、下記組成物９〜３０について、下記実施例４７でインビトロアッセイを行った。
化合物９〜３０を、すべて生還元性(bioreducible)である、本発明のジスルフィド脂質様化合物８０−Ｏ１４Ｂ、８０−Ｏ１６Ｂ、８０−Ｏ１８Ｂ、８７−Ｏ１４Ｂ、８７−Ｏ１６Ｂ、及び８７−Ｏ１８Ｂを用いて、上記方法に従って調製した。これらの組成物及び他の組成物の成分およびこれらの量（μｇ）については下記表参照し、それぞれは脂質様化合物、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びタンパク質（例えば、サポリン）またはｓｉＲＮＡを含む。ただし、下記表には、本発明の組成物３１〜４５および下記比較組成物の成分およびこれらの重量もまた含まれている。比較組成物９’〜３０’は、非生還元性脂質様化合物８０−Ｏ１４、８０−Ｏ１６、８０−Ｏ１８、８７−Ｏ１４、８７−Ｏ１６、及び８７−Ｏ１８を使用した以外は、同様にして調製した。これらの非生還元性化合物の調製は下記に記載する。
組成物３１及び３２は、下記薄膜水和法(thin film hydration method)を用いて調製した。化合物１−Ｏ１６Ｂまたは１−Ｏ１８Ｂ、コレステロール、およびＤＯＰＥを、クロロホルム中で１６：４：１の重量比で混合した後、真空下で蒸発することによって、薄膜が残った。ＰＢＳ中でこの薄膜を再水和することによって、１ｍｇ／ｍＬ濃度の１−Ｏ１６Ｂまたは１−Ｏ１８Ｂの溶液を得た。サポリンを添加した（１−Ｏ１６Ｂまたは１−Ｏ１８Ｂ溶液：サポリン＝１５：１（重量比））。この混合物を室温で１５分間インキュベートした後、ｍＰＥＧ２０００−セラミドＣ１６／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ビオチン(mPEG2000-ceramide C16/DSPE-PEG2000-Biotin)（Avanti Polar Lipidsから購入、重量／重量＝８：１、ＰＥＧ １０重量％の１−Ｏ１６Ｂ、この成分は上記表中に示されていない）を添加した。この混合物を１５分間再インキュベートすることによって、ナノコンプレックス組成物である、組成物３１または３２を得た。化合物１−Ｏ１６Ｂまたは１−Ｏ１８Ｂ、コレステロール、ＤＯＰＥ、およびサポリンの重量比については、上記表参照。このようにして調製されたこれらの２種の組成物について、下記実施例４７に記載のインビボアッセイを行った。
ｍＰＥＧ２０００−セラミドＣ１６／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの代わりに、ｍＰＥＧ２０００−セラミド(mPEG2000-ceramide)を、ならびに、それぞれ、脂質様化合物８０−Ｏ１４Ｂ、８０−Ｏ１６Ｂ、及び８０−Ｏ１８Ｂを使用する以外は、上記方法に従って、組成物３３〜３５を調製した。同様にして、比較組成物３３ａ’−３３ｃ’、３４ａ’−３４ｃ’、及び３５ａ’−３５ｃ’を、サポリンを添加せずに８０−Ｏ１４、８０−Ｏ１６、または８０−Ｏ１８を用いて調製した。これらの組成物について、実施例４７に記載のインビトロアッセイを試験した。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含ませなかった以外は、組成物３３を調製するのに使用した方法に従って、組成物３６を調製した。また、比較組成物３６’は、サポリンを添加しない以外は同様にして調製した。これらの２種の組成物、ならびに下記の９種の組成物３７〜４５及び５種の比較組成物３７’〜４１’について、実施例４７に記載のインビトロ及びインビボアッセイを行った。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を、ＰＥＧが２５重量％の脂質様化合物であるような量で添加する以外は、組成物３３を調製するのに使用した方法に従って、組成物３７を調製した。また、比較組成物３７’を、サポリンを添加しない以外は同様にして調製した。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を、ＰＥＧが４０重量％の脂質様化合物であるような量で添加する以外は、組成物３３を調製するのに使用した方法に従って、組成物３８を調製した。また、比較組成物３８’を、サポリンを添加しない以外は同様にして調製した。
組成物３９を下記方法に従って調製した。化合物８０−１４Ｂ及びコレステロールを、クロロホルム中で１６：４の重量比で混合した後、真空下で蒸発することによって、薄膜が残った。ＰＢＳ中でこの薄膜を再水和することによって、１ｍｇ／ｍＬ濃度の８０−１４Ｂの溶液を得た。サポリンを添加した（８０−１４Ｂ：サポリン＝８：１（重量比））。この混合物を室温で１５分間インキュベートした後、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を添加した（ＰＥＧ １０重量％の８０−１４Ｂ）。この混合物を１５分間再インキュベートすることによって、組成物３９を得た。また、組成物３９’を、サポリンを添加しない以外は同様にして調製した。
コレステロールの代わりに、ＤＯＰＥ（８０−１４Ｂ：ＤＯＰＥ＝１６：１、ｗ／ｗ）を添加した以外は、上記組成物３９を調製するのに使用した方法に従って、組成物４０を調製した。また、比較組成物４０’を、サポリンを添加しない以外は同様にして調製した。
コレステロールを添加しなかった以外は、上記組成物３９を調製するのに使用した方法に従って、組成物４１を調製した。また、比較組成物４１’を、サポリンを添加しない以外は同様にして調製した。
