CZ20002713A3 - Činidlo pro přenos nukleové kyseliny citlivé k redukujícím podmínkám, farmaceutické » přípravky obsahující toto činidlo a použití činidla - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nového činidla pro přenos nukleových kyselin do buněk. Toto činidlo se zvláště vyznačuje tím, že obsahuje ' jeden nebo několik disulfidických můstků, které jsou citlivé k ‘ redukujícím podmínkám. Nové činidlo lze použít k přenosu i·. požadované nukleové kyseliny (transfekci) do buněk různých " ; typů in vitro, in vivo nebo ex vivo.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového činidla pro přenos .nukleových kyselin do buněk. Toto činidlo se' zvláště vyznačuje tím, že obsahuje jeden nebo několik disulfidičkých můstků, které jsou citlivé k redukujícím podmínkám. Nové činidlo podle vynálezu lze použít k přenosu požadované nukleové kyseliny do buněk různých typů (transfekci) in vitro, in vivo nebo ex vivo.

. Dosavadní stav techniky

S rozvojem biotechnologie še stává nezbytností možnost účinného přenosu nukleových kyselin do buněk. To se týká jednak přenosu nukleových kyselin in vitro, např. pro přípravu rekombinantních proteinů, tak i pro výzkumné účely pro studium regulace genové exprese, klonování genů nebo mnohé další manipulace s DNA. Týká se to i přenosu nukleových kyselin in. vivo, např. při vytváření transgenních zvířat, pro přípravu vakcín, značící studie a .také při terapeutických postupech., A týká se to i přenosu nukleových kyselin ěx vivo, a sice při transplantacích kostní, dřeně, imunoterapii a dalších metodách, při kterých se přenáší nukleová kyselina do buněk Odebraných z organismu s cílem jejich opětovného podání do organismu.

• · · · ·· · ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · ···. · · · · · · · ·,····'»· o · ·· ·· ·

Různé syntetické vektory dosud, vyvinuté ke zlepšeni přenosu nukleových kyselin strukturní diverzitu, která do buněk vykazují značnou je odrazem skutečnosti, že účinnost těchto vektorů je velmi různá v závislosti na požadované aplikaci a zamýšleném typu buněk. Účinnost je do velké míry závislá na jejich struktuře.

Mezi dosud známými syntetickými vektory zaujímají významné místo .kationtové lipidy. Tyto vektory obsahují .kationtovou · polární' část, která vstupuje do interakce s nukleovou 'kyselinou, a hydrofobní lipidovou část,- která umožňuje, že vytvořený komplex je chráněn od vnějšího média. Jako. příklady .takových vektorů lze uvést: monokationtové lipidy (DOTMA: Lipofectin®), .lipopolyaminy, zejména dioktadecylamidoglycyispermin (DOGS) nebo 5-carboxyspermylamid palmitoylfosfatidyl-etanolaminu (DPPES)’, ' jejichž ' příprava byla--popsána např,. v patentové přihlášce EP '394 lil, nebo jiné kationtové lipidy popsané v patentových přihláškách WO 96/17823 a WO 97/1.8185 (které jsou zde zahrnuty formou odkazu).

. Mnohé ' předchozí studie prokázaly, že kationtové lipidy mají vlastnosti,, které podporují, transfekcí (tj . přenos DNA do buňky). Ale nyní se ukazuje potřeba vyvinout nové kationtové’ lipidy, které by měly další výhodné vlastnosti. Tak. je potřeba získat kationtové lipidy,· které by byly vhodnější pro průnik' přes membránu. Je řada překážek, které brání účinné transfekcí, a patří k nim právě obtížný průnik nukleové. kyseliny biologickou membránou a průnik do buněčných kompartmentů (viz Cellular and Molecular Barriers to Gene Transfer by a Cationic Lipid, Zabner, J. et .al., J. Biol. Chem., 19.95, No. 32, 18997-19007). A právě tento problém řeší .předkládaný vynález.

, ( ' ' ' · ' • · · · • ·· · · · ·'··,♦ ··· · · · · ·· · • ···· 4 9 9 '9 9 9 9 9 9

9 4 4 9 4 9 9 4

49 4 · · · · ·· 4 4

Podstata vynálezu

Předkládaný· vynález se týká nových činidel pro přenos nukleové kyseliny do buněk (transfekčních činidel), která obsahují alespoň jeden kationtový hydrofilní úsek, který jě schopný nekovalentně se vázat s nukleovou kyselinou, a alespoň jeden lipofilni úsek, přičemž tyto úseky jsou navzájem spojeny tzv. rozpěrovým raménkem (spacer), a navíc obsahují alespoň jeden disulfidický můstek umístěný tak, že jeho redukce způsobuje.částečnou degradaci lipofilního úseku, nebo alternativně umístěný tak, že jeho redukce způsobuje separaci činidla, jestliže je symetrické.

Tato, transfekční činidla jsou schopna účinně vytvářet komplexy - s nukléovými kyselinami (komplexovat) působením své kationtové hydrofilní části, přičemž tato interakce vede k silně ’'kondenzaci nukleové kyseliny,' a lipofilni úsek tím, že -pokryje vytvořenou částici lipidovým filmem, umožňuje, že tyto iontové- interakce nejsou .citlivé k vnějšímu prostředí.

-Avšak kromě těchto -vlastností, které jsou nutné k tomu, aby činidla mohla být užita jako vektory, transfekční činidla podle předkládaného vynálezu mají další mimořádně výhodné detergenční vlastnosti, a sice že vytvářejí, v redukujícím buněčném prostředí, díky přítomnosti disulfidického můstku (event. · několika disulfidických můstků), molekuly , typu polyaminových alkylových řetězců,.'' které působí jako destabilizátory membrán. Skutečně, disulfidické můstky jsou schopny ' vytvořit stabilní kovalentní ' vazby v oxidujícím prostředí, které se rozpadají v-redukujícím prostředí podle následujícího schématu:

X-S-S-Y X-SH + HS-Y.

• · • · β

« ti ti ti • · ti «.titi • . ti ti titi ti • ti · ti titi ti • ti ti titi · • titi titi

Tento typ struktury je přítomen např. , v určitých proteinech obsahujících aminokyselinu cystein, .a přispívá tak k vytváření jejich trojrozměrné 'struktury a tudíž k jejich biologické aktivitě. Disulfidické můstky kromě toho -již byly zavedeny do některých chimérických proteinů., zejména do imundtoxinů,.. s cílem připojit tak zaměřovači doménu k aktivní aomene.

Termín redukující prostředí znamená, v předkládané přihlášce vynálezu, přirozené redukující, prostředí, jako je např. intracelulární prostředí, zejména cytoplazma a endosomy. ' Umělé redukující prostředí reprezentujíc! přirozené prostředí je např. médium obsahuj ící' .0,1 až 20 '% dithiotreitolu (DTT). '

Naproti tomu oxidující prostředí .je ,· ve smyslu předkládaného vynálezu jakékoliv prostředí, které je ' v kontaktu s atmosférickým kyslíkem, a^- které ' neobsahuje redukční činidla, jako je- zejména extracelulární prostředí.' Představitelem reprezentujícím oxidující prostředí je např. médium složené' z- 150 mM iso.toničkého roztoku chloridu sodného obsahující. 5 % glukózy. < . . ,

Původce zcela * neočekávaně '' ukázal, že jeden z disulfidických můstků může být vnesen', do syntetického vektoru pro·, přenos nukleových kyselin, zejména kationtového lipidového typu, což·nijak neovlivňuje schopnost komplexovat nukleové kyseliny v neredukujícím prostředí. .Ukázal' také, že vlastnosti těchto činidel vhodnék přenosu nukleových kyselin j sou zachovány, a dokonce zlepšeny. Nevíc vytvořené .komplexy jsou degradovány v redukujícím prostředí, zejména · tedy •v buňce, což. umožňuje generovat molekuly detergentu, a tím zpřístupnit větší množství nukleové kyseliny pro buněčný transkripční mechanismus.

• · · · • ·

Termín detergent v předkládané přihlášce vynálezu znamená jakoukoliv amf.ifilní molekulu, která má tu vlastnost, že se inzeruje do biologických membrán a destabilizuje je. To je důsledkem schopnosti molekul amfifilních detergentů rozrušit membránu · tím, že se vloží do fosfolipidové dvojvrstvy a solubilizují lipidy a proteiny (La Cellule, Ed. Vigot ^ka Décarie, 1988, pp. 581-583).

Další výhoda transfekčniho činidla podle předkládaného vynálezu spočívá .ve- snížené vlastní toxicitě. Skutečně transfekční činidlo tím, že je degradováno v buňce na. úrovni dlsulfidických .můstků, které jsou citlivé k redukujícímu prostředí, neprojevuje toxické účinky, které jsou běžně pozorovány u 'konvenčních přenosových· vektorů. Navíc zlepšení průchodu membránou dovoluje- použití menších dávek komplexu nukleová kyselina/transfekční činidlo, což má příznivý důsledek ve snížení toxicity.' .A nakonec původce také ukázal, že transfekční vlastnosti byly výrazně zlepšeny, když činidlo bylo dostatečně lipofilní· a když bylo použito v dostatečném množství. Zejména bylo ukázáno, že .'jednou -z hlavních výhod zvýšené lipofilnosti činidel podle předkládaného -vynálezu, nebo vložení řetězce odvozeného ze steroidů, je indukce zlepšené odolnosti k séru.

Transfekční činidla podle předkládaného vynálezu mají dva ' typy. struktury, aniž by se to' projevilo na jejich technickém '' účinku. . V prvním případě je struktura reprezentována následujícím schématem:

kationtový hydrofilní —- spacer -^;— lipofilní úsek' úsek <1 · ' . 6 ' ' .V takové struktuře je disulfidický můstek (případně disulfidické můstky) umístěn v lipofilním úseku, takže když je redukován, vytváří se amfifilní molekula .detergentu.

Druhý typ struktury je znázorněn následujícím schéma-tem:

kationtový hydrofilní úsek kationtový hydrofilní· úsek špacer, spacer lipofilní·úsek lipofilní úsek.

j akoukoliv kladný při

V tomto případě je disulfidický můstek (evént. disulfidické můstky) umístěn takovým způsobem, že jeho redukce „ způsobí oddělení dvou symetrických částí činidla, čili mezi dvěma spacery..

Kationtové ' hydrofilní část znamená hydrofilní .molekulu, jejíž celkový náboj je fyziologickém pH, tj . při pH v rozmezí 5 až 8, a která navíc má schopnost vázat se' s '.nukleovou kyselinou. Tato vazba je zejména vazba nekovaleňtního typu, jako jsou např. iontové interakce. Kationtový hydrofilní úsek'přítomný · v činidle pro přenos nukleových · kyselin do buněk podle . předkládaného vynálezů je výhodně'polyamin neb,o polyaminoguanidin.

