JP2010538647A - 植物における生理的応答を改変するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

植物細胞におけるエチレン応答の制御可能な発現のための遺伝子発現系は、応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメインおよび活性化ドメインを含む活性化カセットと、応答エレメントおよび活性化ドメインに対して応答性の最小プロモーターを動作可能に関連して含む誘導性プロモーターを含むターゲットカセットとを含む。この遺伝子発現系は、エチレン感受性を制御する誘導用組成物の存在下で、トランスジェニック植物細胞、組織、器官および植物全体におけるエチレンに対する感受性を変調する。このようなトランスジェニック植物および組織におけるエチレン感受性は成熟、花の老化および植物の他のエチレン感受性機能を操作する目的で制御されうる。
【選択図】図１

Description

植物における生理的応答を改変するための組成物および方法に関する。

植物ホルモンであるエチレンは、植物のライフサイクルを通じて多くの生理的プロセス、例えば、発芽、花の発生および果実の発生中の応答、並びに干ばつ、高温、過剰な塩分および病気のような様々な環境ストレス因子に対する植物の応答などを調節するシグナル伝達分子である（例えば、Ｃｈｅｎら、２００５年、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ、９５：９０１−９１５；Ｃｚａｒｎｙら、２００６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２４：４１０−４１９を参照）。エチレン生合成経路およびシグナル伝達／調節経路およびネットワークは充分に説明されている。例えば、Ｗａｎｇら「エチレン生合成およびシグナル伝達ネットワーク」Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２００２年（編集：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ（米国植物生理学会））ページＳ１３１−Ｓ１５１の図１および２を参照。植物、例えば、果実および野菜および花などにおけるエチレン応答を調節するための商業的に一般的な方法は、その植物、果実、花または野菜に、１−メチルシクロプロペン（１−ＭＣＰ；ＡｇｒｏＦｒｅｓｈ，Ｉｎｃ．）のような化学物質の適用を含む。１−ＭＣＰは、エチレンが植物組織内のその受容体に結合するのを妨げる、植物成長調節剤として使用される気体として一般的に送達される化合物である。それにより、その適用は植物のエチレン非感受性を増大させる。エチレン感受性の一時的な消耗は、ストレス、成熟遅延、老化または開花、特に商業的に価値のある植物成長の操作に対する植物の抵抗性または耐性を増大させうる。

より最近では、例えば、米国特許６，２９４，７１６号；米国特許出願公開第２００６／０２００８７５号、第２００５／００６６３８９号、第２００５／００６０７７２号および第２００４／０１２８７１９号などにおけるように、改変されたエチレン応答受容体または植物のエチレン応答に関与する他のタンパク質で植物細胞を遺伝的に形質転換する提案が示唆されてきてきた。このような系は、エチレン経路における様々な変異遺伝子の発現に関するものである。これらの系は、概して、そのタンパク質の発現を駆動する様々な示唆されたプロモーター、例えば、構成的プロモーターおよび組織特異的プロモーターを使用する。

一般的に植物における使用のために、化学的に制御された遺伝子発現系の使用が提案されてきたが（Ｍ．Ｐａｄｉｄｉｍ ２００３ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，６（２）：１６９−７７）、多くのこのような系は実験室的なだけであるか、または特定の不利益を有していると報告されてきた。これらの不利益には、問題の中でも特に、毒性もしくは揮発性誘導剤の使用、低い誘導レベル、植物内での劣った移行／移動、遺伝子の発現をゆっくり「オフにする」能力、または植物に対して非毒性の誘導剤に対する不充分な特異性がある。このような遺伝子発現系は全ての植物において普遍的に有用なわけではなく、操作可能な構成要素の選択とその組み立ては多くの場合困難である。

先行技術の例においては、エチレン経路遺伝子の発現は典型的には植物の全ての組織および部分において常にオンであるか、または植物の特定の組織において常にオンである。しかし、組織特異性プロモーターまたは低レベルの構成的プロモーターは刺激なしで低水準で弱く発現しうる（ｌｅａｋｙ）か、または望まれない誘導剤で誘導されうる。このような従来のプロモーターは、植物におけるホルモン発現の厳密な調節を可能にしない。エチレン経路遺伝子発現のタイミング、期間およびレベルは正常な生理的機能のために重要である。自由自在のおよび所定の期間のエチレン非感受性の誘導は従来技術によって成功裏に実証されてこなかった。

米国特許６，２９４，７１６号明細書 米国特許出願公開第２００６／０２００８７５号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６０７７２号明細書 米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号明細書

Ｃｈｅｎら、２００５年、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ、９５：９０１−９１５；Ｃｚａｒｎｙら、２００６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２４：４１０−４１９ Ｗａｎｇら「エチレン生合成およびシグナル伝達ネットワーク」Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２００２年（編集：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ（米国植物生理学会））ページＳ１３１−Ｓ１５１の図１および２ Ｍ．Ｐａｄｉｄｉｍ ２００３ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，６（２）：１６９−７７

農作物および食材において、並びに他の植物において使用するのに安全な、植物のホルモン応答、例えば、エチレン感受性の制御可能な一時的調節を可能にする組成物および方法についての必要性が当該技術分野において存在している。

本明細書に記載される組成物および方法は、エチレン感受性の調節が確実かつ安全に、例えば、一時的、定性的および／または定量的な方法で制御されうる、トランスジェニック植物、植物細胞、組織、器官、果実または花を提供することにより、当該技術分野における必要性を満たす。これらの組成物および方法は、農作物および食材において、並びに他の商業的に価値のある植物において使用するのに安全な、遺伝子発現およびこれによるホルモン発現の厳密な調節を示す。

ある実施形態においては、遺伝子発現系は植物細胞におけるエチレン応答の制御可能な発現のために提供される。この系は活性化カセットとターゲットカセットとを含み、これらは１以上のプラスミド上に存在しうる。活性化カセットは好適なプロモーター、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＥｃＲＬＢＤ）；および活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。ターゲットカセットは化学誘導性プロモーターを含み、この化学誘導性プロモーターは、ＤＢＤが結合する応答エレメント、およびＡＤに対して応答性の最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を動作可能に関連するように含む。この化学誘導性プロモーターは、植物におけるエチレンに対する感受性を改変する選択されたタンパク質またはそのフラグメントをコードするターゲット核酸配列（センスまたはアンチセンス方向）の発現を制御する。２つのカセットの構成要素間の相互作用は、誘導用組成物を有する植物細胞における場合には、植物細胞におけるタンパク質の発現を調節し、かつエチレン感受性を選択的に調節する。タンパク質発現の調節は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御可能である。誘導用組成物は植物の細胞によって吸収され、かつその中に移行し、誘導用組成物は活性化ドメインと相互作用し、ターゲットカセットの化学誘導性プロモーターをオンにする。よって、この系は、ターゲット核酸配列の発現を介して植物細胞におけるエチレン感受性の制御可能かつ選択的な調節を可能にする。
別の実施形態においては、この上記遺伝子発現系を安定的にまたは一時的に発現する植物細胞が提供される。
別の実施形態においては、この上記遺伝子発現系を安定的にまたは一時的に発現する植物組織または器官が提供される。
別の実施形態においては、この上記遺伝子発現系を安定的にまたは一時的に発現するトランスジェニック植物が提供される。

別の実施形態においては、このようなトランスジェニック植物またはその部分を製造する方法は、植物における少なくとも１つの細胞を本明細書に記載される遺伝子発現系で形質転換し；形質転換された植物細胞から、植物細胞、組織、器官またはインタクト（ｉｎｔａｃｔ）植物を発生させ；およびその植物細胞、組織、器官またはインタクト植物が誘導用組成物と接触させられる場合にエチレン非感受性の制御可能な調節を示す植物細胞、組織、器官またはインタクト植物を選択することを含む。タンパク質発現の調節は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御される。誘導用組成物は植物細胞、組織、器官またはインタクト植物によって吸収されることができ、かつその中に移行することができる。
さらなる実施形態においては、植物におけるエチレン感受性を制御する方法は、有効量の誘導用組成物をトランスジェニック植物またはその部分の細胞に適用することを含み、その植物は本明細書に記載される遺伝子発現系を安定的にまたは一時的に発現する細胞を含む。誘導用組成物は植物細胞によって吸収されることができ、およびその中に移行することができる。誘導用組成物の存在下で、その植物細胞のエチレンへの応答は、選択された時間の間低減し；そして、その植物から誘導剤を奪うことにより、選択された時間の後に、その植物細胞のエチレンへの応答は増大する。タンパク質発現の変調は、誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御される。
これらの方法および組成物の他の実施形態および利点は次の詳細な記載にさらに記載される。

図１は、エチレン応答経路ｅｔｒ１−１における変異遺伝子の発現のための遺伝子発現系を含むプラスミドｐ１８５の概略図である。この構築物の上側には、活性化カセットの構成要素、すなわち、１０−９０ｐ構成的プロモーター、ＶＰ１６活性化ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、およびＮＯＳターミネーターが記載されている。この構築物の上側には、ＧＡＬ４応答エレメントの５つの繰り返し（５ｘＧ）、最小３５Ｓプロモーター（Ｍ３５Ｓ）、変異ｅｔｒ１−１遺伝子の配列、および３５Ｓターミネーター（３５Ｓｔ）を含むターゲットカセットの構成要素も記載されている。ターゲットカセットに続くのは、任意の植物選択可能マーカーＰＤＦ１とそれに続くｒｂｃＳターミネーターであり、これらはこの遺伝子構築物が植物細胞内に安定的に組み込まれたかどうかを決定するのに有用である。この構築物の下側には、既存の酵素切断部位の位置および識別が記載されている。 図２は、配列番号１および上記図１において開示されたように特定されるカセットの構成要素を有し、変異遺伝子ｅｔｒ１−１について示されるＧからＡへの変異を有する遺伝子発現系（Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ｅｔｒ１）の活性化カセットとターゲッティングカセットとの双方を運ぶように設計されたプラスミドｐ１８５の例の概略図、および丸括弧内に核酸位置で特定される切断部位である。このプラスミドのカセット部分は配列番号１に報告される。商業的に入手可能なプラスミド骨格は容易に他のプラスミド骨格と置き換えられうるので、商業的に入手可能なプラスミド骨格は配列表または図には提供されない。 図３は設計されたプラスミドｐ１８７の例の概略図であり、これはｅｔｒ１−１のＧＶＥ受容体媒介誘導性発現を用いた、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットの双方［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ｅｔｒ１］を含む。このプラスミドのカセット部分は配列番号２に報告される。商業的に入手可能なプラスミド骨格は容易に他のプラスミド骨格と置き換えられうるので、商業的に入手可能なプラスミド骨格は配列表または図には提供されない。

本明細書に記載される組成物および方法は植物におけるエチレン感受性の制御可能な調節のための組成物および方法についての当該技術分野における必要性について取り組む。より詳細には、本明細書に記載される組成物および方法は、選択された量の化学誘導剤の使用に基づいた発現レベルの意図的な変動を可能にする。植物のホルモン調節を操作するこのような能力は、後述の利点の中でも特に作物の生長および成熟についての農業上の利点を提供する。

Ｉ．遺伝子発現系
遺伝子発現もしくは調節系は、植物細胞における安定的なもしくは一時的な発現のために使用される。このような系の構成要素は少なくとも２つの遺伝子発現カセットを含み、そのそれぞれが植物細胞において発現されうる。
ある実施形態においては、活性化カセットと称される第１の遺伝子発現カセットは、植物細胞において発現可能で、好適なプロモーターの制御下で、かつそれらと動作可能に関連している次の構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む：（ａ）その発現が調節されるべき遺伝子、すなわち、植物におけるエチレンに対する感受性を調節する選択されたタンパク質をコードする遺伝子と関連する応答エレメントを認識する、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＥｃＲＬＢＤ）またはその機能性フラグメントを含む、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）；および（ｃ）植物への適用に好適な誘導用組成物の存在下で活性化される、活性化またはトランス活性化ドメイン（ＡＤ）。ある実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は５’から３’で次の順に存在する：ＬＢＤはＤＢＤの下流にあり、ＤＢＤはＡＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は５’から３’で次の順に存在する：ＬＢＤはＡＤの下流にあり、ＡＤはＤＢＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は５’から３’で次の順に存在する：ＤＢＤはＬＢＤの下流にあり、ＬＢＤはＡＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は５’から３’で次の順に存在する：ＤＢＤはＡＤの下流にあり、ＡＤはＬＢＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は５’から３’で次の順に存在する：ＡＤはＬＢＤの下流にあり、ＬＢＤはＤＢＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は５’から３’で次の順に存在する：ＡＤはＤＢＤの下流にあり、ＤＢＤはＬＢＤの下流にある。活性化カセットは好ましくはそのカセットの３’末端に位置するターミネーターも含む。これらの構成要素の具体的な特徴は以下に示される。

第２の遺伝子発現カセット、すなわち、ターゲットカセットは次の構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む。一つの構成要素は化学誘導性プロモーターであり、この化学誘導性プロモーターは、活性化カセットによってコードされるタンパク質のＤＢＤが結合する応答エレメント（ＲＥ）と、活性化カセットのＡＤに対して応答性の最小プロモーターとを動作可能に関連するように含む。他の構成要素は、植物におけるエチレンに対する感受性を改変する選択されたタンパク質をコードするか、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントをコードするターゲット核酸配列である。この核酸配列はある実施形態においてはセンス方向であることができる。他の実施形態においては、この核酸配列はアンチセンス方向であることができる。誘導性プロモーターは選択されたタンパク質をコードするもしくはアンチセンス配列の発現を制御している。

別の実施形態においては、活性化および／またはターゲットカセットは、例えば、タンパク質をコードする核酸配列またはそのアンチセンス配列の下流のターミネーター配列、および任意の選択可能マーカーをさらに含む。このようなマーカーは周知であり、抗生物質または他の化学物質の存在下でその遺伝子を取り込んだ細胞を選択するために使用される。これらの任意の構成要素は以下でより詳細に論じられる。

この遺伝子発現系は、活性化カセットおよびターゲットカセットの構成要素が、植物細胞内にありかつ誘導用組成物と連携している場合に、選択されたタンパク質の発現を調節するように機能する。この選択されたタンパク質の変調または調節は植物細胞におけるエチレン感受性を選択的に調節する。例えば、ある調節は植物細胞のエチレン感受性を増大させることを伴う。別の実施形態においては、植物細胞のエチレン感受性は低下する。エチレン経路を調節するタンパク質のこの発現は、遺伝子発現系の構成要素と誘導用組成物との相互作用によって植物細胞内で制御される。誘導用組成物は植物の細胞によって吸収されることができおよび／またはその中に移行することができる。