組成物４２を下記方法に従って調製した。化合物８０−１６Ｂ、コレステロール、及びＤＯＰＥを、クロロホルム中で１６：４：１の重量比で混合した後、真空下で蒸発することによって、薄膜が残った。ＰＢＳ中でこの薄膜を再水和することによって、１ｍｇ／ｍＬ濃度の８０−１６Ｂの溶液を得た。ｓｉＲＮＡを添加した（８０−１６Ｂ：ｓｉＲＮＡ＝８：１（重量比））。この混合物を室温で１５分間インキュベートした後、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を添加した（８０−１６Ｂ：ＰＥＧ＝１６：１、ｗ／ｗ）。この混合物を１５分間再インキュベートすることによって、組成物４２を得た。
８０−１６Ｂ及びＰＥＧの割合を１６：１ではなく４：１にした以外は、直前に記載の方法に従って、組成物４３を調製した。
８０−１６Ｂの代わりに、８７−１８Ｂを使用した以外は、組成物４２を調製するのに使用した方法に従って、組成物４４を調製した。
コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含ませなかった以外は、組成物４３を調製するのに使用した方法に従って、組成物４５を調製した。
比較化合物および比較組成物の調製
比較化合物８０−Ｏ１４、８０−Ｏ１６、８０−Ｏ１８、８７−Ｏ１４、８７−Ｏ１６、および８７−Ｏ１８を、テトラデシルアクリレート(tetradecyl acrylate)、ヘキサデシルアクリレート(hexadecyl acrylate)、またはオクタデシルアクリレート(octadecyl acrylate)をジスルファニルアクリレートの代わりに使用した以外は、それぞれ、実施例１〜６に記載の全く同じ方法を用いて、調製した。これらの６種の比較化合物の構造を下記に示す：
これら６種の比較化合物を用いて、上記方法の一つに従って、組成物９’−３０’ ３３ａ’〜３３ｃ’、３４ａ’ 〜３４ｃ’、３５ａ’ 〜３５ｃ’、及び３６’〜４１’を調製し、下記実施例４７に記載の方法に従って試験した。上記表は、これらの組成物に含まれる成分及びこれらの量を示す。
実施例４６：粒径の測定
動的光散乱（ＤＬＳ）アッセイを行って、組成物３３及び３６〜４１ならびにまた比較組成物３３ｂ’及び３６’〜４１’のそれぞれに含まれるナノコンプレックスの粒径を測定した。
１ｍｇ／ｍＬ ナノコンプレックス組成物 約２０μＬを、本測定用にリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で１．２ｍＬに希釈した。
１６種の試験組成物のそれぞれにおいて、粒径は１５０〜４００ｎｍであった。ただし、粒径は、組成物に含まれる成分及びこれらの量を変更することによって調整してもよい。
実施例４７：脂質様化合物のデリバリー効率の評価
実施例１〜６で調製された脂質様化合物について、細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７へのタンパク質、即ち、サポリン（Saponaria officinalis由来、ｐＩ＝９．５）のデリバリー、ならびに細胞系ＧＦＰ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１へのｓｉＲＮＡ、即ち、ｓｉＰＬＫ−１のデリバリーを評価した。
細胞培養
３種の細胞系を、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で１０％ウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを追加したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)（「ＤＭＥＭ」）で培養した。下記タンパク質トランスフェクションアッセイでは、細胞を、トランスフェクションする１日前に、１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるインビトロでのタンパク質のトランスフェクション
タンパク質のデリバリー効率を評価するために、実施例９〜２４で調製した脂質様化合物／タンパク質コンプレックス及び比較組成物９’〜２４’をＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。サポリン濃度は、ＰＢＳにおいて０．１μｇ／２５０μＬであった。脂質様化合物またはサポリンを含まない等容のＰＢＳをコントロールとして使用した。２４インキュベートした後、アマーラブルーアッセイ(Alamar Blue assay)によって細胞の生存率を測定した。全てのトランスフェクション研究を４連で行った。
予想できなかったことに、ジスルフィド脂質様化合物８０−Ｏ１４Ｂ、８０−Ｏ１６Ｂ、８０−Ｏ１８Ｂ、及び８７−Ｏ１６Ｂは、これらの非ジスルフィドのカウンターパート、即ち、８０−Ｏ１４、８０−Ｏ１６、８０−Ｏ１８、及び８７−Ｏ１６に比べて、４研究条件全てにおいて非常により高いサポリンデリバリー効率を示した。より詳細には、組成物１３（８０−Ｏ１４Ｂを含む）、組成物１４（８０−Ｏ１６Ｂを含む）、組成物１５（８０−Ｏ１８Ｂを含む）、及び組成物１６（８７−Ｏ１６Ｂを含む）で処理した細胞は、それぞれ、３２％、９％、１２％、及び３９％の細胞生存率を示した。これに対して、比較組成物１３’（８０−Ｏ１４を含む）、比較組成物１４’（８０−Ｏ１６を含む）、比較組成物１５’（８０−Ｏ１８を含む）、及び比較組成物１６’（８７−Ｏ１６を含む）で処理した細胞は、それぞれ、８０％、５７％、５１％、及び７２％の細胞生存率を示した。
ＭＣＦ−７におけるインビトロでのタンパク質のトランスフェクション
組成物３３〜４１、ならびに比較組成物３３ａ’、３３ｂ’、３３ｃ’、３４ａ’、３４ｂ’、３４ｃ’、３５ａ’、３５ｂ’、３５ｃ’、および３６’〜４１’について、ＭＣＦ−７細胞へのサポリンのデリバリーに関するインビトロ研究を行った。より詳細には、各配合物を、０．０２５〜３μｇ／５０μＬの濃度になるようにＰＢＳで希釈した後、これを１配合物当たり４試験で９６ウェルプレートで調製した細胞にデリバリーした。様々な濃度のサポリンを試験した。ＰＢＳをブランクとした。
