KR100447517B1 - 형질감염제로서리포폴리아민및이의약학적용도 - Google Patents

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제라르도 비크
캐서린 뒤베르트레
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아방티 파르마 소시에테 아노님
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Abstract

화학식 1의 양이온성 지질.
[화학식 1]
Figure pct00021
[화학식 2]
Figure pct00022
상기식에서,
m은 2 내지 6의 정수이고,
n은 1 내지 9, 바람직하게는 1 내지 5의 정수이며, n이 2 내지 9일 때, 수소 이외의 단일 그룹 R이 화학식 1에 존재하고 m은 그룹(a) 또는 -(CH2)m-내에서 다양하거나 동일한 값을 갖고,
R은 수소 원자이거나 화학식 2의 라디칼이며,
X 및 X'은 동일하거나 상이하고 산소 원자, 메틸렌 그룹 -(CH2)q-(여기에서, q는 0, 1, 2 또는 3이다), 또는 아미노 그룹 -NH-또는 -NR'-(여기에서 R'은 C1-C4알킬 그룹이다)이며,
Y 및 Y'은 동일하거나 상이하고, 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 C=S 그룹이며,
R3, R4및 R5는 동일하거나 상이하고 수소 원자이거나 임의로 치환된 C1-C4알 킬 라디칼이며,
p는 0 내지 5이며,
R6는 콜레스테롤 유도체 또는 알킬아미노 그룹 -NR1R2(여기에서, R1및 R2는 각각 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 포화 또는 불포화 C12-C22지방족 라디칼이다)이다. 이러한 지질을 함유하는 약학 조성물, 및 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 세포중에 형질감염시키기 위한 이의 용도가 기술됨.

Description

형질감염제로서 리포폴리아민 및 이의 약학적 용도{LIPOPLYAMINES AS TRANSFECTION AGENTS AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF}
다수의 유전성 질환은 하나 이상의 핵산의 발현 결함 및/또는 비정상적인 발현, 즉 불충분하거나 과도한 발현과 결부되어 있다. 유전자 요법의 주목적은 클로닝된 유전자의 생체내 또는 시험관내 세포 발현에 의하여 이러한 유형의 유전적 이상을 바로잡는 것이다.
현재로서는 이러한 유형의 유전 정보를 세포내 전달하기 위한 수종의 방법이 제안되어 있다. 이러한 방법 중 하나는 특히 화학적 벡터 또는 생화학적 벡터의 사용에 기초하고 있다. 합성 벡터는 형질감염시킬 DNA를 압축하고 세포와의 결합 및 원형질막 및, 경우에 따라 두개의 핵막을 가로질러 이의 통과를 촉진하는 두 가지 주요 기능을 보유하고 있다.
이러한 양식의 형질감염에 있어서 양이온 지질의 사용에 기초한 기술의 개발로 유의할 만한 진척이 이루어졌다. 따라서 양으로 하전된 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTMA) 클로라이드가 리포좀 또는 소낭 형태로 음으로 하전된 DNA를 자발적으로 방해하여 세포막과 융합할 수 있는 지질-DNA 복합체를 형성하고, 이에 따라 DNA의 세포내 수송이 이루어짐이 입증되었다. 그러나, 비록 이러한 분자가 형질감염과 관련하여 효과적이지만, 생분해성이 아니고 세포에 대하여 독성을 띠는 단점이 있다.
DOTMA 이래로, 다른 양이온성 지질이 이러한 구조적 모델에 대하여 개발되어 왔다: 소위 말하는 "스페이서" 암을 통해 아미노 그룹과 결합된 친지성 그룹. 이들 지질 가운데서 특히 친지성 그룹으로서 두개의 지방산 또는 콜레스테롤 유도체를 포함하고, 또한 경우에 따라 유리 아미노 그룹으로서 4급 암모늄 그룹을 함유하는 것들이 언급될 수 있다. DOTAP, DOBT 또는 ChOTB가 양이온성 지질의 이러한 범주의 대표주자로서 특히 언급될 수 있다. DOSC 및 ChOSC와 같은 기타 화합물은 4급 암모늄 그룹 대신에 콜린 그룹이 존재하는 특징이 있다. 일반적으로, 그러나 이들 화합물의 형질감염 활성은 상당히 낮다.
양이온성 지질의 다른 범주, 즉 리포폴리아민도 기술되어 있다. 이러한 유형의 화합물에 있어서, 양이온성 그룹은 4개의 암모늄 그룹, 2개의 1급 및 2개의 2급 그룹을 함유하는 L-5-카복시스퍼민 라디칼로 대표된다. 특히 DOGS 및 DPPES가 이의 일부를 형성한다. 이러한 리포폴리아민은 1차 내분비 세포의 형질감염에 특히 더욱 효과적이다.
사실, 이상적인 합성 형질감염제는 광범위한 숙주범위에 대하여 고수준의 형질감염을 보여야하고, 독성이 없거나, 적어도 사용 용량에서 극히 최소한의 독성을띠고, 최종적으로는 처리 세포의 여하한의 부작용도 없애기 위하여 생분해성이어야 한다.
본 발명의 요지는 사실 세포의 시험관내 및/또는 생체내 형질감염 및, 특허 핵산의 벡터화에 효과적으로 사용될 수 있는 신규 화합물을 제안하는 것이다.
본 발명의 제 1 요지는 화학식 1로 표현되는 D, L 또는 DL 형태의 리포폴리아민 및 이의 염이다.
