CN101848990B - 改变植物生理学反应的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

一种在植物细胞中可控表达乙烯效应的基因表达系统，其包括激活盒和靶标盒，激活盒包括识别效应元件的DNA-结合域、蜕皮激素受体配体结合域和激活域(AD)；靶标盒诱导型启动子，该诱导型启动子包含操作性结合的效应元件和对激活域起反应的最小启动子。该基因表达系统在控制乙烯敏感性的诱导组合物的存在下，调节转基因植物细胞、组织、器官或整个植物的乙烯敏感性。可控制这种转基因植物和组织的乙烯敏感性以操纵熟化、开花、枯萎及植物的其他乙烯敏感性功能。

Description

改变植物生理学反应的组合物和方法
背景技术
植物激素乙烯是调节植物生命周期中的许多生理学过程的信号转导分子，这些生理学过程包括发芽期间、花和果实发育过程中的反应，以及植物对各种环境应激源，例如干旱、热、盐度过量以及疾病的反应(参见例如，Chen等，2005，Annals of Botany，95：901-915；Czarny等，2006 Biotechnol.Adv.，24：410-419)。乙烯生物合成途径和信号转导/调节途径及网络是公知的。例如，参见图1和2，Wang等，“乙烯生物合成和信号转导网络”(Ethylene Biosynthesisand Signaling Networks)，《植物细胞》(The Plant Cell)，2002(美国植物生物学家协会(American Society of Plant Biologists)编著)，第S131-S151页。商业上，调节包括水果、蔬菜和花卉等植物中的乙烯效应的常规途径涉及将化学物质施用于植物、水果、花卉或蔬菜，例如1-甲基环丙烯(1-MCP；农新有限公司(AgroFresh Inc.))。1-MCP是通常为气体的化合物，可用作植物生长调节剂，防止乙烯与其在植物组织中的受体的结合。其应用增加了植物对乙烯的不敏感性。乙烯敏感性的短暂消除可能增加植物对应激的抵抗力或耐受、延迟成熟、枯萎或开花，以及进行其他有商业价值的植物生长操纵。
近来，提出了用修饰的乙烯效应受体或参与植物中乙烯效应的其他蛋白质遗传转化植物细胞的建议，例如参见美国专利6,294,716；美国专利申请公开2006/0200875、2005/0066389、2005/0060772和2004/0128719等。这些系统介导乙烯途径中的各种突变基因的表达。这些系统通常采用各种建议的启动子来启动蛋白质的表达，包括组成型启动子和组织特异性启动子。
虽然已经提出将化学调节的基因表达系统用于植物物种(M.Padidim 2003Curr.Opin Plant Biol.，6(2)：169-77)，但许多这些系统仅仅是实验性的，或者已经报道存在一些缺陷。这些缺陷包括：使用毒性或挥发性诱导剂、诱导水平低、在植物中易位/移动差、“关闭”基因表达的能力慢、或者对植物非毒性诱导剂的特异性不够，等等。这些基因表达系统未能在所有植物中普遍使用，操作性组件及其组合件的选择常常充满挑战。
在现有技术的例子中，乙烯途径基因常常总是在植物的所有组织和部件上或者总是在植物的特定组织上表达。然而，组织特异性启动子或低水平组成型启动子可能有漏洞或者由不希望的诱导剂诱导。这些常规启动子不能严格调节植物中的激素表达。乙烯途径基因的表达时机、表达持续时间和表达水平是正常生理学功能的关键。随意诱导乙烯不敏感性并且保持预定的时间范围在现有技术中尚未成功实现。
本领域仍然需要能够可控地依时序调节植物激素反应，例如乙烯敏感性的组合物和方法，该组合物和方法可安全用于农作物和食物以及其他植物。
附图简要说明
图1是质粒p185的示意图，该质粒包括用于表达乙烯效应途径中的突变基因ETR1-1的基因表达系统。构建物上方是激活盒组件的标记，即10-90p组成型启动子、VP16激活域、GAL4DNA结合域、蜕皮激素受体(EcR)配体结合域和NOS终止子。构建物上方也包括靶标盒组件的标记，包括GAL4效应元件的5个重复单元(5xG)，最小35S启动子(M35S)，突变etr 1-1基因的序列和35S终止子(35St)。靶标盒之后是任选的植物选择性标记物PDF1，然后是rbcS终止子，可用于确定基因构建物是否稳定整合到植物细胞内。构建物下方是常规酶切位点的位置和种类。
图2是称为p185的质粒的一个例子的示意图，该质粒同时具有基因表达系统的激活盒和靶标盒(G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-etr1)，盒中各组件如图1和SEQ ID NO：1所示，显示突变基因etr 1-1具有G到A突变，括号中显示切割位点的核酸位置。该质粒的盒部分在SEQ ID NO：1中有报道。序列表或附图中未提供市售可得的质粒主链，因为这些主链可以容易地被其他质粒主链代替。
图3是称为p187的质粒的一个例子的示意图，该质粒包含激活盒和靶标盒[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-etr1]，利用GVE受体-介导的etr 1-1的诱导表达而表达etr 1-1。该质粒的盒部分在SEQ ID NO：2中有报道。序列表或附图中未提供市售可得的质粒主链，因为这些主链可以容易地被其他质粒主链代替。
发明内容
本文所述组合物和方法通过提供能够以时序、定性和/或定量方式可靠而安全地控制乙烯敏感性调节的转基因植物、植物细胞、组织、器官、果实或花而满足了本领域的需要。这些组合物和方法能够严格调节基因表达和激素表达，可安全应用于农作物和食物以及其他有商业价值的植物。
在一个方面，提供了在植物细胞中可控表达乙烯效应的基因表达系统。该系统包括激活盒和靶标盒，激活盒和靶标盒可以位于一个或多个质粒上。激活盒包括合适的启动子、DNA-结合域(DBD)、蜕皮激素受体配体结合域(EcRLBD)和激活域(AD)。靶标盒包括化学诱导的启动子，该启动子包括操作性结合的效应元件和最小启动子，DBD结合该效应元件，最小启动子对AD起反应。这种化学诱导的启动子控制编码调节植物中乙烯敏感性的选定蛋白质或其片段的靶核酸序列的表达(有义或反义方向)。植物细胞中两个盒中各组件与诱导组合物的相互作用可调节蛋白质的表达并选择性地调节植物细胞中的乙烯敏感性。蛋白质表达的调节可以通过应用诱导组合物的时机、浓度和持续时间进行控制。诱导组合物可被植物细胞吸收和易位到植物细胞内，在细胞内与激活域相互作用以启动靶标盒的化学诱导型启动子。因此，该系统能够通过靶核酸序列的表达可控且选择性地调节植物细胞中的乙烯敏感性。
在另一方面，提供了一种短暂或稳定地表达上述基因表达系统的植物细胞。
在另一方面，提供了一种短暂或稳定地表达上述基因表达系统的植物组织或器官。
在另一方面，提供了一种短暂或稳定地表达上述基因表达系统的转基因植物。
在另一方面，一种制备这种转基因植物或其部分的方法，该方法包括用本文所述的基因表达系统转化至少一个植物细胞；由转化的植物细胞产生植物细胞、组织、器官或完整植株；和当植物细胞、组织、器官或完整植株接触诱导组合物时选择显示能可控调节乙烯不敏感性的植物细胞、组织、器官或完整植株。蛋白质表达的调节可以通过应用诱导组合物的时机、浓度和持续时间进行控制。诱导组合物可以被植物细胞、组织、器官或完整植株吸收和易位到这些植物细胞、组织、器官或完整植株内。
在又一方面，一种控制植物中的乙烯敏感性的方法，该方法包括将有效量的诱导组合物应用于转基因植物或其部分的细胞，所述植物包含能够稳定或短暂表达本文所述基因表达系统的细胞。诱导组合物可以被植物细胞吸收和易位到植物细胞内。在诱导组合物的存在下，在选定的时间内植物细胞对乙烯的反应降低；通过去除植物中的诱导剂，在选定的时间后植物细胞对乙烯的反应增加。蛋白质表达的调节可以通过应用诱导组合物的时机、浓度和持续时间进行控制。
下面的发明详述中将进一步描述这些方法和组合物的其他方面和优点。
具体实施方式
本文所述组合物和方法解决了本领域对于可控调节植物中乙烯敏感性的组合物和方法的需要。更具体说，本文所述的组合物和方法能够基于选定量的化学诱导剂的使用有意改变表达水平。这种操控植物激素调节的能力提供了农作物的生长和成熟的农业优势以及以下所述的其他优点。
I.基因表达系统
利用基因表达或调节系统在植物细胞中稳定或短暂表达。该系统的组件包括至少两个基因表达盒，每个盒能够在植物细胞中表达。
在一个实施方式中，第一基因表达盒称为激活盒，其包括可以在与其操作性结合的合适启动子控制下在植物细胞中表达的多核苷酸，该多核苷酸编码以下组件：(a)DNA-结合域(DBD)，DBD识别与准备调节其表达的基因，即编码调节植物中乙烯敏感性的选定蛋白质的基因相关的效应元件；(b)配体结合域(LBD)，LBD包括蜕皮激素受体配体结合域(EcRLBD)或其功能片段；和(c)激活或反式激活域(AD)，AD在适用于植物的诱导组合物的存在下激活。在一个实施方式中，激活盒中的组件采用以下5′到3′的顺序存在：LBD位于DBD下游，而DBD在AD下游。在另一实施方式中，激活盒中的组件采用以下5′到3′的顺序存在：LBD位于AD下游，而AD在DBD下游。在另一实施方式中，激活盒中的组件采用以下5′到3′的顺序存在：DBD位于LBD下游，而LBD在AD下游。在另一实施方式中，激活盒中的组件采用以下5′到3′的顺序存在：DBD位于AD下游，而AD在LBD下游。在另一实施方式中，激活盒中的组件采用以下5′到3′的顺序存在：AD位于LBD下游，而LBD在DBD下游。在另一实施方式中，激活盒中的组件采用以下5′到3′的顺序存在：AD位于DBD下游，而DBD在LBD下游。激活盒还包括优选位于盒3’末端的终止子。下面将描述这些组件的具体特征。
第二基因表达盒即靶标盒，其包括编码以下组件的多核苷酸。一个组件是化学诱导的启动子，其包括操作性结合的效应元件(RE)和最小启动子，激活盒编码的蛋白质的DBD结合RE，而最小启动子对激活盒的AD起反应。另一个组件是靶核酸序列，该序列编码调节植物中乙烯敏感性的选定蛋白质，或者编码该蛋白质的功能片段。在某些实施方式中，核酸序列可以是有义取向。在其它实施方式中，核酸序列可以是反义取向。诱导型启动子控制编码选定蛋白质的序列或反义序列的表达。
在另一实施方式中，激活盒和/或靶标盒还包含终止子序列，例如在编码蛋白质的核酸序列或其反义序列下游，以及任选的可选标记物。这种标记物是众所周知的，用于在抗生素或其他化学物质的存在下选择摄取基因的细胞。下面将更详细地描述这些任选组件。
植物细胞中与诱导组合物协同作用时，基因表达系统发挥作用，使得激活盒和靶标盒的各组件能够调节选定蛋白质的表达。选定蛋白质的调控或调节能够选择性地调节植物细胞的乙烯敏感性。例如，一种调控方式包括提高植物细胞的乙烯敏感性。在另一实施方式中，降低植物细胞的乙烯敏感性。通过基因表达系统中各组分与诱导组合物的相互作用来控制植物细胞中调节乙烯途径的蛋白质的表达。诱导组合物可以被植物细胞吸收和/或易位到植物细胞内。
在该系统的一个实施方式中，第一盒和第二盒位于同一个质粒上，例如图2和3所示。在另一实施方式中，第一和第二盒位于单独的质粒上。
在基因表达系统的另一个实施方式中，第一基因表达盒可包含DBD和第一LBD；第二盒可包含AD和第二不同的LBD；第三盒可包含编码效应元件的多核苷酸、启动子和需要调节表达的靶基因，第一多肽的DBD结合该效应元件，第二盒的AD激活该启动子。在该系统中，AD和DBD操作性连接于两个不同的蛋白质，在诱导组合物的存在下可激活靶基因的表达。在一个实施方式中，第一LBD可以是EcR LBD，第二LBD可以是来自类视黄醇X受体的LBD。在另一实施方式中，第二LBD可以是EcR LBD，而第一LBD可以是来自类视黄醇X受体的LBD。这种结构在美国专利7091038或2005年12月1日公开的美国专利公开US 2005/0266457中描述。
为了理解以下组件，所用的术语“操作性连接”或“可操作地连接”表示单一核酸片段上核酸序列的结合，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子操作性连接于编码序列。编码序列以有义或反义取向操作性连接于调控序列。
本文所用术语“表达”表示源自核酸或多核苷酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。在一个实施方式中，表达表示mRNA翻译形成蛋白质或多肽。在另一实施方式中，可以通过以下方式降低或下调表达：反义(即，表达与mRNA“有义”序列互补的序列，然后结合“有义”链并阻止其表达)，共抑制(即，过度表达基因序列，通常是转基因，导致同源内源性基因的抑制)或RNA干扰(RNAi，即将RNA引入细胞最终导致互补细胞mRNA下降并导致基因活性降低的过程)。在另一实施方式中，基因表达系统的组件可以在植物细胞中短暂表达。在另一实施方式中，基因表达系统的组件可以通过整合入植物细胞的染色体内而稳定表达。短暂或稳定整合表达的选择可以由产生和使用本文所述基因表达系统领域中的技术人员进行选择。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”表示能够在特定限制位点或者通过同源重组插入核酸或多核苷酸的DNA区段。该DNA区段包括编码感兴趣多肽或者提供反义取向的基因的多核苷酸，盒和限制位点被设计成能够确保盒插入适当读码框以任一方向进行转录和翻译。这些载体或质粒可任选地包含编码感兴趣多肽的多核苷酸并具有除有利于特定宿主细胞转化的多核苷酸之外的元件。在某些实施方式中，这些盒还包含使得编码感兴趣多肽的多核苷酸在宿主细胞中表达提高的元件。这些元件包括但不限于：启动子、最小启动子、增强剂、效应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。
本文使用的所有其他术语采用本领域的常规涵义，除非另有说明。参见例如，美国专利7091038中的术语定义。
A.激活盒的启动子
在所述系统的一个实施方式中，激活盒的启动子是能够控制转化的植物细胞内DBD、LBD和AD序列的表达的核酸序列(DNA或RNA)。通常，这三种激活盒的主要组件位于选定启动子序列的3′端。启动子序列包括称为增强子的近端或较远端的上游元件。“增强子”是能够刺激启动子活性的DNA序列，可以是启动子的先天元件或是插入以增强启动子的水平或特异性的异源元件。本文中有用的启动子可完全源自天然基因，或者由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA区段。
在一个实施方式中，激活盒的启动子是组成型启动子，例如导致基因大多时候在大多数细胞类型中表达的启动子，使得用该盒转化的植物细胞不断产生激活盒组件。例如，适用于所述激活盒的某些组成型启动子包括但不限于：示例性的G10-90启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、木薯花叶病毒启动子、玄参花叶病毒启动子、杆状DNA病毒启动子、紫茉莉花叶病毒启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羟化/加氧酶启动子(Rubisco promoter)、肌动蛋白启动子或泛素启动子。
在其他实施方式中，可采用介导基因在不同组织或细胞类型中表达的启动子(“组织特异性”、“细胞特异性”或“植物器官特异性启动子”)。理想地，这种启动子是植物组织和植物细胞固有或有功能的，或者是植物组织和植物细胞固有或有功能启动子的突变形式。然而，也可使用在植物细胞中起作用的诸如哺乳动物、无脊椎动物等其他来源的其他组织和细胞的启动子。其他实施方式采用在发育的不同阶段表达组分的启动子(“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”)，或者响应不同环境或生理学条件的启动子。组织特异性启动子的详细列表可参见Gallie，美国专利申请公开2005/0066389，其描述了源自以下基因的种子特异性启动子：来自玉米的MACI(Sheridan，1996 Genetics 142：1009-1020)；来自玉米的Cat3(GenBank No.L05934，Abler 1993 Plant Mol.Biol.22：10131-10138)；来自拟南芥属(Arabidopsis)的vivparous-1(Genbank No.U93215)；来自拟南芥属的atmycl(Urao，1996 Plant Mol.Biol.32：571-576；Conceicao 1994 Plant 5：493-505)；来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的napA和BnCysP1(GenBank No.J02798，Josefsson，1987 JBL 26：12196-12201，Wan等，2002 Plant J 30：1-10)；来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的napin基因家族(Sjodahl，1995 Planta 197：264-271)。果实特异性启动子包括来自CYP78A9基因的启动子(Ito和Meyerowitz，2000 Plant Cell 12：1541-1550)。其他组织特异性启动子包括Reiser，1995 Cell 83：735-742，GenBank No.U39944；Ray，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5761-5765中描述的胚珠特异性BELl基因，以及卵和中央细胞特异性FIEl启动子。萼片和花瓣特异性启动子包括：拟南芥属花同源异形基因APETALAl(AP1)(Gustafson Brown，1994Cell 76：131-143；Mandel，1992 Nature 360：273-277)，AP2的相关启动子(例如参见Drews，1991Cell 65：991-1002；Bowman，1991 Plant Cell 3：749-758)。另一种有用的启动子是控制拟南芥属的罕见花器官(ufo)基因表达的启动子(Bossinger，1996Development 122：1093-1102)。其他组织特异性启动子包括：玉米花粉特异性启动子(Guerrero，1990 Mol.Gen.Genet.224：161-168)；也可参见Wakeley，1998Plant Mol.Biol.37：187-192；Ficker，1998 Mol.Gen.Genet.257：132-142；Kulikauskas，1997 Plant Mol.Biol.34：809-814；Treacy，1997 Plant Mol.Biol.34：603-611描述的启动子)。有用的启动子包括来自FUL基因的启动子(Mandel和Yanofsky，1995 Plant Cell，7：1763-1771)以及来自SHP1和SHP2基因的启动子(Flanagan等，1996 Plant J 10：343-353；Savidge等，1995 Plant Cell7(6)：721-733)。启动子可源自TA29基因(Goldberg等，1995 Philos Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350：5-17)。