細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。ＭＴＴ試薬である３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)をＤＭＥＭ中に０．５ｍｇ／ｍＬになるように希釈して、アッセイ溶液を得た。デリバリー実験用に使用した９６ウェルプレートから培地を吸引した。次に、各ウェルを１５０μＬのＭＴＴアッセイ溶液で満たし、３７℃で４時間インキュベートした。５９０ｎｍの吸光度を読んだ。サポリンを以下のようにしてＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識した。サポリン（１ｍｇ／ｍＬ；２００μＬ）を１００μＬ ＤＭＳＯに溶解した６ｍｇ ＦＩＴＣと混合し、遮光した(protected from light)後、数時間遠心した。このようにして標識されたタンパク質を、サイズ排除カラム(size exclusion column)によりＦＩＴＣ染料と分離した。ＦＩＴＣ−標識サポリン画分を得、吸光度を測定するために０．６７ｍｇ／ｍＬ濃度にまで希釈した。ＩＣ５０値を、細胞の生存率が５０％にまで減少した脂質化合物の濃度として算出した。
予想できなかったことに、組成物３３（８０−Ｏ１４Ｂを含む）、組成物３４（８０−Ｏ−１６Ｂを含む）、及び組成物３５（８０−Ｏ−１８Ｂを含む）は、それぞれ、０．７５μｇ／１００００細胞、０．６μｇ／１００００細胞、及び０．８μｇ／１００００細胞のＩＣ５０を示した。これに対して、比較組成物３３ｂ’（８０−Ｏ１４を含む）、比較組成物３４ｂ’（８０−Ｏ−１６を含む）、及び比較組成物３５ｂ’（８０−Ｏ−１８を含む）は、１μｇ／１００００細胞濃度で細胞毒性を示さなかった。
インビトロでのｓｉＲＮＡデリバリー
ｓｉＲＮＡデリバリー効率を評価するために、実施例２５〜３０で調製した脂質様化合物／ｓｉＲＮＡコンプレックスおよび比較組成物２５’〜３０’を、ＧＦＰ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。製造社の指示に従って調製したＯＰＴＩ−ＭＥＭにおけるｓｉＲＮＡ及びリポフェクタミン２０００(Lipofectamine 2000)（「ＬＰＦ ２０００」、Invitrogenから購入した市販のカチオン性脂質）のコンプレックスを含む、コントロール組成物を使用した。ＧＦＰを発現する細胞の割合（％）を 、フローサイトメトリー(BD FACS caliber)によって評価した。全ての組成物は４連で試験した。
予想できなかったことに、ジスルフィド脂質様化合物８０−Ｏ１６Ｂ、８０−Ｏ１８Ｂ、８７−Ｏ１４Ｂ、及び８７−Ｏ１６Ｂの一つを含む組成物は、それぞれ、４０％以下にまでＧＦＰ発現を阻害した。これに対して、これらの非ジスルフィドのカウンターパートである８０−Ｏ１６、８０−Ｏ１８、８７−Ｏ１４、及び８７−Ｏ１６は、７５％以上でＧＦＰ発現を阻害した。
インビボでの癌の処置
組成物３１（即ち、１−Ｏ１６Ｂ及びサポリンを含む）及び組成物３２（即ち、１−Ｏ１８Ｂ及びサポリンを含む）について、下記方法に従ってインビボでの腫瘍成長阻害を試験した。より詳細には、４Ｔ１−１２Ｂ乳房腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０７細胞／ｍＬの濃度で１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭにおける４Ｔ１−１２Ｂ細胞懸濁液から発生させた。細胞懸濁液のアリコート（１００μＬ）を、４〜６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に注射した。このマウスを、注射から７日後にランダムに４群（処置群でｎ＝７、コントロール群でｎ＝５）に分けた。これらのマウスに、３日毎に尾静脈を介して注射した。処置群では、各マウスに、５．５ｍｇ／ｋｇの１−Ｏ１６Ｂまたは１−Ｏ１８Ｂ及び３３０μｇ／ｋｇのサポリンを注射した。腫瘍容積を３日毎に測定した。
また、１−Ｏ１６Ｂ及び１−Ｏ１８Ｂを含まないＰＢＳ、およびサポリンを、コントロールとして注射した。また、比較研究を、１−Ｏ１６Ｂ及び１−Ｏ１８Ｂを含まないＰＢＳにおけるサポリンを用いて行った。
予想できなかったことに、１６日目に、組成物３１または３２で処置したマウスは、腫瘍サイズが１００ｍｍ３未満であり、これはＰＢＳで処置したマウスのサイズ（即ち、２００ｍｍ３）およびサポリンで処置したマウスのサイズ（即ち、１２０ｍｍ３超）よりかなり小さく；さらに、２２日目では、組成物３２で処置したマウスは、腫瘍サイズが１００ｍｍ３未満であり、これはＰＢＳまたはサポリンで処置したマウスのサイズ（即ち、２５０ｍｍ３超）よりかなり小さかった。
インビボでのｓｉＲＮＡのデリバリー
インビボでのｓｉＲＮＡのデリバリー効率を評価するために、組成物４２〜４５を用いて、下記デリバリーアッセイを行った。上記方法に従って、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)（ＧＡＰＤＨ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、これらの組成物を配合した。
試験動物であるマウスを４群（５匹／群）に分けて、静脈内尾静脈注射により組成物４２、４３、４４、または４５を投与した。コントロール群のマウスには、ＰＢＳを投与した。組織特異的抑制効率および蓄積を、肝臓、肺、及び腎臓組織で試験した。
予想できなかったことに、組成物４２及び４３は肺組織での、組成物４４は肝臓組織での、および組成物４５は腎臓組織での、遺伝子発現を抑制した。より詳細には、組成物４２及び４３で処置したマウスの肺組織では、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡがコントロール群のレベルの３７％及び５６％で発現した；組成物４４で処置したマウスの肝臓組織では、５５％のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが発現した；さらに、組成物４５で処置したマウスの腎臓組織では、２５％のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが発現した。