Ve /výhodném, provedení předkládaného vynálezu kationtový hydrofilní úsek má strukturu odpovídající následujícímu obecnému vzorci;

H₂N

• ·

7. ' kde m je celé číslo větší nebo rovno 2 a 1 je celé číslo větší nebo rovno 1, přičemž m je různé pro různé skupiny uhlíku pro dvě aminové .skupiny. ' Výhodně je m 2 až 6 včetně a l je 1 až 5 včetně. Ještě výhodněji je polyaminový úsek • » · · » · * • · 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

- ' · 9 9 99 .

představován sperminem. '

Další výhodný polyaminový úsek. odpovídá následujícímu obecnému vzorci, který byl popsán v-patentové přihlášce WO 97/18185:

N(CH,)/ ,N kde Ri/. R₂ a · R₃- představují, a to navzájem nezávisle, vodíkový atom nebo· skupinu -.(CH_;) ~-NRR' s q nabývajícím hodnot 1, 2, 3, 4, 5 a ' 6 nezávisle pro různé skupiny R/, R? a R3, a R a R' představují,, a to navzájem nezávisle, vodíkový atom nebo skupinu -(CH₂)q-NH₂ s’q definovaným výše, kde man reprezentují navzájem nezávisle celé číslo nabývající hodnot mezi· 0 a 6/ přičemž když je n větší než 1, -m nabývá odličné hodnoty a R3 se liší od výše'uvedeného obecného vzorce.

Lipofilní⁾úsek přítomný v činidle pro přenos nukleových kyselin do buněk podle předkládaného .-vynálezu obsahuje alespoň jeden mastný alifatický řetězěc a jeden nebo několi dalších, alifatických řetězců, jeden nebo několik derivátů steroidů,.’ přirozený nebo syntetický lipid, nebo volitelně jejich kombinaci, které jsou výhodně schopné vytvořit lamelám!', nebo hexagonální. fáze., Ttyto strukturyj sou charakteristické vzdálenostmi mezi lamelami nebo trubicemi, • • · • ·

Λ ' které jsou závislé na délce mastných aliftických řetězců nebo polární .části lipidu.

Termín mastný alifatický řetězec označuje v předkládané přihlášce vynálezu lineární nebo .rozvětvený alkylový řetězec obsahující 10 až 22 atomů uhlíku, volitelně saturovaný a/nebo fluorovaný. Výhodně obsahuje 12 až 22 atomů uhlíku. Zejména lze uvést alifatické skupiny C_i2, Ci₃,-Cu, Cis', Cis a Cis (alifatické skupiny obsahující 12, 13, 14, 16, 18 a 19 atomů uhlíku, v uvedeném 'pořadí), a zvláště' skupiny (CH₂)i.iCH₃, (CH₂)i₂CH₃ (CH₂)i₃CH₃, and (CH₂)i-CH₃.

Když lipofilní úsek obsahuje steroidové deriváty, jsou tyto .deriváty' vybrány výhodně ze skupiny obsahující cholesterol, kyselinu cholovou a cholestervlamin.·

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu obsahuje lipofilní úsek alespoň dva mastné alifatické·. řetězce. Ještě výhodněji obsahuje'dva nebo tři mastné alifatické řetězce.

V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu lipofilní část sestává ž mastného alifatického řetězce a s-troidivého derivátu. Jestliže činidlopro přenos nukleových kyselin do buněk podle předkládaného- vynálezu má symetrickou strukturu, každá ze symetrických částí molekuly obsahuje alespoň jeden mastný alifatický řetězec.

kationtový hydrofilní useká lipofilní úsek 'jsou spojeny prostřednictvím tzv. rozpěrového raménka (spacer). Toto ro.zpěrové raménko neboli spacer lze popsat, aniž by se tím jakkoliv tato struktura omezovala, jako jakoukoliv kyselou nebo aminovou -skupinu obsahující hydrolyzovatelnou funkci, která je odborníkům známa. Výhodně tento úsek tzv. spaceru obsahuje alifatický nebo aromatický řetězec. Výhodně je spacer vabrán ze skupiny obsahující amidové, karbamátové, eterové nebo éterové skupiny :nebo aromatické kruhy.

·· · 99 999 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 * ······ · · · · ·· '·.

·· ··· ···· • 999 9 9 9 9 . 99 9 9 . transfekční činidlo podle předkládaného vynálezu obsahuje jeden- nebo několik disulfidických můstků. Počet těchto .můstků je. stanoven odborníkem v závislosti , na tom, jakou má činidlo strukturu a. jaké jsou jeho požadované vlastnosti. Výhodně transfekční činidlo obsahuje jeden nebo dva disulfidické můstky, výhodněji jeden disulfidický můstek. Disulfidický můstek (évent. můstky) je v činidle umístěn na různých místech. Jeho . (jejich) poloha závisí - na počtu můstků a na struktuře činidla.

V prvním provedení vynálezu je. disulfidický můstek umístěn tak, ' že jeho redukce způsobí ' částečnou degradaci lipofilního úseku a vede tak ke vzniku amfifilní' molekuly . dete.rgentu v buňce. Tato částečná degradace odpovídá zejména ztrátě alifatického '.řetězce, pokud jich lipofilní úsek obsahuje ' několik, ., nebo alternativně ztrátě řetězce .pocházejícího ze steroidu, pokud lipofilní úsek takový řetězec obsahuje. Ztrátou alifatického mastného řetězce se rozumí buďto kompletní ztráta těchto řetězců nebo jen částečná ztráta, kdy zbývající část je příliš krátká, na to, aby tvořila mastný, řetězec (kratší než 10 atomů uhlíku). Takové poškození zcela ničí integritu komplexu, 'který se pak postupně rozkládá a disoci.uje. na složky, z nichž alespoň jedna je amfifilní' molekula detergentů. degradace komplexu může . být snadno kontrolována .mikroskopicky nebo elektroforézou.

V jiném provedení předkládaného'vynálezu je disulfidický '·. můstek umístěn mezi dvěma raménky, ,tj . spacery, činidla se .symetrickou.'strukturou, takže jeho- redukce způsobí oddělení transfekčního činidla.

Výhodná činidla pro přenos nukleových· kyselin do buněk podle předkládaného vynálezu obsahují:

• · · · . ΙΌ

- polyamin nebo polyaminoguanidin jako kationtový. hydrofilní úsek,

- .alespoň dva mastné alifatické./řetězce nebo alespoň jeden řetězce odvozený ze steroidu a jeden mastný alifatický řetězce jakožto lipofilní úsek, a

-..disulfidický můstek, jehož redukce vede ke ztrátě mastného alifatického řetězce nebo řetězce odvozeného ze steroidu, pokud ho činidlo pbsahuje.

- Ve zvláště' výhodném provedení činidlo pro přenos nukleových kyselin do . buněk podle vynálezu obsahuje polyaminový úsek, ' tři alifatické řetězce z nichž 'alespoň dva jsou mastné-· řetězce, a· disulfidický můstek, který v redukujícím prostředí vede ke ztrátě alifatického řetězce.· další zvláště výhodné transfekční činidlo podle předkládaného.' vynálezu obsahuje polyaminový. úsek, mastný alifatický' řet.ě-zec a řetězce odvozený ze , steroidu,· a disulfidický můstek· vedoucí v redukujícím prostředí- ke ztrátě' řetězce odvozeného ze steroidu.

Dalším zvláště výhodným činidlem' pro přenos nukleových kyselin ' do buněk je činidlo složené . ze dvou symetrických .lipopolyaminů, obsahující disulfidický .můstek, který v .redukujícím prostředí, vede k jejich oddělení.

' Takováto 'činidla jsou. ilustrována pomocí · následujících příkladů. Lze uvést sloučeniny (aniž by byl vynález, jakkoliv omezen pouze na ně) následujících vzorců:

• · · · · ♦ • · - · ·· · • · · · · · ·· • · · ···· · ··

-NH₂(CH2)3NH(CH₂)4NH(CH₂)₃NHCH₂COCys[S-S-(CH₂)4CH5]-N[(éH₂)₁₇CH3j₂:

-NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COCys[S-S-(CH₂)i7CH₃]-NH(CH₂)i7CH₃ :

- NH₂(CH₂)3NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COCys[S-S-(CÉ₂)i jCHsj-NHCCHÚnCHj:

(ΠΙ) ·· ·

Λ · · 9 · · · 9.9 • ······· • 9 · 9

9·9· · ·9 tt 4··9

9 9 9 • 9 ·9 • 1.2

- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2), ₁CH₃]-N[(CH₂)₁₇CH₃]₂:

-NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-Cholesterol]-NH(CH₂)₁₇CH₃:

- [NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCysNH(CH2),₇CH₃]2 :

Η Η II

ο

(VI) ·· ···· «· · • · rt · • ···· · · · · • · · · · ··«· · ·· · • rt ·· • · · · • · · · • · · · • rt· « ·· ··

Další předmět vynálezu se týká·přípravku, který obsahuje transf-ekční činidlo, .které bylo definováno výše, a alespoň jednu nukleovou kyselinu. Výhodně . transfekční činidlo a nukleová kyselina jsou přítomny v takových množstvích, že poměr kladných nábojů činidla a negativních nábojů nukleové kyseliny je 0,1 až 50. Tento poměr může být snadno nastaven odborníkem v závislosti na použitém činidle, nukleové kyselině a typu buněk, které mají být transfekoványVýhodně je tento; poměr 3 až 12 nmol ' činidla podle předkládaného vynálezu na 1 μς nukleové kyseliny, ještě výhodněji 3 až 9 nmol transfekčního činidla podle předkládaného' vynálezu. , na 1 pg nukleové kyseliny.

Termín „nukleová kyselina v - popisu předkládaného vynálezu znamená jak deoxyribonukloevou tak . i ribonukleovou kyselinu'. Mohou to být přirozené nebo umělé sekvence, zejména genomová DNA (gDNA), komplementární DNA (cDNA), mediátorová RNA (mRNA),' transferová 'RNA (tRNA), ribosomová RNA (rRNA), hybridní sekvence nebo syntetické či semisyntetické sekvence,, oligonukleotidy, které jsou modifikované, atd. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, živočišného, rostlinného, bakteriálního- nebo ' virového původu. Lze ' je připravit jakýmikoliv metodami známými 'v oboru, zejména screeningem knihoven, chemickou'' syntézou nebo smíšenými metodami včetně chemických nebo., enzymatických modifikací sekvencí získaných primárně screeningem knihoven. Mohou 'být chemicky modifikovány, to znamená, že to mohou být pseudonukleové kyseliny (PNA) , oligonukleotidy modifikované různými chemickými vazbami (jako je např. fošforothioát nebo metylfosfonát), nebo alternativně oligonukleotidy, které jsou funkcionalizovány, tj . které jsou konjugovány s jednou nebo • · · · · · • · několika molekulami, které máji -odlišné charakteristické vlastnosti.