其他合适的启动子包括来自以下基因的启动子：编码甘蓝型油菜的2S储存蛋白的基因(Dasgupta，1993 Gene 133：301-302)；来自拟南芥属的2s种子储存蛋白基因家族；编码甘蓝型油菜的油质蛋白20kD的基因，GenBank No.M63985；编码大豆油质蛋白A的基因，GenbankNo.U091 18，和编码大豆油质蛋白B的基因，Genbank No.U09119；编码拟南芥属油质蛋白的基因，GenbankNo.Z17657；编码玉米油质蛋白18kD的基因，GenBank No.J05212和Lee，1994Plant Mol.Biol.26：1981-1987；编码大豆低分子量富硫蛋白的基因(Choi，1995Mol Gen，Genet.246：266-268)。来自番茄的组织特异性E8启动子和来自ATHB-8、AtPIN1、AtP 5K1或TED3基因的启动子(Baima等，2001 Plant Physiol.126：643-655，Galaweiler等，1998 Science 282：2226-2230；Elge等，2001 Plant J.26：561-571；Igarashi等，1998 Plant Mol.Biol.36：917-927)也是有用的。
也可使用果实熟化、叶片枯萎和脱落期间以及在较低程度上花的枯萎和脱落期间有活性的番茄启动子(Blume，1997 Plant J.12：731-746)。其他示例性的启动子包括：编码雌蕊特异性碱性内切壳多糖酶的马铃薯(Solanum tuberosumL.)SK2基因中的雌蕊特异性启动子(Ficker，1997 Plant MoI.Biol.35：425-431)；转基因苜蓿滋养和花柄尖的表皮组织中有活性的豌豆阿拉斯加栽培品种(Pisum sativum cv.Alaska)的Blec4基因。可使用在滋养型组织中有活性的各种启动子，包括控制土豆的主要储存蛋白patatin的启动子(例如，Kim，1994PlantMol.Biol.26：603-615；和Martin，1997 Plant J.11：53-62)和毛根农杆菌的ORF13启动子(Hansen，1997 Mol.Gen.Genet.254：337-343)。其他有用的滋养型组织特异性启动子包括：编码主要的芋头(Colocasia esculenta L.Schott)球茎蛋白家族的球蛋白tarin的基因的tarin启动子(Bezerra，1995 Plant Mol.Biol.28：137-144)；curculin启动子(de Castro，1992 Plant Cell 4：1549-1559)和烟草根部特异性基因TobRB7的启动子(Yamamoto，1991 Plant Cell 3：371-382)。叶特异性启动子包括：二磷酸核酮糖氢羧化酶(RBCS)启动子、番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因(Meier，1997 FEBS Lett.415：91-95)。几乎只在叶片和叶鞘的叶肉细胞中高水平表达的二磷酸核酮糖羧化酶启动子(Matsuoka，1994 Plant J.6：311-319)，集光叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(Shiina，1997 Plant Physiol.115：477-483；Casal，1998 Plant Physiol.116：1533-1538)，拟南芥myb-相关基因启动子(AtmybS；Li，1996 FEBS Lett.379：117-121)，和Atmyb5启动子(Busk，1997 Plant J.11：1285-1295)都是有用的启动子。
有用的滋养型组织特异性启动子包括：分生组织(根尖和苗端)启动子，如“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECROW”启动子(Di Laurenzio，1996Cell 86：423-433；和Long，1996Nature 379：66-69。另一种有用的启动子控制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因的表达(例如参见Enjuto，1995Plant Cell.7：517-527)。有用的还有来自玉米和其他物种的具有分生组织特异性表达的knl相关基因，例如参见Granger，1996 Plant Mol.Biol.31：373-378；Kerstetter，1994 Plant Cell 6：1877-1887；Hake，1995 Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350：45-51，例如拟南芥KNAT1或KNAT2启动子(例如参见Lincoln，1994 Plant Cell 6：1859-1876)。
在激活盒的某些实施方式中，启动子可以是诱导型或调节型的，例如在细胞接触试剂、生物分子、化学物质、配体、光或一些其他刺激物或用这些物质处理细胞后可引起核酸序列的表达。这种诱导型启动子的非限制性列表包括：PR 1-a启动子、原核阻抑子-操纵子系统和高等真核转录激活系统，例如美国专利7091038中详述。这种启动子包括：来自大肠杆菌的四环素(″Tet″)和乳糖(″Lac″)阻抑子-操纵子系统。其他诱导型启动子包括：玉米干旱诱导型启动子；马铃薯的寒冷、干旱和高盐诱导型启动子，拟南芥属枯萎诱导型启动子，SAG12，以及LEC1、LEC2、FUS3、AtSERK1和AGLI5的胚胎发生相关启动子，都是本领域技术人员已知的。接触植物激素如植物生长激素或细胞激肽类后可诱导的其他植物启动子是也有用的，例如在美国专利申请公开US2005/0066389和美国专利6,294,716中所述。
上在激活盒中，能够启动序列DBD、LBD和AD的表达的任何启动子基本都是合适的，包括但不限于：病毒启动子、细菌启动子、植物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调节的启动子；发病或疾病相关启动子、花椰菜花叶病毒19S、花椰菜花叶病毒35S、CMV35S最小、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、玄参花叶病毒、杆状DNA病毒、紫茉莉花叶病毒、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、苗特异性、根特异性、壳多糖酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、植物超-启动子、马铃薯亮氨酸氨基肽酶、硝酸还原酶、醇脱氢酶、蔗糖合酶、甘露碱合酶、胆脂碱合酶、真蛸碱合酶、泛素、玉米醇溶蛋白、肌动蛋白和花色苷启动子。在本发明优选的实施方式中，启动子选自下组：花椰菜花叶病毒35S启动子、木薯叶脉花叶病毒启动子和花椰菜花叶病毒35S最小启动子、玄参花叶病毒启动子、杆状DNA病毒启动子、紫茉莉花叶病毒、泛素(Ubc)启动子和肌动蛋白启动子。
B.DBD
本文所用术语“DNA结合域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，最长至整个DNA结合蛋白长度，只要该DNA结合域能够与特定效应元件结合。在有或没有配体的存在下，DNA结合域结合RE的DNA序列以启动或抑制受RE调控的下游基因的转录。在基因表达单元的某些实施方式中，DBD位于激活盒中，而效应元件位于靶标盒中。
DNA结合域可以是具有已知效应元件的任何DNA结合域，包括合成和嵌合的DNA结合域，或其类似物、或组合、或修饰形式。在某些实施方式中，DBD是GAL4DBD、LexA DBD、转录因子DBD、H类核受体成员DBD、甾体/甲状腺激素核受体超家族成员DBD或细菌LacZ DBD。更优选地，DBD是昆虫蜕皮激素受体DBD，GAL4DBD(参见本文所述实施例的质粒中所示的序列)，或LexA DBD。这种DBD的序列公开可得，在诸如美国专利7091038或美国专利申请公开2005/0266457中描述。在其它实施方式中，盒中的DBD包括但不限于：由cI启动子或lac启动子获得的DNA结合域，这也是公开可得的序列。
C.蜕皮激素LBD和任选的第二LBD
在基因表达系统的某些实施方式中，蜕皮激素受体(EcR)LBD包括无脊椎动物蜕皮激素受体或其突变体的全部或其一部分。EcR是核甾体受体超家族成员，表现为特征DNA和配体结合域，以及激活域(Koelle等，1991，Cell，67：5977；也可参见美国专利6245531(Stanford)。蜕皮激素受体对许多甾体化合物有响应，例如松甾酮A和莫瑞甾酮A(muristerone A)和非甾体化合物。EcR具有5个模块域，A/B(反式激活)，C(DNA结合，异源二聚化)，D(铰链，异源二聚化)，E(配体结合，异源二聚化和反式激活)和F(反式激活)结构域。这些结构域中的一些，例如A/B、C和E在与其他蛋白融合后保留功能。可以用作本文所述基因表达系统中的LBD的EcR的合适部分包括D、E和F。
优选地，EcR是鳞翅类EcR、双翅类EcR、节肢类EcR、同翅类EcR和半翅类EcR。更优选地，使用的EcR是云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)EcR(″CfEcR″)、黄粉虫甲(Tenebrio molitor)EcR(″TmEcR″)、烟草天蛾(Manduca sexta)EcR(″MsEcR″)、绿棉铃虫(Heliothies virescens)EcR(″HvEcR″)、家蚕蛾(Bombyxmori)EcR(″BmEcR″)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)EcR(″DmEcR″)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)EcR(″AaEcR″)、绿蝇(Lucilia capitata)EcR(″LcEcR″)、地中海果蝇(Ceratitis capitata)EcR(″CcEcR″)、东亚飞蝗(Locusta migratoria)EcR(″LmEcR″)、紫堇瘤蚜(Myzus persicae)EcR(″MpEcR″)、招潮蟹(Uca pugilator)EcR(″UpEcR″)、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)EcR(″AmaEcR″)、银叶粉虱(Bamecia argentifoli)EcR(″BaEcR″)、或黑尾叶蝉(Nephotetix cincticeps)EcR(″NcEcR″)等。甚至更优选地，LBD来自云杉卷叶蛾EcR(″CfEcR″)或黑腹果蝇EcR(″DmEcR″)。这种EcR的序列公开可得，例如在美国专利7091038；国际专利申请WO 97/38117以及美国专利6333318、6265173和5880333中描述。
另一种合适的突变体蜕皮激素受体包含上文引用的美国专利申请公开2005/0266457描述的突变，例如包含至少一个突变的H类核受体配体结合域，所述突变的位置等同于或类似于该公开所鉴定的某些特定氨基酸残基。更具体说，在SEQ ID NO：9包含T到V氨基酸突变的蜕皮激素LBD是在以下实施例中使用特别理想的EcRLBD。这种突变体的序列也可记为本文所述SEQ ID NO：1的氨基酸990-1997。突变体EcR LBD称为T52V，描述了在全长CfEcR中氨基酸位置335处T到V的突变。以下实施例中使用的基因表达盒利用这种EcRLBD的突变。本文所述基因表达系统中也可使用本文所述的其他EcR LBD。在另一实施方式中，突变体蜕皮激素受体LBD是美国专利6,245,531(Stanford)所述的LBD。
在一个具体的实施方式中，LBD来自截短的EcR多肽。EcR多肽截短导致至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260或265个氨基酸的缺失。优选地，EcR多肽截短导致至少一部分多肽结构域的缺失。更优选地，EcR多肽截短导致至少整个多肽结构域的缺失。在一具体实施方式中，EcR多肽截短导致至少A/B-结构域、C-结构域、D-结构域、F-结构域、A/B/C-结构域、A/B/1/2-C-结构域、A/B/C/D-结构域、A/B/C/D/F-结构域、A/B/F-结构域、A/B/C/F-结构域、部分E结构域或部分F结构域的缺失。也可进行一些完整和/或部分结构域缺失的组合。
在另一实施方式中，H类核受体配体结合域由包含导致以下残基发生取代的密码子突变的多核苷酸编码，这些残基是a)SEQ ID NO：8的氨基酸残基48、51、52、54、92、95、96、109、110、119、120、125、128、132、219、223、234或238，b)SEQ ID NO：8的氨基酸残基96和119，c)SEQ ID NO：8的氨基酸残基110和128，d)SEQ ID NO：8的氨基酸残基52和110，e)SEQ ID NO：8的氨基酸残基107、110和127，或f)SEQ ID NO：8的氨基酸残基52、107和127。在另一实施方式中，H类核受体配体结合域由包含密码子突变的多核苷酸编码，所述突变可导致SEQ ID NO：8中氨基酸残基107和127发生取代以及插入氨基酸259。SEQ ID NO：8如图11所示。
