JPH11507233A - 綿繊維転写因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分子プローブとして使用できるか、または植物宿主中に挿入して、綿繊維の種々の発育段階中に目的のＤＮＡ配列の転写を変えることができる新規なＤＮＡ構築物が提供される。このＤＮＡ構築物には、綿繊維中で発現される遺伝子と関連づけられた綿繊維転写開始調節領域が含まれる。また、色素合成遺伝子のこうした構築物を使用して綿繊維細胞中での発現により導入された天然の色を呈する綿繊維を含んでなる新規な綿が提供される。遺伝子工学手法により作り出された色を呈する綿繊維細胞、ならびにメラニン色素およびインジゴ色素を含む綿細胞について記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 綿繊維転写因子 関連出願のクロスレファレンス 本出願は、1995年6月7日出願のアメリカ特許出願08/487,087号の一部継続出願 であり、1995年6月7日出願のアメリカ特許出願08/480,178号の一部継続出願であ る。 序 技術分野 本発明は、植物中で対象のＤＮＡ配列の繊維組織転写を起こして変化した表現 型を有する繊維細胞を生産することができるin vitroで構築されたＤＮＡ転写ま たは発現カセットを使用する方法、及び綿繊維の種々の特徴を与え、あるいは修 飾する方法に関する。本発明は、綿繊維の発現型を変えるための綿繊維プロモー ターを使用する方法、及び該方法で生産された綿繊維により例示される。背景 一般に、遺伝子工学的方法は、個々の原核生物及び真核細胞の発現型の修飾を 、特に培養中に起こすことを指向するものであった。植物細胞は、適したベクタ ー系が不足していることだけでなく、目的が多様である結果として、他の真核細 胞より困難が多いことが判明している。多くの用途のために、植物の成長の特定 の段階において、あるいは特定の植物部分において、遺伝子発現を制御できるこ とは望ましいことである。この目的のためには、植物の発生と生産性に重大な害 を与えることなく、適当な細胞型中、及び／または植物発生中の適当な時期に転 写の所望のように開始できる調節配列が必要である。従って、宿主植物の成長サ イクルの間に、植物細胞中で転写の所望の調節を与えるのに使用することができ る配列を単離できることは関心の高いところである。 この関心の1つの対象は、例えば繊維組織、即ち綿繊維細胞に由来する分化し た表皮細胞等の特定の細胞型の発現型を変化させ、成熟細胞型の変化した、ある いは改善された形態を与えることができる能力である。綿は商業上大きな重要性 を有する植物である。織物の生産での綿繊維の使用に加えて、その他の綿の用途 として綿実油を使用した食料品及び綿実外皮からの動物飼料等がある。 作物としての綿の重要性にもかかわらず、綿繊維発現型についての交配及び遺 伝子工学はそれほど急速には進行してこなかった。これは繊維の発現型を選択的 に変化させるのに使用するための信頼できるプロモーターが欠如していたことに よるものである。所望の発現型変化を生じさせるためには、発生の間に繊維細胞 中で転写を開始できる転写開始領域が必要である。従って、綿の生物工学的研究 の一つの重要な目的は、綿繊維中で選択的にタンパク質の発現し、繊維強度、長 さ、色、染色性等の品質を変化させることを可能とする信頼できるプロモーター を獲得することである。関連文献 綿繊維特異的プロモーターが、ＰＣＴ出願国際公開WO94/12014及びWO95/08914 、並びにJohn and Crow，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:5769-5773，1992に 記載されている。綿繊維中で優先的に発現されるｃＤＮＡクローンが単離されて いる。単離されたこれらのクローンのうちの1つは、後期の一次細胞膜と早期の 二次細胞膜合成段階の間の最も高いレベルのｍＲＮＡ及びタンパク質に対応する ものである。John and Crow(上出)。 