この系のある実施形態においては、第１カセットおよび第２カセットは、図２および３におけるように、単一のプラスミド上に存在する。他の実施形態においては、第１および第２カセットは別々のプラスミド上に存在する。

遺伝子発現系の別の実施形態においては、第１遺伝子発現カセットはＤＢＤおよび第１のＬＢＤを含むことができ；第２カセットはＡＤおよび第２の異なるＬＢＤを含むことができ；並びに第３カセットは、第１ポリペプチドのＤＢＤが結合する応答エレメント、第２カセットのＡＤによって活性化されるプロモーターおよび発現が調節されるべきターゲット遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。この系においては、ＡＤおよびＤＢＤは、誘導用組成物の存在下でターゲット遺伝子発現を活性化する２つの別のタンパク質と動作上関連している。ある実施形態においては、第１のＬＢＤはＥｃＲＬＢＤであることができ、一方、第２のＬＢＤはレチノイドＸ受容体からのＬＢＤであることができる。別の実施形態においては、第２のＬＢＤはＥｃＲＬＢＤであることができ、一方、第１のＬＢＤはレチノイドＸ受容体からのＬＢＤであることができる。このような構築物は米国特許第７０９１０３８号、または米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号（公開日；２００５年１２月１日）に記載されている。

次の構成要素を理解するのに使用するために、用語「動作可能に関連」とは、一つの機能が他のものにより影響を受けるような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の関連をいう。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を与えることができる場合には、プロモーターはコード配列と動作可能に関連している（すなわち、コート配列がプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と動作可能に関連することができる。

用語「発現」は、本明細書において使用される場合、核酸またはポリヌクレオチドから誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。ある実施形態においては、発現はｍＲＮＡのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳をいう。別の実施形態においては、発現はアンチセンス（すなわち、ｍＲＮＡ「センス」配列と相補的な配列を表し、よって「センス」鎖と結合し、その発現を妨げる）、共抑制（すなわち、遺伝子配列、概してトランス遺伝子の過剰発現、これが相同内在遺伝子の抑制を生じさせる）、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ、すなわち、細胞に導入されたＲＮＡが最終的に細胞性の相補的なｍＲＮＡの破壊を生じさせ、そして遺伝子活性の低減をもたらす）によって低減されまたはダウンレギュレーションされうる。別の実施形態においては、遺伝子発現系の構成要素は植物細胞内で一時的に発現されうる。別の実施形態においては、遺伝子発現系の構成要素は植物細胞の染色体に組み込まれることによって安定的に発現されうる。一時的−対−安定的に組み込まれた発現の選択は、本明細書に記載されるような遺伝子発現系を生じさせ、使用する当業者によって選択されうる。

用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」は、特定の制限部位でまたは相同組み替えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入されうるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは目的のポリペプチドをコードするかもしくはアンチセンス方向の遺伝子を提供するポリヌクレオチドを含み、かつカセットおよび制限部位は、両方向性で、このカセットを転写および翻訳に適する読み取りフレームに挿入することを確実にするように設計される。これらのベクターまたはプラスミドは場合によっては、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするポリヌクレオチドに加えて、目的のポリペプチドをコードし、構成要素を有するポリヌクレオチドを含むことができる。このようなカセットは、ある実施形態においては、宿主細胞において目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能にする構成要素も含む。これらの構成要素には、これらに限定されないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが挙げられる。
他に示されない限りは、本明細書において使用される全ての他の用語には、当該技術分野における従来の意味があてはまる。例えば、米国特許第７０９１０３８号の用語の定義を参照。

Ａ．活性化カセットのプロモーター
この系のある実施形態においては、活性化カセットのプロモーターは、形質転換された植物細胞内でＤＢＤ、ＬＢＤおよびＡＤ配列の発現を制御することができる核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。一般に、活性化カセットのこれら３つの主要構成要素は選択されたプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーター配列はエンハンサーと称される近接した上流エレメントおよびより離れた上流エレメントからなる。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの本来の構成要素でありうるか、もしくはプロモーターのレベルまたは特異性を増強させるために挿入された異種構成要素でありうる。この文脈における有用なプロモーターは、その全体が本来の遺伝子に由来することができ、または天然に認められる異なるプロモーターに由来する異なる構成要素から構成されることができ、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。

ある実施形態においては、活性化カセットのプロモーターは構成的プロモーター、例えば、このカセットで形質転換された植物細胞が活性化カセット構成要素を持続的に生産しているように、ほとんどの細胞タイプにおいて、ほとんどの時点で遺伝子が発現されるようにするプロモーターである。例えば、この活性化カセットに有用な特定の構成的プロモーターには、限定されないが、例示されたＧ１０−９０プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５プロモーター、キャッサバモザイクウイルスプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、バドナウイルス（Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミラビリス（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）モザイクウイルスプロモーター、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、アクチンプロモーターまたはユビキチンプロモーターが挙げられる。

さらに他の実施形態においては、異なる組織または細胞タイプにおいて遺伝子の発現を管理するプロモーター（「組織特異的」、「細胞特異的」もしくは「植物器官特異的プロモーター」）がこの目的のために使用されうる。望ましくは、このようなプロモーターは植物組織および植物細胞において固有もしくは機能的であるか、または植物組織および植物細胞において固有もしくは機能的なプロモーターの変異体である。しかし、植物細胞内で機能する他のソース、例えば、ほ乳類、無脊椎動物などからの他の組織および細胞のためのプロモーターもこの目的のために使用されうる。さらに他の実施形態は、発生の異なる段階において（「発生特異的プロモーター」もしくは「細胞分化特異的プロモーター」）、または異なる環境もしくは生理的条件に応じて構成要素を発現するプロモーターを使用する。組織特異的プロモーターの広大なリストについては、Ｇａｌｌｉｅ，米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号、これは次の遺伝子に由来する種子特異的プロモーターを記載する：トウモロコシからのＭＡＣ１（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２：１００９−１０２０）；トウモロコシからのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ０５９３４，Ａｂｌｅｒ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１０１３１−１０１３８）；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのｖｉｖｐａｒｏｕｓ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ９３２１５）；シロイヌナズナからのａｔｍｙｃ１（Ｕｒａｏ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：５７１−５７６；Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ，１９９４，Ｐｌａｎｔ５：４９３−５０５）；西洋アブラナからのｎａｐＡおよびＢｎＣｙｓＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０２７９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，１９８７，ＪＢＬ２６：１２１９６−１２２０１，Ｗａｎら，２００２，Ｐｌａｎｔ Ｊ３０：１−１０）；並びに、西洋アブラナからのｎａｐｉｎ遺伝子ファミリー（Ｓｊｏｄａｈｌ，１９９５，Ｐｌａｎｔａ １９７：２６４−２７１）。果実特異的プロモーターには、ＣＹＰ７８Ａ９遺伝子からのプロモーター（ＩｔｏおよびＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，２０００，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：１５４１−１５５０）が挙げられる。他の組織特異的プロモーターには、胚珠特異的ＢＥＬ１遺伝子、これは以下に記載される：Ｒｅｉｓｅｒ，１９９５ Ｃｅｌｌ ８３：７３５−７４２，ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ３９９４４；Ｒａｙ，１９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５７６１−５７６５、および卵細胞および中心細胞特異的ＦＩＥ１プロモーターが挙げられる。萼片および花弁特異的プロモーターには、シロイヌナズナ花ホメオティック遺伝子ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ Ｂｒｏｗｎ，１９９４ Ｃｅｌｌ ７６：１３１−１４３；Ｍａｎｄｅｌ，１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２７３−２７７）、関連するプロモーター、ＡＰ２（例えば、Ｄｒｅｗｓ，１９９１ Ｃｅｌｌ ６５：９９１−１００２；Ｂｏｗｍａｎ，１９９１ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：７４９−７５８参照）が挙げられる。別の有用なプロモーターは、シロイヌナズナの異常な花器官（ｕｆｏ）遺伝子の発現を制御するものである（Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，１９９６ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１０９３−１１０２）。さらなる組織特異的プロモーターには、トウモロコシ花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，１９９０ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：１６１−１６８）が挙げられ；Ｗａｋｅｌｅｙ，１９９８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：１８７−１９２；Ｆｉｃｋｅｒ，１９９８ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：１３２−１４２；Ｋｕｌｉｋａｕｓｋａｓ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：８０９−８１４；Ｔｒｅａｃｙ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：６０３−６１１）によって記載されるプロモーターも参照。有用なプロモーターには、ＦＵＬ遺伝子からのもの（ＭａｎｄｅｌおよびＹａｎｏｆｓｋｙ，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，７：１７６３−１７７１）、およびＳＨＰ１およびＳＨＰ２遺伝子からのプロモーター（Ｆｌａｎａｇａｎら１９９６ Ｐｌａｎｔ Ｊ １０：３４３−３５３；Ｓａｖｉｄｇｅら，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７（６）：７２１−７３３）が挙げられる。プロモーターはＴＡ２９遺伝子に由来することができる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら，１９９５ Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５０：５−１７）。

他の好適なプロモーターには、西洋アブラナからの２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子（Ｄａｓｇｕｐｔａ，１９９３ Ｇｅｎｅ １３３：３０１−３０２）；シロイヌナズナからの２ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子ファミリー；西洋アブラナからのオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６３９８５；大豆からのオレオシンＡをコードする遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１８、およびオレオシンＢをコードする遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１９；シロイヌナズナからのオレオシンをコードする遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｚ１７６５７；トウモロコシからのオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０５２１２およびＬｅｅ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１９８１−１９８７；ならびに、大豆からの低分子量硫黄リッチタンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈｏｉ，１９９５ Ｍｏｌ Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．２４６：２６６−２６８）からのものが挙げられる。トマトからの組織特異的Ｅ８プロモーター、およびＡＴＨＢ−８、ＡｔＰＩＮ１、ＡｔＰ５Ｋ１またはＴＥＤ３遺伝子からのプロモーター（Ｂａｉｍａら，２００１ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２６：６４３−６５５，Ｇａｌａｗｅｉｌｅｒら，１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２２６−２２３０；Ｅｌｇｅら，２００１ Ｐｌａｎｔ Ｊ．２６：５６１−５７１；Ｉｇａｒａｓｈｉら，１９９８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：９１７−９２７）も有用である。

果実の成熟、老化および落葉中、並びにより少ない程度に落花中に活性なトマトプロモーターが使用されうる（Ｂｌｕｍｅ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２：７３１−７４６）。他の典型的なプロモーターには、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）の雌しべ特異的プロモーター、雌しべ特異的塩基性エンドキチナーゼをコードするＳＫ２遺伝子（Ｆｉｃｋｅｒ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：４２５−４３１）；トランスジェニックアルファルファの成長点の表皮組織において活性な、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ ｃｖ．Ａｌａｓｋａ）からのＢｌｅｃ４遺伝子が挙げられる。栄養組織において特に活性な様々なプロモーター、例えば、ジャガイモ塊茎の主要貯蔵タンパク質であるパタチンを制御するプロモーター（例えば、Ｋｉｍ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：６０３−６１５；およびＭａｒｔｉｎ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：５３−６２）、およびアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）からのＯＲＦ１３プロモーター（Ｈａｎｓｅｎ，１９９７ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：３３７−３４３）が使用されうる。他の有用な栄養組織特異的プロモーターには：サトイモ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ Ｌ．Ｓｃｈｏｔｔ）球茎タンパク質ファミリーのタリン（ｔａｒｉｎ）からのグロブリンをコードする遺伝子のタリンプロモーター（Ｂｅｚｅｒｒａ，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：１３７−１４４）；サーキュリンプロモーター（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ，１９９２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１５４９−１５５９）およびタバコ根特異的遺伝子ＴｏｂＲＢ７のためのプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９１ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：３７１−３８２）が挙げられる。葉特異的プロモーターには、リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター、トマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子（Ｍｅｉｅｒ，１９９７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１５：９１−９５）が挙げられる。葉身および葉鞘における葉肉細胞においてほとんど排他的に高レベルで発現するリブロース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター（Ｍａｔｓｕｏｋａ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：３１１−３１９）、集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター（Ｓｈｉｉｎａ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１５：４７７−４８３；Ｃａｓａｌ，１９９８ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１６：１５３３−１５３８）、シロイヌナズナｍｙｂ−関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５；Ｌｉ，１９９６ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７９：１１７−１２１）、およびＡｔｍｙｂ５プロモーター（Ｂｕｓｋ，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：１２８５−１２９５）は有用なプロモーターである。

有用な栄養組織特異的プロモーターには、分裂組織（根端および成長点）プロモーター、例えば、「ＳＨＯＯＴＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（シュートメリステムレス）」および「ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ」プロモーター（Ｄｉ Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ，１９９６ Ｃｅｌｌ ８６：４２３−４３３；および、Ｌｏｎｇ，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３７９：６６−６９）が挙げられる。別の有用なプロモーターは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡリダクターゼＨＭＧ２遺伝子（例えば、Ｅｎｊｕｔｏ，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．７：５１７−５２７を参照）を制御する。分裂組織特異的発現を示すトウモロコシおよび他の種からのｋｎｌ関連遺伝子、例えば、Ｇｒａｎｇｅｒ，１９９６ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３７３−３７８；Ｋｅｒｓｔｅｔｔｅｒ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１８７７−１８８７；Ｈａｋｅ，１９９５ Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５０：４５−５１参照、例えば、シロイヌナズナＫＮＡＴ１またはＫＮＡＴ２プロモーター（例えば、Ｌｉｎｃｏｌｎ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１８５９−１８７６を参照）も有用である。

活性化カセットのある実施形態においては、プロモーターは誘導性または調節可能プロモーターであることができ、例えば、細胞を薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光または他の刺激に曝露またはこれらで処理した後で核酸配列の発現を生じさせる。このような誘導性プロモーターの非限定的なリストには、ＰＲ１−ａプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーター系および高級真核生物転写活性化系、例えば、米国特許第７０９１０３８号に詳細が記載されているものが挙げられる。このようなプロモーターには、大腸菌からのテトラサイクリン（Ｔｅｔ）およびラクトース（Ｌａｃ）リプレッサー−オペレーター系が挙げられる。他の誘導性プロモーターには、トウモロコシの干ばつ誘導性プロモーター；ジャガイモからの寒冷、干ばつおよび高塩分誘導性プロモーター、シロイヌナズナＳＡＧ１２の老化誘導性プロモーター、並びにＬＥＣ１、ＬＥＣ２、ＦＵＳ３、ＡｔＳＥＲＫ１、およびＡＧＬＩ５の胚形成関連プロモーターが挙げられ、これら全ては当業者に知られている。植物ホルモン、例えば、オーキシンまたはサイトカイニンなどへの曝露により誘導性である他の植物プロモーターが米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号および米国特許第６，２９４，７１６号に記載されるように、この文脈において有用である。