[화학식 1]
Figure pct00001
[화학식 2]
Figure pct00002
상기식에서,
m은 2 내지 6의 정수이고,
n은 1 내지 9, 더욱 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고 수소 이외의 단일 그룹 R이 화학식에 존재하며 m의 값은 각종 그룹
Figure pct00003
에서 다양하거나 동일하며
, R은 수소 원자이거나 화학식 2의 라디칼이며,
X 및 X'은 각각 독립적으로 산소 원자, 메틸렌 그룹 -(CH2)q-(여기에서 q는 0, 1, 2 또는 3이다), 또는 아미노 그룹 -NH- 또는 -NR'-(여기에서 R'은 C1-C4알킬 그룹이다)이며,
Y 및 Y'은 각각 독립적으로 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 C=S 그룹이며,
R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자이거나 치환되거나 비치환된 C1-C4알킬 라디칼이며, p는 0 내지 5의 범위이며,
R6는 콜레스테롤 유도체 또는 알킬아미노 그룹 -NR1R2(여기에서 R1및 R2는 각각 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 포화 또는 불포화 C12-C22지방족 라디칼이다)이다.
특히 가장 관심의 대상이 되는 것은 R이 화학식 2' 로 표현되는 화합물이다.
[화학식 2']
Figure pct00004
상기식에서,
R3, R4, R5, R6및 p는 상기에서 정의한 바와 같고,
X는 산소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-(여기에서 q는 0이다)이다.
이러한 계통의 화합물은 생분해성이라는 측면에서 유리한 내부 에스테르 결합의 존재에 의하여 특징지워진다.
본 발명에 따른 바람직한 리포폴리아민으로서, 특히 D, L 또는 DL 형태의 하기 화합물 또는 이의 염 중 하나가 언급될 수 있다:
[화학식]
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 리포폴리아민의 직접 또는 약학 조성물 형태의 치료 적용이다.
앞서 논의된 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 핵산의 시험관내 및 생체내 형질감염에 특히 가장 유리한 것으로 드러났다. 이들은 DNA를 효과적으로 압축하고 유리하게는 대단히 감소된 독성을 보이거나 심지어는 처리 세포에 대하여 전혀 독성을 보이지 않는다. 또한, 이들은 특히 이들의 에스테르 결합의 가수분해에 의하여 생분해성이다.
본 발명의 조성물에 대한 최대 효과를 수득하기 위하여, 화학식 1의 화합물 및 핵산의 각각의 비율을 바람직하게는 R비 -고려되는 리포폴리아민의 양전하 : 핵산의 음전하-가 최적이 되도록 결정된다. 이러한 최적비는 특히 사용 양식, 즉 생체내 또는 시험관내, 및 형질감염시킬 세포의 유형에 따라 변하게 되므로 그때그때 상황에 따라 최적화시킨다. 이러한 최적화는 당해 분야의 전문가의 역량안에 포함된다.
본 발명의 조성물에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산일 수 있다. 그것은 천연 또는 인공 기원의 서열, 및 특히 게놈성 DNA,cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반-합성 서열일 수 있다. 이러한 핵산은 사람, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등의 기원일 수 있다. 핵산은 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지된 임의의 기술, 특히 뱅크의 스크리닝, 화학적 합성 또는 뱅크의 스크리닝에 의해 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형에 의해 수득될 수 있다. 핵산은 플라스미드 벡터 같은 벡터에 혼입될 수도 있다.
특히 데옥시리보핵산은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 이러한 데옥시리보 핵산은 치료 유전자, 전사 또는 복제 조절을 위한 서열, 변이 또는 비변이 안티센스 서열, 다른 세포 성분에 결합을 위한 부위등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 용어 치료 유전자는 특히 치료 효과를 가진 단백질 생성물을 암호화하는 임의의 유전자를 언급하는 것으로 이해한다. 따라서 암호화된 단백질 생성물은 단백질, 펩티드 등일 수 있다. 이러한 단백질 생성물은 표적 세포(즉 표적 세포가 아무런 병리를 나타내지 않을 때 표적 세포에서 정상적으로 발현되는 생성물)에 대해 상동성이다. 이러한 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포에서 불충분한 발현 또는 변이때문에 불활성 또는 약하게 활성인 단백질의 발현, 또는 대안적으로 상기 단백질의 과발현을 극복하는 것이 가능하다. 치료 유전자는 증가된 안정성, 변이된 활성 등을 가진 세포 단백질의 돌연변이를 암호화할 수 있다. 단백질 생성물은 또한 표적 세포에 대해 불균일할 수 있다. 예를들면, 이러한 경우에, 발현된 단백질은 세포내에서 결손된 활성을 보충하거나 제공하여 병리와 싸우거나 면역 반응에 자극을 주는 것을 가능하게 한다.
본 발명에서 특히 언급될 수 있는 치료 생성물 중에는 효소, 혈액 유도체,호르몬, 림포킨, 인터루킨, 인터페론, TNF등(FR 92/03120), 성장 인자, 신경전달물질 또는 이들의 프로모터 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레오트로핀등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR91/11947), 뮤코비시도시스와 관계된 CFTR 단백질, 종양-억제 유전자 p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev등(FR93/04745) 응고에 관계된 인자, 즉 인자 VII, VIII, IX를암호화하기 위한 유전자, DNA 재생에 관련된 유전자, 자기불활화 유전자(티미딘 키나제, 시토신 디아미나제), 헤모글로빈 유전자 또는 다른 전달 단백질의 유전자, 지질의 대사에 관련된 단백질에 상응하는 유전자, A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 아포(a)아포리포단백, 예를 들면, 지질단백질 리파아제, 간 리파제, 레시틴 콜레스트롤 아실트랜스퍼라제, 7-알파-콜레스테롤 하이드록실라제 및 포스파티드산 포스파타제, 또는 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 및 인지질 전달 단백질, HDL-결합 단백질 같은 지방 전달 단백질 또는 예를 들면, LDL 수용체, 카이로마이크론-렘넌트 수용체 및 스캐빈저 수용체등으로부터 선택된 수용체등이다.