動物においては、ras上科(superfamily)は、細胞増殖と分割の制御に関与して いる亜族のras、分泌過程を制御するrab/YPTのメンバー、及び細胞骨格組織の制 御に関与するrhoに分類され(Bourneら、（1991）Nature 349:117-127)、これま でいくつかの相同遺伝子が植物において同定されている(概観のためには、Terry nら、（1993）Plant Mol．Biol．22:143-152を参照)。同定された遺伝子の一つ がrab/YPTl亜族のメンバーであるということを除いては、重要なras亜族につい ては何等発見されておらず、エンドウのrho遺伝子のクローニングについての最 近のレポートが1つあるだけである(Yang and Watson（1993）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 90:8732-8736)。 植物におけるこれらの遺伝子の機能の特性化は殆ど行われていないが、最近の 1つのレポートが、Arabidopsis属からの小Gタンパク質が小嚢の移動に関与す る酵母における変異体を機能的に補足することができることを示しており、植物 遺伝子の類似した機能を示唆している(Bednarekら、（1994）Plant Physiol 104 :591-596)。 動物においては、rho亜族の2種のメンバー、Rac及びRhoと称するものがアクチ ン組織の調節に関係していることが示されている(概観のためにはDownward,(199 2)Nature 359:273-274を参照)。 Raclは、形質膜上でのミクロフィラメント整列に影響することによって成長因 子が誘発する膜の波打ちを媒介することが示されており(Ridleyら、（1992）Cel l 70: 401-410)、一方RhoAは局所的な粘着力に関連するアクチンストレスファイ バーの形成を調節する(Ridley and Hall，（1992）Cell 70:389-399)。 酵母においては、CDC42遺伝子がrho-型タンパク質をコードし、これは芽痕に おけるキチンの局所的な沈積のために必要な細胞極性の樹立に関与するアクチン の組織化も調節する(Adamsら、（1990）J Cell Biol 111:131-143)。 酵母におけるCDC42-温度感受性変異体による温度シフトによるか(Adamsら、19 90)、あるいは優位な負の発現型を示す変異体RacまたはRhoタンパク質の繊維芽 細胞へのマイクロインジェクションによる(Ridleyら、1992; Ridley and Hall， 1992)遺伝子機能の破壊は、アクチンネットワークの分解を招く。 植物においては、細胞分割、増殖及びその後の二次細胞壁ポリマーの沈積のパ ターンの調節についてのその重要性にもかかわらず、細胞骨格組織化の制御は殆 ど理解されていない。綿繊維は細胞骨格組織化を研究するための優れたシステム を提供する。綿繊維は、細胞伸長と二次膜沈積を明確な事象として調べることが できる唯一の細胞である。これらの繊維は、開花後に莢内で同期して発生し、各 繊維細胞は約3週間延長し、薄い一次膜を沈積させる(Meinert and Delmer，（19 84）Plant Physiol．59:1088-1097; Basra and Malik，（1984）Int Rev of Cyt ol 89:65-113)。二次壁セルロース合成への移行の時点で、繊維細胞は、皮質微 小管のパターンと細胞壁ミクロフィブリル整列の同期した変化、アクチンの組織 化により上流側で制御され得る事象を経る(Seagull，（1990）Protoplasma 159: 44-59; 及び(1992)，Proceedings of the Cotton Fiber Cellulose Conference ，National Cotton Council of America，Memphis RN，pp 171-192)。 アグロバクテリウムにより媒介される綿の形質転換がUmbeck、アメリカ特許第 5,004,863号及び第5,159,135号に記載されており、粒子衝撃による綿の形質転換 が1992年9月17日発行のWO92/15675において報告されている。またアブラナの形 質転換がRadkeらによって記載されている(Theor．