Pokud se týká- konkrétně - deóxyribonukleových kyselin, mohou to být jednořetězcové nebo dvouřetězcové molekuly, jak dlouhé molekuly tak, - i krátké oligonukleotidy. Výhodně jsou nukleové kyseliny ve formě plazmidů, vektorů, . episomů, expresních kazet apod. Deoxyribonukleové kyseliny nesou geny s terapeutickým využitím, sekvence pro regulaci transkripce nebo replikace,. anti-s.ense - sekvence, které jsou modifikované a jiné,; úseky pro vazbu k' jiným buněčným.složkám a pod ^Výhodně obsahuje nukleová kyselina expresní kazetu obsahující jeden nebo několik genů s terapeutickým využitím, které. .. jsou řízeny jedním nebo několika promotory a terminátory . transkripce, které jsou aktivní, v cílových' buňkách. ' , „Geny s terapeutickým využitím v popisu předkládaného vynálezu jsou zejména jakékoliv geny kódující proteinový produkt mající .terapeutický účinek. . Proteinový' produkt je protein, peptid a pod. Proteinový produkt je homologní , ve vztahu k cílové buňce (tj. produkt, ,který je normálně exprimován v cílové buňce, pokud buňka není v patologickém stavu) .' V takovém případě 'exprese proteinu umožňuje např. zmírnit nedostatečnou expresi v buňce'nebo expresi proteinu,který je nedostatečně aktivní kvůli modifikaci nebo nadměrně exprimovat požadovaný protein („overexprese).' Terapeutický gen může také kódovat mutantu buněčného proteinu, která má zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu apod. Proteinový produkt může být také heterologní ve vztahu k’ pilové buňce. V takovém případě, exprimovaný protein např. poskytuje nebo doplňuje aktivitu, která v buňce chybí, což dovoluje bojovat s patologickým stavem nebo např.' stimulovat imunitní reakci.

0000 • 0 · • ‘ /· · • · 0 • 0000 0 ·· 0000 «0 *·

I 0 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 1 • 0 0 0.0 00 1

0 0 0 0 0 «

0 0 0 ·· deamináza) protein,

K produktům s terapeutickým využitím vhodným . k využití podle předkládaného vynálezu patří, např. enzymy, krevní deriváty, - hormony/ l.ymfokiny (interleukiny, interferony, TNF a ' pod, (viz patent FR -9. 203 120) , . růstové - faktory, neurotřansmiteřy- nebo jejich prekurzory nebo enzymy jejich syntézy, trofické faktory (BDNF, CNTF, NGF, IGF,' GMF, aFGF, bFGF, -NT3,- NT5, HARP/pleiotropin a pod.), dyštrofin nebo minidistrofin_: (viz přihláška . FR -91/11947), CTFR protein asociovaný s cystickou fibrózo.u, nádorový supresorový gen (např. P53, Rb, raplA, DCC, k-rev. a pod., viz přihláška FR 93/04745), geny kódujíc faktory podílející se na krevní koagulaci -(faktory VII', VIII, IX), geny účastnící se reparace DNA, tzv. sebevražedné geny (thymidinkiná.za, cytosingeny pro hemoglobin .nebo jiný- transportní geny odpovídající proteinům zúčastněným v metabolismu lipidů apoíipoproteinového 'typu vybraných ze skupiny obsahující apolipoproteiny Á-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, ,C-III, D, E, F, G, H, ' j a apo(a), metabolické enzymy jako je např. lipoproteinli-páza, jaťerní lipáza, lecitin : cholesterol a-cyltransferáza, hydroxyláza, fosfátidylfosfatáza·' nebo transferu jako je-transferový- protein cholesterolesterů nebo fosfolipidů, HDL-vazebný protein nebo receptor vybraný např. zé. skupiny obsahující LDL receptory, receptory zbytkových chilomikronů a' „scavehger·receptory a pod.

Terapeutické -nukleové kyseliny mohou být také geny nebo anti-šense sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožní kontrolovat expresi- genů nebo transkripci buněčných mRNA. Takové sekvence mohou např. Být transkribovány v cílové buňce do. RNA, která je komplementární k buněčné mRNA a tudíž blokuje translaci do,proteinu, což bylo popsáno v evropském patentu EP 140 308. K terapeutickým genům patří také sekvence

7-alfa-cholesterolproteiny lipidového • ti ti titi titi·· • 'titi ti . ti · • ti ti titi ti ti titititi titi titi • ti tititi •tititi ti titi ti • ti titi ti titi ti • titi ti • ti ti ti ti • titi ti • ti titi kódující ribozymy, které jsou schopné selektivní destrukce .cílové RNA (viz EP 321 201) .

Jak. bylo již ukázáno výše, nukleové kyseliny mohou obsahovat jeden nebo' několik genů · kódujících antigenní peptidy, které jsou schopné indukovat ·imunitní reakci u člověka nebo zvířete. V' takovém’ .specifickém provedení předkládaný vynález umožňuje'produkci vakcín nebo provádění imunoterap.ie. u člověka nebo . zvířete, zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovině. Mohou to být konkrétně antigenní. peptidy specifické pro virus Epstein-Barrové, HIV., virus' hepatitidy B (viz EP 185 573), virus pseudorabies, virus' tvořící syncitia SEV a další viry nebo· specifické pro nádory (viz EP 259- 212) .

Výhodně nukleové ..kyseliny také obsahují sekvence umožňující expresi terapeutických genů a/nebo. genů kódujících .antigenní peptidy v požadovaných buňkách nebo orgánu;.Jsou tc sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za - expresi požadovaného .genu,' pokud jsou tyto sekvence ·. funkční v infikované -buňce. - Také to-. mohou být sekvence odlišného původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů’ nebo dokonce syntetické sekvence). Zejména to jsou promotorové sekvence eukaryotických nebo virových genů. Např. jsou to promotorové, sekvence -'pocházející z genomu buněk, které mají být· infikovány. Podobně to mohou' být -promotorové sekvence pocházející z 'virového genomu. V této souvislosti-- 1 ze jako příklad zmínit promotory genů E1A, MLP, CMV a RSV. Kromě toho, tyto‘expresní sekvence mohou být modifikovány přidáním aktivačních nebo regulačních sekvencí a pod. Promotor' může být indukovatelný,nebo reprimovatelný.

¹ Navíc nukleová kyselina může obsahovat, zejména v poloze „upstréam '(proti směru trásnkripce) od terapeutického genu, signální sekvenci, směrující. syntetizovaný terapeutický .

produkt, do sekretorické dráhy cílově buňky. Signální sekvence je .buďto přirozená signální sekvence terapeutického.produktu nebo to jé jakákoliv jiná funkční, signální sekvence nebo'

Λ i .umělá signální . sekvence. Nukleová kyselina může také obsahovat.signální sekvenci směřující terapeutický produkt do určitého kompartmentu v buňce.. .

Přípravek podle předkládaného' vynálezu' navíc může obsahovat adjuvans schopné kombinace s komplexem tr.ansf ekčního činidla á nukleové kyseliny, které zlepšuje transfekční účinnost. - ·.

V tomto .smyslu přípravky podle' předkládaného vynálezumohou obsahovat jako adjuvans jeden nebo několik neutrálních lipidů. Takové přípravky jsou zvláště výhodné, zejména pokud je poměr kladných nábojů činidla k záporným nábojům nukleové kyseliny nízký. Původce skutečně ukázal, . že ' přidání neutrálních lipidů umožňuje zlepšit vytváření nukleolipidových částic a překvapivě podporuje- pronikání částic do buňky tím, že destabilizuje membránu..

Výhodněji jsou neutrální- lipidy použité v přípravku podle předkládaného vynálezu lipidy· obsahující dva mastné řetězce. , ,

Zvláště výhodné je použití přírodních ' nebo syntetických lipidů, 'které -jsou za . fyziologických podmínek zwitteriontov.é povahy nebo postrádajících.iontový náboj. Takové lipidy jsou vybrány 'ze .skupiny obsahující dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), ^; oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -chole.steryl, -myristoylfosfatidyletanolaminy včetně jejich derivátů, které jsou jednou až třikrát N-metylované, f osphatid.ylglyceroly, .glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (např. zejména galaktocerebrosidy), \

sfingolipidy (např. zejména sfingomyeliny) , nebo asialogangliosidy (např. zvláště asialoGMl a GM2).. Tyto různé • · · · · · • · *· lipidy lze získat buďto syntézou nebo . extrakcí z orgánů (např. z mozku) nebo z vajíček, a sice konvenčními způsoby odborníkům- známými. Konkrétně' např. extrakci neutrálních lipidů lze provést pomočí organických rozpouštědel (viz také Lehninger, Biochemistry).

Původce také ukázal, že bylo zvláště výhodné použití jakožto adjuvans sloučenin' -přímo se podílejících na kondenzaci' nukleových kyselin, jako jsou' látky popsané v patentové přihlášce WO 96/25508.. Přítomnost takových sloučenin v přípravcích pro transfekci založených ' na lipopolyaminech dovoluje výrazně snížit množství činidla, což má příznivé důsledky z toxikologického hlediska, aniž by se však projevilo jakékoliv zhoršení transfekčníúčinnosti. Termín ' sloučenina přímo se podílející .na kondenzaci nukleových' kyselin definuje v popisu předkládaného vynálezu sloučeninu, která .vede ke kondenzaci nukleové kyseliny, ať Přesněji' řečeno, tato sloučenina působí úrovni nukleové kyseliny,- -která je transfekována, nebo se účastní kondenzace na úrovni dalších látek,' které jsou přímo zúčastněny v kondenzaci, nukleové kyseliny. Výhodně působí přímo, na úrovni nukleové kyseliny.Předkondenzačnim činidlem, je zvláště jakýkoliv polykation, např. -polylysin. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu činidlo účastnící se- kondenzace- nukleové .kyseliny je' nebo ' částečně, přímo nebo jinak buďto přímo na z protaminu, histonu, Toto činidlo je také peptidovými jednotkami odvozeno, . zcela nukleolinu a/nebo jejich derivátů, tvořeno, zcela .nebo částečně, (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA), přičemž počet, těchto jednotek může být 2 až 10. Ve. struktuře sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou tyto jednotky opakovat souvisle nebo jinak. Mohou být odděleny spojovacími částmi biochemické povahy, tj.

«I» 9

4 4 • 9 4

4 4 9 4

4

4 9 4 4

9

4

9 '

např. jednou nebo několika aminokyselinami, nebo spojovacími částmi chemické povahy.

Výhodně přípravek podle předkládaného vynálezu obsahuje .0,01 až 20 ekvivalentů adjuvans na jeden - ekvivalent' nukleové kyseliny (hmotnost/hmotnost) a ještě výhodněji 0,5 až 5.

Přípravek podle předkládaného vynálezu může také obsahovat zaměřovači ' prvek, který umožní zamířit komplex nukleové kyseliny k receptorům nebo ligandům na povrchu buňky. Tak.např. přípravek podle předkládaného vynálezu může obsahovat jednu nebo. několik protilátek namířených proti molekulám na buněčném povrchu nebo ligandům membránových receptorů jako insulin, transřerrin, ^: folát nebo jakýkoliv růstový, 'faktor, cytokiny nebo. vitaminy. Výhodně - přípravek podle vynálezu využívá lektány, modifikované . i jiné, k zaměření na konkrétní polysacharidy na buněčném povrchu nebo v sousedství i extracelulární matrix. . Mohou se užít proteiny obsahující RGD jednotku, peptidy obsahující tandem RGD jednotek, cyklické i jiné, a také polylysinové peptidy.