ＤＢＤ、ＬＢＤおよびＡＤの配列の発現を進めることができるあらゆるプロモーターが活性化カセットの目的に本質的に好適であり、これらプロモーターには、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：ウイルスプロモーター、バクテリアプロモーター、植物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；発病もしくは病気関連プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ３５Ｓ最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、ゴマノハグサモザイクウイルス、バドナウイルス、ミラビリスモザイクウイルス、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ、芽特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、ライスツングロバシリフォームウイルス（ｒｉｃｅ ｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ）、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、スクロースシンターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、アクチンおよびアントシアニンプロモーター。本発明の好ましい実施形態においては、プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ最小プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、バドナウイルスプロモーター、ミラビリスモザイクウイルス、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、およびアクチンプロモーターからなる群から選択される。

Ｂ．ＤＢＤ
本明細書において使用される場合、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、このＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限りは、ＤＮＡ結合タンパク質の最小ポリペプチド配列からＤＮＡ結合タンパク質の全長までを含む。ＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下でＲＥのＤＮＡ配列に結合し、このＲＥの制御下で下流遺伝子の転写を開始もしくは抑制する。遺伝子発現ユニットのある実施形態においては、ＤＢＤは活性化カセット内に位置し、一方、応答エレメントはターゲッティングカセット内に位置する。

ＤＮＡ結合ドメインは、既知の応答エレメントと関連するあらゆるＤＮＡ結合ドメインであることができ、例えば、合成およびキメラＤＮＡ結合ドメイン、またはその類似体、組み合わせもしくは改変体が挙げられる。ある実施形態においては、ＤＢＤはＧＡＬ４ ＤＢＤ、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＨ核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、またはバクテリアＬａｃＺ ＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤは昆虫エクジソン受容体ＤＢＤ、ＧＡＬ４ ＤＢＤ（本明細書の実施例のプラスミドに示されている配列を参照）、またはＬｅｘＡ ＤＢＤである。このようなＤＢＤの配列は公然と入手可能であり、例えば、米国特許第７０９１０３８号、または米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号のような公報に記載されている。他の実施形態においては、このカセットにおいて有用なＤＢＤには、限定されないが、ｃＩプロモーターまたはｌａｃプロモーターから得られるＤＮＡ結合ドメインが挙げられ、これらも公然と入手可能な配列である。

Ｃ．エクジソンＬＢＤおよび任意の第２のＬＢＤ
遺伝子発現系のある実施形態において、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ＬＢＤは無脊椎動物エクジソン受容体もしくはその変異体の全部または一部分を含む。ＥｃＲは、シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインおよび活性化ドメインによって特徴づけられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら １９９１，Ｃｅｌｌ，６７：５９ ７７；米国特許第６２４５５３１号（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）も参照）。エクジソン受容体は多くのステロイド化合物、例えば、ポナステロンＡおよびムリステロンＡなど、並びに非ステロイド化合物に対して応答性である。ＥｃＲは５つのモジュラードメイン、すなわち、Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロダイマー化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロダイマー化）、Ｅ（リガンド結合、ヘテロダイマー化およびトランス活性化）、並びにＦ（トランス活性化）ドメインを有する。これらのドメインのいくつか、例えば、Ａ／Ｂ、ＣおよびＥなどは、それらが他のタンパク質に融合される場合に、その機能を保持している。本明細書において記載される遺伝子発現系においてＬＢＤとして使用するのに好適なＥｃＲの部分はドメインＤ、ＥおよびＦを含む。

好ましくは、ＥｃＲは鱗翅目ＥｃＲ、双翅目ＥｃＲ、節足動物ＥｃＲ、同翅目ＥｃＲおよび半翅目ＥｃＲである。より好ましくは、使用するＥｃＲはハマキガ類のトウヒシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（ＣｆＥｃＲ）、チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ）ＥｃＲ（ＴｍＥｃＲ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）ＥｃＲ（ＭｓＥｃＲ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）ＥｃＲ（ＨｖＥｃＲ）、カイコガＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）、キイロショウジョウバエＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）ＥｃＲ（ＡａＥｃＲ）、クロバエ類のルシリア・クプリナ（Ｌｕｃｉｌｉａ ｃａｐｉｔａｔａ）ＥｃＲ（ＬｃＥｃＲ）、チチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）ＥｃＲ（ＣｃＥｃＲ）、トノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）ＥｃＲ（ＬｍＥｃＲ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）ＥｃＲ（ＭｐＥｃＲ）、シオマネキ（Ｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ）ＥｃＲ（ＵｐＥｃＲ）、マダニ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ＥｃＲ（ＡｍａＥｃＲ）、シルバーリーフコナジラミ（Ｂａｍｅｃｉａ ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ）ＥｃＲ（ＢａＥｃＲ）、またはツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）ＥｃＲ（ＮｃＥｃＲ）などである。さらにより好ましくは、ＬＢＤはトウヒシントメハマキＥｃＲ（ＣｆＥｃＲ）またはキイロショウジョウバエＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）である。このようなＥｃＲの配列は公然と入手可能であり、例えば、米国特許第７０９１０３８号、国際公開第９７／３８１１７号および米国特許第６３３３３１８号、第６２６５１７３号および第５８８０３３３号のような公報に記載されている。

他の好適な変異エクジソン受容体は上で引用された米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号に記載されるような変異を含むものであり、例えば、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインが少なくとも１つの変異を含み、この変異は前記公報において特定されるある特定のアミノ酸残基に相当するまたは類似する位置にある。より詳細には、配列番号９におけるアミノ酸位置ＴがＶへ変異した変異を含むエクジソンＬＢＤは、次の実施例において使用される特に望ましいＥｃＲＬＢＤである。この変異体の配列は、本明細書において、配列番号１のアミノ酸番号９９０から１９９７としても再現される。この変異ＥｃＲＬＢＤはＴ５２Ｖとも称されるが、全長ＣｆＥｃＲにおけるアミノ酸位置３３５におけるスレオニンからバリンへの変異を記載する。ＥｃＲＬＢＤのこの変異体は後述の実施例において使用される遺伝子発現カセットにおいて使用される。本明細書において記載されるさらに他のＥｃＲＬＢＤは本明細書において記載される遺伝子発現系において有用であり得る。別の実施形態においては、変異エクジソン受容体ＬＢＤは米国特許第６，２４５，５３１号（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）に記載されるものである。

ある特定の実施形態においては、ＬＢＤはトランケートされたＥｃＲポリペプチドからのものである。ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、または２６５アミノ酸の欠失をもたらす。好ましくは、ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的なポリペプチドドメインの欠失をもたらす。より好ましくは、ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくともあるポリペプチドドメイン全体の欠失をもたらす。特定の実施形態においては、ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも、Ａ／Ｂ−ドメイン、Ｃ−ドメイン、Ｄ−ドメイン、Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン、部分的なＥドメイン、または部分的なＦドメインの欠失を生じさせる。完全なドメイン欠失および／または部分的なドメイン欠失のいくつかの組み合わせも行われうる。

別の実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号８のアミノ酸残基４８、５１、５２、５４、９２、９５、９６、１０９、１１０、１１９、１２０、１２５、１２８、１３２、２１９、２２３、２３４、または２３８、ｂ）配列番号８のアミノ酸残基９６および１１９、ｃ）配列番号８のアミノ酸残基１１０および１２８、ｄ）配列番号８のアミノ酸残基５２および１１０、ｅ）配列番号８のアミノ酸残基１０７、１１０および１２７、またはｆ）配列番号８のアミノ酸残基５２、１０７および１２７；の置換を生じさせるコドン変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸残基１０７および１２７の置換、並びにアミノ酸２５９の挿入を生じさせるコドン変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号８は図１１に示される。

別の特定の実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号８のアミノ酸残基４８に相当するもしくは類似する位置での、アスパラギン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、ロイシンもしくはリシン残基；ｂ）配列番号８のアミノ酸残基５１に相当するもしくは類似する位置でのメチオニン、アスパラギンもしくはロイシン残基；ｃ）配列番号８のアミノ酸残基５２に相当するもしくは類似する位置でのロイシン、プロリン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、グリシン、グルタミンもしくはグルタミン酸残基；ｄ）配列番号８のアミノ酸５４に相当するもしくは類似する位置でのトリプトファンもしくはスレオニン；ｅ）配列番号８のアミノ酸９２に相当するもしくは類似する位置でのロイシンもしくはグルタミン酸；ｆ）配列番号８のアミノ酸残基９５に相当するもしくは類似する位置でのヒスチジン、メチオニンもしくはトリプトファン残基；ｇ）配列番号８のアミノ酸残基９６に相当するもしくは類似する位置でのロイシン、セリン、グルタミン酸もしくはトリプトファン残基；ｈ）配列番号８のアミノ酸１０９に相当するもしくは類似する位置でのトリプトファン、プロリン、ロイシン、メチオニンもしくはアスパラギン；ｉ）配列番号８のアミノ酸残基１１０に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸、トリプトファンもしくはアスパラギン残基；ｊ）配列番号８のアミノ酸１１９に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン；ｋ）配列番号８のアミノ酸１２０に相当するもしくは類似する位置でのトリプトファンもしくはメチオニン；ｌ）配列番号８のアミノ酸１２５に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸、プロリン、ロイシン、システイン、トリプトファン、グリシン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、バリンもしくはアルギニン；ｍ）配列番号８のアミノ酸１２８に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン；ｎ）配列番号８のアミノ酸１３２に相当するもしくは類似する位置でのメチオニン、アスパラギン、グルタミン酸もしくはバリン；ｏ）配列番号８のアミノ酸残基２１９に相当するもしくは類似する位置でのアラニン、リシン、トリプトファンもしくはチロシン残基；ｐ）配列番号８のアミノ酸残基２２３に相当するもしくは類似する位置でのリシン、アルギニンもしくはチロシン残基；ｑ）配列番号８のアミノ酸２３４に相当するもしくは類似する位置でのメチオニン、アルギニン、トリプトファンもしくはイソロイシン；ｒ）配列番号８のアミノ酸２３８に相当するもしくは類似する位置でのプロリン、グルタミン酸、ロイシン、メチオニンもしくはチロシン；ｓ）配列番号８のアミノ酸１１９に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン残基、および配列番号８のアミノ酸９６に相当するもしくは類似する位置でのスレオニン；ｔ）配列番号８のアミノ酸１１０に相当するもしくは類似する位置でのプロリン残基、および配列番号８のアミノ酸１２８に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン残基；ｕ）配列番号８のアミノ酸５２に相当するもしくは類似する位置でのバリン残基、および配列番号８のアミノ酸１１０に相当するもしくは類似する位置でのプロリン残基；ｖ）配列番号８のアミノ酸１０７に相当するもしくは類似する位置でのイソロイシン残基、配列番号８のアミノ酸１２７に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸残基、および配列番号８のアミノ酸１１０に相当するもしくは類似する位置でのプロリン残基；または、ｗ）配列番号８のアミノ酸１０７に相当するもしくは類似する位置でのイソロイシン、配列番号８のアミノ酸１２７に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸、および配列番号８のアミノ酸５２に相当するもしくは類似する位置でのバリン：への置換を生じさせるコドン変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸１０７に相当するもしくは類似する位置でのイソロイシン残基、配列番号８のアミノ酸１２７に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸への置換、および配列番号８のアミノ酸２５９に相当するもしくは類似する位置でのグリシン残基の挿入：を生じさせるコドン変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体に由来する。

さらに他の実施形態においては、置換変異を含むＬＢＤは、下記の群から選択される置換変異を生じさせるコドン変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる置換変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。このリストにしたがって、Ｆ４８Ｙとの言及は、配列のアミノ酸位置４８におけるフェニルアラニンがチロシンで置換されている配列番号８のＬＢＤを意味する。よって、この群は配列番号８のＦ４８Ｙ、Ｆ４８Ｗ、Ｆ４８Ｌ、Ｆ４８Ｎ、Ｆ４８Ｒ、Ｆ４８Ｋ、Ｉ５１Ｍ、Ｉ５１Ｎ、Ｉ５１Ｌ、Ｔ５２Ｍ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５２Ｅ、Ｔ５２Ｐ、Ｔ５２Ｒ、Ｔ５２Ｗ、Ｔ５２Ｇ、Ｔ５２Ｑ、Ｍ５４Ｗ、Ｍ５４Ｔ、Ｍ９２Ｌ、Ｍ９２Ｅ、Ｒ９５Ｈ、Ｒ９５Ｍ、Ｒ９５Ｗ、Ｖ９６Ｌ、Ｖ９６Ｗ、Ｖ９６Ｓ、Ｖ９６Ｅ、Ｆ１０９Ｗ、Ｆ１０９Ｐ、Ｆ１０９Ｌ、Ｆ１０９Ｍ、Ｆ１０９Ｎ、Ａ１１０Ｅ、Ａ１１０Ｎ、Ａ１１０Ｗ、Ｎ１１９Ｆ、Ｙ１２０Ｗ、Ｙ１２０Ｍ、Ｍ１２５Ｐ、Ｍ１２５Ｒ、Ｍ１２５Ｅ、Ｍ１２５Ｌ、Ｍ１２５Ｃ、Ｍ１２５Ｗ、Ｍ１２５Ｇ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｎ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ｖ、Ｖ１２８Ｆ、Ｌ１３２Ｍ、Ｌ１３２Ｎ、Ｌ１３２Ｖ、Ｌ１３２Ｅ、Ｍ２１９Ｋ、Ｍ２１９Ｗ、Ｍ２１９Ｙ、Ｍ２１９Ａ、Ｌ２２３Ｋ、Ｌ２２３Ｒ、Ｌ２２３Ｙ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｗ、Ｗ２３８Ｐ、Ｗ２３８Ｅ、Ｗ２３８Ｙ、Ｗ２３８Ｍ、Ｗ２３８Ｌ、Ｎ１１９Ｆ／Ｖ９６Ｔ、Ｖ１２８Ｆ／Ａ１１０Ｐ、Ｔ５２Ｖ／Ａ１１０Ｐ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｔ５２Ｖ、およびＶ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ａ１１０Ｐの置換変異で表される置換変異を含む。別の特定の実施形態においては、置換変異を含むＬＢＤは、配列番号８の置換変異Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅを生じさせ、配列番号８の挿入変異Ｇ２５９をさらに含むコドン変異を含むポリヌクレオチド（Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｇ２５９）によってコードされる置換変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。

別の実施形態においては、ＬＢＤは、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃でのハイブリダイゼーション工程と、少なくとも６３℃での２×ＳＳＰＥにおける洗浄工程とを含むハイブリダイゼーション条件下で、上記特定されたポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程について２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。別の好ましい実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程の双方について２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。