Appl．Genet．（1988）75;685 -694; Plant Cell Reports（1992）11:499-505)。 発明の概要 綿繊維における対象の遺伝子の、特に繊維発生及び二次細胞膜発生の早期にお ける転写を起こすことができる新規なＤＮＡ構築物とそれらの使用方法を記載す るものである。新規な構築物は、綿繊維において発現される遺伝子から得られる 転写及び翻訳開始領域を有するベクター、及び繊維発現型を変化させるためのベ クターを含む構築物を使用する方法を包含するものである。内在性の3'領域と5' 領域の両方が効率的な転写及び翻訳を起こすのに重要であり得る。 綿繊維発生の調節に関与する遺伝子から3つのプロモーターが提供される。一 つはRac13であり、動物Racタンパク質相同物をコードする綿のタンパク質からの ものである。Rac13は、繊維発生の間、非常に増強された発現を示す。発現のこ のパターンは細胞骨格組織の再構成のタイミングとよく相関しており、Rac13綿 遺伝子が、その動物における対応物のように、細胞骨格形成のシグナル伝達経路 に関与し得るものであることを示唆している。Rac13は、繊維発生の間に適度に 発現される遺伝子であり、9 dpaにおいて開始され、約24 dpaで停止される。そ して17〜21 dpaの間に最大限に発現され、繊維を発生させる。 綿のタンパク質からのもう一つのプロモーターは4-4と称される。4-4 ｍＲＮ Ａは、開花後17日で繊維細胞に蓄積され、開花後60日程度で起こる繊維成熟まで 継続される。4-4プロモーターが開花後35日において非常に活性が高いままであ ることがデータにより示されている。 さらに提供されるのは、綿繊維で優先的に発現される脂質転移タンパク質(以 下「Ltp」と称することがある)からのプロモーターである。 本発明の方法は、綿繊維プロモーターを含む転写または発現カセットで対象の 宿主植物細胞をトランスフェクトし、成長して所望の発現型を有する繊維を生産 する植物を発生させることを含む。従って本発明の構築物及び方法は、内在繊維 産物の改変並びに外来産物の生産に使用され、また繊維及び繊維産物の発現型を 修飾する際に使用される。構築物はまた、分子プローブとしても使用される。特 に、本明細書においては綿の胚組織中での遺伝子発現における構築物及び方法の 使用を考慮する。これらの方法により、新規な綿植物及び修飾された綿繊維のよ うな綿植物部分が得られ得る。 また、綿繊維における色発現型の修飾に関する構築物及び使用方法が提供され る。そのような構築物は、アントシアニン、メラニンあるいはインジゴのような 有色化合物の生産に関与する遺伝子の発現のための配列を含み、さらに植物細胞 中の特定の位置、例えばプラスチド細胞小器官あるいは液胞等に遺伝子産物を向 かわせる(標的化)配列を含み得る。プラスチドを標的化することは、芳香族アミ ノ酸生合成経路に関与する遺伝子の発現に関して特に重要であり、液胞を標的化 することは顔料の合成において必要である前駆体が液胞に存在する場合に特に重 要である。 着色している繊維、即ち植物によって繊維発生の間に生産された顔料を含む繊 維を生成する植物は、収穫した後に別の工程により染色あるいは着色される繊維 とは異なり、特に重要である。そのような着色した繊維を生産する植物からの繊 維は、染色工程にかけられていない着色糸及び／または織物を生産するために使 用し得る。自然に着色された綿が、種々の栽培されてきた綿の品種、あるいは野 生型の綿の品種から利用できるが、本出願は遺伝子工学的に生産されたタンパク 質の発現により生成された色を有する綿繊維を提供する。 従って、本出願は綿繊維における色発現型の修飾に関する構築物と使用方法を 提供する。そのような構築物は、メラニンやインジゴのような着色した化合物の 生産に関与する遺伝子の発現のための配列を含み、さらに遺伝子産物をプラスチ ド細胞小器官あるいは液胞のような植物細胞中の特定の位置に向かわせる配列を 含む。プラスチドを標的化することは、芳香族アミノ酸生合成経路に関与する遺 伝子の発現に関して特に有用であり、液胞を標的化することは顔料の合成におい て必要である前駆体が液胞に存在する場合に特に有用である。 