在另一具体实施方式中，H类核受体配体结合域由包含导致以下残基发生取代的密码子突变的多核苷酸编码，所述残基是：a)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基48位置的天冬酰胺、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸或赖氨酸残基，b)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基51位置的甲硫氨酸、天冬酰胺或亮氨酸残基，c)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基52位置的亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷胺酰胺或谷氨酸残基，d)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸54位置的色氨酸或苏氨酸，e)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸92位置的亮氨酸或谷氨酸，f)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基95位置的组氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，g)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基96位置的亮氨酸、丝氨酸、谷氨酸或色氨酸残基，h)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸109位置的色氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺，i)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基110位置的谷氨酸、色氨酸或天冬酰胺残基，j)SEQID NO：8中等同于或类似于氨基酸119位置的苯丙氨酸，k)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸120位置的色氨酸或甲硫氨酸，l)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸125位置的谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸或精氨酸，m)SEQ ID NO：中等同于或类似于氨基酸128位置的苯丙氨酸，n)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸132位置的甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或缬氨酸，o)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基219位置的丙氨酸、赖氨酸、色氨酸或酪氨酸残基，p)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基223位置的赖氨酸、精氨酸或酪氨酸残基，q)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸234位置的甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸或异亮氨酸，r)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸238位置的脯氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸，s)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸119位置的苯丙氨酸残基和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸96位置的苏氨酸，t)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸110位置的脯氨酸残基和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸128位置的苯丙氨酸残基，u)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸52位置的缬氨酸残基和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸110位置的脯氨酸残基，v)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸107位置的异亮氨酸残基，SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸127位置的谷氨酸残基，和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸110位置的脯氨酸残基，或者w)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸107位置的异亮氨酸，SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸127位置的谷氨酸，和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸52位置的缬氨酸。在另一实施方式中，H类核受体陪配体结合域由包含密码子突变的多核苷酸编码，所述突变导致在SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸107的位置取代异亮氨酸残基，在SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸127的位置取代谷氨酸残基，和在SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸259的位置插入甘氨酸残基。在优选实施方式中，H类核受体陪配体结合域来自蜕皮激素受体。
在另一实施方式中，包含取代突变的LBD是包含取代突变的蜕皮激素受体配体结合域，由包含导致选自下组的取代突变的密码子突变的多核苷酸编码。根据该列表，F48Y表示SEQ ID NO：8的LBD中序列氨基酸位置48处的苯丙氨酸被酪氨酸取代，等等。因此，所述组包括SEQ ID NO：8中F48Y、F48W、F48L、F48N、F48R、F48K、I51M、I51N、I51L、T52M、T52V、T52L、T52E、T52P、T52R、T52W、T52G、T52Q、M54W、M54T、M92L、M92E、R95H、R95M、R95W、V96L、V96W、V96S、V96E、F109W、F109P、F109L、F109M、F109N、A110E、A110N、A110W、N119F、Y120W、Y120M、M125P、M125R、M125E、M125L、M125C、M125W、M125G、M125I、M125N、M125S、M125V、V128F、L132M、L132N、L132V、L132E、M219K、M219W、M219Y、M219A、L223K、L223R、L223Y、L234M、L234I、L234R、L234W、W238P、W238E、W238Y、W238M、W238L、N119F/V96T、V128F/A110P、T52V/A110P、V107I/Y127E/T52V和V107I/Y127E/A110P所表示的取代突变。在另一具体的实施方式中，包含取代突变的LBD是包含取代突变的蜕皮激素受体配体结合域，由包含导致SEQ ID NO：8中V107I/Y127E取代突变的密码子突变的多核苷酸编码，还包含SEQ ID NO：8中G259的插入突变((V107I/Y127E/G259)。
在另一实施方式中，LBD由在杂交条件下与上文鉴定的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，所述杂交条件包括在小于500mM的盐浓度和至少37℃进行杂交步骤，以及在2×SSPE和至少63℃进行洗涤步骤。在优选实施方式中，杂交条件包括在小于200mM的盐浓度和至少37℃进行杂交步骤。在另一优选的实施方式中，杂交条件包括在2×SSPE和63℃进行杂交和洗涤步骤。
在另一具体的实施方式中，配体结合域包含在等同于或类似于以下氨基酸残基位置的取代突变，这些氨基酸残基是：a)SEQ ID NO：8的氨基酸残基48、51、52、54、92、95、96、109、110、119、120、125、128、132、219、223、234或238，b)SEQ ID NO：8的氨基酸残基96和119，c)SEQ ID NO：8的氨基酸残基110和128，d)SEQ ID NO：8的氨基酸残基52和110，e)SEQ ID NO：8的氨基酸残基107、110和127，或f)SEQ ID NO：8的氨基酸残基52、107和127。在另一实施方式中，H类核受体配体结合域包含取代突变以及SEQ ID NO：8中氨基酸残基259的插入突变，所述取代突变导致等同于或类似于SEQ IDNO：8中氨基酸残基107和127位置发生取代突变。
优选地，LBD包含以下残基的取代：a)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基48位置的天冬酰胺、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸或赖氨酸残基，b)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基51位置的甲硫氨酸、天冬酰胺或亮氨酸残基，c)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基52位置的亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷胺酰胺或谷氨酸残基，d)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸54位置的色氨酸或苏氨酸残基，e)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸92位置的亮氨酸或谷氨酸残基，f)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基95位置的组氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，g)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基96位置的亮氨酸、丝氨酸、谷氨酸或色氨酸残基，h)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸109位置的色氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺，i)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基110位置的谷氨酸、色氨酸或天冬酰胺残基，j)SEQID NO：8中等同于或类似于氨基酸119位置的苯丙氨酸残基，k)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸120位置的色氨酸或甲硫氨酸残基，l)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸125位置的谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸或精氨酸残基，m)SEQID NO：中等同于或类似于氨基酸128位置的苯丙氨酸残基，n)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸132位置的甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或缬氨酸残基，o)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基219位置的丙氨酸、赖氨酸、色氨酸或酪氨酸残基，p)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸残基223位置的赖氨酸、精氨酸或酪氨酸残基，q)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸234位置的甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸或异亮氨酸残基，r)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸238位置的脯氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸残基，s)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸119位置的苯丙氨酸残基和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸96位置的苏氨酸残基，t)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸110位置的脯氨酸残基和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸128位置的苯丙氨酸残基，u)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸52位置的缬氨酸残基和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸110位置的脯氨酸残基，v)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸107位置的异亮氨酸残基，SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸127位置的谷氨酸残基，和SEQID NO：8中等同于或类似于氨基酸110位置的脯氨酸残基，或者w)SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸107位置的异亮氨酸残基，SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸127位置的谷氨酸残基，和SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸52位置的缬氨酸残基。在另一实施方式中，H型核受体陪配体结合域包含SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸107位置的异亮氨酸残基的取代，SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸127位置的谷氨酸残基的取代以及SEQ ID NO：8中等同于或类似于氨基酸259位置的甘氨酸残基的插入。
在某些实施方式中，基因表达系统采用第二LBD。第二LBD不是蜕皮激素受体多肽，但可以是第二核受体的配体结合域。这种第二结合域包括但不限于：脊椎动物类视黄醇X受体配体结合域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合域、超气门蛋白(ultraspiracle protein)配体结合域，以及包含两个多肽片段的嵌合配体结合域，其中第一多肽片段来自脊椎动物类视黄醇X受体配体结合域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合域或超气门蛋白配体结合域，第二多肽片段来自不同的脊椎动物类视黄醇X受体配体结合域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合域或超气门蛋白配体结合域。例如参见美国专利申请公开US2005/0266457中描述的结合域。这种LBD是本领域技术人员熟知的并且已在文献中详细记载。
D.激活域
可用于基因表达系统的激活或反式激活域(缩写为“AD”)可以是任何H类核受体成员AD、甾体/甲状腺激素核受体AD、合成或嵌合AD、聚谷胺酰胺AD、碱性或酸性氨基酸AD、VP 16 AD、GAL4 AD、NF-κB AD、BP64 AD、B42酸性激活域(B42AD)、p65反式激活域(p65AD)、糖皮质激素激活域或其类似物、组合或修饰形式。在具体实施方式中，AD是合成或嵌合AD，或者由EcR、糖皮质激素受体、VP16、GAL4、NF-κB或B42酸性激活域AD获得。优选地，AD是EcRAD、VP16AD、B42AD或p65AD。这种激活域的序列在诸如美国专利7,091,038或本文所述的其他文献中公开可得。示例性的VP16AD在本文实施例所述的质粒中描述。这些结构域是本领域技术人员熟知的并且已在文献中详细记载。
E.靶标盒的诱导型启动子
在某些实施方式中，靶标盒的诱导型启动子是多组件启动子序列。其包括与对应于激活盒中的DNA结合域的一个或多个拷贝的效应元件操作性结合的最小启动子。如本文所述，最小启动子包括核心启动子(即，介导转录启动的序列)和5′非翻译区(5′UTR)而没有增强子序列。因此，在基因表达系统的实施方式中，最小启动子可以是源自部分A所述激活盒中使用的任何启动子的最小启动子。在靶标盒的某些实施方式中，理想的最小启动子包括：花椰菜花叶病毒35S最小启动子；合成的E1b最小启动子(SEQ ID NO：10；参见美国专利7091038)和合成的TATA最小启动子(TATATA；参见美国专利申请公开US2005/0228016)。本领域技术人员可以容易地从文献中详述的各种启动子选择本文所述基因表达系统中使用的最小启动子。35S最小启动子的序列在以下实施例所述的质粒中描述。