別の特定の実施形態においては、リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号８のアミノ酸残基４８、５１、５２、５４、９２、９５、９６、１０９、１１０、１１９、１２０、１２５、１２８、１３２、２１９、２２３、２３４、もしくは２３８、ｂ）配列番号８のアミノ酸残基９６および１１９、ｃ）配列番号８のアミノ酸残基１１０および１２８、ｄ）配列番号８のアミノ酸残基５２および１１０、ｅ）配列番号８のアミノ酸残基１０７、１１０、および１２７、ｆ）配列番号８のアミノ酸残基５２、１０７および１２７：に相当するもしくは類似する位置での置換変異を含む。別の実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸残基１０７および１２７に相当するもしくは類似する位置での置換変異をもたらす置換変異、並びに配列番号８のアミノ酸残基２５９の挿入を含む。

好ましくは、ＬＢＤはａ）配列番号８のアミノ酸残基４８に相当するもしくは類似する位置でのアスパラギン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、ロイシンもしくはリシン残基、ｂ）配列番号８のアミノ酸残基５１に相当するもしくは類似する位置でのメチオニン、アスパラギンもしくはロイシン残基、ｃ）配列番号８のアミノ酸残基５２に相当するもしくは類似する位置でのロイシン、プロリン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、グリシン、グルタミンもしくはグルタミン酸残基、ｄ）配列番号８のアミノ酸５４に相当するもしくは類似する位置でのトリプトファンもしくはスレオニン残基、ｅ）配列番号８のアミノ酸９２に相当するもしくは類似する位置でのロイシンもしくはグルタミン酸残基、ｆ）配列番号８のアミノ酸残基９５に相当するもしくは類似する位置でのヒスチジン、メチオニンもしくはトリプトファン残基、ｇ）配列番号８のアミノ酸残基９６に相当するもしくは類似する位置でのロイシン、セリン、グルタミン酸もしくはトリプトファン残基、ｈ）配列番号８のアミノ酸１０９に相当するもしくは類似する位置でのトリプトファン、プロリン、ロイシン、メチオニンもしくはアスパラギン、ｉ）配列番号８のアミノ酸残基１１０に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸、トリプトファンもしくはアスパラギン残基、ｊ）配列番号８のアミノ酸１１９に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン残基、ｋ）配列番号８のアミノ酸１２０に相当するもしくは類似する位置でのトリプトファンもしくはメチオニン残基、ｌ）配列番号８のアミノ酸１２５に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸、プロリン、ロイシン、システイン、トリプトファン、グリシン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、バリンもしくはアルギニン残基、ｍ）配列番号８のアミノ酸１２８に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン残基、ｎ）配列番号８のアミノ酸１３２に相当するもしくは類似する位置でのメチオニン、アスパラギン、グルタミン酸もしくはバリン残基、ｏ）配列番号８のアミノ酸残基２１９に相当するもしくは類似する位置でのアラニン、リシン、トリプトファンもしくはチロシン残基、ｐ）配列番号８のアミノ酸残基２２３に相当するもしくは類似する位置でのリシン、アルギニンもしくはチロシン残基、ｑ）配列番号８のアミノ酸２３４に相当するもしくは類似する位置でのメチオニン、アルギニン、トリプトファンもしくはイソロイシン残基、ｒ）配列番号８のアミノ酸２３８に相当するもしくは類似する位置でのプロリン、グルタミン酸、ロイシン、メチオニンもしくはチロシン残基、ｓ）配列番号８のアミノ酸１１９に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン残基、および配列番号８のアミノ酸９６に相当するもしくは類似する位置でのスレオニン残基、ｔ）配列番号８のアミノ酸１１０に相当するもしくは類似する位置でのプロリン残基、および配列番号８のアミノ酸１２８に相当するもしくは類似する位置でのフェニルアラニン残基、ｕ）配列番号８のアミノ酸５２に相当するもしくは類似する位置でのバリン残基、および配列番号８のアミノ酸１１０に相当するもしくは類似する位置でのプロリン残基、ｖ）配列番号８のアミノ酸１０７に相当するもしくは類似する位置でのイソロイシン残基、配列番号８のアミノ酸１２７に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸残基、および配列番号８のアミノ酸１１０に相当するもしくは類似する位置でのプロリン残基、またはｗ）配列番号８のアミノ酸１０７に相当するもしくは類似する位置でのイソロイシン残基、配列番号８のアミノ酸１２７に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸残基、および配列番号８のアミノ酸５２に相当するもしくは類似する位置でのバリン残基：への置換を含む。別の実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸１０７に相当するもしくは類似する位置でのイソロイシン残基、配列番号８のアミノ酸１２７に相当するもしくは類似する位置でのグルタミン酸残基の置換、並びに配列番号８のアミノ酸２５９に相当するもしくは類似する位置でのグリシン残基の挿入を含む。

遺伝子発現系の特定の実施形態においては、第２のＬＢＤを使用する。第２のＬＢＤはエクジソン受容体ポリペプチドではないが、第２の核受容体のリガンド結合ドメインであることができる。このような第２の結合ドメインには、限定されないが、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン、およびキメラリガンド結合ドメイン、ここで当該キメラリガンド結合ドメインは２つのポリペプチドフラグメントを含み、その第１のポリペプチドフラグメントが脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン由来であり、かつその第２のポリペプチドフラグメントが異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン由来であるキメラリガンド結合ドメインが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号に記載されているような結合ドメインを参照。このようなＬＢＤは当業者に周知であり、かつ文献において充分に説明されている。

Ｄ．活性化ドメイン
遺伝子発現系において有用な活性化もしくはトランス活性化ドメイン（「ＡＤ」と略す）はあらゆるグループＨ核受容体メンバーＡＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体ＡＤ、合成もしくはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性もしくは酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６ ＡＤ、ＧＡＬ４ ＡＤおよびＮＦ−κＢ ＡＤ、ＢＰ６４ ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、ｐ６５トランス活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）、グルココルチコイド活性化ドメイン、またはこれらの類似体、組み合わせもしくは修飾体でありうる。特定の実施形態においては、ＡＤは合成もしくはキメラＡＤであるか、またはＥｃＲ、グルココルチコイド受容体、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢもしくはＢ４２酸性活性化ドメインＡＤから得られる。好ましくは、ＡＤはＥｃＲ ＡＤ、ＶＰ１６ ＡＤ、Ｂ４２ ＡＤ、またはｐ６５ ＡＤである。このような活性化ドメインの配列は、米国特許第７，０９１，０３８号のような公報においてまたは本明細書に記載される他の文献において公然と利用可能である。典型的なＶＰ１６ＡＤは本明細書の実施例において記載されるプラスミドにおいて説明される。このようなドメインは当業者に周知であり、かつ文献において充分に説明されている。

Ｅ．ターゲットカセットの誘導性プロモーター
特定の実施形態においては、ターゲットカセットの誘導性プロモーターは複数構成要素プロモーター配列である。それは最小プロモーターを含み、この最小プロモーターは応答エレメントの１以上のコピーと動作可能に関連しており、この応答エレメントは活性化カセット内のＤＮＡ結合ドメインに対応する。最小プロモーターは、本明細書において使用される場合、コアプロモーター（すなわち、転写の開始を媒介する配列）および５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、エンハンサー配列を含まない。よって、遺伝子発現系の実施形態において使用するために、最小プロモーターは、活性化カセットにおける使用について項目「Ａ」において上述したあらゆるプロモーターに由来する最小プロモーターであることができる。ターゲットカセットの特定の実施形態において、望まれる最小プロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ最小プロモーター；合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号１０；米国特許第７０９１０３８号を参照）；および合成ＴＡＴＡ最小プロモーター（ＴＡＴＡＴＡ；米国特許出願公開第２００５／０２２８０１６号を参照）が挙げられる。本明細書において記載される遺伝子発現系において有用な最小プロモーターは、文献に充分に記載されている多くのプロモーターから当業者によって容易に選択されうる。３５Ｓ最小プロモーターの配列は後述の実施例において記載されるプラスミド中に記載される。

ターゲットカセットの誘導性プロモーターの他の部分は最小プロモーターに対して５’または３’側に位置する応答エレメントを含む。あるＲＥは２つの異なるもしくは同じ最小プロモーターをそれぞれの側に有することができ、２つの異なるタンパク質を発現することができる。ある実施形態においては、ＲＥは最小プロモーターに操作上または動作可能に関連している。応答エレメントは、活性化カセットのＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介して媒介されるプロモーターに応答をもたらす１以上のシス作動性ＤＮＡエレメントである。このＤＮＡエレメントはその配列内でパリンドローム（完全もしくは不完全）でありうるか、または変化しうる数のヌクレオチドによって分離された複数の配列モチーフもしくは複数のハーフサイト（ｈａｌｆ ｓｉｔｅ）からなることができる。この複数のハーフサイトは同じもしくは異なっていてよく、そして直接反復もしくは逆方向反復で配列されてよく、または単一のハーフサイトとして配置されてよく、または直列に隣接するハーフサイトのマルチマーとして配置されてよい。天然のエクジソン受容体の応答エレメントのＤＮＡ配列の例はＣｈｅｒｂａｓ Ｌ．ら１９９１ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５，１２０−１３１；Ｄ’Ａｖｉｎｏ ＰＰ．ら１９９５ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１１３：１９およびＡｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ Ｃ．ら１９９４ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４，４４６５−４４７４などの文献に記載されている。ＲＥは活性化カセットのＤＮＡ結合ドメインに対応するあらゆる応答エレメント、またはその類似体、組み合わせもしくは修飾体であることができる。ターゲットカセットにおいて、単一のＲＥが使用されうるか、または複数のＲＥ、すなわち、同じＲＥの複数のコピーもしくは２種以上の異なるＲＥのいずれかが使用されうる。ＲＥは改変されうるか、または酵母からのＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら１９８８ Ｎａｔｕｒｅ，３３５：５６３−５６４を参照）もしくは大腸菌からのＬｅｘＡタンパク質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ １９８５，Ｃｅｌｌ，４３：７２９−７３６を参照）のような他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインのための応答エレメント、またはキメラ受容体に適合するための特異的相互作用のために設計され、修飾されおよび選択されるタンパク質との標的相互作用に特異的な合成応答エレメント（例えば、Ｋｉｍら１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：３６１６−３６２０を参照）で置き換えられうる。特定の実施形態においては、ＲＥはＧＡＬ４からのＲＥ（ＧＡＬ４ＲＥ）、好ましくは、２以上のコピーである。後述の実施例は５コピーのＧＡＬ４ＲＥ（５×ＧＡＬ４）の使用を示す。しかし、他の好適なＲＥには、限定されないが、ＬｅｘＡ、グループＨ核受容体ＲＥ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ結合ドメインを認識する合成ＲＥが挙げられる。他の実施形態においては、ＲＥはエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、またはポリヌクレオチド配列を含むＬｅｘＡ ＲＥ（オペロン「ｏｐ」）である。このようなＲＥの全ては文献において充分に説明されており、かつ本明細書の教示を得た当業者によって容易に選択されうる。

ターゲットカセットにおいては、この「誘導性プロモーター」は、後述のように、エチレン感受性を改変する核酸配列もしくは遺伝子の発現と動作可能に関連し、制御する。ターゲットカセットの誘導性プロモーターは化学誘導用組成物もしくは誘導剤によって誘導され、この組成物もしくは誘導剤は、活性化カセットのリガンド結合ドメインと接触する場合に、最小プロモーターの応答エレメントを活性化する。

Ｆ．選択されたタンパク質をコードする核酸配列
この系において有用な核酸配列は、植物におけるエチレン感受性またはエチレン生産を改変する選択されたタンパク質をコードする。このような核酸配列には、特定の実施形態においては、エチレン生合成遺伝子、ＡＣＣシンターゼ（ＡＣＳ）、ＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）およびＡＣＣデアミナーゼ（ＡＣＤ）が挙げられる。他の好適なエチレン受容体遺伝子はＥＴＲ１、ＥＴＲ２、ＥＲＳ１、ＥＲＳ２およびＥＩＮ４タンパク質をコードするこれら野生型遺伝子である。ＲＴＥ１、ＣＴＲ１、ＥＩＮ２、ＥＩＮ３、ＥＩＮ３様（ＥＩＬ１−５）、ＥＩＮ５、ＥＩＮ６およびＥＥＮのようなタンパク質をコードするさらに他のエチレンシグナル伝達経路遺伝子は、本明細書において記載される方法、並びに植物、植物器官および組織において有用な遺伝子発現系で有用である。遺伝子発現系の実施形態を形成するさらなる核酸配列には、エチレン応答因子、ＥＲＦ１、ＥＤＦ１、ＥＤＦ２、ＥＤＦ３およびＥＤＦ４、並びにＥＩＮ３結合Ｆ−ボックスタンパク質、ＥＢＦ１およびＥＢＦ２が挙げられる。さらなるエチレン変調のターゲットについては、Ｃｚａｒｎｙら２００６ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖａｎｃｅｓ，２４：４１０−４１９；Ｃｈｅｎら２００５ Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔ．９５：９０１−９１５；並びに、ＣｉａｒｄｉおよびＫｌｅｅ，２００１，Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔ，８８：８１３−８２２を参照．

遺伝子発現系は、野生型、または天然に存在する植物遺伝子の使用と共に、これらの遺伝子配列およびコードされるタンパク質において有用な変異を含む特定の核酸配列も使用できる。このような変異ｅｔｒ１−１受容体配列の例は配列番号１のヌクレオチド２５５７〜４７６７に特定される。様々な既知の変異エチレン受容体タンパク質が文献に記載されており、このような変異体を作り出す方法も文献に記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号に開示される変異受容体、およびパラグラフ００３３−００４１に記載される変異体；および米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号のＡＣＣオキシダーゼ配列；および米国特許出願公開第２００６／０２００８７５のＥＴＲ配列などを参照。

本明細書に記載される発明のある実施形態においては、特定の植物についての野生型遺伝子が遺伝子発現系において、および本明細書において記載される方法に使用され、植物におけるエチレン感受性を制御もしくは調節する。別の実施形態においては、植物細胞におけるエチレン感受性もしくはエチレン生産に関連する野生型タンパク質の変異体が使用される。さらに他の実施形態においては、ある種の植物細胞においてエチレン感受性もしくはエチレン生産を改変するタンパク質をコードする遺伝子の野生型の変異体が別の種類の植物細胞において使用され、例えば、潜在的なＲＮＡサイレンシングをなくするためにこのような使用が望まれる。

エチレン感受性を調節するために使用されうるタンパク質配列をコードする核酸配列の使用に加えて、本明細書において有用な特定の遺伝子発現系の別の構成要素は本明細書において参照されるコード配列に相補的な配列のポリヌクレオチドを含む。例えば、多くの上述の特定された野生型遺伝子配列のアンチセンス配列が植物細胞内の遺伝子発現系によって発現されうる。このようなアンチセンス配列の転写は、植物の本来の配列に結合してこれを不活性化することにより、エチレン感受性を調節することができる。