치료 핵산은 또한 안티센스 서열 또는 표적 세포에서 발현이 유전자의 발현 또는 세포성 mRNA의 전사를 조절하는 것을 가능하게 하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 이러한 서열은 표적 세포에서 세포성 mRNA의 상보적 RNA로 전사될 수 있고, 유럽 특허 제 140,308 호에 기재된 기술에 따라 이의 단백질로의 해독이 블럭된다. 치료적 유전자는 또한 선택적으로 표적 RNA를 파괴할 수 있는 리보자임을 위한 서열 암호를 포함한다(EP 321,201).
상기에서 지적한 바와 같이, 핵산은 또한 사람 또는 동물에서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 따라서, 본 특정 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물, 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대한 백신 또는 면역치료적 처리를 생성하는 것을 가능하게 한다. 이들은 특히 엡스타인 바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185,573), 의(pseudo) 광견병 바이러스, 합포체-형성 바이러스, 다른 바이러스 또는 종양에 특이한 항원성 펩티드일 수 있다(EP 259,212).
바람직하게는, 핵산은 또한 치료 유전자 및/또는 바람직한 세포 또는 기관에서 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들 서열은 이러한 서열이 감염된 세포에서 기능할 수 있을 때 고려된 유전자의 발현을 자연적으로 책임진다. 이들 서열은 또한 다른 기원(다른 단백질, 또는 심지어는 합성 단백질의 발현을 책임지는)의 서열일 수 있다. 특히, 진핵성 또는 바이러스성 유전자를 위한 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터의 서열일 수 있다. 유사하게는, 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이에 대해서, 예를 들면 유전자 E1A, MLP, CMV, RSV등의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성화 서열, 조절 서열 등의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 핵산은 또한 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다.
추가로, 핵산은 또한 치료 유전자의 특정 업스트림, 표적 세포의 분비 경로로 합성된 치료적 생성물을 지정하는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 본 시그널 서열은 치료 생성물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 또한 임의의 다른 기능성 시그널 서열, 또는 인공 시그널 서열일 수 있다. 핵산은 또한 세포의 특정 부분에 대한 합성된 치료적 생성물을 지정하는 시그널 서열을 함유할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 핵산, 청구된 리포폴리아민 및 리포폴리아민/핵산 복합체와 회합될 수 있고 이의 형질감염을 향상시킬 수 있는 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 출원인은 실제로 리포폴리아민의 형질감염력이 뜻밖에도 리포폴리아민/핵산 복합체와 회합될 수 있는 특정 보조제(예를 들면, 지방 또는 단백질)의 존재하에서 증가된다는 것을 보여 주었다.
더 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 보조제로서의 하나 이상의 중성 지질을 포함한다. 이러한 조성물은 특별히 R 비율이 낮을 때 특히 유리하다. 본 출원인은 실제로 중성 지질을 첨가하면 뉴클레오리피드 입자의 형성을 향상시키는 것을 가능하게 하여, 놀랍게도, 세포 막을 불안정화시킴으로써 세포내로 입자의 침투를 증가시킨다는 것을 보여주었다.
더 바람직하게는, 본 발명의 내용에서 사용된 중성 지질은 2개의 지방쇄를 함유하는 것이다.
특리 유리한 방법으로, 생리학적 조건에서 쯔비터이온성, 또는 이온성 전하가 없는 중성 또는 합성 지질이 사용된다. 지질은 특히 디올레오일포르파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE) 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3배 N-메틸화된 이의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(특히 갈락토세레브로사이드), 스핑고리피드(특히 스핑고미에린) 또는 대안적으로 아시아로갱글리오사이드(특히 아시아로GM1 및 GM2)중에서 선택될 수 있다.
이러한 다양한 지질은 당해 분야의 숙련인에게 잘 공지된 표준 기술에 의해 합성하여 수득하거나 또는 기관(예: 뇌) 또는 난으로부터의 추출로 수득될 수 있다. 특히, 중성 지질의 추출은 유기 용매를 사용하여 수행될 수 있다(또한 Lehninger, Biochemistry 참조).
본 발명의 조성물은 바람직하게는 1 당량의 화학식 I의 화합물 당 0.1 내지 20, 더 바람직하게는 1 내지 5당량의 보조제를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등의 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 특히 원하는 기관에 직접 주사하거나 또는 국소 투여(피부 및/또는 점막)하기위한 주사제에 대해 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유하는 것이 바람직하다. 조성물은 특히 멸균의 등장성 용액이거나, 또는 멸균수 또는 생리학적 식염수를 첨가하여 주사액으로 제조할 수 있는 건조 조성물, 특히 동결-건조 조성물일 수 있다. 주입에 사용되기 위한 핵산의 용량 및 투여의 횟수는 각종 변수, 특히 사용된 투여의 형태, 관여된 병리, 발현될 유전자 또는 대안적으로 원하는 치료 기간에 따라 달라질 수 있다. 투여의 형태에 대해, 부가로 언급하자면 투여 형태는 조직내로의 직접 주입할 수 있거나, 또는 배양물내 세포를 처리하고 이어서 이들을 주입 또는 그래프트에 의해 생체내 재이식하는 형태일 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 조건하에서 화학식 I의 화합물가함께 질병을 고칠 수 있는 핵산의 생체내 또는 시험관내 투여를 포함하는 질병의 치료를 위해 특히 유리한 방법을 제공한다. 특히, 본 방법은 단백질 또는 핵산 생성물의 결핍으로부터 기인한 질병에 적용될 수 있고 투여된 핵산은 단백질 생성물을 암호화하거나 핵산 생성물을 함유한다.