靶标盒中诱导型启动子的其他部分包括：位于最小启动子5′或3′位置的效应元件(″RE″)。一个RE的两侧可具有两种不同或者相同的最小启动子以表达两种不同的蛋白质。在一个实施方式中，RE操作性连接于最小启动子。效应元件是一种或多种顺式作用的DNA元件，它能够赋予启动子以通过与激活盒的DNA-结合域相互作用介导的反应性。这种DNA元件可以是回文序列(完美或不完美)或者由可变数量的核苷酸分隔的序列基序或半位点(half sites)组成。半位点可以类似或者相同，并排列成正向或反转重复序列或者形成单个半位点或相邻半位点串联形成的多聚体。天然蜕皮激素受体的效应元件的DNA序列的例子在Cherbas L.等，1991 Genes Dev.5，120 131；D′Avino PP.等，1995 Mol.Cell.Endocrinol，113：19和Antoniewski C.等，1994 Mol.Cell Biol.14，4465-4474以及其他出版物中描述。RE可以是对应于激活盒中的DNA结合域的任何效应元件，或其类似物、组合或修饰形式。靶标盒中可采用单个RE或多个RE，多个RE可以是相同RE的多个拷贝或是两种或更多种不同的RE。RE可以被针对其他DNA结合蛋白域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，1988Nature，335：563564)或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent和Ptashne 1985，Cell，43：729736)的效应元件修饰或取代，或对根据特异性相互作用设计、修饰和选择的蛋白质的靶向相互作用特异的合成效应元件(例如参见Kim等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94：3616-3620)以适合嵌合受体。在一个具体实施方式中，RE是GAL4的RE(″GAL4RE″)，优选两个或更多个拷贝。以下实施例显示采用5个拷贝的GAL4RE(Le，5XGAL4)。然而，其他合适的RE包括但不限于：LexA、H类核受体RE、甾体/甲状腺激素核受体RE、或识别合成DNA结构域的合成RE。在其它实施方式中，RE是蜕皮激素效应元件(EcRE)、或包含多核苷酸序列的LexA RE(操纵子，″op″)。所有这些RE已在文献中详细记载，本领域技术人员可以容易地根据本说明书内容进行选择。
在靶标盒中，“诱导型启动子”操作性连接，控制调节乙烯敏感性的核酸序列或基因的表达，如下所述。靶标盒的诱导型启动子由化学诱导组合物或者诱导剂诱导，当所述化学诱导组合物或者诱导剂接触激活盒的配体结合域时激活最小启动子的效应元件。
F.编码选定蛋白的核酸序列
该系统中使用的核酸序列编码能够调节植物乙烯敏感性或乙烯产生的选定蛋白。在某些实施方式中，这种核酸序列包括：乙烯生物合成基因、ACC合酶(ACS)、ACC氧化酶(ACO)和ACC脱氨酶(ACD)。其他合适的乙烯受体基因是编码ETR1、ETR2、ERS1、ERS2和EIN4蛋白的野生型基因。其他乙烯信号传导途径基因编码蛋白，如RTE1、CTR1、EIN2、EIN3、EIN3-样(EIL1-5)、EIN5、EIN6和EEN可用于在本文所述方法以及植物、植物器官和组织中使用的基因表达系统。形成基因表达系统的实施方式的其他核酸序列包括：乙烯反应因子、ERF1、EDF1、EDF2、EDF3和EDF4、EIN3结合F-盒蛋白、EBF1和EBF2。其他乙烯调节靶点也可参见Czamy等，2006 Biotech.Advances，24：410-419；Chen等，2005 Annals Bot.95：901-915；和Ciardi和Klee，2001，Annals Bot，88：813-822。
除了使用野生型或天然来源的植物基因外，基因表达系统也可采用某些核酸序列，在这些基因序列和编码蛋白中包含有用的突变。这种突变体etr1-1受体序列的例子鉴定为SEQ ID NO：1中的核苷酸2557至4767。文献中描述了许多已知的突变乙烯受体蛋白以及产生这种突变的方法。参见例如，美国专利申请公开US2004/0128719中描述的突变受体，以及段落0033-0041中描述的突变；和美国专利公开US 2005/0066389中描述的ACC氧化酶序列；和美国专利申请公开US 2006/0200875中描述的ETR序列等等。
在本文所述本发明的一个实施方式中，本文所述的基因表达系统中以及方法中使用特定植物的野生型基因来控制或调节植物乙烯敏感性。在另一实施方式中，采用介导植物细胞乙烯敏感性或乙烯产生的野生型蛋白的突变体。在又一些实施方式中，将调节一种植物细胞的乙烯敏感性或乙烯产生的蛋白的编码基因突变体的野生型用于另一种植物细胞中，需要这样使用来消除潜在的RNA沉默。
除了使用编码能够用于调节乙烯敏感性的蛋白序列的核酸序列，本文使用的某些基因表达系统的另一组件还包括序列与本文所述编码序列互补的多核苷酸。例如，基因表达系统可以在植物细胞中表达许多上文鉴定的野生型序列的反义序列。这种反义序列的转录通过结合植物固有序列并使该序列失活而调节乙烯敏感性。
G.任选的组件
基因表达系统各个盒中的任选组件包括终止控制区。在本发明的某些实施方式中，激活盒或靶标盒中可使用这种终止子或聚腺苷酸化序列。该区域源自优选宿主天然具有的各种基因。在本发明的一个实施方式中，终止控制区包括或源自合成的聚腺苷酸化信号、胆脂碱合酶(nos)、花椰菜花叶病毒(CaMV)、真蛸碱合酶(ocs)、土壤杆菌、病毒和植物终止子序列等。
选择性标记物包括：能够基于其作用进行选择的抗生素或化学抗性基因，即抗生素耐药性、除草剂抗性、比色标记物、酶、荧光标记物等。本领域已知并使用的可选择的标记基因的例子包括：提供氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、放线酰胺素(PDF1基因)、双丙氨磷除草剂、草甘磷除草剂、磺酰胺、甘露糖等抗性的基因；和可用作表型标记物的基因，即花色素苷调节基因、异戊烯转移酶基因、GUS和荧光素酶。
根据本文所述的某些实施方式转化到植物细胞内的盒或包含盒的质粒中可以存在其他调控序列，例如在质粒中用作间隔序列的核苷酸序列，以及其他小调控序列、酶切位点等。
根据本文内容，本领域技术人员可以容易地从公知并且已在文献中详细记载的各种序列中选择合适的终止序列、选择性标记物和其他常规质粒调控序列。
H.用于基因表达系统的诱导组合物/诱导剂
当基因表达系统在植物中表达时，使用诱导组合物可以控制选定蛋白表达的调节以及植物细胞中乙烯敏感性的选择性调节。在一个实施方式中，诱导组合物是与植物细胞相接触的化学物质。在另一实施方式中，诱导组合物是被植物细胞吸收的化学物质。在又一实施方式中，诱导组合物是易位到植物细胞内的化学物质。诱导组合物也可以是对激活盒的EcR LBD高度特异的配体。诱导组合物或配体与激活盒的LBD的结合可诱导靶标盒的诱导型启动子以及编码选定蛋白的核酸序列的表达。因此，该系统可调节植物的乙烯敏感性。诱导组合物还表现为对植物细胞、组织或器官的毒性低。诱导组合物还能够从植物快速去除以“关闭”乙烯敏感性的调节，并有效控制这种调节，如下文更详细所述。
其中，有效的诱导组合物是优先结合蜕皮激素配体结合域的配体。在某些实施方式中，这些配体包括二乙酰肼化合物，包括市售虫酰肼(陶氏农用科技公司(Dow AgroSciences))、甲氧虫酰肼(陶氏农用科技公司)、氯虫酰肼(陶氏农用科技公司)和环虫酰肼(日本化药株式会社(Nippon Kayaku))(参见国际专利公开WO 96/027673和美国专利号5,530,028)。其他有用的诱导剂是非甾体配体，包括美国专利6,258603所述的二苯甲酰肼衍生物。其他有用的诱导剂是美国专利申请公开US 2005/0228016中详细描述的4-四氢喹啉衍生物。许多其他合适的化合物如1-芳酰基-4-(芳基氨基)-1，2，3，4-四氢喹啉(THQ)在Kumar等，J.Biol.Chem..2004，279(26)：2721 1-8；Hormann等，J.Comput Aided Mol.Res 200317(2-4)：135-53；Tice等，Bioorg Med Chem Lett 2003，13(11：1883-6；和Tice等，2003 Bioorg Med Chem Lett.2003 13(3)：475-8中列出。
因此，基因表达系统由化学诱导组合物诱导或“打开”，当诱导组合物接触激活盒的配体结合域时可激活最小启动子的效应元件，从而打开调节乙烯敏感性的核酸序列或基因的表达。该基因表达系统提供了对包含基因表达系统的植物细胞的乙烯敏感性的外部可控的调节。
II.转基因植物、植物细胞、组织或器官
如上所述，基因表达系统设计成能够整合到植物、植物细胞或植物的其他组织或器官内。任选地，这种整合可以是短暂的。然而，在本发明的某些实施方式中，希望稳定整合到植物染色体内。
在一个实施方式中，转基因植物细胞设计成能够表达上述基因表达系统，暂时且可逆地控制乙烯敏感性。在一个实施方式中，这种植物细胞是用基因表达系统的激活盒和靶标盒转染或转化的细胞。在一个实施方式中，激活盒和靶标盒位于相同质粒上，并将该质粒转染或转化入植物细胞。在另一实施方式中，激活盒和靶标盒位于不同质粒上，两质粒单独或一起转染或转化入相同的植物细胞。或者，两个单独的质粒各自转染或转化入相同植物的不同细胞中。在又一个实施方式中，两个质粒各自转染或转化入不同植物，具有单一质粒的各植物有性杂交形成含有两种质粒的杂交体，从而提供功能诱导性系统。
转染包括将外源或异源RNA或DNA引入细胞内，以实现表型改变。转化表示将核酸片段转移和整合到植物细胞的染色体DNA内，得到遗传稳定的遗传特性。因此，包含转化的核酸片段的植物细胞称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。因此，初始转化或转染的植物细胞的后代也具有短暂或稳定整合入其染色体的盒。
1.转化
植物细胞的转化包括产生仅包含激活盒、仅包含靶标盒或包含两种盒的甾体或质粒。例如，参见图2-3。合适的载体和植物组合是本领域技术人员容易明白的，可参见例如Maliga等，1994《植物分子生物学方法：实验室手册》(Methods in Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual)，纽约冷泉港(ColdSpring Harbor，NY)。
例如，合适的“载体”是用于将核酸克隆和/或转移到植物细胞内的任何部件。载体可以是连接另一DNA区段的复制子，以实现所连接区段的复制。“复制子”是用作DNA自主复制单位的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，即能够在其自身控制下进行复制。适合用基因表达系统转化植物细胞的载体包括将核酸引入细胞的病毒和非病毒载体。可使用本领域已知的大量载体来操纵核酸，将效应元件和启动子引入基因等。合适的载体包括例如：质粒和修饰的植物病毒，包括例如噬菌体如λ衍生物，或质粒如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。将合适的DNA片段连接到具有互补粘性末端的选定载体内或通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端内以便对合适的插入位点进行酶促修饰的常规方式是已知的。可用于转化植物细胞的任何病毒或非病毒载体都是有用的。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂(cytofectin))、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。除了基因表达系统的盒之外，载体还可包含一个或多个调控区，和/或用于选择、测量和监测核酸转移结果(转移到哪个组织、表达持续时间等)的选择性标记物。
术语“质粒”表示通常为环状双链DNA分子形式的额外染色体元件。这些元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，源自任何来源的线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，其中大量核苷酸序列已连接或重组入能够将启动子片段和选定基因产物的DNA序列与合适的3’未翻译序列引入细胞的独特结构。
载体或质粒可以通过本领域已知的方式引入所需的植物细胞，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE右旋糖苷、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、利用基因枪、或DNA载体转运子(参见例如，Wu等，1992，J.Biol.Chem.267：963967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.263：14621 14624；和Hartmut等，美国专利5354844)。或者，利用阳离子脂质有利于负电荷核酸的包封，也有利于与负电荷细胞膜的融合(Feigner和Ringold，1989Science337：387 388)。用于转移核酸的尤其有用的脂质化合物和组合物如美国专利6172048、6107286和5459127所述。也可利用其他分子促进核酸转染，例如阳离子寡肽或阳离子聚合物(例如，美国专利5856435)，或源自DNA结合蛋白的肽(例如，美国专利6200956)。也可将载体以裸DNA质粒的形式引入(参见美国专利5693622、5589466和5580859)。也可利用受体-介导的DNA递送方法来实现基因表达盒转化入植物细胞。植物转化例如可以利用Horsch等，1988《叶盘转化：植物分子生物学手册》(Leaf Disc Transformation：Plant MolecularBiology Manual)所述的土壤杆菌介导的叶盘转化法或本领域已知的其他方法来实现。
2.繁殖与筛选
因此，用上述基因表达系统(在单一质粒中，或者作为多个转化质粒，各自包含不同的盒)转化植物中的至少一个细胞之后，产生转基因植物、植物组织或植物器官的方法还包括在选定植物的典型条件下由转化的植物细胞或植物繁殖植物、或如上所述的植物杂交体。然后，筛选植物以选择包含或显示转化植物细胞表型性状的植物(细胞、组织、器官)。例如，随后进行所得植物或其细胞、组织和器官的筛选以确定所述植物是否包含所需的基因表达盒的整合核酸序列，这也是本领域技术人员已知的。例如，利用质粒中的一种或多种报道基因或标记物来选择将引入的DNA稳定整合到其染色体中的细胞。在下面的实施例中，采用了卡那霉素、放线酰胺素、双丙氨磷或荧光素酶。
成功整合表达系统的植物(组织或器官)在接触上述诱导组合物时，快速出现乙烯不敏感性。任何植物(包括植物细胞、组织或器官)易于进行这种转化，因而可通过常规方式培育重组植物。尤其适合用基因表达系统进行转化、因而易于调节其乙烯敏感性的植物包括：双子叶植物、单子叶植物、装饰性植物、开花植物以及用于人或动物消费的植物。非限制性地，这种植物包括：水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、栗米、牧草、燕麦、番茄、马铃薯、香蕉、猕猴桃、鳄梨、甜瓜、芒果、甘蔗、甜菜、烟草、木瓜、桃、草莓、悬钩子、黑莓、蓝莓、莴苣、卷心菜、花椰菜、洋葱、椰菜、抱子甘蓝、棉花、芸苔、葡萄、大豆、油菜、芦笋、豆类、胡萝卜、黄瓜、黄瓜、甜瓜、秋葵、防风草、花生、胡椒、菠萝、南瓜、甜马铃薯、黑麦、香瓜、豌豆、西葫芦、向日葵、菠菜、苹果、樱桃、酸果蔓、葡萄柚、柠檬、酸橙、油桃、橙、桃、梨、蜜柑与柚子杂交品(tangelos)、橘子、百合、康乃馨、菊、矮牵牛花、玫瑰、天竺葵、紫罗兰、剑兰、兰花、紫丁香、山楂、枫香树(sweetgum)、槭树、猩猩木、刺槐、岑树、菩提树和拟南芥。
植物组织和器官包括但不限于：营养组织，例如根、茎或叶，或生殖组织，例如果实、胚珠、胚、胚乳、珠被、种子、种皮、花粉、花瓣、萼片、雌蕊、花、花药或任何其他胚胎组织。
.III.控制乙烯敏感性的方法
可以对这种转基因植物、细胞、组织、花、种子或器官应用控制乙烯敏感性的方法，该方法包括使用有效量的诱导组合物。诱导组合物可以与转基因植物、植物细胞、植物组织或植物器官的细胞相接触、被其吸收和/或易位到这些细胞内。应用技术包括但不限于：用诱导剂浸渍、喷雾、洒粉、灌透、滴加或灌溉植物或者与植物相接触的土壤或介质。
在诱导组合物的存在下，可以根据选定蛋白的种类调节植物细胞对乙烯的反应。在下面的实施例中，选定蛋白是显性负相突变体etr1-1，应用诱导剂可提高etr1-1的表达并降低植物对乙烯的敏感性。这种敏感性的降低持续一段时间，该持续时间包括诱导剂施加于植物(细胞、组织或器官)以及停止主动施加后植物继续代谢剩余的诱导剂的时间。一段时间后，由于植物清除了诱导剂，植物细胞对乙烯的反应发生逆转，在这种情况下反应提高。
“控制”、“调节”或“调控”影响植物细胞乙烯敏感性或乙烯产生的蛋白表达可以多种方式实现。在一种实施方式的方法中，通过诱导组合物应用于植物的时机选择来控制蛋白表达的调节(包括该表达的量化大小)。在另一实施方式中，利用应用于植物的诱导组合物的浓度来控制蛋白表达(包括该表达量化大小)，因而控制乙烯敏感性。在另一个实施方式中，通过诱导组合物应用于植物的持续时间来控制蛋白表达的调节作用(包括该表达的量化大小)。植物生长期间可以改变施加诱导组合物的这三种参数中的任一种、两种或全部三种参数以获得所需结果。