Ｇ．任意の構成要素
遺伝子発現系のカセットに認められる任意の構成要素には、ターミネーション制御領域が挙げられる。このようなターミネーターもしくはポリアデニル化配列も本発明の特定の実施形態における活性化およびターゲットカセットにおいて使用されうる。このような領域は、好ましい宿主本来の様々な遺伝子に由来する。本発明のある実施形態においては、ターミネーション制御領域は、合成ポリアデニル化シグナル、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、アグロバクテリウム、ウイルスおよび植物ターミネーター配列などを含むか、またはこれらに由来する。

選択可能なマーカーには、その効果、すなわち、抗生物質耐性、除草剤耐性などに基づいて選択されうる抗生物質もしくは化学物質耐性遺伝子、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどが挙げられうる。当該技術分野で知られ、使用されている選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、アクチノニン（ＰＤＦ１遺伝子）、ビアラホス除草剤、グリホサート除草剤、スルホンアミド、マンノースなどに対する耐性をもたらす遺伝子；並びに、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン制御遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳおよびルシフェラーゼが挙げられる。

他の調節配列、例えば、プラスミドにおけるスペーサー配列として機能するヌクレオチド配列、および他のマイナーな制御配列、酵素切断部位なども、本明細書において記載された特定の実施形態に従って植物細胞を形質転換するのためのカセットを含むプラスミド中に、もしくはカセット中に認められうる。

好適なターミネーション配列、選択可能マーカーおよび他の従来のプラスミド制御配列は、当業者に周知で、かつ本明細書における教示をもたらす文献において充分に記載されているこのような数多くの配列から、当業者によって容易に選択されうる。

Ｈ．遺伝子発現系に有用な誘導用組成物／誘導剤
遺伝子発現系が植物において発現される場合に、選択されたタンパク質の発現の調節、および植物細胞内のエチレン感受性の選択的な調節は誘導用組成物の使用によって制御可能である。ある実施形態においては、誘導用組成物は、植物の細胞と接触するように配置される化学物質である。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物の細胞によって吸収される化学物質である。さらに他の実施形態においては、誘導用組成物は植物細胞内に移行する化学物質である。誘導用組成物は活性化カセットのＥｃＲＬＢＤに非常に特異的なリガンドでもある。誘導用組成物もしくはリガンドが、活性化カセットのＬＢＤに結合することは、ターゲットカセットの誘導性プロモーターの誘導、および選択されたタンパク質をコードする核酸配列の発現をもたらす。よって、この系は植物におけるエチレン感受性を調節する。誘導用組成物は植物細胞、組織および器官に対する低い毒性によっても特徴づけられる。誘導用組成物はエチレン感受性の調節を「オフ」にするために植物から素早く枯渇する能力、および調節の効果的な制御を可能にする能力も有し、これらは以下でより詳細に記載される。

このような有効な誘導用組成物には、エクジソンリガンド結合ドメインに優先的に結合するリガンドがある。ある実施形態においては、これらのリガンドには、ジアシルヒドラジン化合物、例えば、市販のテブフェノジド（ダウアグロサイエンス）、メトキシフェノジド（ダウアグロサイエンス）、ハロフェノジド（ダウアグロサイエンス）、およびクロマフェノジド（日本化薬）（国際公開第９６／０２７６７３および米国特許第５，５３０，０２８号）が挙げられる。他の有用な誘導剤は非ステロイド系リガンド、例えば、米国特許第６，２５８，６０３号に記載されるジベンゾイルヒドラジン誘導体である。さらに他の有用な誘導剤は、米国特許出願公開第２００５／０２２８０１６号に詳細に記載される４−テトラヒドロキノリン誘導体である。さらなる多くの好適な化合物、例えば、１−アロイル−４−（アリールアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（ＴＨＱ）がＫｕｍａｒらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９（２６）：２７２１１−８；ＨｏｒｍａｎｎらＪ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｒｅｓ２００３ １７（２−４）：１３５−５３；ＴｉｃｅらＢｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００３，１３（１１：１８８３−６；およびＴｉｃｅら２００３ Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００３ １３（３）：４７５−８に示される。

よって、化学誘導用組成物もしくは誘導剤が活性化カセットのリガンド結合ドメインと接触した場合に、化学誘導用組成物もしくは誘導剤は応答エレメントの最小プロモーターを活性化し、これにより、エチレン感受性を調節する核酸配列もしくは遺伝子の発現をオンにする化学誘導用組成物もしくは誘導剤によって、遺伝子発現系は誘導されまたは「オン」にされる。この遺伝子発現系は、この遺伝子発現系を含む植物細胞のエチレン感受性の外部制御可能な調節のための手段をもたらす。

ＩＩ．トランスジェニック植物、植物細胞、組織もしくは器官
上述のように、遺伝子発現系は、植物、植物細胞または植物の他の組織もしくは器官に組み込まれるように設計される。場合によっては、このような組み込みは一時的でもありうる。しかし、本発明の特定の実施形態においては、植物の染色体への安定的な組み込みが望まれる。

ある実施形態においては、トランスジェニック植物細胞は、上述のような遺伝子発現系を発現し、エチレン感受性が一時的でありかつ可逆的に制御されるように設計される。このような植物細胞は、ある実施形態においては、遺伝子発現系の活性化カセットおよびターゲットカセットでトランスフェクトされたまたは形質転換された細胞である。ある実施形態においては、活性化カセットおよびターゲットカセットは同じプラスミド上にある場合には、このプラスミドで植物細胞はトランスフェクトされるかまたは形質転換される。別の実施形態においては、活性化カセットおよびターゲットカセットが別々のプラスミド上にある場合には、双方のプラスミドで別々にもしくは一緒に同じ植物細胞はトランスフェクトされるかもしくは形質転換される。あるいは、その２種の別々のプラスミドのそれぞれで同じ植物の異なる細胞がトランスフェクトされるかまたは形質転換される。さらに他の実施形態においては、その２種のプラスミドのそれぞれで、別々に、異なる植物が形質転換され、単一種のプラスミドを運ぶそれぞれの植物は性的に交配されて、双方のプラスミドを含む交配種を生じさせ、これにより機能的な誘導性システムをもたらす。

トランスフェクションは、表現型の変化をもたらすように外来もしくは異種ＲＮＡもしくはＤＮＡを細胞内に導入することを伴う。形質転換は、結果的に遺伝的に安定な形質をもたらす植物細胞の染色体ＤＮＡへの核酸フラグメントの移送および組み込みをいう。よって、形質転換核酸フラグメントを含む植物細胞は「トランスジェニック」もしくは「組み替え」もしくは「形質転換」生物と称される。よって、最初に形質転換もしくはトランスフェクトされた植物細胞の子孫も、その染色体に一時的にもしくは安定的に組み込まれたカセットを有する。

１．形質転換
植物細胞の形質転換は、活性化カセットのみ、ターゲットカセットのみ、または双方のカセットを含むベクターもしくはプラスミドを所持させることを伴う。図２、３の例を参照。好適なベクターと植物との組み合わせは、当業者に容易に明らかとなり、例えば、Ｍａｌｉｇａら１９９４（植物分子生物学における方法；実験室マニュアル） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州に見いだされうる。

例えば、好適な「ベクター」は核酸を植物細胞内にクローニングするおよび／または移行させるためのあらゆる手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントが、その結合したセグメントの複製をもたらすように結合するレプリコンであることができる。「レプリコン」は、ＤＮＡ複製の自律ユニットとして、すなわち、それ自身の制御下で複製可能なように機能するあらゆる遺伝的構成要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。遺伝子発現系で植物細胞を形質転換するのに有用なベクターには、細胞内に核酸を導入するために、ウイルス系手段および非ウイルス系手段の双方が挙げられる。核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどのために、当該技術分野において既知の多数のベクターが使用されうる。可能なベクターには、例えば、プラスミドまたは改変された植物ウイルス、例えば、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、またはブルースクリプトベクターが挙げられる。ＤＮＡ末端へヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることにより、相補的な付着端もしくは酵素で修飾された好適な挿入部位を有する選択されたベクターに、好適なＤＮＡフラグメントをライゲーションする従来の手段が知られている。植物細胞を形質転換するのに使用されうるあらゆるウイルス系もしくは非ウイルス系ベクターがこの目的のために有用である。非ウイルス系ベクターには、プラスミド、リポソーム、電荷を有する脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。遺伝子発現系のカセットに加えて、ベクターは１以上の調節領域、および／または核酸移行の結果（どの組織に移行するか、発現の期間など）をモニタリングし、測定し、選択するのに有用な選択可能なマーカーも含みうる。

用語「プラスミド」は、通常、環状２本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外構成要素をいう。このような構成要素は、あらゆるソースに由来する、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、線状、環状もしくはスーパーコイルの、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡであることができ、多くのヌクレオチド配列は、プロモーターフラグメントおよび好適な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列を細胞内に導入することができる独自の構造に結合されもしくは組み替えられている。

ベクターもしくはプラスミドは、当該技術分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、Ｗｕら１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；並びに、Ｈａｒｔｍｕｔら米国特許第５３５４８４４号を参照）によって所望の植物細胞内に導入されうる。あるいは、カチオン性脂質の使用が負に帯電した核酸のカプセル封入を促進することができ、負に帯電した細胞膜の融合も促進できる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８）。核酸の移送に特に有用な脂質化合物および組成物は米国特許第６１７２０４８号、第６１０７２８６号および第５４５９１２７号に記載されている。他の分子、例えば、カチオン性オリゴペプチドもしくはカチオン性ポリマー（例えば、米国特許第５８５６４３５号）、またはＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（例えば、米国特許第６２００９５６号）なども核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用である。裸のＤＮＡプラスミドとしてのベクターを導入することも可能である（米国特許第５６９３６２２号、第５５８９４６６号および第５５８０８５９号を参照）。受容体に媒介されたＤＮＡ送達アプローチも、遺伝子発現カセットで植物細胞の形質転換を行うために使用されうる。例えば、アグロバクテリウム媒介リーフディスク形質転換法（Ｈｏｒｓｃｈら，１９８８ Ｌｅａｆ Ｄｉｓｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）または当該技術分野において知られた他の方法を用いて、植物の形質転換が達成されうる。

２．繁殖およびスクリーニング
上述のように、植物における少なくとも１つの細胞を上述の遺伝子発現系で形質転換した後に（単一種のプラスミドで、もしくはそれぞれが異なるカセットを含む複数種の形質転換プラスミドとして）、トランスジェニック植物、植物組織もしくは植物器官を生じさせる方法は、選択された植物に典型的な条件下で形質転換された植物細胞もしくは植物から上述のような植物もしくは植物交配種を繁殖させることをさらに含む。次いで、植物は、形質転換された植物細胞の表現型特徴を含むもしくは示す植物（細胞、組織、器官）を選択するためにスクリーニングされる。例えば、植物が、遺伝子発現カセットの所望の組み込まれた核酸配列を含むかどうかを決定するために、引き続いて、得られた植物またはその細胞、組織および器官のスクリーニングが行われ、これも当業者に知られている。例えば、プラスミド内の１以上のレポーター遺伝子もしくはマーカーの使用によって、安定的に染色体に組み込まれた導入ＤＮＡを有する細胞が選択されうる。以下の実施例において、カナマイシン、アクチノニン、ビアラホスまたはルシフェラーゼがこの目的のために使用される。

成功裏に組み込まれた発現系を有する植物（組織もしくは器官）は、その植物が上述のような誘導用組成物と接触する場合に素早いエチレン非感受性を示す。あらゆる植物（植物細胞、組織もしくは器官を含む）がこのような形質転換に感受性であり、よって組み替え植物が従来の手段によって繁殖させられうる。遺伝子発現系での形質転換およびそれによるそのエチレン感受性の変調に感受性であることが特に望まれる植物には、双子葉植物、単子葉植物、装飾用植物、顕花植物、並びに人または動物に摂取される植物が挙げられる。限定されることなく、このような植物には、イネ、トウモロコシ、小麦、大麦、モロコシ、キビ、グラス（ｇｒａｓｓ）、オーツ麦、トマト、ジャガイモ、バナナ、キーウイフルーツ、アボカド、メロン、マンゴー、サトウキビ、テンサイ、タバコ、パパイヤ、桃、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、タマネギ、ブロッコリー、芽キャベツ、綿、キャノーラ、ブドウ、大豆、菜種、アスパラガス、豆類、ニンジン、キュウリ、ナス、メロン、オクラ、パースニップ、落花生、コショウ、パインアップル、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、サツマイモ、ライ麦、カンタロープ、エンドウ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ヒマワリ、ホウレンソウ、リンゴ、サクランボ、クランベリー、グレープフルーツ、レモン、ライム、ネクタリン、オレンジ、モモ、ナシ、タンジェロ、タンジェリン、ユリ、カーネーション、キク、ペチュニア、バラ、ゼラニウム、スミレ、グラジオラス、ラン、ライラック、野生リンゴ、モミジバフウ、カエデ、ポインセチア、ニセアカシア、セイヨウトネリコ、シナノキおよびシロイヌナズナが挙げられる。

植物組織および器官には、限定されないが、栄養組織、例えば、根、茎もしくは葉、および生殖組織、たとえば、果実、胚珠、胚、胚乳、外皮、種子、種皮、花粉、花弁、萼片、雌しべ、花、葯またはあらゆる胚組織が挙げられる。

ＩＩＩ．エチレン感受性を制御する方法
このようなトランスジェニック植物、細胞、組織、花、種子もしくは器官は、誘導用組成物の有効量を用いることによって、エチレン感受性を制御する方法にかけられうる。誘導用組成物は、トランスジェニック植物、植物細胞、植物組織もしくは植物器官の細胞と接触されうるか、これらに吸収されうるか、および／またはこれらに移行しうる。適用技術には、限定されないが、植物または植物と接触している土壌もしくは媒体を、誘導剤で浸せきし、噴霧し、粉末散布し、ドレンチング（ｄｒｅｎｃｈｉｎｇ）し、ディッピングし、もしくは液体供給する（ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ）ことが挙げられる。

誘導用組成物の存在下、エチレンに対する植物細胞の応答が、選択されたタンパク質の特徴に応じた方法で調節される。選択されたタンパク質が優性ネガティブ変異体ｅｔｒ１−１である後述の実施例においては、誘導剤の適用はｅｔｒ１−１の発現を増大させ、そしてその植物のエチレンに対する感受性を低減させる。この感受性の低減は、誘導剤がその植物（細胞、組織もしくは器官）に適用されている時間中続き、かつ活性剤の適用が停止された後でその植物が残りの誘導剤を代謝し続ける時間中続く。植物から誘導剤を枯渇させることによって、選択された時間後に、エチレンに対する植物細胞の応答は逆にされ、この場合には、増大する。