본 발명은 세포의 생체내 또는 시험관내 형질감염을 위한 본 발명에 따른 리포폴리아민의 임의의 사용을 포함한다.
본 발명은 비-제한 예시로서 고려되야 하는 다음의 실시예를 사용하여 더 충분히 기술될 것이다.
약칭과 기호
EtOAc : 에틸 아세테이트
BOP : 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DCC : 디시클로헥실카보디이미드
DCU : 디시클로헥실우레아
DMAP : 4-디메틸아미노피리딘
DMF : 디메틸포름아미드
DMSO : 디메틸 술폭사이드
DODA : 디옥타데실아민
PE : 석유 에테르
EtOH : 에탄올
Et3N : 트리에틸아민
Rf : 정면 체류 계수
TFA : 트리플루오로아세트산
THF : 테트라하이드로퓨란
TMS : 테트라메틸실란
UV : 자외선
장비 및 방법
A. 사용된 생성물
Fluka의 DODA, Et3N, TFA, L-오르니틴, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드, 라니 니켈 및 디글리콜 무수물; 프로펩티드로부터 프랑스의 BOP; Aldrich의 이소부틸 클로로포르메이트 및 N-메틸모르포린. Merck의 THF; 사용된 기타 모든 용매는 RP Prolabo 제품이다. NaCl 및 NaHCO3용액은 포화된 것이고 KHSO4용액은 0.5 M이다.
B. 물리적 측정
양성자 핵 자기 공명 스펙트럼(1H NMR)가 Bruker 스펙트로미터상에 기록된다.
화학적 이동은 TMS에 대해 ppm 단위로 표현된다.
C. 실리카상 크로마토그래피
박층 크로마토그래피(TLC)가 0.2 mm 두께 Merck 실리카 겔 플레이트상에서수행된다.
가시화:
- UV (254 nm)
- 닌하이드린으로 아민 또는 아미드를 가시화하기 위해 닌하이드린의 에탄올성 용액(40 mg/100 mℓ EtOH)을 150℃까지 기화
- 플루오레스카민으로 1급 아민을 가시화하기 위해 용액(40 mg/ 100 mℓ아세톤)을 기화
- 플레이트를 요오드 분말 컬럼 크로마토그래피로 전환시킴이 입자 크기 0.063-0.200 mm의 Merck 60 실시카 겔 상에서 수행된다.
실시예 1
2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트의 합성
[화학식]
Figure pct00007
1. a테트라메틸암모늄 2,5-비스(2-시아노에틸아미노)펜타노에이트(1. a)의 제조
(S)-2,5-디아미노펜타노산(L-오르니틴)모노하이드로클로라이드(6.74 g, 40 mmol) 및 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 5수화물(14.48 g, 80 mmol)을 메탄올(20 mℓ)에 용해시킨다. 형성된 물과 메탄올을 감압(오일 펌프 사용)하에서 증발시켜 건조 잔류물을 수득한다.
N,N-디메틸포름아미드(30 mℓ)를 상기에서 수득한 염에 첨가한다. 혼합물을 질소로 가스 제거시키고 10분 동안 격렬하게 교반시켜서 테트라메틸암모늄 2,5-디아미노펜타노에이트가 용해되도록 한다(테트라메틸암모늄 클로라이드가 DMF내 현탁액으로 잔류한다).
아크릴로니트릴(6 mℓ, 85.6 몰)을 적가하고; 플라스크를 천천히 가온한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 질소하에 둔다. 이어서 테트라메틸암모늄 클로라이드를 제거하기 위해서 여과한다. DMF를 감압하에 증발시킨다. 수득된 잔사는 오일성 액체이고; 회전식 증발기로부터 제거될 때 고체화된다. 아세토니트릴(100 mℓ)를 첨가하고, 투명한 용액이 수득될 때까지 플라스크를 천천히 가열한다. 탁한 용액이 수득될 때까지 THF를 첨가한다. 플라스크를 2일 동안 냉동기에 보관하고: L-2,5-비스(2-시아노에틸아미노)펜타노산의 테트라메틸암모늄 염을 여과에 의해 백색 고체의 형태로 회수한다. 소결기상에서 THF로 세정하고 이어서 P2O5로 건조한다. 6.06 g이 수득된다 (49%(조)의 수율과 동등).
1.b 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜타노산의 테트라메틸암모늄 염(1.b)의 제조
생성물 1.a를 에탄올(18 mℓ), 물(2 mℓ) 및 2 M 수산화칼륨(5 mℓ)의 혼합물에 용해시킨다. 용액을 아르곤으로 관류시킨다. 라니 니켈(2 mℓ의 플러카 현탁액)을 첨가한다. 오토클레이브에서 수소화를 수행하고, 26℃에서 질소로 관류시킨다. 3시간 후에, 압력을 50.6 에서 44.7 bar로 강하하고, 이어서 1시간 이상동안 안정시킨다. 오토클레이브는 250 mℓ의 용량을 갖고, 반응 혼합물은 30 mℓ이다. 수득된 현탁액을 여과하고, 물로 세정하고, 회전식 증발기에 배치한다. 노란색 오일이 수득된다. 플루오레스카민 시험은 양성이다.