作为一个通过时机选择进行控制的例子，可以在植物生长周期的选定时间施加诱导组合物以诱导乙烯敏感性，例如在植物发芽、果实熟化或开花中的一个阶段之前或之后或者根据环境条件(例如在植物接触应激因子如病原体或干旱之前或之后)施加。在另一实施方式中，在植物生长周期过程中多次应用诱导组合物。在其它实施方式中，在选定时间停止应用诱导组合物以控制乙烯敏感性。理想的施加时间可根据需处理植物的类型、诱导组合物的效能、及其对植物可能产生的植物毒性作用进行选择和改变。
作为通过诱导组合物的浓度进行控制的一个例子，将浓度0.01-20μM的诱导组合物应用于植物。在另一实施方式中，浓度为10μM。在另一实施方式中，浓度为至少0.01、0.10、0.20、0.30、0.40、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和至少20.0μM，包括各浓度之间的小数浓度。在又一实施方式中，浓度为20μM。在其它实施方式中，采用浓度大于20μM的诱导组合物。在另一实施方式中，采用大于30μM的浓度。在另一实施方式中，采用大于40μM的浓度。在又一实施方式中，本文所述方法中采用大于50μM的浓度。例如，如实施例9所述，该实施例显示了诱导剂的浓度如何调节植物所具有的乙烯敏感性的程度。类似于通过施加时机进行的控制，诱导组合物的浓度可用于响应植物在不同生长阶段变化的需求或者响应变化的环境条件。
第三种控制介导植物乙烯敏感性或乙烯产生的蛋白质的调节方法包括改变施加诱导组合物的持续时间。例如，将诱导组合物应用于植物的持续时间为至少10分钟、至少30分钟的施加时间，从至少1到约24小时，或者更长时间，取决于所需的作用、诱导剂的效能以及不良植物毒性作用的可能性。如果需要，诱导组合物的施加时间可以达到几天。施加持续时间通常由有经验的培育员进行选择。
通常，从停止施加诱导剂到植物对诱导剂的反应逆转之间的时间约为2天或更长，取决于植物大小、施加方法和诱导剂的用量。
或者，当靶标盒诱导型启动子控制下的核酸序列是野生型基因的互补序列或其反义序列时，施加合适的诱导剂可提高植物对乙烯的敏感性。例如，增加乙烯受体(ETR1、ETR2、ERS1、ERS2或EIN4)的表达可导致产生更多乙烯受体而乙烯敏感性降低。与CTR1的N-末端激酶结构域融合的截短ETR1的过度表达导致野生型拟南芥产生轻微的乙醚不敏感性。增加植物中EBF1、EBF2的表达，和/或降低EIN3的表达可使植物对乙烯的敏感性降低。降低ACO、ACS、EIN2、EDF或EEN和EIN6的表达可导致乙烯产生减少和/或乙烯反应降低。增加ACD的表达可导致乙烯减少且乙烯反应降低。一段时间后由于植物中诱导剂的消除，植物细胞对乙烯的反应被逆转、在这种情况下增加。这就使得植物能够在去除诱导剂后继续正常发育、成熟、熟化。
将诱导剂应用于用本文所述的基因表达系统稳定转化的植物能够控制对乙烯敏感的一种或多种植物生长特性，例如枯萎、果实熟化、发芽、病原体抗性、叶片脱落、花蕾脱落、芽脱落、荚壳脱落、果实脱落和开花，以及植物对应激，例如干旱、热、群体密度和盐度等条件导致的应激的反应。
更具体说，本文所述方法也可用作提高植物对疾病的抗性和/或耐受性的方法，该方法包括提高植物对乙烯的不敏感性。或者，该方法可通过提高植物对乙烯的不敏感性延迟植物、组织或器官的熟化或开花，例如用于储存或运输的目的。在另一个实施方式中，采用本文所述转化植物与在适当时机施加诱导组合物的方法能够处理处于不良生长条件，例如干旱或过热条件的植物，该方法包括施加诱导组合物以降低乙烯敏感性并使植物更易于忍受环境条件。基于本说明书的内容，植物繁殖与生长领域的技术人员可能容易地选择转化植物和诱导上述核酸序列表达的方法能够提供效益的情况。
因此，利用本文所述方法，在植物生长期间可以改变施加诱导剂的时机、持续时间或浓度以控制乙烯敏感性，因而以相当准确地控制植物的生长特性。.
IV.实施例
下面的实施例表明使用上述基因表达系统，该系统包括激活盒，激活盒包括：在与其操作性结合的组成型G10-90启动子控制下的(a)GAL 4 DBD，该DBD识别由5个拷贝的GAL4效应元件组成的效应元件；(b)突变体蜕皮激素受体LBD，其包括结构域D、E和F，在全长Cf EcR的氨基酸335处具有苏氨酸到缬氨酸突变；和(c)VP16 AD，该AD在诱导组合物的存在下被激活。靶标盒包括诱导型启动子，诱导型启动子包括操作性结合的位于对VP16 AD激活起反应的最小35S启动子上游的5个拷贝的GAL 4效应元件，该诱导型启动子控制(e)编码突变体ETR1蛋白的核酸序列的表达。根据该实施方式，在植物细胞中，激活盒和靶标盒各组件可调节突变体ETR1蛋白的表达并选择性地降低植物细胞的乙烯敏感性。这种蛋白表达受到诱导组合物相互作用的控制，诱导组合物调节选定蛋白的表达并选择性地调节植物细胞的乙烯敏感性。蛋白表达的调节可以通过施加诱导组合物的时机、浓度和持续时间进行控制。
更具体说，示例性的基因表达系统包含位于单一质粒p185上的激活盒和靶标盒。该质粒示意性地如图2所示。另一种示例性的质粒如图3所示。图2-3所示质粒各自的基因表达盒组件的核酸序列进一步如SEQ ID NO：1-2所示。实施例中讨论的其他质粒的基因表达盒组件的核苷酸序列在SEQ ID NO：3中示出。
下面的实施例阐述了上述组合物和方法的某些实施方式。这些实施例并不限制权利要求书和说明书的范围。
实施例1：质粒
基因盒组件包括激活盒，激活盒包括：G10-90组成性启动子(SEQ ID NO：1的核苷酸1-243)，VP16激活域(SEQ ID NO：1的核苷酸249-529)，GAL4DNA结合域(SEQ ID NO：1的核苷酸534-983)，与NOS终止子序列(SEQ ID NO：1的核苷酸2070-2364)结合的T52V突变型蜕皮激素受体配体结合域(SEQ ID NO：1的核苷酸990-1997)，对其进行单独克隆。类似地，单独克隆靶标盒组件，靶标盒包括：由5个拷贝的GAL4效应元件(SEQ ID NO：1的核苷酸2391-2492)和最小35S启动子(SEQ ID NO：1的核苷酸2499-2554)构成的诱导型启动子、以及突变型etr1-1基因(SEQ ID NO：1的核苷酸2557-4764)和35S终止子序列(SEQ ID NO：1的核苷酸4791-5001)。SEQ ID NO：1如图4所示。
这些组件在SK-质粒(司查塔基公司(Stratagene))中单独组装形成表达盒，然后合并到各种质粒中：
盒(1)：G10-90启动子→VP16：GAL4：EcRDEF T52V-NOS终止子
盒(2)：G10-90启动子→GAL4：VP16：EcRDEF T52V-NOS终止子
盒(3)：G10-90启动子→etr1-1-35S终止子
盒(4)：G10-90启动子→PDF1-E9终止子
盒(5)：G10-90启动子→萤光素酶-35S终止子
盒(6)：5xG-M35S诱导型启动子→etr1-1-35S终止子
盒(7)：5xG-M35S诱导型启动子→萤光素酶-35S终止子
在组装激活盒的过程中，以下组件以两种不同顺序融合形成两种不同的激活盒：
VP16AD到GAL4LBD到T52V DBD的EcR(DEF)(缩写为“VGE”)和
GAL4LBD到VP16AD到T52V DBD的EcR(DEF)(缩写为GVE)
也提供诱导型萤光素酶控制子作为阳性对照。
随后，用pBlueScript II SK-主链(司查塔基公司(Stratagene))制备质粒DNA。SK-多克隆位点区域被包含8bp切割酶的识别位点的新多克隆位点取代。这种酶切位点中的一些在示例性质粒的图2-3中示出。
制备了六个示例性的大肠杆菌质粒并测序以验证核苷酸序列。这些质粒包含独特的酶切位点，用于添加/删除/交换各个组件，如图2-3所示。因此，每个完整的构建物可转移至包括植物转化二元载体在内的所选择的任何其他载体中。
然后，将SK-质粒中的构建物转移至二元质粒pBIN19(美国典型培养物保藏中心编号37327)。由于pBIN19已经具有新霉素植物选择性标记基因、LB、RB和nptII选择性标记物，所以附图和/或序列表未示出主链序列，而是仅仅显示了感兴趣的基因表达序列，即基因表达系统的主要组件，例如克隆到左右边界之间的Ec受体和诱导型etr1-1或萤光素酶。
选择以下五种土壤杆菌(Agrobacterium)二元质粒用于制备实施例2的转基因植株和进行实施例3的原生质体实验：
p184[G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-LUC]用于获得包含G10-90启动子驱动的VGE受体和诱导型萤光素酶的转基因植株。p184的表达盒组件如SEQ ID NO：3所示，即G10-90组成型启动子(SEQ ID NO：3的核苷酸1-243)、VP16激活域(SEQ ID NO：3的核苷酸249-529)、GAL4DNA结合域(SEQ ID NO：3的核苷酸534-983)、和与NOS终止子序列(SEQ ID NO：3的核苷酸2070-2364)结合的T52V突变型蜕皮激素受体配体结合域(SEQ ID NO：1的核苷酸990-1997)，由5个拷贝的GAL4效应元件(SEQ ID NO：3的核苷酸2391-2492)和最小35S启动子(SEQ ID NO：3的核苷酸2499-2554)组成的诱导型启动子、萤光素酶标记基因(SEQ ID NO：3的核苷酸2557-4209)和35S终止子序列(SEQID NO：3的核苷酸4217-4427)。
p185[G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-etr1]是包含与靶标盒融合的激活盒的示例性质粒，用于制备包含G10-90启动子驱动的VGE受体和诱导型etr1-1的转基因植株。例如参见图2和SEQ ID NO：1，以及上述组件。
p186[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-LUC]质粒用于获得包含G10-90启动子驱动的GVE受体和诱导型萤光素酶的转基因植株。p186的表达盒组件如SEQ ID NO：4所示，即G10-90组成型启动子(SEQ ID NO：4的核苷酸1-243)、GAL4DNA结合域(SEQ ID NO：4的核苷酸276-716)、VP16激活域(SEQ ID NO：4的核苷酸717-793)、和与NOS终止子序列(SEQ ID NO：4的核苷酸2064-2258)结合的T52V突变型蜕皮激素受体配体结合域(SEQ ID NO：4的核苷酸994-1991)，由5个拷贝的GAL4效应元件(SEQ ID NO：4的核苷酸2385-2486)和最小35S启动子(SEQ ID NO：4的核苷酸2493-2548)组成的诱导型启动子，萤光素酶标记基因(SEQ ID NO：4的核苷酸2551-4203)和35S终止子序列(SEQID NO：4的核苷酸4211-4421)。
p187[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-etr1]质粒用于获得包含G10-90启动子驱动的GVE受体和诱导型etr1-1的转基因植株。参见图3和SEQ ID NO：2。p187的表达盒组件是：G10-90组成型启动子(SEQ ID NO：2的核苷酸1-243)、GAL4DNA结合域(SEQ ID NO：2的核苷酸276-716)、VP16激活域(SEQ ID NO：2的核苷酸717-793)、和与NOS终止子序列(SEQ ID NO：2的核苷酸2064-2258)结合的T52V突变型蜕皮激素受体配体结合域(SEQ ID NO：2)的核苷酸994-1991)，由5个拷贝的GAL4效应元件(SEQ ID NO：2的核苷酸2385-2486)和最小35S启动子(SEQ ID NO：2的核苷酸2493-2548)组成的诱导型启动子，etr1基因(SEQ ID NO：2的核苷酸2551-4761)和35S终止子序列(SEQ ID NO：2的核苷酸4785-4995)。
p1002[G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-etr1和MMVp-def-rbcS-E9t]及其组件如SEQ ID NO：5所示，即G10-90组成型启动子(SEQ ID NO：5的核苷酸1-243)、VP16激活域(SEQ ID NO：5的核苷酸249-529)，GAL4DNA结合域(SEQ ID NO：5的核苷酸534-983)，和与NOS终止子序列(SEQ ID NO：5的核苷酸2070-2364)结合的T52V突变型蜕皮激素受体配体结合域(SEQ ID NO：5的核苷酸990-1997)，由5个拷贝的GAL4效应元件(SEQ ID NO：5的核苷酸2391-2492)和最小35S启动子(SEQ ID NO：5的核苷酸2499-2554)组成的诱导型启动子，etr1基因(SEQ ID NO：5的核苷酸2557-4764)，35S终止子序列(SEQ IDNO：5的核苷酸4791-5001)，MMV启动子(SEQ ID NO：5的核苷酸7228-6592)，P-DEF标记基因(SEQ ID NO：5的核苷酸6533-5712)和rbcS-E9终止子(SEQ IDNO：5的核苷酸5682-5038)。
p1003[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-etr1和MMVp-def-rbcS-E9t]及其组件如SEQ ID NO：6所示，即G10-90组成型启动子(SEQ ID NO：6的核苷酸1-243)，GAL4DNA结合域(SEQ ID NO：6的核苷酸276-716)，VP16激活域(SEQ ID NO：6的核苷酸717-973)，和与NOS终止子序列(SEQ ID NO：6的核苷酸2064-2258)结合的T52V突变型蜕皮激素受体配体结合域(SEQ ID NO：6的核苷酸984-1991)，由5个拷贝的GAL4效应元件(SEQ ID NO：6的核苷酸2385-2486)和最小35S启动子(SEQ ID NO：6的核苷酸2493-2548)组成的诱导型启动子，etr1基因(SEQ ID NO：6的核苷酸2551-4761)，35S终止子序列(SEQ IDNO：6的核苷酸4785-4995)，MMV启动子(SEQ ID NO：6的核苷酸7222-6586)，P-DEF标记基因(SEQ ID NO：6的核苷酸6527-5706)和rbcS-E9终止子(SEQ IDNO：6的核苷酸5676-5032)。
实施例2：制备转基因烟草植株
用实施例1的质粒转化烟草植株，通过Fisher和Guiltinan 1995的《植物分子生物学报道》(Plant Molecular Biology Reporter)13：278-289所述的标准土壤杆菌介导的叶盘转化法进行制备。植株在包含卡那霉素的生根培养基上进行繁殖，然后通过PCR验证基因表达系统的引入和遗传，如下所述。
收集维持在品红盒子中的每株植物的一个叶片放入液氮快速冷冻并在-80℃冻存。然后将叶片(50-100mg)转移至KONTES管并采用钻孔机用KONTES一次性研磨棒研磨约1分钟，加入裂解缓冲液后再研磨几秒钟。用DNEASY小抽试剂盒(凯杰公司(Qiagen))方案纯化DNA。DNA最终洗脱在100μl中。
设计特定的PCR引物以扩增529bp的VGE、495bp的GVE、463bp的标记物基因萤光素酶LUC或441bp的突变etr-1基因。采用3微升植物DNA、10皮摩尔的各种引物和25微升AMPLITAQ GOLD PCR(ABI)，在50微升反应液中循环35次扩增转基因。在1％琼脂糖凝胶上分离25微升PCR反应液，通过两种不同转基因的扩增鉴定阳性植株。
需极其小心以避免由于污染和非特异扩增引起的假阳性。合成了不结合烟草基因组的高严谨引物。研磨和DNA制备期间对叶材料应极其小心以尽可能减少污染。与各批DNA制备一起制备非转基因对照植株DNA。每次PCR扩增包括无DNA PCR对照。其他注意事项包括耐气溶胶吸管端和一次性操作台表面擦布，并且频繁更换手套。采用热启动PCR以尽可能减少引物的非特异结合。用预计不会产生带的引物进行PCR，在一些DNA中也检查交叉污染。
PCR结果如下：
对于p184(VP16AD到GAL4LBD到T52V DBD的EcR(DEF)加上诱导型萤光素酶；缩写为“VGE”)：筛选10个植株，其中8个植株VGE和LUC阳性(p184-2、3、4、5、7、8、9和10)。两个植株VGE或LUC阴性(p184-1和6)。
对于包含激活盒和靶标盒用于表达突变型etr1-1基因的示例性质粒p185，筛选16个植株，其中13个植株VGE和etr-1阳性(质粒分别是p185-1、2、3、4、5、8、10、11、12、13、14、15和16)。两个植株VGE或etr-1阴性(p185-6、7和9)。
对于p186(GAL4LBD到VP16AD到T52V的EcR(DEF)；缩写为“GVE”+诱导型LUC)，筛选25个植株，其中23个植株GVE和LUC阳性(p186-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25)，2个植株GVE或LUC阴性(p186-1和14)。