図面の説明 図1は、ｃＤＮＡ4-4からの構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。 図2は、4-4-6ゲノムクローンからのゲノムＤＮＡを使用することにより作製さ れたプロモーター構築物pCGN5606に対する配列を示す。 図3は、4-4プロモーター構築物pCGN5610に対する配列を示す。 図4は、綿繊維中で発現されるRac13遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を示す。 図5は、rac13遺伝子からのプロモーター領域配列を示す。 図6は、pCGN4735についての制限地図を示す。 図7は、綿繊維に特異的な脂質転移タンパク質遺伝子からのLtpプロモーター領 域の配列を示す。 図8は、メラニン合成とインジゴ合成のそれぞれのための遺伝子を発現する植 物形質転換のためのバイナリーベクターpCGN5148とpCGN5616の構造を示す。 図9は、色構築物を使用した形質転換において使用された対照Coker130綿の繊 維から得られた色の測定の結果を示す。 図10は、メラニン合成のための遺伝子を発現するようにpCGN5148構築物によっ て形質転換された植物の色の測定の結果を示す。 図11は、メラニン合成のための遺伝子を発現するようにpCGN5149構築物によっ て形質転換された植物の色の測定の結果を示す。 図12は、pCGN5616構築物を使用してインジゴ合成のための遺伝子を発現するよ うに形質転換された植物の色についての測定の結果を示す。 図13は、非トランスジェニック着色綿植物によって生産された天然の着色した 綿植物について行った対照測定を示す。 発明の詳細な説明 本発明によれば、新規な構築物及び方法が記載され、それらは宿主植物細胞中 、特に綿繊維細胞中で変化した色発現型を有する綿繊維を生産する、対象のヌク レオチド配列の転写を得るために使用し得る。 綿繊維は、胚珠の外珠皮の分化した単一の表皮細胞である。これは4つの明確 な増殖期、即ち開始、伸長(一次細胞膜合成)、二次細胞膜合成及び成熟を示す。 繊維発生の開始はホルモンによって引き起こされるようである。一次細胞膜は、 開花後日(DPA)で25日まで継続する伸長相の間に形成される。二次膜の合成は、 伸長相の休止より前に開始し、約40 DPAまで続き、殆ど純粋なセルロースの壁を 形成する。 構築物に意図される用途に依り、そのような細胞中で使用するための構築物は いくつかの形態とし得る。即ち、構築物としてはベクター、転写カセット、発現 カセット、プラスミド等がある。また、転写及び翻訳開始領域(「プロモーター 」と称する場合がある)は、好ましくは非翻訳5'配列の転写開始調節領域及び翻 訳開始調節領域、ｍＲＮＡをリボソームに結合し翻訳を開始するための「リボソ ーム結合部位」を含む。開始制御領域の転写及び翻訳機能エレメントの全てが同 じ遺伝子から獲得されるか得られることが好ましい。いくつかの態様においては プロモーターは、エンハンサーのような配列の付加、あるいは本質的でない、及 び／または望ましくない配列の削除により修飾される。「得られる」は、本来の プロモーターに十分に類似したＤＮＡ配列を有し、対象のＤＮＡ配列の転写につ いて所望の特異性を与えるようなプロモーターを意味する。これは天然及び合成 の配列、並びに合成及び天然の配列の組合せであってもよい配列を含む。 綿繊維修飾のために選択された綿繊維転写開始領域は、本明細書で記載する4- 4、rac13及びLtp綿繊維プロモーター領域を含むものとすることができる。 綿繊維中の対象のヌクレオチド配列の転写のための転写カセットは、転写の方 向に、植物細胞において機能する、綿繊維転写開始領域、対象のＤＮＡ配列及び 転写終結領域を含む。カセットが対象のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を与える場合 、それを発現カセットとみなす。また、一つ以上の介在配列が存在してもよい。 所望によりシグナルペプチド及び分泌リーダー配列をコードするもの等のその 他の配列が存在してもよい。 