植物細胞におけるエチレン感受性もしくはエチレン生産をもたらすタンパク質の発現の「制御」、「変調」または「調節」はいくつかの方法で達成されうる。本方法のある実施形態においては、タンパク質発現の調節（その発現の量的大きさを含む）は植物への誘導用組成物の適用のタイミングによって制御されうる。別の実施形態においては、植物に適用される誘導用組成物の濃度は、タンパク質の発現（その発現の量的大きさを含む）およびこれによるエチレン感受性を制御するように使用される。さらなる実施形態においては、タンパク質発現の調節（その発現の量的大きさを含む）は植物への誘導用組成物の適用の期間により制御される。所望の結果を得るために、その植物の成長中に、誘導用組成物の適用のこれらパラメーターのいずれか１つ、２つもしくは３つ全部が変更されうる。

タイミングを通じた制御の一例として、誘導用組成物は植物の生長サイクルにおける選択された時点で、例えば、植物の発芽、果実成熟もしくは開花のいずれかの前もしくは後で、または、環境条件に応答して（例えば、植物がストレス要因、例えば、病原体もしくは干ばつに曝露される前もしくは後で）、エチレン感受性を誘導するように適用されうる。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物の生長サイクルにおける複数の時点で適用される。さらに他の実施形態においては、誘導用組成物の適用は、エチレン感受性を制御するために、選択された時点で停止される。適用の所望のタイミングは処理される植物の種類、誘導用組成物の効力、および植物に対するその潜在的な細胞毒性効果に応じて選択され、変化しうる。

誘導用組成物濃度による制御の一例として、誘導用組成物は０．０１〜２０μＭの濃度で植物に適用される。別の実施形態においては、その濃度は１０μＭである。別の実施形態においては、その濃度は少なくとも、０．０１、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０および少なくとも２０．０μＭであり、並びにこれらの間の区分濃度も含む。さらに他の実施形態においては、その濃度は２０μＭである。さらに他の実施形態においては、２０μＭより高い濃度の誘導用組成物が使用される。さらに他の実施形態においては、３０μＭより高い濃度が使用される。別の実施形態においては、４０μＭより高い濃度が使用される。さらに別の実施形態においては、５０μＭより高い濃度が本明細書に記載される方法において有用である。例えば、以下の実施例９を参照、この実施例９は誘導剤の濃度が、植物により示されるエチレン感受性の程度をどのように調節するかを示す。適用のタイミングによる制御に似た方法で、異なる成長段階においてまたは環境条件の変化に対応して、植物の変化する要求に対応するように、誘導用組成物の濃度が使用されうる。

植物におけるエチレン感受性もしくはエチレン生産を媒介するタンパク質の調節を制御する第３の方法は、誘導用組成物の適用の期間を変化させることを伴う。例えば、植物への誘導用組成物の適用の期間は、望まれる効果、誘導剤の有効性、および望まれない細胞毒性効果の可能性に応じて、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間の適用時間から、約２４時間もしくはそれより多い時間の範囲であり得る。望まれる場合には、誘導用組成物の適用は数日の期間にわたってなされうる。適用の期間は一般に熟練した栽培者によって選択されうる。

一般に、誘導剤の適用停止とその誘導剤に対する植物の応答の反転との間の時間は、植物のサイズ、適用の方法、および適用される誘導剤の量に応じて、約２日以上である。

あるいは、ターゲットカセットの誘導性プロモーターの制御下の核酸配列が、野生型遺伝子に対する相補的配列もしくはそのアンチセンス体である場合には、好適な誘導剤の適用はエチレンに対する植物の感受性を増大させうる。例えば、エチレン受容体（ＥＴＲ１、ＥＴＲ２、ＥＲＳ１、ＥＲＳ２もしくはＥＩＮ４）の発現を増大させることは、より多くのエチレン受容体およびエチレンに対する低減された感受性を導く。ＣＴＲ１のＮ−末端キナーゼドメインに融合されたトランケートされたＥＴＲ１の過剰発現は野生型シロイヌナズナにおいてわずかなエチレン非感受性を与える。植物におけるＥＢＦ１、ＥＢＦ２の発現増大および／またはＥＩＮ３の発現低減は、その植物のエチレンに対する感受性をより低くする。ＡＣＯ、ＡＣＳ、ＥＩＮ２、ＥＤＦまたはＥＥＮおよびＥＩＮ６の発現の低減は、低減されたエチレン生産および／または低減されたエチレン応答を導く。ＡＣＤの発現増大は低減されたエチレンおよび低減されたエチレン応答を導く。エチレンに対する植物細胞の応答は、植物から誘導剤を枯渇させることにより、選択された時間の後で、反転し、この場合には増大する。このことは、一旦、誘導が除かれた後で、植物が正常に発生し、成長しおよび成熟し続けることを可能にする。

本明細書に記載される遺伝子発現系で安定的に形質転換された植物への誘導剤の適用は、エチレンに対して感受性の植物成長、例えば、老化、果実熟成、発芽、病原体耐性、落葉、落花、つぼみの落下、丸莢（ｂｏｌｌ）の落下、果実の落下、および開花、並びに干ばつ、高温、植物密度および塩分などの条件により引き起こされるようなストレスに対する植物の応答などの一以上の特徴の制御を可能にする。

本明細書に記載される方法は、より具体的には、植物のエチレン非感受性を増大させることによって、病気に対する植物の抵抗性および／または耐性増大のための方法として使用されうる。あるいは、本方法は、植物のエチレン非感受性を増大させることによって、例えば、貯蔵もしくは輸送の目的のために、植物、組織もしくは器官の成熟もしくは開花を遅らせるために適用されうる。さらに別の実施形態においては、本明細書に記載される、誘導用組成物の好適な時点での適用で形質転換された植物を使用する方法は、誘導用組成物を適用することによって、望まれない成長条件下、例えば、干ばつもしくは過剰な高温下にある植物を処理し、エチレンに対する感受性を低減させることと可能にし、かつ植物をより容易に環境条件に耐性にする。植物繁殖および成長の分野の当業者は、形質転換された植物および上記核酸配列の発現の誘導方法が本明細書の教示に基づいた利益をもたらすであろう事例を容易に選択できる。

よって、本明細書に記載される方法を使用する、誘導剤の適用のタイミング、期間または濃度は、植物の成長中に変更されることができ、かなりの精度でエチレン感受性およびこれによる植物の生長特性を制御できる。

ＩＶ．実施例
以下の実施例は、構成的Ｇ１０−９０プロモーターの制御下にあってかつこれと動作可能に関連している、（ａ）５コピーのＧＡＬ４応答エレメントを含む応答エレメントを認識するＧＡＬ４ ＤＢＤ；（ｂ）全長ＣｆＥｃＲにおけるアミノ酸３３５番にＴｈｒからＶａｌへの変異がある、ドメインＤ、ＥおよびＦを含む変異エクジソン受容体ＬＢＤ；および（ｃ）誘導用組成物の存在下で活性化されるＶＰ１６ＡＤを含む活性化カセットを含む上記遺伝子発現系の使用を示す。ターゲットカセットは誘導性プロモーターを含み、この誘導性プロモーターは、ＶＰ１６ＡＤの活性化に対して応答性の最小３５プロモーターの上流に配置された５コピーのＧＡＬ４応答エレメントを動作可能に関連するように含み、この誘導性プロモーターは（ｅ）変異ＥＴＲ１タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御する。この実施形態によると、活性化カセットおよびターゲッティングカセットの構成要素は、植物細胞内にある場合、植物細胞内で変異ＥＴＲ１タンパク質の発現を調節し、エチレン感受性を選択的に低減させる。このタンパク質発現は誘導用組成物との相互作用によって制御され、誘導用組成物は選択されたタンパク質の発現を調節し、および植物細胞におけるエチレン感受性を選択的に調節する。タンパク質発現の調節は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御される。

より詳細には、例示される遺伝子発現系は単一のプラスミド、ｐ１８５上に存在する活性化カセットおよびターゲットカセットを含む。このプラスミドは図２に図式的に示される。さらに他の典型的なプラスミドは図３に示される。図２および３のそれぞれのプラスミドの遺伝子発現カセット構成要素の核酸配列は配列番号１および２としてさらに特定される。実施例において論じられる他のプラスミドの遺伝子発現カセット構成要素のヌクレオチド配列は配列番号３に開示される。

次の実施例は上記組成物および方法の特定の実施形態を示す。これらの実施例は特許請求の範囲および明細書の開示を限定するものではない。

実施例１：プラスミド
遺伝子カセット構成要素は活性化カセットのために以下のものを含む：Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号１のヌクレオチド１〜２４３）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号１のヌクレオチド２４９〜５２９）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号１のヌクレオチド５３４〜９８３）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号１のヌクレオチド２０７０〜２３６４）と関連しているＴ５２Ｖ変異エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号１のヌクレオチド９９０〜１９９７）が個々にクローニングされた。同様に、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号１のヌクレオチド２３９１〜２４９２）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号１のヌクレオチド２４９９〜２５５４）からなる誘導性プロモーター、並びに変異ｅｔｒ１−１遺伝子（配列番号１のヌクレオチド２５５７〜４７６４）および３５Ｓターミネーター配列（配列番号１のヌクレオチド４７９１〜５００１）を含むターゲットカセット構成要素が個々にクローニングされた。配列番号１は図４に示される。

これらの構成要素はＳＫ⁻プラスミド（ストラタジーン）において個々に発現カセット内で組み立てられ、次いで様々なプラスミドに組み合わされた。
カセット（１）：Ｇ１０−９０プロモーター→ＶＰ１６：ＧＡＬ４：ＥｃＲＤＥＦ Ｔ５２Ｖ −ＮＯＳターミネーター
カセット（２）：Ｇ１０−９０プロモーター→ＧＡＬ４：ＶＰ１６：ＥｃＲＤＥＦ Ｔ５２Ｖ −ＮＯＳターミネーター
カセット（３）：Ｇ１０−９０プロモーター→ｅｔｒ１−１ −３５Ｓターミネーター
カセット（４）：Ｇ１０−９０プロモーター→ＰＤＦ１ −Ｅ９ターミネーター
カセット（５）：Ｇ１０−９０プロモーター→ルシフェラーゼ −３５Ｓターミネーター
カセット（６）：５×Ｇ−Ｍ３５Ｓ誘導性プロモーター→ｅｔｒ１−１ −３５Ｓターミネーター
カセット（７）：５×Ｇ−Ｍ３５Ｓ誘導性プロモーター→ルシフェラーゼ −３５Ｓターミネーター

活性化カセットの組み立てにおいて、次の構成要素は２つの異なる順に融合されて、２種の異なる活性化カセットを作成した：
ＶＰ１６ＡＤ→ＧＡＬ４ ＬＢＤ→ＥｃＲ（ＤＥＦ）のＴ５２Ｖ ＤＢＤ（ＶＧＥと略する）；および
ＧＡＬ４ ＬＢＤ→ＶＰ１６ＡＤ→ＥｃＲ（ＤＥＦ）のＴ５２Ｖ ＤＢＤ（ＧＶＥと略する）。
誘導性ルシフェラーゼ対照も正の対照として供給された。
その後、プラスミドＤＮＡはｐブルースクリプトＩＩＳＫ⁻骨格（ストラタジーン）内で製造された。ＳＫ⁻複数クローニングサイト領域は、８ｂｐ切断酵素のための認識部位を含む新たな複数クローニングサイトで置き換えられた。これらの酵素切断部位のいくつかは図２および３の例示プラスミドにおいて特定された。
ヌクレオチド配列を確認するために、６種の例となる大腸菌プラスミドが準備され、配列決定された。それぞれのプラスミドは、図２および３に示されるような各構成要素の付加／欠失／交換のための独自の酵素切断部位を含んでいる。よって、それぞれの全構築物は、植物形質転換のためのバイナリーベクターをはじめとする最適な他のベクターに移されうる。
ＳＫ⁻マイナスプラスミドにおいて作成された構築物は、次いで、バイナリープラスミドｐＢＩＮ１９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号３７３２７）に移された。ｐＢＩＮ１９はすでにネオマイシン植物選択可能マーカー遺伝子、ＬＢ、ＲＢおよびｎｐｔＩＩ選択可能マーカーを有しているので、図および／または配列表は骨格配列を示しておらず、目的の遺伝子発現配列のみを示し、すなわち、遺伝子発現系の主要構成要素、例えば、Ｅｃ受容体および誘導性ｅｔｒ１−１またはルシフェラーゼは左側境界と右側境界との間にクローニングされた。

実施例２におけるトランスジェニック植物の生産における使用および実施例３のプロトプラスト実験における使用のために、次の５つのアグロバクテリウムバイナリープラスミドが選択された。
ｐ１８４［Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５×ＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＬＵＣ］が使用され、Ｇ１０−９０プロモーター駆動ＶＧＥ受容体および誘導性ルシフェラーゼを含むトランスジェニック植物を得た。ｐ１８４の発現カセット構成要素は配列番号３に示されており、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号３のヌクレオチド１〜２４３）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号３のヌクレオチド２４９〜５２９）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号３のヌクレオチド５３４〜９８３）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号３のヌクレオチド２０７０〜２３６４）と関連しているＴ５２Ｖ変異エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号１のヌクレオチド９９０〜１９９７）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号３のヌクレオチド２３９１〜２４９２）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号３のヌクレオチド２４９９〜２５５４）からなる誘導性プロモーター、ルシフェラーゼマーカー遺伝子（配列番号３のヌクレオチド２５５７〜４２０９）、並びに３５Ｓターミネーター配列（配列番号３のヌクレオチド４２１７〜４４２７）。

ｐ１８５［Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５×ＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ｅｔｒ１］は、Ｇ１０−９０プロモーター駆動ＶＧＥ受容体および誘導性ｅｔｒ１−１を含むトランスジェニック植物を生産するための、ターゲットカセットに融合した活性化カセットを含む典型的なプラスミドであった。

ｐ１８６［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５×ＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＬＵＣ］は、Ｇ１０−９０プロモーター駆動ＧＶＥ受容体および誘導性ルシフェラーゼを含むトランスジェニック植物を得るために使用されたプラスミドであった。ｐ１８６の発現カセット構成要素は配列番号４に示されており、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号４のヌクレオチド１〜２４３）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４のヌクレオチド２７６〜７１６）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号４のヌクレオチド７１７〜７９３）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号４のヌクレオチド２０６４〜２２５８）と関連しているＴ５２Ｖ変異エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号４のヌクレオチド９９４〜１９９１）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号４のヌクレオチド２３８５〜２４８６）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号４のヌクレオチド２４９３〜２５４８）からなる誘導性プロモーター、ルシフェラーゼマーカー遺伝子（配列番号４のヌクレオチド２５５１〜４２０３）、並びに３５Ｓターミネーター配列（配列番号４のヌクレオチド４２１１〜４４２１）。