对于p187(GVE+诱导型etr-1)：筛选34个植株，其中33个植株GVE和etr-1阳性(p187-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34)，1个植株GVE和etr-1阴性(p187-14)。
实施例3：调节乙烯敏感性对烟草植株生长的影响
进行根据Guzman和Ecker 1990The Plant Cell，2：513-523改良的三重反应分析以确定实施例2转化的烟草植株中调节乙烯敏感性的作用。从标为185-1、184-3、185-8、185-11、187-7、187-13、187-17和187-21的各种转化植株获取两个叶片并切成小块。将这些小块接种在包含100纳克/升卡那霉素的MSS板上，其中包含或不含10μM诱导剂，即3，5二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N’-(3S-羟甲基-5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-羰基)肼。使用没有抗生素或诱导剂的MSS板作为对照。
这些种板植物组织在25℃中培育，生长室中有光以诱导发芽。将芽转移至新鲜板培育约2周，在25℃继续生长。然后将各个愈伤块转移至含有或不含诱导剂的新的培养皿中。将各个开始发芽的愈伤块分到几个板中，每块板含有大约相等的愈伤块。
然后，将板分组，进行持续18天的以下处理过程。
(a)诱导、避光、无乙烯(空气对照)
(b)无诱导剂、避光、无乙烯(空气对照)
(c)诱导、避光、浓度约10ppm的乙烯
(d)无诱导剂、避光、乙烯(浓度约10ppm)
测定芽长度，表1显示了基于上述处理过程(a)到(d)得到的芽长度的原始数据对根据实施例制备的转基因植株的功效进行相对评价的结果。通常，避光暴露于乙烯的野生型芽显示生长变矮。在这些条件下，乙烯不敏感性植株应显示生长变长。基于在相同环境下相对于未诱导转基因植株芽长度增加，在用于表达突变型etr1-1的诱导剂的存在下，包含用于表达etr1-1的激活盒和靶标盒的转基因植株显示乙烯不敏感性。具光生长条件下的芽产生的数据无法解释。
表1：诱导烟草的乙烯不敏感性
该实施例的结果表明，用基因表达系统对其有反应的选定诱导组合物处理时，基因表达系统和用该系统转化的植株能够成功调节乙烯敏感性。
实施例4：转基因拟南芥属植株的制备
采用标准花浸渍方法，用实施例1的土壤杆菌质粒转化拟南芥属植株。收获种子并接种到含卡那霉素的培养基上。选择转化植株能够在卡那霉素上生长的能力并通过PCR筛选以验证etr1-1基因的存在。对携带萤光素酶构建物的转化体采用萤光素酶试验。阳性转化体自交产生T1种子。种子在含卡那霉素的培养基上生长以鉴定转基因纯合品系。采用纯合植株进行诱导乙烯不敏感性的试验。
实施例5：调节乙烯敏感性对拟南芥属植株生长的影响
进行三重反应分析(根据上文引用的Guzman和Ecker，1990进行如下所述的改良)以确定实施例4转化的拟南芥属植株中乙烯敏感性的调节。对拟南芥种子表面除菌并浸泡在20μM诱导剂中，4℃保持避光4天。将种子接种到含1％蔗糖和20μM诱导剂的0.5X MS上，突变型受体用10ppm乙烯处理，或者野生型受体用1ppm乙烯处理，21℃避光培育4-8天。在最后一天记录对乙烯的反应。基于在相同环境下相对于未诱导转基因植株芽长度增加和/或根生长改变，在用于表达突变型etr1-1的诱导剂的存在下，包含用于表达etr1-1的激活盒和靶标盒的转基因植株显示乙烯不敏感性。该实施例的结果进一步表明，用基因表达系统对其有反应的选定诱导组合物处理时，基因表达系统和用该系统转化的植株能够成功调节乙烯敏感性。
采用三重反应试验测定野生型、ein2-5(乙烯不敏感突变体对照)和p1002拟南芥属转化体幼苗的乙烯不敏感性(Guzman和Ecker，1990，同上，改良如下)，其中种子在0.5x MS培养基上、10ppm乙烯的存在下避光培育11天使其发芽。乙烯敏感型幼苗的根和下胚轴生长受到乙烯抑制，但乙烯不敏感性幼苗不受抑制。
表II：拟南芥属中乙烯不敏感性的诱导
Figure GPA00001061499900341
  下胚轴(mm)
  野生型   11.8   1.37   -   12   1.08   - -  -  -
  Ein2-5   约30   -   -   约30   -   -  -  -  -
  p1002-1-4   12.4   1.61   p＝0.217   12.3   1.01   p＝0.270  -  -  -
  p1002-3-4   12.5   1.63   p＝0.139   12.7   2.18   p＝0.199  -  -  -
  p1002-11-3   11.9   1.27   p＝0.915   12.1   0.85   p＝0.656  -  -  -
  p1002-24-4   10.6   1.5   p＜0.01   12.2   1.12   p＝0.639  -  -  -
  p1002-23-2   12.4   1.69   p＝0.174   12.1   0.73   p＝0.772  -  -  -
所有样品在0.5x MS+1％蔗糖上用10ppm乙烯室温避光处理11天
如上所示，在没有诱导剂的存在下，p1002转化体幼苗的根和下胚轴生长与野生型幼苗相比并无显著差别。然而，在诱导剂的存在下，相对于野生型幼苗p1002转化体显示根显著更长，虽然没有像ein2突变体那样长。下胚轴中没有观察到这种结果。在也可导致乙烯不敏感性的银和诱导剂的存在下，如预期的那样，大多数p1002拟南芥属转化体幼苗的根并不显著长于野生型或ein2突变体幼苗。因此，基于在相同环境下相对于未诱导转基因植株根长度增加，在用于表达突变型etr1-1的诱导剂的存在下，包含用于表达etr1-1的激活盒和靶标盒的转基因植株显示乙烯不敏感性。
实施例6：转基因番茄植株的制备
采用标准方法，用实施例1的土壤杆菌质粒转化番茄子叶片。用卡那霉素或放线酰胺素选择推定的转化体并用PCR试验进行验证。阳性转化体自交两次，获得转基因纯合品系。使用纯合植物进行测定，以类似于实施例5的方式诱导乙烯敏感性。
采用三重反应试验(Guzman和Ecker，1990，同上，如下所述进行改良)来确定转化的番茄植株中乙烯敏感性的调节。对番茄种子进行表面除菌并浸泡在20μM诱导剂中，4℃保持避光4天。将种子接种到含1％蔗糖和20μM诱导剂的0.5X MS上，突变型受体用10ppm乙烯处理，或者野生型受体用1ppm乙烯处理，21℃避光培育4-8天。在最后一天记录对乙烯的反应。基于在相同环境下相对于未诱导转基因植株芽长度增加和/或根生长改变，在用于表达突变型etr1-1的诱导剂的存在下，包含用于表达etr1-1的激活盒和靶标盒的转基因植株显示乙烯不敏感性。该实施例的结果进一步表明，用基因表达系统对其有反应的选定诱导组合物处理时，基因表达系统和用该系统转化的植株能够成功调节乙烯敏感性。
来自三种纯合的独立p1002和p1003品系的种子在含20μM ACC(乙烯前体)的0.5x MS培养基+1％蔗糖上避光发芽。在ACC上发芽抑制番茄幼苗生长。来自相同品系的种子在20μM ACC加上20μM诱导剂的存在下发芽。结果列于表III。
表III：番茄中乙烯不敏感性的诱导
Figure GPA00001061499900361
取20μM ACC存在下培养的14日龄幼苗进行测量。
在诱导剂的存在下在ACC上生长导致乙烯不敏感性，因为诱导的幼苗显示变长的下胚轴而没有尖钩(apical hook)。在没有诱导剂的情况下，含p1002的品系无乙烯不敏感性，p1003构建物仅产生很少乙烯不敏感性。该结果进一步表明，完全状态的乙烯不敏感性是需要诱导的。
实施例7：转基因玉米植株的制备及乙烯敏感性的调节对玉米植株生长的影响
采用实施例1的质粒通过微粒轰击转化玉米植株。用卡那霉素或双丙氨磷选择推定的转化体并用PCR试验进行验证。阳性转化体与近交B73回交以增加活力。测定如上所述制备的转基因玉米植株中乙烯敏感性的调节。通过使植株暴露于乙烯并测定乙烯诱导型基因的诱导变化，在分子水平测定乙烯敏感性的调节。基于乙烯诱导型基因表达的减少，在用于表达突变型etr1-1的诱导化合物的存在下，包含用于表达etr1-1的激活盒和靶标盒的转基因植株显示乙烯不敏感性。
测定如上所述制备的转基因玉米植株中乙烯敏感性的调节。通过使植株暴露于ACC(乙烯前体)并测定乙烯诱导型基因的诱导变化，在分子水平测定乙烯敏感性的调节。从在温室中培育的转基因T0玉米植株切割茎鞘组织用于体外生物试验。切割的组织用水或20μM诱导剂处理2天以诱导乙烯不敏感etr1-1转基因的表达。2天诱导后，组织用0、1或10μM ACC处理以1天产生乙烯，然后收获。收获的组织立即置于RNAlater中(安碧公司(Ambion))。使用MagMAX-96总RNA分离试剂盒(安碧公司(Ambion))，由组织制备总RNA。在应用生物系统(Applied Biosystems)7900HT快速实时PCR系统(ABI)上，通过定量PCR测定乙烯诱导型基因(ACC氧化酶)的诱导。采用生产商推荐的方案，用TaqMan分析试剂盒(ABT)进行逆转录酶(RT)和PCR。使用玉米18s作为内标以标准化各样品的表达。
引物和探针序列如下：
18s
正向引物CGTCCCTGC CCTTTGTACAC    SEQ ID NO：11
反向引物ACACTTC ACCGGACCATTCAA   SEQ ID NO：12
探针CCGCCCGTCGCTCCTACCG          SEQ ID NO：13
ACC氧化酶(aco)：
正向引物GTTGTAGAAGGACGCGATGGA    SEQ ID NO：14
反向引物CAGGT ACAAGAGCGTCATGCA   SEQ ID NO：15
探针TCCTGTTCCCGCTGGGCTGC         SEQ ID NO：16
为了测定基因表达，标准化各个玉米品系中0μM诱导剂加上0μM ACC对照处理的ACC氧化酶的表达。各玉米品系的相对表达以及每种处理的平均表达如表IV所示。
表IV：诱导的玉米中ACC氧化酶的表达
玉米品系  0诱导剂/0 ACC   0诱导剂/1μM ACC   0诱导剂/10μM ACC   20μM诱导剂/0 ACC  20μM诱导剂/1μM ACC   20μM诱导剂/10μM ACC
 B73  1   0.189902   0.600869   1.963743  0.095059   0.25899
 4.5  1   0.486376   0.542974   1.350714  1.081217   0.418362
 4.6  1   1.071547   1.098976   1.148245  0.758144   0.33477
 4.7  1   2.465694   1.526099   0.74521  1.388455   0.255725
 10.2  1   1.864168   0.846999   1.378451  0.492793   0.676117
 10.4  1   0.665926   1.198439   0.343681  0.359115   1.82099
 10.5  1   1.316937   1.366966   0.680428  0.068126   0.198294
 平均ACO表达  1   1.151507   1.025903   1.08721  0.606129   0.566164
 SEM  0   0.304275   0.142362   0.205243  0.188466   0.218046
如预期的那样，在诱导剂加上ACC(乙烯前体)的存在下，转基因玉米品系中ACC氧化酶的平均表达受到抑制。基于乙烯诱导型基因表达的减少，在用于表达突变型etr1-1的诱导化合物的存在下，包含用于表达etr1-1的激活盒和靶标盒的转基因植株显示乙烯不敏感性。
实施例8：ACC浓度对乙烯不敏感性的影响
来自一种p1002品系和一种p1003品系的纯合番茄种子在包含20μM诱导剂和各种水平的乙烯前体ACC(即1.0-μM)的培养基上发芽。如表V所示，在测定的ACC浓度下能够诱导乙烯不敏感性。较高的ACC浓度实现的不敏感性水平有一些降低，表现为下胚轴和根延长较少，然而，相对于野生型对照数值仍然显著提高。
表V：以一系列ACC浓度诱导乙烯不敏感性
Figure GPA00001061499900381
取在诱导剂的存在培养的14日龄幼苗进行测量。
实施例9：植物中乙烯不敏感性的程度与诱导剂浓度的关系
来自一种含p1002品系和一种含p1003品系的纯合番茄种子在包含20μMACC和各种水平的诱导剂(即0.5-20μM)的培养基上发芽。如表VI所示，诱导剂的浓度与每种品系获得的乙烯不敏感性水平正相关。这些数据表明，植物中不同水平的乙烯不敏感性可以简单地通过调节诱导水平而实现。
表VI：施加的诱导剂水平调节乙烯不敏感性水平
Figure GPA00001061499900382
对10日龄幼苗进行测量。
实施例10：植物中乙烯不敏感性的短暂诱导
为了验证当不再提供诱导剂的情况下诱导的乙烯不敏感性植物恢复到乙烯敏感，来自一种p1002品系的纯合番茄种子在包含20μM ACC和10μM诱导剂的培养基上发芽2、4、6、8或14天。避光培育14天后，测定下胚轴和根以评价乙烯不敏感性。预计乙烯不敏感幼苗将具有较长的下胚轴和根。没有诱导剂的存在下，幼苗将变得乙烯敏感并在避光条件下生长变矮。因此，逆转幼苗(reversed seedling)的根和下胚轴生长是敏感和不敏感幼苗间的中间状态。如表VII所示，幼苗诱导2或4天后分别去除诱导剂培育10或6天，结果表明与未诱导对照幼苗相比，其恢复到乙烯敏感状态。在包含p1002的番茄品系中，6天足以诱导完全状态的乙烯不敏感性。
表VII：去除诱导剂导致恢复乙烯敏感性
Figure GPA00001061499900391
取在20μM ACC上避光培养的14日龄幼苗进行测量。
虽然上述实施例显示使用了etr1-1的核苷酸序列，但本说明书清楚地向本领域技术人员提供了以相同方式调节乙烯生物合成途径和其他植物途径中许多其他基因表达的能力。
上述实施方式的各种改良和变化包括在本说明书中，并且是本领域技术人员显而易见的。据信这种对本文所述组合物和方法的改良和改变包括在本文所附权利要求书的范围内。
上文列出或引用的所有文献，包括专利、专利申请和出版物以及非专利出版物以及附图和/或序列表的全部内容都包括在此作为参考，只要它们与本说明书的明确涵义不发生矛盾。然而，任何参考文献的引用不应解释为承认这些参考文献构成本申请的“现有技术”。
序列表
<110>J.L.罗西尚(Rosichan，Jeffrey L.)
D.R.加里(Gallie，Daniel R.)
<120>改变植物生理学反应的组合物和方法
<130>A01937
<150>US 60/973,057
<151>2007-09-17
<160>16
<170>PatentIn 3.4版
<210>1
<211>5001
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>p185盒
<400>1
atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgatccaa gctcaagcta agcttgcatg     60
cctgcaggat atcgtggatc caagcttgcc acgtgccgcc acgtgccgcc acgtgccgcc    120
acgtgcctct agaggatcca tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc    180
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctggga    240
tccccaccat ggcccccccg accgatgtca gcctggggga cgaactccac ttagacggcg    300
aggacgtggc gatggcgcat gccgacgcgc tagacgattt cgatctggac atgttggggg    360
acggggattc cccaggtccg ggatttaccc cccacgactc cgccccctac ggcgctctgg    420
atatggccga cttcgagttt gagcagatgt ttaccgatgc ccttggaatt gacgagtacg    480
gtgggaagct tctaggtacc tccagaagaa tatcaggcgg ggaattcggc gggatgaagc    540
tactgtcttc tatcgaacaa gcatgcgata tttgccgact taaaaagctc aagtgctcca    600
aagaaaaacc gaagtgcgcc aagtgtctga agaacaactg ggagtgtcgc tactctccca    660