本発明の繊維-組織転写開始領域は、好ましくは他の植物組織においては容易 に検出可能でないものである。前述のことに加えて、他の植物組織及び／または 繊維発生の他の段階で転写を開始できる転写開始領域は、そのような領域が対象 の規定された期間に綿繊維中で有意な発現量を与え、全体として植物を負に阻害 せず、特に繊維及び／または繊維に関連した部分の発生を阻害しない限り許容さ れる。 綿繊維転写/翻訳開始制御領域の下流にあり、その調節制御下にあるのは、繊 維の発現型の修飾を与える、対象のヌクレオチド配列である。ヌクレオチド配列 は、対象のポリペプチド、例えば酵素をコードする任意のオープンリーディング フレーム、あるいはオープンリーディングフレームであってもよいゲノム配列に 相補的な配列、介在配列、非コードリーダー配列、あるいは相補的配列が転写、 ｍＲＮＡプロセシング、例えばスプライシング、あるいは翻訳を阻害するその他 の配列等とすることができる。本発明のヌクレオチド配列は、合成のもの、天然 から得られるもの、あるいはそれらの組合せとすることができる。対象のＤＮＡ 配列の性質により、その植物に好ましいコドンにより配列を合成することが好ま しい場合がある。その植物に好ましいコドンは、対象の特定の植物種において最 も大い量で発現されるタンパク質中の最も高い頻度のコドンから決定することが できる。発現型修飾は、内在性の転写あるいは翻訳産物の生産を、例えば量、相 対的な分布等について調整し、あるいは外来転写産物もしくは翻訳産物の生産を 調整することにより行い、例えば、トランスジェニック宿主細胞または組織にお いて新規な機能あるいは産物を与えることができる。特に有用であるのは、サイ トカイニン、オーキシン、エチレン、アブシジン酸等の代謝に関係する遺伝子を 含む植物繊維の発生に関連した発現産物をコードしているＤＮＡ配列である。サ イトカイニン発現を修飾するための方法と組成物はアメリカ特許第5,177,307号 に記載されている。この開示は引用により本明細書の一部とする。あるいは、そ の他の真核生物細胞及び細菌を含む原核生物細胞を含むソースからの種々の遺伝 子、例えば、Agrobacterium tumefaciens T-ＤＮＡオーキシンとサイトカイニン 生合成遺伝子産物、及び哺乳類、例えばインターフェロンからの遺伝子を使用し てもよい。 その他の発現型修飾としては、綿繊維の色の修飾が挙げられる。メラニンの生 産に関与する遺伝子、及びインジゴの生産に関与する遺伝子が重要である。メラ ニンは、動物、植物、微生物において見られる暗褐色の色素であり、そのいずれ も本発明の構築物に挿入する配列のソースとすることができる。具体例としては 、 Streptomyces antibioticusからクローン化することができるチロシナーゼ遺伝 子が挙げられる。S．antibioticus中のORF438コードタンパク質もメラニン産生 に必要で、銅供与体機能を提供し得る。さらに、チロシナーゼ遺伝子はメラニン を形成する任意の生物から単離することができる。遺伝子は、人毛、メラニン細 胞、あるいはメラノーマ、イカ、及び赤雄鶏等から分離することができる。例え ば、メラニンの製造方法、微生物中のそれらの前駆体及び誘導体を開示するEP出 願89118346.9を参照。また、Bernanら、Gene（1985）37:101-110;及び della-Ci oppaら、Bio/Technology（1990）8:634-638も参照。 インジゴは、トルエン及びキシレンを(メチル)ベンジルアルコールに酸化し、 インドールをインジゴに変換するキシレンオキシゲナーゼのようなモノオキシゲ ナーゼをコードする遺伝子を使用することによって得ることができる。キシレン オキシゲナーゼ遺伝子のクローニングとヌクレオチド及びアミノ酸配列は、1990 年5月7日に発行された日本特許出願公開2-119777号に記載されている。同様にイ ンドールをインジゴに変換するナフタリンジオキシゲナーゼのようなジオキシゲ ナーゼも使用される。ナフタリンジオキシゲナーゼ遺伝子nahAはScience（1983 ）222: 167に記載されている。