^; Nedávno byly také popsány - přírodní nebo, syntetické ligandové peptidy, které- jsou výhodné -zejména pro svou selektivnost pro specifické buňky, a které podporují internalizaci v těchto buňkách (Bary et al.,- Natu-re Medicine, 2, - 1996, 299-305) . Tato zaměřovači činidla jsou- obecně konjugována s kationtovým transfekčním činidlem.

Předkládaný vynález se také týká jakéhokoliv přípravku popsaného výše, který navíc obsahuje jedno nebo několik jiných činidel pro transfekci nukleových kyselin.- Konkrétně lze např. uvést produkty popsané v patentu EP' 394 111 a v patentových přihláškách WO 96/17823 a WO 97/18185 (které jsou zde zahrnuty formou odkazuj .

Další předmět vynálezu se týká použití činidla, jak je definováno výše, pro-přenos nukleových kyselin do buněk.

« <» • ·

í	• • • ·	• · · · · -: z ··· · · ♦ · · · i » ······ · · * · ·· · • · · · ···· «· · ·-· « ·· ··
Přípravek	obsahuj ící	20 . transfekční	činidlo	podle
předkládaného	vynálezu je	formulován pro	topické,	kutánní,

perorální, ' rektální, •vaginální, ' parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, .trnasdermální, intratracheální nebo intraperitoneální,· případně i. 'jiné, podávání. Výhodně farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu obsahuje vehikulum, které je farmaceuticky přijatelné pro injekční přípravky, zejména pro přímou injekci do požadovaného, orgánu, nebo pro' podávánítopické (na kůži a/nebo sliznici) Je to zejména isotonický sterilní roztok nebo suchý, výhodně lyof i.lizovaný, přípravek, který umožňuje' po přidání . sterilní vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti ' na případu, rekonstituovat injikovatelný roztok. Množství nukleové kyseliny použité pro 'injekci' a také počet dávek se upraví v závislosti na různých parametrech; jako · je. zejména způsob podávání, relevantní patologický stav, - gen, který má být exprimován a požadované trvání léčení. Pokud se týká zvláště způsobu' podávání, může to být\ přímá injekce do tkáně nebo.do krevního oběhu'nebo se může jednat o ošetření buněk 'v kultuře, které jsou poté reimplantovány injekcí nebo transplantací..

i Předkládaný· vynález se navíc týká způsobu přenosu’ nukleových kyselin do buněk, který obsahuje následující ' kroky:

1) ' nukleová kyselina se uvede do kontaktu, s transfekčním • činidlem podle vynálezu, aby se vytvořil ‘ komplex nukleová kyselina/transfekční činidlo,

2) . buňky se přivedou do kontaktu s komplexem vytvořeným podle bodu Ί) . ” .

V takovém případě přípravek .podle předkládaného vynálezu obsahuje jedno nebo . několik transfekčních činidel a/nebo jedno nebo několik adjuvans, přičemž, kroku 1) předchází krok, • · · · ·········* <».······ · · · * ·· · • · · Λ · ·.··· • · ί» · · · -· · · ♦ ·· . ' _χ ’ kdy se jednotlivá různá transfekční činidla přivedou navzájem do kontaktu a/nebo krok, kdy se transfekční činidlo přivede do kontaktu s jedním nebo několika adjuvans.

Činidlo piodle předkládaného vynálezu/komplexy nukleových kyselin se vytvářejí mícháním, v objemových' poměrech, dvou 'roztoků, - kdy jeden obsahuje transfekční činidlo podle předkládaného vynálezu ve · formě micel · nebo hexagonální lamelární fáze, a druhý obsahuje nukleovou kyselinu, která má být trans fekována ,do buněk. Komplexy se vytvářejí během' několika vteřin. . Jsou 'kladně nebo záporně nabity nebo jsou neutrální v závisloti na množství lipidů přidaných k nukleové kyselině (P.itard B. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA., Vol. ^;94,'pp. 14412-14417, prosinec 1997).' Velikost těchto komplexů kolísá ‘ od 50, do 300 nm” v průměru · '(měřeno kvazielastickou difúzí světla nebo transmisní elektronovou mikrosokopií.) . Kromě toho morfologie komplexů, je proměnlivá· s poměrem nábojů· R (poměr kladných nábojů poskytnutých kationtovým lipidem, . k negativním nábojům,nukleové kyseliny). Např. záporně nabité komplexy j'SOU obklopeny molekulami nukleových kyselin. Kladně nabité, komplexy mají kationtové lipidy na, svém povrchu. Pokud jde o neutrální komplexy, ty jsoukoloidně nestálé. Původce ukázal, že bylo možné takové komplexy stabilizovat přidáním neióntového surfaktantu (povrchově aktivního činidla) v dostatečném množství. Výhodné surfaktanty jsou např. zejména poloxamery, ' polyoxyetylenalkoholy,. pol.yoxye-tylennonylfenyléter nebo PEG .(polyetylenglykoly)' s-dendritickou ' benzylpolyéterovou.·hlavou. .

Buňky se přivedou do kontaktu s komplexy tím, že se buňky s komplexy inkubují (při použití in vitro nebo ex vivo) nebo se komplexy injikují do organismu (při použití in vivo). Inkubace se výhodně provádí v přítomnosti např. 0,01 až

• »

1000 pg nukleové kyseliny na 10⁵ buněk. Pro podávání in vivo se užívají dávky nukleové kyseliny 0,01 až '10 mg.

Transfekční činidla podle předkládaného vynálezu jsou zvláště výhodná k přenosu nukleových kyselin do primárních buněk nebo. do buněk zavedených buněčných linií. Mohou to být fibřoblasty, svalové 'buňky, ·. · nervové buňky (neurony, astrocyty, gliové buňky), jaterní buňky, buňky hematopoeze (lymfocyty, CD34, -dendritické buňky a další) , epitelové buňky a další typy buněk v'diferencované nebo pluripotentní formě (prekurzory). .

Předkládaný vynález poskytuje zvláště výhodný 'způsob . í· ’ léčení nemocí, .který obsahuje in vivo, ex vivo nebo in vitro podávání nukleových' kyselin, které jsou 'Schopné upravit léčenou nemoc, v kombinaci se . sloučeninou podle předkládaného vynálezu. Tento · způsob je zvláště využitelný v případě nemocí, které jsou ·důsledkem nepřítomnosti nebo nedostatku proteinu -nebo produktu nukleové kyseliny. Podávaná nukleová kyselina kóduje požadovaný proteinový produkt nebo obsahuje požadovanou nukleovou kyselinu.,'

- Kromě výše uvedeného předkládaný vynález má •další vlastnosti a výhody, které vyplynou z dále uvedených výkresů a příkladů. Jak výkresy tak i příklady jsou uvedeny jako ilustrace pro lepší vysvětlení· vynálezu a- předmět vynálezu nijak neomezují. Původce uvádí různé postupy a reakční meziprodukty pro- přípravu činidla podle předkládaného vynálezu,, aniž by však byl jimi. vynález omezen. Samozřejmě odborník na.základě inspirace poskytnuté popsanými postupy nebo'meziprodkty je schopen odvodit analogické metody vedoucí 'ke. stejným sloučeninám.

♦ · • ftft ftftft ftft··.

'»«····· ·· ·· ·· · • · ftftft ftftftft ftft»· · ftft · ft-ft ftft . ,

Popis obrázků '

Obr., i: Křivka reprezentuje profil' solubilizace liposomů .EPC/EPA (10:1) Tritonem X-100 .měřený turbiditou roztoku pomocí spektrofotometru. Osa x představuje množství přidaného Tritonu X-100 v mM. Absorbance roztoku obsahujícího liposomy je uvedena- na ose y. . · Obr. 2:: Křivka reprezentuje profil solubilizace'liposomů EPC/EPA (10:1) sloučeninou (VII) měřený turbiditou roztoku pomocí spektrofotometru. Osa x představuje množství přidané sloučeniny VII v mM) Absorbance roztoku obsahujícího liposomy -je uvedena na ose y. .'

Obr. 3: Aktivita tránsfekce při použití- sloučeniny VI do buněk HepG2 v nepřítomnosti séra, ve srovnání s kationtovým lipidem podle vzorce:. \ .

Η₂Ν(ΟΗ₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) sNHCHzCOGly [ (CH₂) ₁₇CH₃] 2/ použitým jako referenční tránsfekční -činidlo- (označené .REF v dalším popisu vynálezu).

Obr. 4: Aktivita tránsfekce při^; použití sloučeniny I a IV do buněk' HepG2. a HeLa, v přítomnosti či nepřítomnosti séra, v porovnání.s referenčním kationtovým. lipidem REF.

Obr. 5: Histogram reprezentující aktivitu in vitro přenosu do. HeLa buněk - při použití sloučeniny I bez lipidů (ko-lipidů) nebo- ' alternativně v přítomnosti DOPE nebo cholesterolu, jako ko-lipidu. Osa y. reprezentuje expresi luciferázy v pg na jednu j,amku. Osa x ukazuje poměr sloučenina (I)/DNA v nmol/dg DNA.

• ftftft * • ft ftftftft ·· ·· • · · ftft·· • ftft ftftftft ftft ftft ft· ftft · • ftft ftftftft ftft · ftft ft · . 24 , Obr. 6:· Histogram reprezentující aktivitu in vitro .· přenosu do HeLa buněk při použití sloučeniny (IV) bez lipidů (ko-lipidů) nebo alternativně 'v přítomnosti' DOPE . nebo cholesterolu -jako ko-lipidu. Osa y' reprezentuje expresi luciferázy · v pg na jednu jamku. Osa x ukazuje poměr sloučenina (I)/DNA v nmol/pg DNA. .' ‘

Obr. 7: Aktivita transfekce při použití sloučeniny (II). do buněk HepG2, v přítomnosti. či nepřítomnosti séra, v porovnání S referenčním kationtovým lipidem REF'.·.

.;Obr. 8: Histogram, .reprezentující aktivitu in .vitro přenosu do HeLa buněk při použití sloučeniny (II) bez lipidů (ko-lipidů) nebo alternativně v přítomnosti DOPE nebo cholesterolu jako ko-lipidU. Osa y . reprezentuje expresi luciferázy v pg na. . jednu jamku. Osa x ukazuje poměr, sloučenina (I)/DNA v nmol/pg DNA. , ' Obr. -9;· Aktivita transfekce sloučeniny (V) do buněk HepG2 · a HeLa', v přítomnosti '' či nepřítomnosti séra,

V porovnání s referenčním kat iontovými lipidem REF.

• · ♦ ti ti · · ( • ti ti ti

Příklady provedení, vynálezu

Příklad.1 '

Chemická syntéza transfekčního činidla

A. Materiály

Trietyiamin, N-etyldiisopropylamin, dioktadecylamin,

Ν_α, N_a'-diBcccystin, a činidlo BOP j sou . komerčně . dostupné reagencie. Obdobně .také amylamin, oktadecylamin, pentanthiol, dodekanthiol, oktadekanthiol a thiocholesterol.