1.c 2,5-비스{tert-부톡시카보닐[3-(tert-부톡시카보닐아미노)프로필]아미노}펜타노산(1.c)의 제조
생성물 1.b를 디옥산(30 mℓ)에 용해시킨다. 디-tert-부틸 디카보네이트(17.46 g; 80 mmol)을 적가한다. 혼합물을 밤새 교반한다. 디옥산을 증발시킨다. KHSO4를 첨가한다. 생성물을 CHCl3(3 x 100 mℓ)로 추출한다. 이어서 유기상을 NaHCO3(pH=7.5)와 NaCl로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 감압하에서 증발시킨다. 10g의 생성물이 수득된다 (15.4 mmol, 오르니틴에 관하여 39%의 수율과 동등).
HPLC : MeCN/H2O : 0-3분 50% MeCN, 3-20분 50-100% MeCN, 20-40분 100% MeCN, K'=7.96 (RP-18 컬럼, 유동 비율 = 1 mℓ/분)
TLC : Rf(CHCl3: EtOAc ; 95 : 5 (v : v)) = 0.28
NMR (ppm) : 1.3 (m, 8H, N+CH2-CH2-CH2-CHN+COO/ 2x N+CH2CH2CH2N+) ; 2.7-3.0 (m, 10H 5x N+CH2) ; 3.8 (t, 1H, N+CHCOO)
MS : MH+= 647, (MW = 646)
1.d 2,5-비스{tert-부톡시카보닐[3-(tert-부톡시카보닐아미노)프로필]아미노}펜탄-1-올(1.d)의 제조
L-5-카복시테트라-tert-부톡시카보닐스퍼민 (1.94 g, 3 mmol)을 30 mℓ의 THF내에 용해시킨다. 370 mℓ (3.1 mmol)의 N-메틸모폴린을 마이크로피펫을 사용하여 도입한다. 질소하에 배치된 반응 혼합물을 (카디스와 에틸렌 글리콜의 조에서) -15℃로 냉각하고; 이어서 390 mℓ (3.1 mmol)의 이소부틸 클로로포메이트를 첨가한다. 3분 후에 반응 혼합물을 4℃에서 20 mℓ의 물에 용해된 NaBH4(2g)를 함유하는 비이커에 붓는다. THF를 증발시킨다. KHSO4를 첨가한다 (pH = 7로). 생성물을 EtOAc로 추출하고, NaHCO3와 NaCl로 세정하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 이어서 증발시킨다. 1.15 g이 수득된다 (61% 수율과 동등).
TLC는 두 점을 부여한다; 따라서 동일한 용출제로 실리카 컬럼상의 분리가 수행되고 0.97 g의 생성물(노란색 오일)을 수득한다. 분리에 대한 수율은 84%이다.
환원에 대한 수율은 51%이다.
TLC : Rf (PE : EtOAc ; 1 : 1(v : v) = 0.24
NMR (ppm) : 1.42 (s, 4xBoc) : 1.5-1.7 (m, 8H N+CH2-CH2-CH2-CHN/2xN+CH2CH2CH2N) ; 2.85-3.2 (m, 10H 5x NCH2), 3.4 (m, 1H, NCHCH2OH), 3.7 (d, 2H, CH2OH), 6.8 (m, 2H , NH)
MS : MH+= 633. MW = 632
1.e 2.5-비스[3-(tert-부톡시카보닐아미노)프로필-{tert-부톡시카보닐아미노}펜틸옥시카보닐메톡시 아세트산(1.e)의 제조
생성물 1.d의 0.51 g (0.806 mmol)을 10 mℓ의 CH2Cl2에 용해시키고; 2 eq의 디글리콜 무수물 (1.535 mmol ; 0.178 g), 2.2 eq의 트리에틸아민 (1.687 mmol ; 235 μℓ) 및 5 mg의 DMAP를 첨가한다. 1시간 후, 알콜이 반응하는 것을 보여주는 TLC와 함께 CH2Cl2를 첨가하고, 이어서 혼합물을 3 x 50 mℓ의 KHSO4와 3 x 50 mℓ의 NaCl로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조하고 여과하고 이어서 증발시킨다. 0.26 g의 고체가 수득된다 (43%의 수율과 동등).
TLC : Rf (CHCl3: MeOH : AcOH ; 90 : 80 : 2(v : v : v)) = 0.75
MS : MH+= 749, MW = 748
1.f 2,5-비스{tert-부톡시카보닐[3-(tert-부톡시카보닐아미노)프로필]아미노}펜틸디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트(1.f)의 제조
상기 생성물 (0.164 mmol) 0.123 g, 1 eq (0.0856 g)의 디옥타데실아민, 3 eq의 트리에틸아민 (68.4 mℓ) 및 1.1 eq (0.0798 g)의 BOP를 CHCl3에 용해시킨다.반응 혼합물을 실온에서 교반한다. 2시간 후, 100 mℓ의 CH2Cl2를 첨가하고, 혼합물을 3 x 100 mℓ의 KHSO4, NaHCO3, NaCl로 연속적으로 세척하고 (pH = 7로), 건조하고 이어서 증발시킨다. 0.13 g의 생성물이 수득된다 (63% 수율과 동등).