ｐ１８７［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５×ＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ｅｔｒ１］は、Ｇ１０−９０プロモーター駆動ＧＶＥ受容体および誘導性ｅｔｒ１−１を含むトランスジェニック植物を得るために使用されたプラスミドであった。図３および配列番号２を参照。ｐ１８７の発現カセット構成要素は、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号２のヌクレオチド１〜２４３）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号２のヌクレオチド２７６〜７１６）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号２のヌクレオチド７１７〜７９３）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号２のヌクレオチド２０６４〜２２５８）と関連しているＴ５２Ｖ変異エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号２のヌクレオチド９９４〜１９９１）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号２のヌクレオチド２３８５〜２４８６）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号２のヌクレオチド２４９３〜２５４８）からなる誘導性プロモーター、ｅｔｒ１遺伝子（配列番号２のヌクレオチド２５５１〜４７６１）、並びに３５Ｓターミネーター配列（配列番号２のヌクレオチド４７８５〜４９９５）。

ｐ１００２［Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５×ＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ｅｔｒ１およびＭＭＶｐ−ｄｅｆ−ｒｂｃＳ−Ｅ９ｔ］およびその構成要素は配列番号５に示され、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号５のヌクレオチド１〜２４３）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号５のヌクレオチド２４９〜５２９）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号５のヌクレオチド５３４〜９８３）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号５のヌクレオチド２０７０〜２３６４）と関連しているＴ５２Ｖ変異エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号５のヌクレオチド９９０〜１９９７）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号５のヌクレオチド２３９１〜２４９２）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号５のヌクレオチド２４９９〜２５５４）からなる誘導性プロモーター、ｅｔｒ１遺伝子（配列番号５のヌクレオチド２５５７〜４７６４）、３５Ｓターミネーター配列（配列番号５のヌクレオチド４７９１〜５００１）、ＭＭＶプロモーター（配列番号５のヌクレオチド７２２８〜６５９２）、Ｐ−ＤＥＦマーカー遺伝子（配列番号５のヌクレオチド６５３３〜５７１２）、並びにｒｂｃＳ−Ｅ９ターミネーター（配列番号５のヌクレオチド５６８２〜５０３８）。

ｐ１００３［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５×ＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ｅｔｒ１およびＭＭＶｐ−ｄｅｆ−ｒｂｃＳ−Ｅ９ｔ］およびその構成要素は配列番号６に示され、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号６のヌクレオチド１〜２４３）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号６のヌクレオチド２７６〜７１６）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号６のヌクレオチド７１７〜９７３）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号６のヌクレオチド２０６４〜２２５８）と関連しているＴ５２Ｖ変異エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号６のヌクレオチド９８４〜１９９１）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号６のヌクレオチド２３８５〜２４８６）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号６のヌクレオチド２４９３〜２５４８）からなる誘導性プロモーター、ｅｔｒ１遺伝子（配列番号６のヌクレオチド２５５１〜４７６１）、３５Ｓターミネーター配列（配列番号６のヌクレオチド４７８５〜４９９５）、ＭＭＶプロモーター（配列番号６のヌクレオチド７２２２〜６５８６）、Ｐ−ＤＥＦマーカー遺伝子（配列番号６のヌクレオチド６５２７〜５７０６）、並びにｒｂｃＳ−Ｅ９ターミネーター（配列番号６のヌクレオチド５６７６〜５０３２）。

実施例２：トランスジェニックタバコ植物の生産
タバコ植物は実施例１のプラスミドで形質転換され、ＦｉｓｈｅｒおよびＧｕｉｌｔｉｎａｎ １９９５ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １３：２７８−２８９に記載されるような標準的なアグロバクテリウム媒介リーフディスク形質転換によって生産された。カナマイシンを含む発根培地上で植物を繁殖させ、次いで、遺伝子発現系の導入および継承を後述のようにＰＣＲによって確認した。
マゼンタ箱に保持された各植物からの単一の葉が液体窒素で素早く凍結することにより集められ、凍結したまま−８０℃で保存された。葉（５０〜１００ｍｇ）は、次いで、ＫＯＮＴＥＳチューブに移され、ＫＯＮＴＥＳディスポーサブル乳棒で、約１分間の回転を用いて粉砕され、次いで、数秒後、溶解緩衝液を添加した。ＤＮＡはＤＮＥＡＳＹミニキット（キアゲン）を用いて精製された。ＤＮＡは最終的に１００μｌに溶出された。
ＶＧＥの５２９ｂｐ、ＧＶＥの４９５ｂｐ、マーカー遺伝子ルシフェラーゼＬＵＣの４６３ｂｐまたは変異ｅｔｒ−１遺伝子の４４１ｂｐを増幅するための特定のＰＣＲプライマーが設計された。導入遺伝子は３μｌの植物ＤＮＡ、１０ｐモルの各プライマー、および２５μｌのＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ ＰＣＲ（ＡＢＩ）を用いる５０μｌの反応で、３５サイクルで増幅された。２５μｌのＰＣＲ反応物を１％アガロースゲルにかけ、２種の異なる導入遺伝子の増幅によってポジティブな植物を同定した。

コンタミネーションおよび非特異的増幅による偽のポジティブ結果を防止するために、かなりの注意が払われた。タバコゲノムに結合しない高度にストリンジェントなプライマーが合成された。クロスコンタミネーションを最小化するために、粉砕およびＤＮＡ調製中にかなりの注意を払って葉物質は取り扱われた。非トランスジェニック対照植物ＤＮＡはＤＮＡ調製物の各バッチと同様に単離された。ＤＮＡのないＰＣＲ対照が核ＰＣＲ増幅に含まれた。他の予防措置、例えば、エアロゾルレジスタントピペットチップ、およびディスポーサブルベンチ表面ダイアパーが使用され、手袋は頻繁に交換された。ホットスタートＰＣＲが使用され、プライマーの非特異的結合を最小化した。バンドを生じさせることが予想されないプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、いくつかのＤＮＡについてクロスコンタミネーションもチェックされた。
ＰＣＲの結果は次の通りであった：
ｐ１８４（ＶＰ１６ ＡＤとＧＡＬ４ ＬＢＤとＴ５２ＶのＥｃＲ（ＤＥＦ） ＤＢＤプラス誘導性ルシフェラーゼ；略記「ＶＧＥ」）について：１０株の植物がスクリーニングされ、８株の植物がＶＧＥおよびＬＵＣについてポジティブであった（ｐｌ８４−２、３、４、５、７、８、９、および１０）。２株の植物はＶＧＥまたはＬＵＣについてネガティブであった（ｐｌ８４−１および６）。
変異ｅｔｒ１−１遺伝子、ｐ１８５の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含む典型的なプラスミドについて、１６株の植物がスクリーニングされ、１３株の植物がＶＧＥおよびｅｔｒ−１についてポジティブであった（ｐ１８５−ｌ、２、３、４、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６として設計されたプラスミド）。２株の植物はＶＧＥおよびｅｔｒ−１についてネガティブであった（ｐ１８５−６、７および９）。
ｐ１８６（ＧＡＬ４ ＬＢＤとＶＰ１６ ＡＤとＴ５２ＶのＥｃＲ（ＤＥＦ）；略記「ＧＶＥ」＋誘導性ＬＵＣ）については、２５株の植物がスクリーニングされ、２３株の植物がＧＶＥおよびＬＵＣについてポジティブであった（ｐ１８６−２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５）、並びに２株の植物はＧＶＥまたはＬＵＣについてネガティブであった（ｐ１８６−１および１４）。
ｐ１８７（ＧＶＥ＋誘導性ｅｔｒ−１）については：３４株の植物がスクリーニングされ、３３株の植物がＧＶＥおよびｅｔｒ−１についてポジティブであり（ｐ１８７−ｌ、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４）、並びに１株の植物がＧＶＥおよびｅｔｒ−１についてネガティブであった（Ｐ１８７−１４）。

実施例３：タバコ植物成長に対するエチレン感受性の調節の影響
ＧｕｚｍａｎおよびＥｃｋｅｒ １９９０ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：５１３−５２３に記載され、本明細書において記載されるように改変されたトリプル応答アッセイが行われ、実施例２の形質転換されたタバコ植物におけるエチレン感受性の調節の効果を決定した。設計された各形質転換植物、１８５−１、１８４−３、１８５−８、１８５−１１、１８７−７、１８７−１３、１８７−１７および１８７−２１について、各植物から２枚の葉が小片に切断された。これらの小片は、１００ｎｇ／Ｌのカナマイシンを含み、１０μＭの誘導剤、すなわち、３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３Ｓ−ヒドロキシメチル−５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボニル）ヒドラジンを含むかもしくは含まないＭＳＳプレート上に置かれた。抗生物質もしくは誘導剤を含まないＭＳＳプレートは対照として使用された。
これらのプレートの植物組織を２５℃で、光を照射して、成長チャンバー内で成長させて、芽を生じさせた。芽は新たなプレートに移され、約２週間２５℃で成長を続けさせられた。各カルスは、次いで、誘導剤を含むかもしくは含まない新たな培養皿に移された。芽が生え始めている各カルスは、１プレートあたりのカルスの量がほぼ等しくなるようにいくつかのプレートに分けられた。
次いで、このプレートは、１８日間続く次の処理プロトコールのためにグループに分けられた：
（ａ）誘導、暗所、エチレンなし（空気対照）
（ｂ）誘導剤なし、暗所、エチレンなし（空気対照）
（ｃ）誘導、暗所、約１０ｐｐｍの濃度のエチレン
（ｄ）誘導剤なし、暗所、エチレン（約１０ｐｐｍの濃度）。
芽の長さが測定され、上記条件（ａ）〜（ｄ）について、芽の長さの生データに基づいて、実施例にしたがって生産されたトランスジェニック植物の有効性の相対的評価が表Ｉに報告される。典型的には、暗所でエチレンに曝露された野生型の芽は発育不全を示す。エチレン非感受性植物は、これらの条件下で、伸長した成長を示した。変異ｅｔｒ１−１の発現のための誘導剤の存在下で、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含むトランスジェニック植物は、同じ環境下での非誘導のトランスジェニック植物と比較して増大した芽の長さに基づいて、エチレン非感受性を示した。光の照射下での芽の成長は説明できないデータをもたらした。

この実施例の結果は、遺伝子発現系およびこれにより形質転換された植物は、選択された誘導用組成物で処理された場合に、その誘導用組成物に応答した遺伝子発現系が成功裏にエチレン感受性を調節することを可能にすることを示す。

実施例４：トランスジェニックシロイヌナズナ植物の生産
シロイヌナズナ植物は実施例１からのプラスミドで、アグロバクテリウムを用い、標準的なフローラルディッププロトコールを用いて形質転換された。種子が収穫され、カナマイシン含有培地上に蒔かれた。形質転換された植物は、カナマイシン上で成長する能力について選択され、ｅｔｒ１−１遺伝子の存在を確認するためにＰＣＲでスクリーニングされた。ルシフェラーゼ構築物を運ぶ形質転換体のためにルシフェラーゼアッセイが使用された。ポジティブ形質転換体は自家受粉させてＴ１種子を生じさせた。種子はカナマイシン含有培地上で成長させられ、導入遺伝子のホモ接合型の系統を同定した。エチレン非感受性の誘導について試験するためにホモ接合型の植物が使用された。

実施例５：シロイヌナズナ植物成長に及ぼすエチレン感受性調節の影響
トリプル応答アッセイ（上述のＧｕｚｍａｎおよびＥｃｋｅｒ、１９９０、後述のように改変された）が使用されて、実施例４の形質転換されたシロイヌナズナ植物におけるエチレン感受性の調節を決定した。シロイヌナズナ種子は表面が滅菌され、暗所で、４日間、４℃で、２０μＭの誘導剤中で水分を吸収させられた。この種子は１％スクロースおよび２０μＭの誘導剤を含む０．５×ＭＳ上に蒔かれ、そして変異受容体については１０ｐｐｍエチレンで処理され、または野生型受容体については１ｐｐｍエチレンで処理され、２１℃で４から８日間暗所で成長させられた。エチレンに対する応答は最終日にスコア化された。変異ｅｔｒ１−１の発現のための誘導剤の存在下で、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含むトランスジェニック植物は、同じ環境下での非誘導のトランスジェニック植物と比較して増大した芽の長さおよび／または変化した根の成長に基づくエチレン非感受性を示した。この実施例の結果は、遺伝子発現系およびそれにより形質転換された植物は、選択された誘導用組成物で処理された場合に、その誘導用組成物に応答する遺伝子発現系が成功裏にエチレン感受性の調節を可能にすることをさらに示す。
野生型、ｅｉｎ２−５（エチレン非感受性変異体対照）、およびｐ１００２シロイヌナズナ形質転換体苗木はトリプル応答アッセイ（上述のＧｕｚｍａｎおよびＥｃｋｅｒ、１９９０、後述の改変を伴う）を用いてエチレン非感受性についてアッセイされ、このアッセイにおいては種子は、１０ｐｐｍエチレンの存在下で、暗所で１１日間、０．５×ＭＳ培地上で発芽させられた。根および胚軸成長はエチレン感受性苗木においてエチレンによって阻害されるが、エチレン非感受性苗木においては阻害されない。

上述のように、誘導剤の非存在下で、ｐ１００２形質転換体苗木における根および胚軸成長は野生型苗木からの成長と有意に相違していなかった。しかし、誘導剤の存在下では、根はｐ１００２形質転換体において、野生型苗木と比較して有意に長かったが、それらはｅｉｎ２変異体ほど長くはなかった。胚軸においては影響は認められなかった。エチレン非感受性をもたらす銀および誘導剤の存在下においては、予想されたように、ｐ１００２シロイヌナズナ形質転換体苗木のほとんどの根は、野生型またはｅｉｎ２変異体苗木のいずれよりも有意に長くなかった。よって、変異ｅｔｒ１−１の発現のための誘導剤の存在下で、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含むトランスジェニック植物は、同じ条件下の非誘導のトランスジェニック植物と比較して増大した根の長さに基づくエチレン非感受性を示す。