- Bo.cNH (CH?) 3 NBoc (CHj) 4 NBoc(CH₂)₃ NBocCH₂C0₂H . ' byl syntetizován v laboratoři postupem, který byl popsán v patentové přihlášce WO 97/18185 a v publikovaném článku Byk G., Frederic M., and Scherman D., Tetrahedron Letters ' (1997) 38, 3219-3222.· '

B. Metody

a) Spektroskopické analýzy (Spektra protonové . NMR •(nukleární magnetická rezonance) byla získána pomocí spektrometrů Bruoker 250 a 400 Mhz.

b) Chromatografické techniky

Analýzy HPLC (Výsokoúčinná- kapalinová chromatografie) byly provedeny na zařízení HITACHI vybavené .automatickým sběračem vzorků AS-2000A, pumpou L-6200A, UV detektorem L4000 pro 220 nm a integřátorem-počítačem , D2500. Použita byla kolona komerčně dostupná od firmy APPLIED BIOSYSTEMS, ž nerezové oceli, délky 3 cm . a s průměrem. 4,6 mm.' Mobilní fáze býla voda a acetonitril doplněný trifluoroctovou ft· ···· ·· ft . · · · · ft ft · ft 4 9

4 9 4 4 4 9 · · · · 4 4

4 4 9 4

6 kyselinou a stacionární fází byl Aquapore butyl, 7 micron. Průtok byl 1 až 4 ml/min.

Chromatografie ne tenké vrstvě (TLC) byla provedena na hliníkových deskách pokrytých silikagelem velikosti 20 x 20 cm.

c) Purifikace 'preparativní HPLC ''

Použité zařízení je souprava pro gradientovou kapalinovou • chromatografii ' s UV detekcí. Preparativní- systém byl složen.z následujících komponent:

Pumpa A: GILSON model 305, vybavená.hlavou 50 SC. Pumpa B: GILSON model 303, .vybavená hlavou. 50 SC..

Vstřikovací pumpa: GILSON model 303, vybavená hlavou

SC.;Tlakový modul: GILSON model 806. '

Mixer: GILSON model 811 G vybavený hlavou 23‘ml.

UV detektor: GILSON model 119, vybavený preparativní komorou a nastaven na 220 'nm. ...

Sběrač frakcí: GILSON model 202, vybavený stojanem č . 21.

Integrátor: SHIMADZU model C-R6A.

- Kolona: Kolona C4 (10 mm) z nerezové, oceli',, dlouhá 25 cm s průměrem 2,2 cm, komerčně dostupná jako model 214 TP 1022 firmy VYDAC. ‘

Roztok produktu, který měl být purifikován, se'nanesl na kolonu vstřikovací pumpou při průtoku 15 ml/min. Mobilní fáze byla voda a acetonitril.

····

C, Chemická syntéza ' '

a) Lipopolyaminy s mastnými řetězci, které mohou být redukovány prostřednictvím disulfidických můstků

Tyto molekuly mají obecnou strukturu:

Polyamin — Spacer

Lipid 'S—S—Lipid

Byly připraveny postupem podle následujícího schématu:

Krok 1) \l o

A

O NH O

HO Á S. _λλ y ^y s γ OH ° ™Y V

- O ' + R,-SH

TEA

DMF

R,-S.

OH

O

HN O

Y

O + R,-S-S-R, aX

HN O ⁰ tíY*

OH

Krok 2' s γ o HN O y Ko ' '

HN s γ o HN O

X

X

999· • · · ·

• 9 9.9

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

Krok 3)

ΗΝ ο, _? · Ι ·> ý γ V · ° Á Λ ⁰ Λ°Λ ν -ν °γ° ^θγ° ,Κ ^ΝΗ

a) TFA

b) ΒΟΡ, DIEA/CH-.CL

c) TFA

R.~S_X

S 0 HN

ΥΎ o

Následující neomezující příklady ilustrují tato trarisfekční činidla: '

Sloučenina	(I) : Ri = .	(CK2) «CH?; R? =	ÍCH2ji7	CH?; R? = (	ch2) í7ch?
[Příprava 3.	• 1] '
Sloučenina	'(II): Ri	= (CH2),-CH2;	R? =	(CH2) í-CH3;	R? = H
[Příprava 3.	.2]	-
Sloučenina	(III) : ' Rl.	= (CHUnCH,;	R2 =	(CH2).i7CH3;	R3 = H

[Příprava 3.3]

Sloučenina	(IV) :	: Ri = JCH2)iiGH3; R? =	(CH2)nCH3; R3 =	(CH2) í7CH3
[Příprava 3 Sloučenina	• 4] (V) :	Ri = cholesterylová	skupina; R2 =	(CH?) 17CH3;

Ra = H [Příprava 3.5j

Krok 1. ’ .

• Příprava 1.1': ŇHBocCys [S-S-(CH₂) ₄CH₃]-OH

6, 81 mmol Ν_α, N_a'-diBoc-cystinu ¹ bylo rozpuštěno ve cm³ dimetylformamidu.. ·: K tomuto roztoku bylo přidáno

58,1 mmol trietylaminu' a pak 6,81 mmol 1-pentanthiolu. Směs se míchala po 2 hodiny při teplotě místnosti. Trietylamin se titi · ti· titititi • titi ti · · • ti ti ti ti · «ι ······ ti · • ti titi· titititi ti ti · ti • ti titi • titi ti • titi ti ti ti titi ti • titi ti • ti titi odpařil a koncentrát byl přidán k 300 cm³ 0,5M roztoku síranu draselného ' (KHSO4) · Produkt, který precipitoval, byl extrahován 3x 100 cm³ chloroformu. Organické fáze byly sloučeny a vysušeny přes bezvodý síran hořečnatý a pak byl chloroform odpařen. Suchý extrakt byl solubilizován ' 100 cm³ dietyléteru., a pak byl extrahován 3 x 50 cm³ nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3) .' Sloučené vodné fáze;,.byly neutralizovány, až do pH = 3, přídavkem 350 cm³ 0,5M roztoku KHSO4 .· 'Produkt, který ' precipitoval, byl· extrahován 3 x 100 ciť chloroformu.· Sloučené organické fáze byly promyty 2 x 50 cm³ nasyceného roztoku .chloridu sodného (NáCl) a pak vysušeny '.přes bezvodý síran -hořečnatý.

odpařen* v rotačním· evaporátoru. Získaný eluován · směsí chloroform/metanol (9/1 objem/objem) na křemičitanové koloně.

Bylo získáno 2,31 mmol produktu, což představuje výtěžek 34%. ' ' ' ' ·

TLC'Rf = 0,63 (CHClj/MeOH, 9:1) .

Chloroform byl produkt , byl • Příprava 1.-2 :· NHBocCys [S-S-(CH?) i-CH₃]-OH

6,81.mmol· Ν_β,.Ν_α' -diBoc-cystinu. bylo rozpuštěno ve 20 cm'³ dimetylformamidu. K-tomuto. roztoku bylo přidáno .58,1 mmol trietylaminu a ,pak'^: -6,81 mmol 1-pentanthiolu. Směs se míchala po 2 hodiny', při 40 °C. Trietylamin se odpařil· v rotačním evaporátoru a koncentrát byl přidán k 300 cm³ . 0, 5M roztoku síranu draselného (KHSOJ . .Produkt, ktérý precipitoval, byl extrahován . 3x ... 100 cm³ chloroformu. Organické fáze' byly sloučeny a vysušeny přes bezvodýsíran hořečnatý a pak byl chloroform odpařen. Suchý extrakt byl solubilizován 100 cm³ dietyléteru a pak. byl extrahován 3 ,x 50 cm³ nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu-sodného (NaHCO₃) . Sloučené éterové fáze byly okyseleny dvakrát vytřepáním do 100 cm³ 0,5M roztoku ·· ···· • · · · · ···· ··<· 9 99 · ·· ··

KHSO₄ a pak. byly pro.myty 2 x 50 . cm³ nasyceného roztoku chloridu sodného' (NaCl). Éterová fáze pak byla vysušena přes bezvodý síran hořečnatý a odpařena do sucha ne rotačním evaporátoru. Získaný surový . produkt byl .krystalizován z petroléteru. ·

Bylo získáno 1,36 mmol produktu (Y = 20 %) .

TLC Rf = 0,67· (CHCla/MeOH, 9:1), HPLC Rt' = 17,.80 min. .

• Příprava 1.3 : NHBoc.Cýs {S-S-Cholesterol]-OH

Syntéza byla identická s· přípravou 1.2 kromě' toho, že byl užit thiocholesterol.

'Výtěžek byl 58%.

TLC Rf = 0,59 (CHCla/MeOH, 9:1) ,. HPLC Rt = 19,16min.

• Příprava 1...4 i NHBocCvs [S-S-(CH₂) iiCH₃] -OH

Syntéza byla identická s přípravou 1.2 kromě toho, že probíhala při teplotě místnosti a byl užit'1-dodekanthiol.

Výtěžek byl 40%. TLC Rf = 0,69 (CHClj/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 13,23 mini

Krok 2 • Příprava 2.1, : NHBocCys [S-S- (CH₂) 4CH3] -N [ (CH?) 17CH3] ?

1,15 mmol produktu získaného v přípravě 1.1 bylo rozpuštěno v ' 10 cm³ dichlormetanu a bylo přidáno 2,86 mmol N-etyldiisopropylaminu, 1,15 mmol dioktadečylaminu a 1,27 mmol BOP .

Směs-, byla míchána 2 hodiny a monitorována pomocí TLC a HPLC..

Dicnlorométan byl odpařen 'na rotačním evaporátoru.

Surový produkt· byl odebrán do 100 ml chloroformu a pak postupně 3 x promyt 50 cm³ 0,5M KHSO₄, 3 x 50 cm³ nasyceného roztoku NaHCO₃ a pak nakonec 2 x 50 cm³ nasyceného roztoku

·· ·· • · · · • · · · • · · · · , · · · ·

9 9 9

NaCl.· Organická fáze byla vysušena přes bezvodý síran hořečnatý a chloroform byla odpařenná rotačním evaporátoru.

Byl získán výtěžek 64 %.

TLC Rf = 0,90 (CHCla/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 25,96 min.

• Příprava 2.2: NHBocCys [S-S- (CH?) 17CH3] -NH (CH?) 17CH3 ·

Syntéza byla identická s přípravou 2.1 až.na to, že jako výchozí látka byl použit produkt z přípravy 1.4 .

Výtěžek byl 97% .

TLC Rf ·= 0,-89- (CHCl₃/MeOH, 9:1), HPLC Rt - 24, 84 min.

• Příprava 2.3 : NHBocCys [S-S-(CH₂) uCH^] -NH (CH₂)T7CH₃ . Syntéza byla identická s přípravou 2.1 až na to, že jako výchozí látk,a byl. použit produkt z přípravy 1.4.