Pseudomonas putidaのナフタリンジオキシゲナー ゼをコードしている遺伝子の特性化におけるヌクレオチド配列のクローニングに ついては、Kurkelaら、Gene（1988）73:355-362を参照。トリプトファナーゼ遺 伝子配列は、オキシゲナーゼと共に使用して、インジゴへの変換に利用できるイ ンドールの量を増加することができる。トリプトファナーゼ遺伝子配列のソース としては、大腸菌が挙げられる(例えばDeeleyら、（1982）J．Bacteriol．151:9 42-951を参照)。 プラスチド標的化配列(シグナルペプチド)は、リブロースビスホスフェートカ ルボキシラーゼの小サブユニット(SSU)、アシルキャリヤータンパク質(ACP)、ス テアロイル-ACPデサチュラーゼ、β-ケトアシル-ACPシンターゼ、アシル-ACPチ オエステラーゼ等の植物脂肪酸生合成関連遺伝子、あるいはLHCPII遺伝子のよう な多くの植物核コードプラスチドタンパク質から利用できる。プラスチドへの輸 送を与えるシグナルペプチドのコード配列は、特定のシグナルペプチドのコード 配列の全てあるいは部分を含み得、また特定のシグナルペプチドに関連した成 熟タンパク質コード配列の部分を含んでいてもよい。プラスチド細胞小器官に標 的タンパク質をデリバリーするために使用することができるシグナルペプチドの 多数の例が当分野で知られている。本発明において使用する特定のシグナルペプ チド配列をコードする配列は必須のものではなく、プラスチドへのデリバリーが 得られればよい。 顔料合成タンパク質をプラスチド細胞小器官に向かわせるためにシグナルペプ チドを使用することに代わるものとして、所望の構築物を使用してプラスチドゲ ノムを直接形質転換してもよい。この場合は、植物プラスチドで遺伝子の転写を 与えることができるプロモーターが必要である。転写の高いレベルを与えるため にT7プロモーターを使用することが有用である。プラスチドがT7プロモーターか らの転写のための適当なポリメラーゼを含まないことから、T7ポリメラーゼは核 の構築物から発現させ、先に述べたようにシグナルペプチドを使用してプラスチ ドに向かわせてもよい(McBrideら、（1994）Proc．Nat．Acad．Sci．91:7301-73 05を参照；また、1995年6月6日に出願された「トランスジェニック構築物の植物 プラスチド中での制御された発現」と題する係属中のアメリカ特許出願08/472, 719号、1993年12月14日に出願された係属中のアメリカ特許出願08/167,638号、 及び1994年12月12日に出願されたPCT/US94/14574も参照)。組織特異的あるいは 発生的に調節されるプロモーターは、発現を適当な組織あるいは発生の段階に限 定するために、T7ポリメラーゼの発現に有用であり得る。 また、メラニン合成遺伝子の液胞への標的化は、液胞におけるメラニン合成に 関係するチロシン基質を蓄積する植物組織においてはやはり重要である。液胞へ の標的化のためのタンパク質シグナルは、トマトからのメタロカルボキシペプチ ダーゼ阻害因子遺伝子の32アミノ酸Ｎ末端領域のような通常は粗面小胞体を横切 って輸送される植物遺伝子から提供されてもよい(Martineauら、（1991）Mol．G en．Genet．228:281-286)。シグナル配列に加えて、液胞標的化構築物は、コー ドされたタンパク質のカルボキシ末端に位置する液胞局地化シグナル(VLS)もコ ードする。適当なシグナル配列とVLS領域は種々のその他の植物遺伝子から得ら れ、本発明の構築物において同様に使用され得る。多数の液胞標的化ペプチドが 当分野で知られており、Chrispeelsら、Cell（1992）68:613-616において概観さ れて いる。 アントシアニン染色経路の酵素であるジヒドロフラボノールレダクターゼをコ ードするトウモロコシA1遺伝子は、そのような遺伝子の一つである。A1遺伝子を 発現する細胞においては、ジヒドロケンフェロール(dihydrokempferol)は2-8ア ルキルロイコペラルゴニジンに変換され、これは内在植物酵素によってペラルゴ ニジン顔料にさらに代謝され得る。