実施例６：トランスジェニックトマト植物の生産、および植物成長に及ぼすエチレン感受性の調節の影響
実施例１からのプラスミドを用いて、アグロバクテリウムによって、標準的な方法を用いて、トマト子葉片が形質転換された。想定される形質転換体は、カナマイシンまたはアクチノニンを用いて選択され、ＰＣＲ分析によって確認された。ポジティブ形質転換体は２回自家受粉されて、導入遺伝子についてホモ接合型の系統を得た。ホモ接合型植物が使用され、実施例５の方法と類似の方法で、エチレン感受性の誘導について試験された。
トリプル応答アッセイ（上述のＧｕｚｍａｎおよびＥｃｋｅｒ、１９９０、後述のように改変された）が使用されて、形質転換されたトマト植物におけるエチレン感受性の調節を決定した。トマト種子は表面が滅菌され、暗所で、４日間、４℃で、２０μＭの誘導剤中で水分を吸収させられた。この種子は１％スクロースおよび２０μＭの誘導剤を含む０．５×ＭＳ上に蒔かれ、そして変異受容体については１０ｐｐｍエチレンで処理され、または野生型受容体については１ｐｐｍエチレンで処理され、２１℃で４から８日間暗所で成長させられた。エチレンに対する応答は最終日にスコア化された。変異ｅｔｒ１−１の発現のための誘導剤の存在下で、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含むトランスジェニック植物は、同じ環境下での非誘導のトランスジェニック植物と比較して増大した芽の長さおよび／または変化した根の成長に基づくエチレン非感受性を示した。この実施例の結果は、遺伝子発現系およびそれにより形質転換された植物は、選択された誘導用組成物で処理された場合に、その誘導用組成物に応答する遺伝子発現系が成功裏にエチレン感受性の調節を可能にすることをさらに示す。
ホモ接合型で、独立したｐ１００２およびｐ１００３系統の３種からの種子は、エチレンの前駆体であるＡＣＣを２０μＭ含む、１％スクロース＋０．５×ＭＳ培地上で、暗所で発芽させられた。ＡＣＣ上での発芽はトマト種子成長を阻害した。同じ系統からの種子は２０μＭのＡＣＣ＋２０μＭ誘導剤の存在下でも発芽させられた。結果は表ＩＩＩに示される。

誘導剤の存在下でのＡＣＣ上での成長は、誘導された苗木が頂端屈曲部を有しない伸長した胚軸を示すような、結果的にエチレン非感受性の状態をもたらした。誘導剤の非存在下においては、ｐ１００２含有系統についてはエチレン非感受性は得られず、ほんのわずかのエチレン非感受性しかｐ１００３構築物からもたらされなかった。この結果は、誘導には完全な状態のエチレン非感受性を誘導することが必要とされることをさらに示す。

実施例７：トランスジェニックトウモロコシ植物の生産およびトウモロコシ植物成長に及ぼすエチレン感受性の調節の影響
トウモロコシ植物は実施例１のプラスミドを用いて、微粒子衝突（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって形質転換された。想定される形質転換体は、アクチノニンまたはビアラホスを用いて選択され、ＰＣＲ分析によって確認された。ポジティブ形質転換体は近交系Ｂ７３と戻し交配されて活力を増大させた。上述のように生産されたトランスジェニックトウモロコシ植物はエチレン感受性の調節について試験された。エチレン感受性の調節は、植物をエチレンに曝露し、エチレンで誘導された遺伝子の誘導の変化を測定することにより、分子レベルで決定された。変異ｅｔｒ１−１の発現のための誘導用化合物の存在下で、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含むトランスジェニック植物は、エチレン誘導性遺伝子の低下された発現に基づくエチレン非感受性を示した。
上述のように生産されたトランスジェニックトウモロコシ植物はエチレン感受性の調節について試験された。エチレン感受性の調節は、植物をＡＣＣ、すなわちエチレンの前駆体に曝露し、エチレンで誘導された遺伝子の誘導における変化を測定することにより分子レベルで決定された。温室で成長中のトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物茎の外皮（ｓｔａｌｋ ｓｈｅａｔｈ）組織が摘出され、インビトロバイオアッセイにおいて使用された。エチレン非感受性ｅｔｒ１−１導入遺伝子の発現を誘導させるために、摘出された組織は水または２０μＭ誘導剤で２日間処理された。２日間の誘導期間の後で、この組織は１日間、０、１または１０μＭのＡＣＣで処理されて、エチレンを生じさせ、次いで収穫された。収穫された組織は直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に入れられた。ＭａｇＭＡＸ−９６全ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、この組織から全ＲＮＡが調製された。エチレン誘導性遺伝子（ＡＣＣオキシダーゼ）の誘導はアプライドバイオシステムズ７９００ＨＦファーストリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）で定量的ＰＣＲを用いて測定された。逆転写酵素（ＲＴ）についてはＴａｑＭａｎアッセイキット（ＡＢＩ）が使用され、ＰＣＲは製造者の推奨するプロトコールを使用した。内部対照としてトウモロコシ１８を使用して各サンプルについての発現を正規化した。

プライマーおよびプローブの配列は次の通りであった：

遺伝子発現を決定するために、０μＭの誘導剤プラス０μＭのＡＣＣ対照の処理におけるＡＣＣオキシダーゼ発現が各トウモロコシ系統について正規化された。各トウモロコシ系統についての相対的な発現および処理あたりの平均発現が表ＩＶに示される。

予想されるように、トランスジェニックトウモロコシ系統におけるＡＣＣオキシダーゼの平均発現は誘導剤プラスＡＣＣ、すなわち、エチレンの前駆体の存在下で抑制される。変異ｅｔｒ１−１の発現のための誘導用化合物の存在下で、ｅｔｒ１−１の発現のための活性化カセットおよびターゲットカセットを含むトランスジェニック植物は、エチレン誘導性遺伝子の低減された発現に基づくエチレン非感受性を示した。

実施例８：エチレン非感受性に及ぼすＡＣＣ濃度の影響
一つのｐ１００２系統および一つのｐ１００３系統からのホモ接合型トマト種子が２０μＭの誘導剤および様々な量（すなわち、１．０〜μＭ）のエチレン前駆体であるＡＣＣを含む培地上で発芽させられた。表Ｖに示されるように、エチレン非感受性の誘導は、試験されたＡＣＣ濃度の範囲にわたって起こった。胚軸および根のわずかに少ない伸長によって認められるように、より高いＡＣＣ濃度で達成される非感受性の水準の幾分かの低減があったが、その値は依然として野生型対照と比較して実質的に増大していた。

実施例９：誘導剤濃度の関数としての植物におけるエチレン非感受性の程度
一つのｐ１００２含有系統および一つのｐ１００３含有系統からのホモ接合型トマト種子が２０μＭのＡＣＣおよび様々な量（すなわち、０．５〜２０μＭ）の誘導剤を含む培地上で発芽させられた。表ＶＩに示されるように、誘導剤の濃度は、各系統で得られたエチレン非感受性の水準に直接関連していた。これらのデータは、植物におけるエチレン非感受性の様々な水準は単に誘導の水準を調節することにより達成されうることを示す。

実施例１０：植物におけるエチレン非感受性の一時的な誘導
誘導されたエチレン非感受性植物が、誘導剤がもはや提供されない場合にエチレン感受性に戻ることを示すために、一つのｐ１００２系統からのホモ接合型トマト種子が、２０μＭのＡＣＣおよび１０μＭ誘導剤を含む培地上で、２、４、６、８または１４日間発芽させられた。暗所で１４日間成長させた後、胚軸および根がエチレン非感受性を評価するために測定された。エチレン非感受性苗木はより長い胚軸および根を有することが期待された。誘導剤の非存在下においては、その苗木はエチレンに対して感受性になり、暗所における矮小の成長をしめすであろう。よって、戻された苗木の根および胚軸の成長は感受性の苗木および非感受性の苗木の中間であろう。表ＶＩＩに示されるように、２または４日間誘導され、次いで１０または６日間誘導剤から隔離された苗木は、それぞれ、非誘導の対照の苗木と匹敵するエチレン感受性の状態に戻ったことを示した。６日間は、このｐ１００２含有トマト系統における完全な状態のエチレン非感受性を誘導するのに充分であった。

上記実施例はｅｔｒ１−１のヌクレオチド配列の使用を示すが、本明細書は、当業者に、同じ方法で、エチレン生合成経路および他の植物経路における多くの他の遺伝子の発現を調節する能力を明らかにもたらす。
上述の実施形態の多くの修飾および変更が本明細書に含まれ、かつ当業者に自明であると考えられる。本明細書に記載される組成物および方法に対するこのような修飾および変更は添付の特許請求の範囲に包含されると考えられる。
上に示され、参照される特許、特許出願および公報、並びに非特許文献をはじめとする全ての文献、並びに、添付の図面および／または配列表は、本明細書の明示的な教示と整合する限りは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。

Claims (19)

1. 植物細胞におけるエチレン応答の制御可能な発現のための遺伝子発現系であって；
   当該遺伝子発現系は活性化カセットおよびターゲットカセットを含み；
   前記活性化カセットは、好適なプロモーターの制御下で、これと動作可能に関連するように、（ａ）選択された応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＥｃＲＬＢＤ）；および（ｃ）誘導用組成物の存在下で活性化される活性化ドメイン（ＡＤ）；を含み；
   前記ターゲットカセットは（ｄ）誘導性プロモーターを含み；
   前記誘導性プロモーターは、（ａ）のＤＢＤが結合する応答エレメントと、（ｃ）のＡＤに応答性の最小プロモーターとを動作可能に関連するように含み；
   前記誘導性プロモーターは、（ｅ）植物においてエチレンに対する感受性を改変する選択されたタンパク質をコードする核酸配列の発現を制御し；
   植物細胞内に誘導用組成物が存在する場合には、前記活性化カセットの構成要素と前記ターゲットカセットの構成要素との間の相互作用が、選択されたタンパク質の発現を調節し、植物細胞におけるエチレン感受性を選択的に調節し、タンパク質発現の調節が誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御可能である；
   植物細胞におけるエチレン応答の制御可能な発現のための遺伝子発現系。
2. 活性化カセットおよびターゲットカセットが同じプラスミド上に存在する、請求項１に記載の系。
3. 活性化カセットおよびターゲットカセットが別々のプラスミド上に存在する、請求項１に記載の系。
4. 活性化カセットのプロモーターが、構成的プロモーター、植物細胞特異的プロモーター、植物組織特異的プロモーター、植物器官特異的プロモーター、誘導性プロモーター、発生特異的プロモーター、および細胞分化特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の系。
5. プロモーターが構成的プロモーターである請求項４に記載の系。
6. ＤＢＤが、ＧＡＬ４ ＤＢＤ、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＨ核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、バクテリアＬａｃＺ ＤＢＤ、ＥｃＲ ＤＢＤ、ｃＩプロモーターＤＢＤからなる群から選択される、請求項１に記載の系。
7. エクジソン受容体ＬＢＤが、無脊椎動物エクジソン受容体もしくはこの変異体の全部もしくは一部分を含む、請求項１に記載の系。
8. エクジソンＬＢＤがＣｆＥｃＲの全長におけるアミノ酸位置３３５にスレオニンからバリンへの変異を含む、請求項７に記載の系。
9. 活性化ドメインが、ＶＰ１６、グルココルチコイド活性化ドメイン、Ｇａｌ４活性化ドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の系。
10. 誘導性プロモーターが、最小プロモーター配列と、活性化カセットにおけるＤＮＡ結合ドメインに対応する応答エレメントの１以上のコピーとを動作可能に関連するように含む、請求項６に記載の系。
11. 選択されたタンパク質をコードする核酸配列が、エチレン生合成遺伝子ＡＣＳおよびＡＣＯ、ＡＣＣデアミナーゼ、エチレン受容体遺伝子ＥＴＲ１、ＥＴＲ２、ＥＲＳ１、ＥＲＳ２およびＥＩＮ４、エチレンシグナル伝達経路遺伝子ＲＴＥ１、ＣＴＲ１、ＥＩＮ２、ＥＩＮ３およびＥＩＮ３様（ＥＩＬ１−５）、エチレン応答因子ＥＲＦ１、ＥＤＦ１、ＥＤＦ２、ＥＤＦ３およびＥＤＦ４、およびＥＩＮ３結合Ｆ−ボックスタンパク質ＥＢＦ１およびＥＢＦ２、並びにこれらの変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の系。
12. 活性化カセットが、構成的Ｇ１０−９０プロモーターの制御下で、これと動作可能に関連するように、（ａ）５コピーのＧＡＬ４応答エレメントを含む応答エレメントを認識するＧＡＬ４ ＤＢＤ；（ｂ）エクジソン受容体ＬＢＤ；および（ｃ）誘導用組成物の存在下で活性化されるＶＰ１６ＡＤ；を含み；並びに
    ターゲットカセットが（ｄ）誘導性プロモーターを含み；
    前記誘導性プロモーターは、５コピーのＧＡＬ４応答エレメントおよび最小３５Ｓプロモーターを動作可能に関連するように含み、前記最小３５ＳプロモーターはＶＰ１６ＡＤの活性化に対して応答性であり、前記誘導性プロモーターは（ｅ）変異ＥＴＲ１タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御し；
    植物細胞内に誘導用組成物が存在する場合には、前記活性化カセットの構成要素と前記ターゲットカセットの構成要素との間の相互作用が、前記変異ＥＴＲ１タンパク質の発現を調節し、植物細胞におけるエチレン感受性を選択的に低減させ、タンパク質発現の低減が誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御可能である；
    請求項１に記載の系。
13. 請求項１に記載の遺伝子発現系を安定的に発現するトランスジェニック植物細胞を含む構成体。
14. トランスジェニック植物組織または器官である請求項１３に記載の構成体。
15. トランスジェニック植物である、請求項１３に記載の構成体。
16. （ａ）植物における少なくとも１つの細胞を、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子発現系で形質転換し；
    （ｂ）形質転換された植物細胞から植物を発生させ；並びに
    （ｃ）形質転換された植物細胞を含む植物であって、当該植物が誘導用組成物と接触させられる場合に、エチレン非感受性の選択的な調節を示し、当該調節が誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御される植物を選択する；
    ことを含む、トランスジェニック植物を生産する方法。
17. 植物におけるエチレン感受性を調節する方法であって、
    有効量の誘導用組成物をトランスジェニック植物の細胞に適用することを含み；
    前記植物は請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子発現系を安定的に発現する細胞を含み；
    誘導用組成物の存在下で、植物細胞のエチレンに対する感受性が低減し、誘導用組成物の不在下で、植物細胞のエチレンに対する感受性が増大し；
    エチレン感受性の調節は、誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御される；
    植物におけるエチレン感受性を調節する方法。
18. 誘導用組成物がジアシルヒドラジン化合物である、請求項１７に記載の方法。
19. 制御されるエチレン感受性が、老化、果実熟成、ストレス応答、発芽、病原体耐性、落葉、落花、つぼみの落下、丸莢の落下、果実の落下、開花；並びに干ばつ、高温、植物密度および塩分に対する応答、からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

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