TLC : Rf (PE : EtOAc : 1 : 1 (v : v) = 0.62 ; 요오드, 닌하이드린 및 플루오레스카민으로 가시화
NMR (ppm) 0.90 (t, J = 7.5 Hz, 6H ; CH3, 1.20-1.75 (m, 108H : CH2/C(CH3)3), 3.05-3.35 (m, 14H : CH2N), 4.15-4.35 (m, 3H : NCHCH2OCO), 4.23-4.27 (2s, 2x 2H, OCH2CO), 4.5-5.5 (넓은 m, 2H : NH)
MS : MH+= 1252. MW= 1251
원소 분석 실험식 : C71H137N5O12
% 이론치 : C68.06 H 11.02 N 5.59
% 실측치 : C 67.14 H11.93 N 5.86
1.g 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트(1.g)의 제조
1 mℓ의 TFA를 1.5 mℓ "에펜도르프(Eppendorf)"?시험관 내의 생성물 1.f(0.02 mmol) 0.025 g에 첨가하고 1시간 동안 실온에 둔다. TFA를 증발시킨다.
500 μℓ의 에탄올을 첨가하여 생물학적 시험을 요구하는 40 mM의 용액을 수득한다.
MS : MH+= 852, MW = 851
실시예 2
1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 (2.f)의 제조
[화학식]
Figure pct00008
2.a 1,3-비스(2-시아노에틸아미노)프로판-2-올(2.a)의 제조
3.6 g (40 mmol)의 1,3-디아미노프로판-2-올을 75 mℓ의 메탄올에 용해시킨다. 5.76 mℓ (80 mmol)의 아크릴로니트릴을 15분에 걸쳐서 첨가한다. 플루오레스카민 시험은 양성이다. 반응 혼합물은 무색이 된다. 실온에서 밤새 교반한다. 플루오레스카민 시험은 음성이다. 메탄올을 증발시킨다. 7.9 g의 생성물이 수집된다 (조 생성물에 대해 100% 수율).
2.b 1,3-비스(2-아미노프로필아미노)프로판-2-올(2.b)의 제조
수소화가 오토클레이브에서 수행되고, 27℃에서 질소로 관류시킨다.
생성물 2.a를 15 mℓ의 메탄올, 10 mℓ의 에탄올 및 5 mℓ의 KOH(2 M)의 혼합물에 용해시킨다. 용액을 아르곤으로 관류시키고, 4 mℓ의 라니 니켈 현탁액을 오토클레이브에 첨가한다.
3시간 30분 후, 압력을 51.6 에서 37.6 bar로 강하한 다음 한시간 이상 동안 안정시킨다. 오토클레이브는 250 mℓ의 용량을 갖고, 반응 혼합물은 30 mℓ이다. 수득된 현탁액을 여과하고, 물로 세정하고, 회전식 증발기에 배치한다. 노란색 오일이 수득된다. 플루오레스카민 시험은 양성이다.
2.c 1,3-비스{3-tert-부톡시카보닐아미노(tert-부톡시카보닐아미노프로필)-2-프로판-2-올 (2.c)의 제조
생성물 2.b는 1.c에서와 동일한 방법으로 보호된다. 100 mℓ의 CH2Cl2을 첨가한다. 100 mℓ의 디옥산에 용해된 39.2 g (179 mmol)의 디-tert-부틸 디카보네이트를 적가한다. 용액을 72시간 동안 교반한다. 용매를 증발시키고 KHSO4를 첨가한다. 생성물을 EtOAc (3 × 100 mℓ)로 추출하고; 상을 합하고 KHSO4, NaHCO3, NaCl로 연속적으로 세정하고, MgSO4로 건조하고 증발시킨다. 20 g이 수득된다(초기 생성물에 관하여 83% 수율).
생성물을 PE로부터 결정화한다.
TLC : Rf (PE : EtOAc ; 1 : 1(v : v)) = 0.23
Rf (PE : EtOAc ; 1 : 2 (v : v)) = 0.63
NMR (ppm) : 1.4 (2s, 36H : 4 x (CH3)3) ; 1.65 (qt, 4H ; 2 x NCH2CH2CH2NH); 2.95 (q, 4H ; 2 x NHCH2CH2) ; 3.1 (2d, 4H ; NCH2CHCH2N) ; 3.2 (t, 4H ; NCH2CH2) ; 3.85 (m, 1H ; OH) ; 5.9 (s, 2H ; NH)
MS : MH+= 605, MW = 604
2.d 1,3-비스{3-tert-부톡시카보닐아미노(tert-부톡시카보닐아미노프로필}-2-프로필-2-에톡시카보닐메톡시아세트산(2.d)의 제조
생성물 2.c의 604 mg(1 mmol)을 20 mℓ의 CH2Cl2에 용해시킨다. 2 eq의 무수물 (2 mmol ; 0.232 g), 2.2 eq의 Et3N(307 μℓ와 이어서 100 μℓ) 및 6.5 g의 DMAP를 도입한다. 24시간 동안 실온에서 교반한 후, CH2Cl2를 첨가하고, 혼합물을 KHSO4, NaCl로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고 이어서 증발시킨다. 0.156 g의 생성물이 수득된다 (22%의 수율).