他の実施形態
本明細書に開示されるすべての特徴は、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価の、または同様の目的に適う別の特徴に置換されてもよい。ゆえに、特記しない限り、開示される各特徴は、一連の等価のまたは同様の特徴の一例であるのみである。
上記説明から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認でき、本発明の概念および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合するように本発明を様々に変更及び修飾することが可能である。したがって、他の実施形態もまた下記特許請求の範囲に含まれる。

Claims (28)

  1. 下記式（Ｉ）：
    ただし、親水性頭部(hydrophilic head)である、Ａは、下記：
    であり、この際、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；さらにＺはＣ１−Ｃ２０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；
    Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２４の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、１価のヘテロアリール基、または下記：
    であり、この際、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＹは、下記定義であり；
    Ｒ１およびＲ４は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；
    Ｒ２およびＲ５は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｃ１−Ｃ２０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；
    Ｒ３およびＲ６は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；
    疎水性尾部である、下記：
    およびやはり疎水性尾部である、下記：
    は、それぞれ、８〜２４炭素原子を有し；さらに
    リンカーである、Ｘ、およびやはりリンカーである、Ｙは、それぞれ独立して、下記：
    であり、この際、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、およびｔは、それぞれ独立して、１〜６であり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｌ１、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ７、およびＬ９は、それぞれ独立して、単結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８、およびＬ１０は、それぞれ独立して、単結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｅであり；さらにＶは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、およびＲｉは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０のオキシ脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基である、
    を有する化合物。
  2. Ａは、下記：
    であり、この際、ＲａおよびＲａ’は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；さらにＺは、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｂは、Ｃ８−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ８−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基、またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；さらに、Ｘは、下記：
    である、請求項２に記載の化合物。
  4. Ｂは、下記：
    であり；Ｒ１およびＲ４は、それぞれ、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；Ｒ５およびＲ６の全炭素数は、１２〜２０であり；ＸおよびＹは、それぞれ独立して、下記：
    である、請求項２に記載の化合物。
  5. Ｂは、Ｃ８−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ８−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸは、下記：
    である、請求項１に記載の化合物。
  6. Ｂは、下記：
    であり；Ｒ１およびＲ４は、それぞれ、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；Ｒ５およびＲ６の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸおよびＹは、それぞれ独立して、下記：