Výtěžek byl 86 ·%.-. TLC Rf = 0,90 (CHCl₃/MeOH, 9:1), HPLC Rt =22,22 min.

• Příprava 2.4 : NHBocCys [S-S (CH₃) i:CH₃] -N [ (CH?) 1-CH3] ?

Syntéza byla /identická s přípravou 2.1 až na' to, že jako výchozí látky byly- použity dioktadecylamin a produkt z přípravy 1.4. · '

- · Výtěžek- byl 85 %.

TLC Rf -.0,90 (CHCl₃/MeOH, 9:1).

.·- Příprava 2.5 : NHBocCys [ S-S-Choles terol ] -NH (CH₃) nCH₃

Syntéza byla identická s přípravou 2.1 až na to, že jako výchozílátky bylypoužity oktadecylamin a produkt ž přípravy-1.3. ’ '

Výtěžek byl 90 TLC Rf = 0,88 (CHCl₃/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 26,98 min.

• to ··

to· • · · · • · · · •toto to• · · · « ···· to · • to · • · · · ··

Krok 3 • Příprava 3.1 [sloučenina (I) ]

NH₂ (CH₂) aNH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₂NHCH₂COCys- [S-S- (CH₂) ₄CH₃] -N [ (CH₂) ₁₇CH₃] ₂

'.10 cm³ kyseliny trifluoroctové bylo přidáno k produktu z přípravy '2.1./Médium se - míchalo 1,5 hodiny a štěpení . BOC bylo monitorováno pomocí. HPLC. Kyselina trifluoroctová byla odpařena a. aby se odstranila stopová'množství, bylo odpařeno 3x5 ml' dietylěteru. ’

Suchý' extrakt 'byl· rozpuštěn v 10 cm³ dichlorometanu. a pak bylo přidáno 3,34 mmol N-etyldiisopropylaminu a 0, 644 mmol BocNH (CH₂) ₃ NBoc (CH₂) ₄ NBoc(CH₂)₃ NBocCH₂C0₂H a 0, 7 08 mmol BOP. Směs se' míchala 2 hodiny a reakce se monitorovala pomocí TLC a HPLC.

Dichlorometan byl .odpařen- na rotačním· e.vaporátoru. Surový produkt byl odebrán do 100 cm³ chloroformu a pak. postupně 3' x promyt 50 cm³ 0,5M. KHSOr,' 3- x . 50 cm³ nasyceného roztoku NaHCO₃ a pak nakonec 2 x 50 cm³ nasyceného roztoku· NaCl. Organická fáze byla vysušena' přes bezvodý síran hořečnatý a chlorofom byl odpařen na rotačním evaporátoru.

. cm^J kyseliny trifluoroctové bylo přidáno k suchému .extraktu. Médium se míchalo 1,5 hodiny a štěpení BOC bylo monitorováno pomocí ’ HPLC. Kyselina -trifluoroctová byla odpařena a aby se odstranily i stopy, bylo odpařeno3 x 5 ml dietylěteru.

Získaný ' surový produkt byl ' purifiko.ván preparativní HPLC. Požadované frakce byly sloučeny'a lyofilizovány.

Bylo získáno 0,081 mmol produktu ve formě soli, což představuje výtěžek 1.1 %.

-HPLC Rt = 17,79 min. ^XH NMR spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d₆, δ v ppm) : 0,90 (mt,

9H : CH₃ dvou oktadecylaminoskupiri a CH₃ pentyldisulfanylu);

·· ···· • , · ·· · • * ·· ♦· ► · · ·

I 4 · · » 4 4 ♦ » · · ·

4 4 4 od 1,15 , do 1,50. (mt,

64Η

CH₂ jedné ze dvou oktadecylaminoskupin - 15 CH₂ druhé oktadecylaminoskupiny) a 2 CH₂ pentyldisulfanylu); 1,47 (mt, 2H : 1 CH₂ jedné ze dvou oktadecylaminoskupin); od 1,55 do 1,75 (mt, 4H : l' CH₂ jedné ze dvou oktadecylaminoskupin a 1 CH₂ pentyldisulfanylu)'; 1,65 (mf, 4H : 2 centrální skupiny CH? butylové skupiny); od 1,85 do 2,05' (mt, 4H : centrální CH? dvou propylových skupin); od 2,70 do 2,85 '(mt, 1H : 1H ze skupiny CH?S cysteinu); 2,78 (mt, 2H : skupiny SCH? pentyldisulfanylu); od 2,85 do 3,50 (mt. : <2 .NCH? skupiny butylu - 2'NCH? dvou propylových skupin další H ze skupiny CH?S cysteinu a skupiny - NCH? dvou oktadecylaminoskupin); 3,80- (široký s, 2H:NCH?CON glycylaminoskupiny) ; 5,07 (mt, 1H : CONCHCON cysteinu)·; 9,.05 (d, J = 8 Hz, 1H : CONH cysteinu); 7,95 až 8,.85 a od 8,90 do 9,15 (2· -nerozlišené komponenty a široká nerozlišená komponenta: atomy-H Odpovídající skupinám NH a' NH? ) . '

MH⁺.' = 9 69 • Příprava 3'. 2 [sloučenina (II) ] : .,

NH? (CH₂) ?NH (CH₂)-₄NH (CH) ₃NHCH₂COCys- [S~S- (CH₂) 1/CH3] ~NH(CH₂) ítCH₃

Postup byl identický s postupem popsaným v přípravě 3.1, až na to, že vycházel z.-produktu 'získaného v přípravě 2.2.

Výtěžek produktu vé formě soli byl 31 %j HPLC Rt = 15,63 min.

. I ^:H 'NMR spektrum. (400 MHz, (CD₂) ?SO-d₆, δ in ppm) : 0.89 (t, J ,,,= .. ,-7...-5 Hz, 6H:CH? oktadecylaminoskupiny a CH₃ oktadecyl-.

disulf ánylu) ;od 1,15 to 1,45 (mt, 60H : 15 CH₂ oktadecylaminoskupiny) a 15 CH₂ oktadecyldisulfanylu); 1,42 (mt : 1 CH₂ oktadecylaminoskupin) ; od 1,55.do 1,70 (mt, 2H. :

z CH₂ skupin oktadecyldisulfanylu); ‘ 1,66 (nerozlišená komponenta, 4H ' : 2 centrální CH₂ butylové skupiny); od 1,85 • ft ft ftft ···· · · · ftft · • ftft ft ft · ₄· ······ · · • · · · · ••ftft · ftft · ftft ftft • ftft · • ftft ft • ftft · · • ftft · • ft ftft do 2,05 (mt, 4H : centrální CH₂ dvou propylových skupin); 2,76 (t, J = 7,5 Hz, 2H : SCH₂ oktadecyldisulfanylu); od 2,85 do 3,10 (mt, 14H 2 NCH₂ bútylové skúpiny - 2 NCH₂ dvou propylových skupin - 1H z NCH₂ oktadecylaminoskupiny· a 1H ze skupiny CH₂S cysteinu); 3,10 (dd, J = 13,5 a 6 Hz, 1H : další (mt,

1H (velmi 4, 60 další H

NCH₂ limitující AB, 2H (mt,

1H

CONCHCON

CONH oktadecylaminoCONH cysteinu); 7,95 H . z CH₂S cysteinu); 3,18 oktadecylaminoskupiny) ; 3, 82

NCH₂CON glycylaminoskupiny) ;

cysteinu); 8,27 (t, J = 5,5 Hz, 1H skupiny).; 8,90 (d, J = 8,5 Hz, 1H .

8,82 a 9,07 (3 nerozlišené komponenty: atomy · H odpovídající skupinám NH a NH₂) .

MH⁺ = 3 99 '· / • Příprava. 3.3 [Sloučenina (III)] :

NH₂ (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH?COCys- [S-S- (CH₂) _UCH₃] -NH (CH₂) ₁₇CH₃ .

Postup je shodný s přípravou 3.1 až na to, 'že výchozí látkou je produkt přípravy 2.3.

Výtěžek produktu ve formě soli byl 26,5' %.

HPLC Rt = 12,3 6. min.

¹H NMR spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d₆, δ, i.n ppm) : 0,90 (t, J

7,5 Hz,

6H

:. CH₃ oktadecylaminoskupiny a CH₃ dodecyldisulfanylové skupiny);· od 1,15 do 1,50 (mt, 48H : 15

CH? ' oktadecylaminoskupin a 9 CH₂ dodecyldisulfanylové skupiny); 1,43 (mt : 1 CH? .octadecylaminoskupiny); od 1,55 do 1 CH₂. dodecyldisulfanylu) ; 1, 65 (nerozliě..ená : 2 centrální CH₂ bútylové skupiny).; od 1,85 do 2', 05 (mt, ^: 4H : centrální CH₂ dvou propylových · skupin) ;

2,76 (t, J = 7,5 Hz, 2H : SCH₂ dodecyldisulfanylové skupiny);

2,80 do 3,05 (mt, 14H :. 2 NCH₂ bútylové skupiny - 2 NCH? dvou propylových . skupin- 1H z NCH₂ oktadecylaminoskupiny a 1H z

1,70 (mt, 2H : komponenta, 4H ·· »»·* ·· ·

I · · • · · • ····

·. · ·· ·♦ » · · 1 » · · 1

I · · 1 » · · 1 ·· ··

CH?S cysteinu) ; 3,11 (dd, J = 13,5 a 6' Hz, 1H : ostatní H z .1H : další H z NCH₂ [omezující AB, 2H : NCH₂CON

CH₂S cysteinu); 3,17. (mt, óktadecyláminoskupiny) ; 3, 83 glycylaminóskupiný); 4,60 (mt, 1H : CONCHCON cysteinu); 8,25 (t, J = 5,5 Hz , 1H, : CONH oktadecylaminoskupiny);· 8,99 (d,‘ J = 8,5 Hz, 1H : CONH cysteinu); 7,96 - '8,84 a 9,09 (3 nerozlišené komponenty: atomy H odpovídající skupinám .NH a NHC ..

MH⁺ =815 • Příprava 3.4 [Sloučenina (IV)] :

NH? (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) _;NHCH₂COCys-TS-S- (CH₂) iiCH₃] -N[ (CH?) ₁₇CH₃] ? Produkt získaný v přípravě 2.4 byl použit' v syntéze identické s přípravou 3.1.

Výtěžek, produktu ve formě soli byl 39 %.

HPLC Rt= 19,75'min.