TLC : Rf (CHCl3: MeOH : AcOH ; 90 : 8 : 2(v : v : v) = 0.71
NMR (ppm) : 1.2-1.4 (2s, 36H 4 x (CH3)3) : 1.5 (m, 4H : 2 x NHCH2CH2CH2N), 2.85 (q, 4H, 2 x NHCH2CH2) ; 3.1 (m, 8H ; 4 x NCH2) ; 3.9-4.2(2s, 4H ; 2 x OCH2COO) ; 5.25 (m, 1H : CH2CHCH2) ; 6.7 (2H ; NH)
MS : MH+= 721, MW = 720
2.e 1,3-비스{3-tert-부톡시카보닐아미노(tert-부톡시카보닐아미노프로필}-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트(2.e)의 제조
0.216 mmol의 산 2.d를 3 mℓ의 CHCl3에 용해시킨다. 1 eq의 DODA (0.113 g), 3 eq의 Et3N (100 μℓ) 및 1.1 eq의 BOP (0.11 g)을 첨가한다. 반응 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반한다. CHCl3를 증발시킨다. 100 mℓ의 EtOAc를 첨가한다. 유기상을 HCl (0.5 M), NaHCO3, NaCl로 연속적으로 세척하고 (pH=7로), MgSO4로 건조하고, 이어서 증발시킨다. 0.185 g이 수득된다 (70% 수율). 컬럼이 실리카에서 수행된다. 100 mg의 생성물이 수집된다 (42%의 수율).
TLC : Rf (CHCl3: MeOH : AcOH ; 90 : 8 : 2(v : v : v))=0.81
Rf (PE : EtOAc ; 1 : 1(v : v)) = 0.67
NMR (ppm) 0.85 (t, 6H ; 2 x CH3) ; 1.20-1.55 (m, 100H ; CH2/C(CH3)3), 1.6 (m, 4H ; 2 x NHCH2CH2CH2N) ; 3.05-3.4 (m, 16H, 2 x NHCH2CH2CH2N/NCH2CHCH2N/2 x CH2N) ; 4.1 (s, 2H ; NCOCH2O) ; 4.15 (s, 2H ; OCH2COO) ; 5.25 (m, 1H ; CH2CH2), 6.15 (m, 2H ; NH)
MS : MH+= 1224, MW = 1223
2.f 1,3-비스{3-tert-부톡시카보닐아미노(tert-부톡시카보닐아미노프로필}-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트(2.f)의 제조
1 mℓ의 TFA를 1.5 mℓ의 "Eppendorf"?시험관 내의 생성물 2.e (0.021mmol) 0.0247 g에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 실온에 둔다. TFA를 증발시킨다.
505 μℓ의 에탄올을 첨가하여 생물학적 시험을 필요로하는 40 mM의 용액을 수득한다.
MS : MH+= 824, MW = 823
실시예 3 ; 2-(3-아미노프로필아미노-1-(3-아미노프로필아미노메틸)에틸(N,N-디옥타데실)숙시나메이트의 제조
[화학식]
Figure pct00009
이러한 화합물이 실시예 2에서 기재된 절차에 따라서 디글리콜산을 숙신산으로 치환함으로써 제조된다.
이렇게 수득된 생성물의 질량 분광 측광 분석은 예상되는 질량에 따라서 MH+분획 808을 나타낸다.
유전 물질의 시험관내 형걸감염을 위한 본 발명에 따른 리포폴리아민의 사용
A. 시험관내 유전자 전달에 사용되는 플라스미드
플라스미드 pCMV-LUC가 사용된다. 이것은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 프로모터를 함유하는 분획 Mlu I- Hind III의 삽입에 의해 플라스미드 pGL2-기본 벡터(Promega) 또는 플라스미드 pGL2-조절 벡터(Promega)로부터 유도되고 벡터 플라스미드 pcDNA3 (Invitrogen)로부터 추출된 "루시페라제(luciferase)" 리포터 유전자를 함유하는 작제물이다.
B. 형질감염에 사용된 용액의 제조 절차
상기 실시예에 따라서 제조된 리포폴리아민을 에탄올에 40 mM 농도로 용해시키고 이어서 에탄올 농도를 10% 이하로 유지하면서 에탄올/물 혼합물에 희석시킨다.
형질감염될 핵산 용액을 생리 식염수 (0.15 M NaCl)로 희석하고 이어서 1/1비 (v/v)로 리포폴리아민 용액에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 와동 균질화 및 배양한 후, DNA/리포폴리아민 용액을 세포가 단백질-유리 배양 배지(혈청)로 세척된 웰에 최종 농도 9% (v/v)로 부여한다.
실시예 4
형질감염 효율에 대한 전하 비(아민/포스페이트)의 영향
2 cm2의 대수기 성장 상의 1x105NIH 3T3 세포의 샘플을 5% CO2하에 37℃에서 4시간 동안 다양한 전하 비를 갖는 리포폴리아민/pCMV-LUL 용액으로 처리한다; 각각의 샘플에 1 μℓ의 핵산을 수령한다. 태 송아지(calf) 혈청을 최종 농도 8%로 첨가하고 CO2오븐에서 40시간 동안 배양한 후, 리포터 유전자의 발현에 대한 조사가 수행된다.
루시페라제 활성은 20초 동안 루시페린, 조효소 A 및 ATP의 존재하에 광 방출 [RLU = 상대적인 광 단위]에 의해서 분석되고, 세포 용혈 후 수득된 상등액의 단백질 1μℓ에 관하여 발현된다. 수득된 결과가 하기 표 1에 기재되어 있다.
[표 1]
Figure pct00010
각각의 값은 별개의 세가지 시험의 평균에 해당한다.
이러한 실험은 본 발명에 따른 리포폴리아민이 이들의 발현을 위해 필요한 조건하에서 유전자의 전달을 허용한다는 것을 명백히 나타낸다.
실시예 5
DNA/리포폴리아민 혼합물 중의 핵산 농도의 영향
상기 실시예에 기재된 것과 동일한 절차에 따라서, DNA의 다양한 농도가 동일한 전하 비에 사용되는 조건하에 NIH 3T3 세포를 DNA/리포폴리아민 혼합물로 처리한다. 이러한 경우에, 루시퍼라제 활성은 20초 동안 측정되고, 2.5x103처리 세포로 수행된다. 결과는 하기의 표 2와 표 3에 제시하였다.