    である、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ４の２価のヘテロ脂肪族基であり；さらにＲ２およびＲ３の全炭素数は、１４〜１８である、請求項１に記載の化合物。
  8. Ｘは、下記：
    である、請求項１に記載の化合物。
  9. Ｘは、下記：
    である、請求項１に記載の化合物。
  10. Ｘは、下記：
    であり、この際、ｍは、２〜６である、請求項１に記載の化合物。
  11. 製薬上許容できる担体および請求項１に記載の化合物から形成されるナノコンプレックス(nanocomplex)および薬剤(pharmaceutical agent)を含み、前記ナノコンプレックスは、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有し；前記化合物は、非共有相互作用(non-covalent interaction)、共有結合、または双方を介して前記薬剤に結合し；さらに前記薬剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはこれらの組み合わせである、薬剤組成物。
  12. Ａは、下記：
    であり、この際、ＲａおよびＲａ’は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；さらにＺは、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  13. Ｂは、Ｃ８−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ８−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸは、下記：
    である、請求項１２に記載の薬剤組成物。
  14. Ｂは、下記：
    であり；Ｒ１およびＲ４は、それぞれ、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；Ｒ５およびＲ６の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸおよびＹは、それぞれ独立して、下記：
    である、請求項１２に記載の薬剤組成物。
  15. Ｂは、Ｃ８−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ８−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸは、下記：
    である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  16. Ｂは、下記：
    であり；Ｒ１およびＲ４は、それぞれ、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；Ｒ５およびＲ６の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸおよびＹは、それぞれ独立して、下記：
    である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  17. Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ４の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１４〜１８である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  18. Ｘは、下記：
    である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  19. Ｘは、下記：
    である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  20. Ｘは、下記：
    であり、この際、ｍは、２〜６である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
  21. ナノコンプレックス(nanocomplex)を含む薬剤組成物であって、前記ナノコンプレックスはタンパク質および生還元性化合物(bioreducible compound)から形成され、前記ナノコンプレックスは、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有し；前記タンパク質は、非共有相互作用(non-covalent interaction)、共有結合、または双方を介して前記生還元性化合物に結合し；さらに前記生還元性化合物は、ジスルフィド疎水性部分(disulfide hydrophobic moiety)、親水性部分、ならびに前記ジスルフィド疎水性部分および前記親水性部分を結合するリンカーを含む、薬剤組成物。
  22. 前記ジスルフィド疎水性部分は、１以上の−Ｓ−Ｓ−基および８〜２４炭素原子を含むヘテロ脂肪族基であり；
    前記親水性部分は、１以上の親水性基および１〜２０炭素原子を含む脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、前記親水性基は、それぞれ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアミノ、テトラアルキルアンモニウム、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート(carboxylate)、カルバメート(carbamate)、カルバマイド(carbamide)、カーボネート(carbonate)、ホスフェート(phosphate)、ホスファイト(phosphite)、スルフェート(sulfate)、スルファイト(sulfite)、またはチオスルフェート(thiosulfate)であり；さらに