^:H NMR spektrum (400 MHz, (CD?) ?SO-d₆, δ in ppm) : 0,87 (t, J = 7,5 Hz., 9H. : CH₃ dvou -oktadecylaminoskupin a ' CH?

dodecyldisulf anylové.: skupiny) ; od 1,15 do 1,50 . (mt, . 78H . 15

CH₂ jedné ze dvou Oktadecylaminoskupin - 15 CH? další oktadecylaminoskupiny) a' 9 CH? dodecyldisulfanylu) ; 1-,47 (mt,

2H. : -1 CH₂ jedné ze .dvou oktadecylaminoskupin); od 1,50 do 1,70 (mt,. 4H : 1 CH?' jedné ze dvou oktadecylaminoskupin .a 1

C.H₂ dodecyldisulf anylu) ;. 1,68 (nerozlišená komponenta,' 4H : 2 centrální CH? skupiny butylu) ;' od 1,85 do 2,10 (mt,· · 4H :

centrální CH₂ dvou propylových skupin); 2,77' (t, J- 7,5 Hz, 2H : SCH₂ dodecyldisulfanylové skupiny); 2,80 (mt, 1H : 1H z CH₂S cysteinu); od 2,70 do 3,50 (mt : 2 NCH₂ butylové skupiny - 2 ŇCH₂ dvou propylových skupin - další H z CH₂S cysteinu a NCHý dvou oktadecylaminoskupin, 3,80 (široký s, 2H NCH₂CON glycylaminoskupiny); 5,05 (mt, 1H : CONCHCON cysteinu); 9,07 • 999 ·· 9 • 4 «

(d, .J = 8 ·Ηζ.,. - 1H .: CONH cysteinu); od 7,75 do 8,20 a od 8,65 do 9,25 (2 široké nerozlišené komponenty: ' atomy H odpovídající skupinám NH a NH₂) .

MH⁺ -= 10 67 • Příprava 3.5 (sloučenina,(V)] :

NH₂ (CH?) ?NH (CH₂) ₄NH (CH?) ₃NHCH₂COCys- [S-S-Cholesterol}NH(CH₂) í-CH₃ ' Produkt získaný v přípravě 2.5 -byl použit Vsyntéze identické s přípravou 3 .'1 až . na sto, že pro konečné' štěpení BOC skupin byla použita následující směs: 1Ό cm³ TFA, 0,5 ml vody,' 0,5 ml thioanisolu a, 0,75 g fenolu.

Výtěžek byl 5,6 % produktu se-solí.

HPLC Rt = 16,59 min. - ' ¹H NMR spektrum (400 MHz, (CD?) ,SO-d₅,. při teplotě 383 Κ, δ v ppm) : ' 0, 74 . a 1, 05 (2 s, 3H každý' : 'CH₃ v poloze 18 a CH?

v poloze 19 cholesterylové skupiny); od 0,80 do 0,95 (mt :

; atomy H odpovídající CH₃ oktadecylaminoskupiny aCH? v poloze 26 - CH₃ v poloze 27 a CH₃ v poloze 21 cholesterylové s-kupiny) 1,77 (mt : 4H atomy odpovídající 2 centrálním skupinám CH? -butyiově- skupiny); od 1,85 do 2,10. (mt : 4. H atomy odpovídající centrální' CH? dvou propylových skupin); od /2,90 do 3,25 (mt : 16H atomy odpovídající 2 NCH? dvou butylóvých skupin - 2 NCH₂ dvou propylových skupin - skupině CH?S cysteinu a skupině NCH₂ oktadecylaminoskupiny); 3,63 (omezující AB, 2-H : NCH?CON glycylaminoskupiny); 4,61 .(mt,

1H: CONCHCON cys teinu) ;. . 5, 39.. (mt, 1H : CH v poloze 6 cholesterylové skupiny); . 7,69 (mt, 1H : CONH oktadecyl> aminoskupiny) ; 8,25 (nerózlišená komponenta, 1H : CONH cysteinu). Pro všechny další protony cholesterylové skupiny •· ···· • ft ft • -ft ft ftftft • ftftftft • · ' • ftftft · ·· »··· ftft ·* ftft · * ·· · • ftft · · · ft ··· ····· • · · · · ·· • ft · ftft ·· a oktadecylaminóskupiny byly odpovídající signály 'v rozmezí0,60 až 3,00 ppm.

MH⁺ =1015

b) Symetrické tránsfekční činidlo, které může být odděleno disulfidickým. můstkem

Tyto' molekuly mají obecnou strukturu:

Polyamin -Spacer - Lipid

Polyamin . -- Spacer - Lipid

Tyto ' sloučeniny byly připraveny postupem. podle následujícího schématu:

. Krok 1) ' o o γ on HN + 2 HN .R,

HN ' °

Λ OH ~ O °γ°ο ^:vv

N

HN Υ XΛ o o o

• · • · • · ' Krok 2)

o o

A

a) TFA

b) BOP. DIEÁ/CH2C12

c) TFA

Následující příklad, aniž by vynález jakkoliv- omezoval, -ilustruje jedno z takových' transfekčních činidel:

Sloučenina - (VI') : R_: = (CH₂)₂-CH₂; R₂ = H '

Krok 1 • Příprava 1 :, -[NHBoc-CH (CO-NH (CH₂) ₁₇CH₃) CH₂-S-] 2

0,57 mmol Na,N_a'-diBoc-cystinu bylo rozpuštěno v 15 cítí

Chloroformu a bylo přidáno 5,67 mmol N~etyldiisopropylaminu>0,10 mmol oktadecylaminu a 1,24 mmol' BOP. .

Směs se-míchala 2 hodiríy a byla monitorována pomocí TLC a HPLC. ' _ , . Chloroform byl odpařen v rotačním evaporátoru. Surový produkt byl odebrán do 100 cm³ etylacetátu a pak postupně; promyt 3 x- 50 cm³ 0,5M roztokem KHSO₄ a pak 3 x nasyceným .roztokem NaHC0₃ a nakonec 2 x nasyceným roztokem NaCl.

• · · · «· · · :.

Organická fáze byla' vysušena přes bezvodý síran hořečnatý a etylacetát byl' odpařen v rotačním evaporátoru.

Bylo získáno 0,346 mmol produktu, což představuje výtěžek 69 . %.

TLC Rf = 0,94 (CHCl₃/MeOH, 9:1).

Krok. 2 ‘ .

• Příprava 2 [Sloučenina (VI)]' :

[NH₂ (CH?) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂CO-CyNH (CH₂) ₁₇CH₃] ₂ • 5 cm³ kyseliny- trifluoroctové bylo přidáno k produktu získanému v přípravě 1·. Směs se míchala 1,5 hodiny .a štěpení BOC bylo monitorováno pomocí HPLC. Trifluoroctová kyselina byla odpařena ,a pro odstranění stopového množství bylo odpařeno 3 x 5 cm³ dietyléteru.

•Suchý extrakt byl rozpuštěn v 25 ,cm³ dichlorometanu a pak bylo přidáno ; 3_t, 44 mmol -N-ethyldiisopropylaminu, 0,697 mmol' ’ BocNH (CH₂)₃ · NBoc (CH?) 4 NBoc(-CH₂)₃ NBocCH?C0₂H a Ό, 86 mmol BOP. Směs se míchala 2 hodiny a reakce'se monitorovala pomocí TLC a HPLC? ’ '

Dichlo.rmetan byl odpařen v rotačním evaporátoru. .Surový produkt byl ' odebrán do 100. cm³ etylacetátu a. pak postupně promyt 3 x 50 cm³ 0,5M roztokem KHSO₄ a pak 3 x nasyceným roztokem . NaHCO₃. a nakonec 2 x nasyceným roztokem NaCl. Organická fáze byla vysušena přes bezvodý' síran hořečnatý a etylacetát byl odpařen v rotačním evaporátoru. ·

TLC Rf -0,90 ,(CHCl₃/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 26,10 min.

' 5 .cm³ kyseliny trifluoroctové bylo přidáno . k suchému extraktu. Směs se·’ míchala 1,5 hodiny a Štěpení BOC bylo monitorováno pomocí HPLC.· Trifluoroctová kyselina byla odpařena a pro odstranění stopového množství bylo odpařeno

3x5 cm³ dietyléteru.

' ' 4 0

Surový extrakt byl dále purifikován pomocí preparativní HPLC. Požadované výsledné frakce byly sloučeny a lyofilizovány.

.0,099 / mmol produktu., se solí bylo .získáno, což představuje výtěžek 28,5 %, HPLC Rt = 10,55 min.

v ^:H NMR spektrum (400 MHz,' (CD₃)₂SO-d_s, δ v ppm) : 0,91- (t, J = 7,5 Hz, 6H : CH₃ dvou oktadecylaminoskupin) ; od 1,10 do 1,40 .(mt, 60H, : 15 CH₂ jedné' ze dvou oktadecylaminoskupin 15 CH₂ druhé- oktadecýlaminoskupiny); l',43 .(mt,' 4H : 1 CH₂ dvou oktadecylaminoskupin) ; 1, 64^ (nerozlišená' komponenta, 8H : 2 centrální CH₂ skupiny dvou butylových skupin); od 1,35 do 2,10 (mt, 8H : centrální CH₂ čtyřech pro.pylových skupin); od 2,80 do 3,15 (mt, . 32H : 2·· NCH? dvou butylových .skupin'- 2 NCH₂ čtyřech propylových skupin - NCH₂. dvou oktadecylaminoskupin -a skupina 'CH₂S dvou cysteinů); 3,84' (nerozlišená komponenta, 4H' : NCH_:CON dvou glycylaminoskupin) ; 4,60 (mt, - 2H ; CONCHCON .dvou cysteinů);· 8,27 (nerozlišená komponenta, 2H .: .CONH dvou oktadecylaminoskupin) ; 8, 95:--- (nerozlišená komponenta, 2H

CONH dvou cysteinů); 7,97 -· 8,87 a 9,15 (3 rierozlišené komponenty: atomy H odpovídající skupinám NH a' NH?) .

MH.' = -1227. . \

Příklad 2

Zhodnocení detergenčního účinku činidla podle vynálezu

Cílem tohoto příkladu bylo vyhodnotit,jaké detergenční vlastnosti má činidlo podle předkládaného vynálezu pro přenos nukleových kyselin do buněk,. čili. zjistit, zda je schopno rozpouštět membrány.

Pro tento účel. byl užit in vitro model, který tvoří biologické membrány, zejména liposomy EPC/EPA (vaječný fosfatidylcholin/vaječná kyselina fosfatidová, 10:1).. Stejně j-ako u biologických membrán, steny ' těchto liposomů jsou tvořeny fosfolipidovou. dvouvrstvou a vykazují tudíž •srovnatelné chování.

Tyto liposomy se , ρ-řipravují 'tak, že' různé složky se rozpustí v chloroformu, který se pak pomocí rotačního evaporátoru odpaří. 'Získaný lipidový film se pak redisperguje ve vodě -a 'liposomy se vytvoří sonikací a zahřátím. Vyhodnocení detergenční aktivity . .produktu přidaného k liposbmům se provede tak, že se měří turbidita pomocí spektrofotometru. Jako srovnávací pokus byl nejdříve proveden' pokus s Tritonem' X-l00, což je dobře známý komerčně dostupný detergent. Úplné soiubilizace liposomů (100% . soiubiiizace) bylo dosaženo' jak je znázorněno grafem na obr. T.