[표 2]
실시예 1의 리포폴리아민
Figure pct00011
[표 3]
실시예 2의 리포폴리아민
Figure pct00012
각각의 값은 별개의 세가지 시험의 평균에 해당한다.
괄호 안에 부여된 값은 %로 표시된 변이계수에 해당한다.
본 발명은 리포폴리아민 계열에 속하는 신규 화합물, 이를 함유하는 약학 조성물 및 핵산의 생체내 및/또는 시험관내 형질감염을 위한 이의 적용방법에 관한 것이다.

Claims (23)

  1. 화학식 1로 표현됨을 특징으로 하는 D, L 또는 DL형의 리포폴리아민 또는 이의 염으로서,
    Figure pct00013
    상기 식에서,
    m은 2 내지 6의 정수이고,
    n은 1 내지 9, 보다 바람직하게는 1 내지 5의 정수이며, n이 2 내지 9일 때, 수소 이외의 단일 그룹 R로 상기 화학식에 존재하고 m 값은 각종 그룹
    Figure pct00014
    및 -(CH2)m에서 같거나 다르며,
    R은 수소 원자이거나 화학식 2의 라디칼이고,
    Figure pct00015
    X 및 X'은 각각 독립적으로 산소 원자, 메틸렌 그룹 -(CH2)q-(여기에서, q는 0, 1, 2 또는 3이다), 또는 아미노 그룹 -NH- 또는 -NR'-(여기에서, R'은 C1-C4알킬 그룹이다)이며,
    Y 및 Y'은 각각 독립적으로 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 C=S 그룹이고,
    R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자이거나 치환되거나 비치환된 C1-C4알킬 라디칼이며, p는 0 내지 5의 범위일 수 있으며,
    R6는 콜레스테롤 유도체 또는 알킬아미노 그룹 -NR1R2(여기에서, R1및 R2는 각각 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 포화 또는 불포화 C12-C22지방족 라디칼이다)인 리포폴리아민 또는 이의 염.
  2. 제1항에 있어서, R이 바람직하게는 화학식 2' 로 표현됨을 특징으로 하는 리포폴리아민으로서,
    Figure pct00016
    상기 식에서,
    R3, R4, R5, R6및 p는 제 1 항에서 정의한 바와 같고,
    X는 산소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-(여기에서, q는 0이다)인 리포폴리아민.
  3. 제1항에 있어서, D, L 또는 DL형의 하기 화합물 또는 이의 염 중 하나임을특징으로 하는 리포폴리아민.
    Figure pct00017
  4. 제1항에 있어서, D, L 또는 DL형의 하기 화합물 또는 이의 염 중 하나임을 특징으로 하는 리포폴리아민.
    Figure pct00018
  5. 제1항에 있어서, D, L 또는 DL형의 하기 화합물 또는 이의 염 중 하나임을 특징으로 하는 리포폴리아민.
    Figure pct00019
  6. 제1항에 있어서, D, L 또는 DL형의 하기 화합물 또는 이의 염 중 하나임을 특징으로 하는 리포폴리아민.
    Figure pct00020
  7. 유전자 결손 또는 핵산의 비정상 발현으로부터 발생하는 질병, 또는 미생물 또는 바이러스의 감염으로부터 발생하는 질병, 또는 암의 치료를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 리포폴리아민 및 적어도 하나의 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 핵산이 리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형됨을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 핵산이 안티센스 핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제7항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 치료 유전자가 A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 아포(a)아포리포단백질 중에서 선택된 아포리포단백질, 지질단백질 리파제, 간 리파제 또는 기타 리파제, 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 7-α-콜레스테롤 하이드록실라제, 포스파티드산 포스파타제와 같은 효소, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 및 인지질 전달 단백질과 같은 지질 전달 단백질, HDL- 결합 단백질, 또는 LDL 수용체, 카이로마이크론-잔기 수용체 및 스캐빈저 수용체 중에서 선택된 수용체와 같이 지질의 대사에 관여하는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
  14. 유전자 결손 또는 핵산의 비정상 발현으로부터 발생하는 질병, 또는 미생물 또는 바이러스의 감염으로부터 발생하는 질병, 또는 암의 치료를 위한, 핵산, 제1 항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 리포폴리아민 및 리포폴리아민/핵산 복합체와 회합할 수 있고 이의 형질감염력을 향상시킬 수 있는 보조제를 포함하는 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 보조제가 하나 이상의 중성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 중성 지질(들)이 생리학적 조건하에서 쯔비터이온성이거나 이온 전하가 없는 중성 또는 합성 지질 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 중성 지질(들)이 2개의 지방쇄를 함유하는 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 중성 지질(들)이 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민 및 이들의 1 내지 3 회 N-메틸화된 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(특히, 갈락토세레브로사이드), 스핑고리피드(특히, 스핑고마이엘린) 및 아시알로강글리오사이드(특히, 아시알로GM1 및 GM2) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 리포폴리아민 1당량당 보조제 0.1 내지 20당량을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제7항에 있어서, 주사제에 약학적으로 허용되는 부형제를 포함함을 특징으로하는 조성물.
  21. 제7항에 있어서, 피부 및/또는 점막 적용에 약학적으로 허용되는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  22. 생체내 및 시험관내에서 세포를 형질감염시키는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 리포폴리아민.
  23. 제19항에 있어서, 리포폴리아민 1당량당 보조제 1 내지 5당량을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
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