aaaccaaaag gtctccgctg actagggcac atctgacaga agtggaatca aggctagaaa    720
gactggaaca gctatttcta ctgatttttc ctcgagaaga ccttgacatg attttgaaaa    780
tggattcttt acaggatata aaagcattgt taacaggatt atttgtacaa gataatgtga    840
ataaagatgc cgtcacagat agattggctt cagtggagac tgatatgcct ctaacattga    900
gacagcatag aataagtgcg acatcatcat cggaagagag tagtaacaaa ggtcaaagac    960
agttgactgt atcgggaggc ggtgggatcc ggcctgagtg cgtagtaccc gagactcagt   1020
gcgccatgaa gcggaaagag aagaaagcac agaaggagaa ggacaaactg cctgtcagca   1080
cgacgacggt ggacgaccac atgccgccca ttatgcagtg tgaacctcca cctcctgaag   1140
cagcaaggat tcacgaagtg gtcccaaggt ttctctccga caagctgttg gtgacaaacc   1200
ggcagaaaaa catcccccag ttgacagcca accagcagtt ccttatcgcc aggctcatct   1260
ggtaccagga cgggtacgag cagccttctg atgaagattt gaagaggatt acgcagacgt   1320
ggcagcaagc ggacgatgaa aacgaagagt cggacactcc cttccgccag atcgtggaga   1380
tgactatcct cacggtccaa cttatcgtgg agttcgcgaa gggattgcca gggttcgcca   1440
agatctcgca gcctgatcaa attacgctgc ttaaggcttg ctcaagtgag gtaatgatgc   1500
tccgagtcgc gcgacgatac gatgcggcct ccgacagtgt tctgttcgcg aacaaccaag   1560
cgtacactcg cgacaactac cgcaaggctg gcatggccta cgtcatcgag gatctactgc   1620
acttctgccg gtgcatgtac tctatggcgt tggacaacat ccattacgcg ctgctcacgg   1680
ctgtcgtcat cttttctgac cggccagggt tggagcagcc gcaactggtg gaagagatcc   1740
agcggtacta cctgaatacg ctccgcatct atatcctgaa ccagctgagc gggtcggcgc   1800
gttcgtccgt catatacggc aagatcctct caatcctctc tgagctacgc acgctcggca    1860
tgcaaaactc caacatgtgc atctccctca agctcaagaa cagaaagctg ccgcctttcc    1920
tcgaggagat ctgggatgtg gcggacatgt cgcacaccca accgccgcct atcctcgagt    1980
cccccacgaa tctctagccc ctgcgcgcac gcatcgccga tgccgcgtcc ggccgcgctg    2040
ctctgagaat tcgatatcaa gcttctagac ccgggctgca gagatctacg cgttaagctt    2100
aattcccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg    2160
tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat    2220
gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat    2280
ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt    2340
gtcatctatg ttactagatc ggggactagt aaggccggcc gcttggatcc gctcggagga    2400
cagtactccg ctcggaggac agtactccgc tcggaggaca gtactccgct cgaggacagt    2460
actccgctcg gaggacagta ctccgatccg tcagatctgc aagacccttc ctctatataa    2520
ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaccatgg aagtctgcaa ttgtattgaa    2580
ccgcaatggc cagcggatga attgttaatg aaataccaat acatctccga tttcttcatt    2640
gcgattgcgt atttttcgat tcctcttgag ttgatttact ttgtgaagaa atcagccgtg    2700
tttccgtata gatgggtact tgttcagttt ggtgctttta tcgttcttta tggagcaact    2760
catcttatta acttatggac tttcactacg cattcgagaa ccgtggcgct tgtgatgact    2820
accgcgaagg tgttaaccgc tgttgtctcg tgtgctactg cgttgatgct tgttcatatt    2880
attcctgatc ttttgagtgt taagactcgg gagcttttct tgaaaaataa agctgctgag    2940
ctcgatagag aaatgggatt gattcgaact caggaagaaa ccggaaggca tgtgagaatg    3000
ttgactcatg agattagaag cactttagat agacatacta ttttaaagac tacacttgtt    3060
gagcttggta ggacattagc tttggaggag tgtgcattgt ggatgcctac tagaactggg    3120
ttagagctac agctttctta tacacttcgt catcaacatc ccgtggagta tacggttcct    3180
attcaattac cggtgattaa ccaagtgttt ggtactagta gggctgtaaa aatatctcct    3240
aattctcctg tggctaggtt gagacctgtt tctgggaaat atatgctagg ggaggtggtc    3300
gctgtgaggg ttccgcttct ccacctttct aattttcaga ttaatgactg gcctgagctt    3360
tcaacaaaga gatatgcttt gatggttttg atgcttcctt cagatagtgc aaggcaatgg    3420
catgtccatg agttggaact cgttgaagtc gtcgctgatc aggtggctgt agctctctca    3480
catgctgcga tcctagaaga gtcgatgcga gctagggacc ttctcatgga gcagaatgtt    3540
gctcttgatc tagctagacg agaagcagaa acagcaatcc gtgcccgcaa tgatttccta    3600
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<210>2
<211>4995
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>p187盒
<400>2
atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgatccaa gctcaagcta agcttgcatg     60
cctgcaggat atcgtggatc caagcttgcc acgtgccgcc acgtgccgcc acgtgccgcc    120
acgtgcctct agaggatcca tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc    180
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctggga    240
tccccaccat ggatccgcca ccatgctagc ccaccatgaa gctactgtct tctatcgaac    300
aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg    360
ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc    420
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tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata    540
taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag    600
atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg    660
cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatccatgg    720
cccccccgac cgatgtcagc ctgggggacg aactccactt agacggcgag gacgtggcga    780
tggcgcatgc cgacgcgcta gacgatttcg atctggacat gttgggggac ggggattccc    840
caggtccggg atttaccccc cacgactccg ccccctacgg cgctctggat atggccgact    900
tcgagtttga gcagatgttt accgatgccc ttggaattga cgagtacggt gggaagcttc    960
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tcatcttttc tgaccggcca gggttggagc agccgcaact ggtggaagag atccagcggt   1740
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ccgtcatata cggcaagatc ctctcaatcc tctctgagct acgcacgctc ggcatgcaaa   1860
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<400>7
atggaagtct gcaattgtat tgaaccgcaa tggccagcgg atgaattgtt aatgaaatac    60
caatacatct ccgatttctt cattgcgatt gcgtattttt cgattcctct tgagttgatt   120
tactttgtga agaaatcagc cgtgtttccg tatagatggg tacttgttca gtttggtgct   180
tttatcgttc tttatggagc aactcatctt attaacttat ggactttcac tacgcattcg   240
agaaccgtgg cgcttgtgat gactaccgcg aaggtgttaa ccgctgttgt ctcgtgtgct   300
actgcgttga tgcttgttca tattattcct gatcttttga gtgttaagac tcgggagctt   360
ttcttgaaaa ataaagctgc tgagctcgat agagaaatgg gattgattcg aactcaggaa   420
gaaaccggaa ggcatgtgag aatgttgact catgagatta gaagcacttt agatagacat   480
actattttaa agactacact tgttgagctt ggtaggacat tagctttgga ggagtgtgca   540
ttgtggatgc ctactagaac tgggttagag ctacagcttt cttatacact tcgtcatcaa   600
catcccgtgg agtatacggt tcctattcaa ttaccggtga ttaaccaagt gtttggtact   660
agtagggctg taaaaatatc tcctaattct cctgtggcta ggttgagacc tgtttctggg   720
aaatatatgc taggggaggt ggtcgctgtg agggttccgc ttctccacct ttctaatttt   780
cagattaatg actggcctga gctttcaaca aagagatatg ctttgatggt tttgatgctt   840
ccttcagata gtgcaaggca atggcatgtc catgagttgg aactcgttga agtcgtcgct   900
gatcaggtgg ctgtagctct ctcacatgct gcgatcctag aagagtcgat gcgagctagg   960
gaccttctca tggagcagaa tgttgctctt gatctagcta gacgagaagc agaaacagca  1020
atccgtgccc gcaatgattt cctagcggtt atgaaccatg aaatgcgaac accgatgcat  1080
gcgattattg cactctcttc cttactccaa gaaacggaac taacccctga acaaagactg  1140
atggtggaaa caatacttaa aagtagtaac cttttggcaa ctttgatgaa tgatgtctta  1200
gatctttcaa ggttagaaga tggaagtctt caacttgaac ttgggacatt caatcttcat  1260
acattattta gagaggtcct caatctgata aagcctatag cggttgttaa gaaattaccc  1320
atcacactaa atcttgcacc agatttgcca gaatttgttg ttggggatga gaaacggcta  1380
atgcagataa tattaaatat agttggtaat gctgtgaaat tctccaaaca aggtagtatc  1440
tccgtaaccg ctcttgtcac caagtcagac acacgagctg ctgacttttt tgtcgtgcca  1500
actgggagtc atttctactt gagagtgaag gtaaaagact ctggagcagg aataaatcct  1560
caagacattc caaagatttt cactaaattt gctcaaacac aatctttagc gacgagaagc  1620
tcgggtggta gtgggcttgg cctcgccatc tccaagaggt ttgtgaatct gatggagggt  1680
aacatttgga ttgagagcga tggtcttgga aaaggatgca cggctatctt tgatgttaaa  1740
cttgggatct cagaacgttc aaacgaatct aaacagtcgg gcataccgaa agttccagcc  1800
attccccgac attcaaattt cactggactt aaggttcttg tcatggatga gaacggggta  1860
agtagaatgg tgacgaaggg acttcttgta caccttgggt gcgaagtgac cacggtgagt  1920