    前記リンカーは、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ１−６のアルキレン、下記：
    であり、この際、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、それぞれ独立して、１〜６であり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｌ１、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ７は、それぞれ独立して、単結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；さらにＬ２、Ｌ４、Ｌ６、およびＬ８は、それぞれ独立して、単結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｅであり、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基である、請求項２１に記載の薬剤組成物。
  23. 前記生還元性化合物が、下記式（Ｉ）：
    ただし、Ａは、下記：
    であり、この際、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；さらにＺは、Ｃ１−Ｃ２０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；
    Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２４の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、１価のヘテロアリール基、または下記：
    であり、この際、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＹは、下記定義であり；
    Ｒ１およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；
    Ｒ２およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ２０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基であり；
    Ｒ３およびＲ６は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；
    疎水性尾部である、下記：
    およびやはり疎水性尾部である、下記：
    は、それぞれ、８〜２４炭素原子を有し；さらに
    リンカーである、Ｘ、およびやはりリンカーである、Ｙは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、下記：
    であり、この際、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、およびｔは、それぞれ独立して、１〜６であり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｌ１、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ７、およびＬ９は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８、およびＬ１０は、それぞれ独立して、単結合(bond)、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｅであり；さらにＶは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、およびＲｉは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０のオキシ脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基である、
    を有する化合物である、請求項２２に記載の薬剤組成物。
  24. ＸおよびＹは、それぞれ、Ｃ１−Ｃ６のアルキレンである、請求項２３に記載の薬剤組成物。
  25. ＸおよびＹは、それぞれ独立して、下記：
    である、請求項２３に記載の薬剤組成物。
  26. Ａが、下記：
    であり、この際、ＲａおよびＲａ’は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ１０の１価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；さらにＺは、Ｃ１−Ｃ１０の２価の脂肪族基、Ｃ１−Ｃ１０の２価のヘテロ脂肪族基、２価のアリール基、または２価のヘテロアリール基である、請求項２５に記載の薬剤組成物。
  27. Ｂは、Ｃ８−Ｃ２０の１価の脂肪族基、Ｃ８−Ｃ２０の１価のヘテロ脂肪族基、１価のアリール基、または１価のヘテロアリール基であり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸは、下記：
    である、請求項２６に記載の薬剤組成物。
  28. Ｂは、下記：
    であり；Ｒ１およびＲ４は、それぞれ、Ｃ１−Ｃ６の２価の脂肪族基またはＣ１−Ｃ６の２価のヘテロ脂肪族基であり；Ｒ２およびＲ３の全炭素数は、１２〜２０であり；Ｒ５およびＲ６の全炭素数は、１２〜２０であり；さらにＸおよびＹは、それぞれ独立して、下記：
    である、請求項２６に記載の薬剤組成物。
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