.' Druhý testovaný produkt byla amfifilni molekula obsahující' polyamin spojený prostřednictvím spaceru s mastným řetězcem obsahujícícm 18 atomů .uhlíku' (sloučenina VII). Odpovídá tudíž molekule, která se získá redukcí disulfidického . můstku ' sloučeniny TI podle · předkládaného vynálezu. Graf. na obr. 2 znázorňuje výsledky získané s touto amfifilni molekulou přidanou k liposomům: byla pozorována •částečná soiubilizace,· která odpovídala asi-30 % soiubilizace s Tritonem X-100. . .

Nakonec stejný pokus byl , proveden . s kationtovým referenčním lipidem,analogem sloučeniny .· II, který .však neobsahuje disulfidický můstek. V tomto případě nebyla pozorována žádná- soiubilizace liposomových membrán.

Závěrem tohoto příkladu lze . shrnout, že transfekční činidlo podle předkládaného vynálezu je schopné; vytvářet v redukujícím prostředí amfifilní molekuly s detergenčním účinkem, neboli jě^ .schopné rozpouštět membrány. Tato vlastnost, je mimořádně výhodná, neboť . transfekční činidlo, podle vynálezu dovolujme vektorizovat nukleové kyseliny pro buněčné kompartmenty ve větším, množství a snadněji, což vede ke zlepšení transfekční účinnosti (jak je ukázáno v následujícím přikladu tr.ansfekce) ·. >

Příklad 3

Použití .produktu 'podle vynálezu., pro in vitro transfekci genetického materiálu .Tento' příklad ukazuje schopnosti činidel podle vynálezu pro přenos nukleových kyselin do buněk,, a sice ukazuje, že účinně transfekují buňky in vitro i přes to, že v jejich struktuře je vložen·disulfidický můstek (případně můstky)

A. Použitý genetický materiál

Plazmidy použité v pokusu byly popsány v patentové přihlášce WO 97/10343 . · Konstrukt pCOŘ_pXL2774 obsahuje gen kódující luciferázu řízený promotorem časného genu humánního cytomegaloviru (hCMV-IE).

Roztok nukleové kyseliny byl nařeďěn' ná koncentraci 20 μg/ml fyziologickým roztokem (Ó,15M NaCl).

.43

B. Rotoky činidel pro. transfekci buňky (cytoféktantů) ,. připravené bezprostředně..před použitím

Produkty podle vynálezu byly rozpuštěny ve vodě v koncentracích 40 až 160 160 pmol a' smíchány v objemových poměrech s rotokem DNA. Výsledná ' koncentrace soli byla 75 mmol.

C. Tránsfekce ' ' .,

Buňky byly . kultivovány ve vhodných . podmínkách na 24-jamkových mikrodestič.kách (2 cm²/jamka) a byly transfekovány, když , byly ve fázi exponenciálního růstu adosáhly-konfluence,50 až 70%. '

Buňky byly opláchnuty dvakrát 0,5 cm³ média bez' sérových proteinů a' ponechány růst buďto v_:médiu.bez sera (tránsfekce v nepřítomnosti séra) nebo v médiu se sérem (tránsfekce v přítomnosti séra).' 0,05 cm³ směsi cytoféktantů (0,5 pg DNA/jamka) bylo přidáno k buňkám (3 jamky na každé podmínky a vektor). Když byly buňky transfekovány v nepřítomnosti Séra, růstové médium bylo 2 hodiny po transfekci doplněno potřebným množstvím séra.

Účinnost tránsfekce byla vyhodnocena- 43 hodin po provedení tránsfekce měřením exprese luciferázy . podle doporučení výrobce pro uživatele - . soupravy . Promega (Luciferase Assay Systém). Toxicita 'směsi cytofektahtu byla stanovena měřením koncentrace proteinů v buněčném lyzátu.

··· · • ·

.

D. Výsledky

a) Symetrické transfekční činidlo, které lze oddělit redukcí disulfidickéhó můstku: Sloučenina VI (obr. 3)

Tento produkt, popsaný v předkládané přihlášce, byl použit a srovnán s referenčním kationtovým lipidem REF (který byl popsán jako . sloučenina . .6 v patentové přihlášce WO 97/13135) jakožto vektor pro transfekci DNA do buněk linie ,HepG2 . ' . '

Pro tento typ buněk je toxicicťa sloučeininy'VI stejného rozsáhu jako je u referenčního kationtového lipidu REF: pokud je' transfekce 'prováděna· bez přítomnosti 'sérových proteinů/ přežívání buněk HepG2 je .80% pro dávku kationtového lipidu 160 μΜ. ¹

Maximální transfekční .účinnosti bylo dosaženo pro poměr 4 až 8..nmol kationtového lipidu^g DNA. Exprese. transgenu získaná při použití.· sloučeniny VI byla vyšší .ve. srovnání s expresí získanou .při po’užití referenčního kationtového lipidu (4 x). při transfekci buněk HepG2.

b} ' Transfekční činidlo, jehož lipidová část je složena ze '-, dvou alkylových řetězců obsahujících 18 atomů uhlíku (C_ig) a třetího.· alkylového- řetězce navázaného, disulfidickým můstkem: Sloučeniny Γ a IV

Tyto dva. produkty, popsané v předkládané přihlášce, ^! neprojevují významnou toxicitu až do koncentrace .1.60 μΜ kationtového lipidu, a to jak pro HeLa tak i pro HepG2 buňky.

Ve srovnání s expresí transgenu při použití referenčního kationtového lipidu REF, přidání třetího lipidového řetězce (obsahujícího 5 uhlíků, Cs, sloučenina I) vedlo • · · · .99

k transfekčním výsledkům při transfekci- bez přítomndsti séra, které, byly srovnatelné. Na druhé straně' při shodných transfekčních podmínkách, když třetí lipidový. - řetězec . byl řetězec obsahující 12 atomů uhlíku (C12, sloučenina IV), exprese transgenu byla zvýšena 2 x u buněk HeLa a 9 x u buněk

HepG2 (viz obr. 4). ,

Navíc jedna z hlavních výhod zvětšující se lipofilnosti kationtových- lipidů po přidání třetího alkylového řetězce je demonstrována v transfekčních pokusech v přítomnosti sérových proteinů.' V tomto případě skutečně nedochází k významné inhibici , v důsledku' přítomnosti sérových proteinů, což z těchto činidel dělá výhodné kandidáty na činidla pro in.vivo transfekci. ,

Obr.. 5 a 6 představuj í ve - formě histogramů - tránsfekční. účinnost sloučenin I,a IV.

o) Tránsfekční činidla, jejichž lipidová. část je složena ze dvou. alkylových' řetězců obsahuj ících ·< 18 atomů uhlíku (Cis), přičemž , jeden z řetězců je .navázán disulfidickým můstkem (sloučenina II)

Tento produkt, který je popsán v předkládané přihlášce, neprojevuje toxicitu pro buňky ,HepG2 při - použitých dávkách 1.60 μΜ kationtovéhol lipidu.

Při transfekci v nepřítomnosti sérových proteinů byla hladina, exprese ' transgenu až 3 x vyšší ve 'srovnání s referenčním kationtovým lipidem REF. (viz obr. . 7.) . Navíc tránsfekce byla jasně zlepšena (až 40 x) v přítomnosti sérových proteinů.) Takže bylo zcela neočekávaně ukázáno, 'že zde nedošlo.k žádné inhibici v důsledku přítomnosti séra.

Obr. 8 představuje ve formě histogramu tránsfekční účinnost sloučeniny II. , ·* ···· ·· ·♦ • » · · • · · · • · · · ·

d) Transfekční činidlo, jehož lipidová část obsahuje řetězce odvozené ze s-teroidu . navázané disulfidickým můstkem: Sloučenina V (obr. 9)

Tato sloučenina, ' která, je popsána v předkládané přihlášce, neprojevuje.toxicitu pro buňky Heta·ani HepG2 při použitých dávkách (160 μΜ kationtovéhol lipidu).

Navázání cholesterolu.místo.alkylového řetězce poskytuje velmi výhodný zisk, .pokpd jde o expresi transgenu, a navíc v tomto případě nebyla pozorována žádná . inhibice v přítomnosti sérových proteinů, takže .tento produkt j.e velmi atraktivní pro použití in vivo. ’

Závěrem .lze -shrnout;, že výsledky -uvedené'¹ v tabulkách a .histogramech na obr. 3 až' 9 'ukázaly, -že: ' vložení disulfidického můstku (případně-, můstků) do transfekčního činidla typu /kationotových lipidů neovlivňuje ..schopnost., těchto činidel transfekovat DNA in vitro, ba právě.-naopak vede ke zlepšení transfekční účinnosti,- ' ' . '

- 'transfekční činidla nejsou toxická pro buňky.při použitých dávkách,

- 'a- nakonec zvýšení lipofilnosti transf-ekčních činidel podle vynálezu .umožňuje odstranit, alespoň částečně, inhibicí transf-ekce sérem. ··'.··

Claims (8)

1. Činidlo pro přenos nukleových kyselin, které obsahuje ' alespoň jeden kationtový hydrofilní úsek schopný nekovalentní . vazby s nukleovými kyselinami a alespoň jeden lipofilní úsek, přičemž tyto dva úseky jsou spojeny 'raménkem, tzv. spacerem, a navíc 'činidlo obsahuje alespoň jedeň disulfidický můstek umístěný ták, že jeho redukce způsobí , částečnou degradaci lipofilního úseku,. nebo umístěný .tak, že jeho redukce způsobí Oddělení činidla, jestliže je'symetrické.

2. Transfekční činidlo, podle , nároku 1, kde kationtový hydrofilní úsek je polymain nebo polyaminoguanidin.

3. Transfekční činidlo podlé nároku 1-, kde lipofilní úsek'je tvořen' alespoň' jedním 'alifatickým ‘mastným řetězcem a jedním nebo několika alifatickými -řetězci, jedním nebo několika, steroidovými deri.váty, přirozenými 'nebo syntetickými lipidy a/nebo případně jejich kombinací.

* \ * *

4. Transfekční činidlo podle nároku 3/ kde lipofilní úsek je' tvořen, alespoň'dvěma mastnými alifatickými řetězci.

'

5. ' Transfekční činidlo podle nároku 3, kde' lipofilní' úsek je tvořen- alifatickým mastným', řetězcem a- steroidovým derivátem.

6. Transfekční činidlo podle nároku 3, kde alifatické mastné řetězce jsou 'lineární nebo rozvětvené alkylové řetězce • 9 9999

9 · 9 9 9 9 9 9 obsahující. 10. až 22 atomů uhlíku, a jsou případně nasycené a/nebo fluorované.

7. Transfekční činidlo podle nároku 3, kde. steroidové deriváty jsou vybrány ze skupiny obsahující cholesterol, kyselinu cholovou á cholesterylamin.

8. Transf ekční.. činidlo podle nároku 1, .kde tzv. oddělovací ramínko čili spaceř.. je vybrán ze skupiny obsahující amidovou, karbamátovou, esterovou nebo éterovou skupinu a/nebo aromatické kruhy'. '

Transfekční· činidlo podle nároku 1, které obsahuje jeden nebo dva disulfidické můstky.