tcaaacgagg agtgtctccg agttgtgtcc catgagcaca aagtggtctt catggacgtg  1980
tgcatgcccg gggtcgaaaa ctaccaaatc gctctccgta ttcacgagaa attcacaaaa  2040
caacgccacc aacggccact acttgtggca ctcagtggta acactgacaa atccacaaaa  2100
gagaaatgca tgagctttgg tcttgacggt gtgttgctca aacccgtatc actagacaac  2160
ataagagatg ttctgtctga tcttctcgag ccccgggtac tgtacgagta a           2211
<210>8
<211>259
<212>PRT
<213>云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)
<400>8
Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln
1                5                   10                   15
Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln
             20                  25                   30
Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe
        35                   40                   45
Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu
    50                   55                   60
Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln
65                   70                   75                   80
Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val
                 85                   90                   95
Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Phe Ala Asn Asn
             100                  105                 110
Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Tyr Val
         115                 120                 125
Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu
     130                 135                 140
Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp
145                  150                  155                 160
Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr
                 165                 170                 175
Tyr Leu Ash Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser
             180                 185                 190
Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu
         195                 200                 205
Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys
    210                  215                 220
Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val
225                  230                 235                 240
Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr
                 245                 250                 255
Asn Leu Gly
<210>9
<211>259
<212>PRT
<213>云杉卷叶蛾
<400>9
Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln
1                5                    10                  15
Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln
             20                  25                  30
Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe
         35                  40                  45
Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu
    50                  55                  60
Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln
65                  70                   75                   80
Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val
                 85                   90                   95
Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Phe Ala Asn Asn
            100                  105                  110
Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Tyr Val
        115                  120                  125
Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu
    130                  135                  140
Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp
145                   150                  155                  160
Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr
                 165                  170                  175
Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser
            180                  185                  190
Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu
         195                  200                  205
Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys
    210                  215                  220
Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val
225                  230                  235                  240
Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr
                 245                  250                  255
Asn Leu Gly
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成E1b最小启动子
<400>10
tatataatgg atccccgggt accg    24
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>18s正向引物
<400>11
cgtccctgcc ctttgtacac         20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>18s反向引物
<400>12
acacttcacc ggaccattca a    21
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>18s探针
<400>13
ccgcccgtcg ctcctaccg       19
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>ACC氧化酶(aco)正向引物
<400>14
gttgtagaag gacgcgatgg a    21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>ACC氧化酶(aco)反向引物
<400>15
caggtacaag agcgtcatgc a    21
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>ACC氧化酶(aco)探针
<400>16
tcctgttccc gctgggctgc    20

Claims (14)

1.用于在植物细胞中可控表达乙烯效应的载体，其包括：
激活盒，激活盒包括在与其操作性结合的合适启动子控制下的以下组件：识别含有5个拷贝的GAL4的选定效应元件的GAL4DNA-结合域；野生型蜕皮激素受体配体结合域或其T52V突变体；和在诱导组合物存在下激活的VP16激活域；和
靶标盒，其包括诱导型启动子，该启动子包含操作性结合的所述效应元件和最小启动子，所述GAL4DNA-结合域结合所述效应元件，所述最小启动子对所述激活盒的VP16激活域起反应，所述诱导型启动子控制编码能够调节乙烯敏感性的选定蛋白的核酸序列在植物中的表达；其中，所述选定蛋白选自ACC脱氨酶、RTE1、CTR1、EIN2、EIN3、EDF1、EDF2、EDF3、EDF4、EBF1或EBF2；
在植物细胞中，所述激活盒和靶标盒各组件与诱导组合物之间的相互作用可调节所述选定蛋白的表达和选择性地调节植物细胞的乙烯敏感性，蛋白表达的调节可受施加诱导组合物的时机、浓度和持续时间的控制；
其中，所述激活盒和靶标盒位于同一载体上，或位于单独的载体上。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒，所述激活盒和靶标盒位于同一质粒上。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒，所述激活盒和靶标盒位于单独的质粒上。
4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述激活盒的启动子选自下组：组成型启动子、植物细胞特异性启动子、植物组织特异性启动子、植物器官特异性启动子、诱导型启动子、发育特异性启动子和细胞分化特异性启动子。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述启动子是组成型启动子。
6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述诱导型启动子包含操作性结合的最小启动子序列以及一个或多个拷贝的对应于激活盒中DNA结合域的效应元件。
7.用于在植物细胞中可控表达乙烯效应的载体，其包括：
激活盒，包括在与其操作性结合的组成型G10-90启动子控制下的以下组件：识别包含5个拷贝的GAL4效应元件的选定效应元件的GAL4DNA-结合域；野生型蜕皮激素受体配体结合域或其T52V突变体；和在诱导组合物的存在下激活的VP16激活域；和
靶标盒，其包括诱导型启动子，该启动子包含操作性结合的5个拷贝的所述GAL4效应元件和对VP16激活域激活起反应的最小35S启动子，所述诱导型启动子控制编码突变体ETR1蛋白的ETR1-1基因的核酸序列的表达；
在植物细胞中，所述激活盒和靶标盒各组件与诱导组合物之间的相互作用可调节突变体ETR1蛋白的表达和选择性地降低植物细胞的乙烯敏感性，蛋白表达的降低受到施加诱导组合物的时机、浓度和持续时间的控制；
其中，所述激活盒和靶标盒位于同一载体上，或位于单独的载体上。
8.用于在植物细胞中可控表达乙烯效应的载体，其包括：
激活盒，包括在与其操作性结合的组成型G10-90启动子控制下的以下组件：识别包含5个拷贝的GAL4效应元件的效应元件的GAL4DNA-结合域；蜕皮激素受体配体结合域；和在诱导组合物的存在下激活的VP16激活域；和
靶标盒，其包括诱导型启动子，该启动子包含操作性结合的5个拷贝的所述GAL4效应元件和对VP16激活域激活起反应的最小35S启动子，所述诱导型启动子控制编码突变体ETR1蛋白的ETR1-1基因的核酸序列的表达；
在植物细胞中，所述激活盒和靶标盒各组件与诱导组合物之间的相互作用可调节突变体ETR1蛋白的表达和选择性地降低植物细胞的乙烯敏感性，蛋白表达的降低受到施加诱导组合物的时机、浓度和持续时间的控制；和
其中，所述载体含有SEQ ID NO:1、2、5或6所示的序列。
9.一种调节植物乙烯敏感性的方法，该方法包括：
将有效量的诱导组合物施加于转基因植物细胞，所述植物包含能够稳定表达权利要求1-7中任一项所述的载体的细胞，
在所述诱导组合物的存在下所述植物细胞对乙烯的敏感性降低，而在没有所述诱导组合物的情况下所述植物细胞对乙烯的敏感性提高；和
所述乙烯敏感性的调节受到施加所述诱导组合物的时机、浓度和持续时间的控制。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述诱导组合物是二酰肼化合物。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受控的乙烯敏感性选自下组：枯萎、果实熟化、应激反应、发芽、病原体抗性、叶片脱落、花蕾脱落、芽脱落、荚壳脱落、果实脱落、开花以及对干旱、热、群体密度和盐度的反应。
12.一种调节植物乙烯敏感性的方法，该方法包括：
将有效量的诱导组合物施加于转基因植物细胞，所述植物包含能够稳定表达权利要求8中所述的载体的细胞，
在所述诱导组合物的存在下所述植物细胞对乙烯的敏感性降低，而在没有所述诱导组合物的情况下所述植物细胞对乙烯的敏感性提高；和
所述乙烯敏感性的调节受到施加所述诱导组合物的时机、浓度和持续时间的控制。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述诱导组合物是二酰肼化合物。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述受控的乙烯敏感性选自下组：枯萎、果实熟化、应激反应、发芽、病原体抗性、叶片脱落、花蕾脱落、芽脱落、荚壳脱落、果实脱落、开花以及对干旱、热、群体密度和盐度的反应。
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