また、その他のアントシアニンあるいはフラ ボノイド型顔料が綿細胞繊維の修飾に重要であり得、植物花における使用に提案 されている(植物花色の概観のためには、van Tunenら、Plant Biotechnology Se ries，Volume 2（1990）Developmental Regulation of Plant Gene Expression ，D．Grierson ed.を参照)。アントシアニンは、細胞のフェニルアラニンプール から段階が進行することにより生産される。R及びC1遺伝子は、これらのプール からのアントシアニン生合成における上流側段階に正に影響を及ぼすことにより 活性を示すトウモロコシ調節タンパク質である。R遺伝子はPerot and Cone（198 9）Nucl．Acids Res.，17:8003に記載され、C1遺伝子はPaz-Aresら、（1987）EM BO，6:3553-3558に記載されている。Lloydら、（1992）Science，258:1773-1775 は両方の遺伝子について論じている。 商業上栽培されている品種の綿繊維の色は主として白であるが、その他の天然 の綿品種は褐色または赤褐色の繊維を有する。また、緑に着色した繊維を含む綿 の系列も確認されている。そのような繊維を与える綿の系列はBC種綿(BC Cotton Inc.，Box 8656，Bakersfield，CA 93389)及びFox Fibre綿(Natural Cotton Co lors，Inc.，P.O．Box 791，Wasco CA 93280)を含む種々のソースから利用でき る。 そのような着色した綿の系列の存在は、アントシアニン色素経路のために必要 な前駆体が綿繊維細胞に存在し、さらに色発現型修飾を可能とすることを示唆し ている。このように、トウモロコシR及びC1遺伝子は、繊維細胞中で生産される アントシアニンのレベルを高めるのに使用され得る。R及びC1タンパク質はアン トシアニン色素前駆体生合成での調節レベルで正の制御を有するタンパク質であ るので、これらのタンパク質は核で発現され、プラスチドあるいは液胞に標的化 されない。 いくつかの用途については、繊維の他の性質を修飾することが有用である。例 えば、繊維の強さやテクスチャーのような綿繊維の種々の性質を修飾することが 有用である。適当な遺伝子を本発明の構築物に挿入することができ、そのような 遺伝子としては、PHB生合成の遺伝子(Peoplesら、J．Biol．Chem．（1989）264: 15298-15303及び上出、15293-15397、Saxena，Plant Molecular Biology（1990 ）15:673-683［これはセルロースシンターゼ触媒サブユニット遺伝子のクローン 化及び配列決定を開示する］、及びBowenら、PNAS（1992）89:519-523［Sacchar omyces cerevisiae及びCandida albicansのキチンシンターゼ遺伝子を開示する ］参照)。繊維品質を変化させるためのホルモンの使用について種々の構築物及 び方法が、「子房組織転写因子を使用する綿の修飾」と題する1995年2月2日に出 願された係属中のアメリカ特許出願08/397,652号に開示されている。この教示は 引用により本明細書の一部とする。 アンチセンス配列の転写が必要な場合は、転写カセットを使用することができ る。ポリペプチドの発現が所望される場合は、対象のＤＮＡ配列の転写及び翻訳 を与える発現カセットを使用する。種々の変化が有用であり、そのような変化と しては、特定の糖、ホルモン、酵素、あるいはその他の生物学的物質の形成の調 節(増加または減少)等がある。水、固形物、繊維あるいは糖の比率及び／または 量を変化させる最終的な繊維の組成を調整することも含まれる。その他の対象と なる修飾のための発現型特性としては、ストレス、生物、除草剤、ブラッシング 、成長調整剤等に対する反応等が挙げられる。これらの結果は、天然の遺伝子の 転写産物に相補的な(アンチセンス)転写産物を生産して転写産物の成熟及び／ま たは発現を阻害するか、あるいは植物繊維の発生に関連する内在または外来遺伝 子の発現を与えることによって、一種以上の内在産物、特に酵素あるいは共因子 の発現を減少させることにより得ることができる。 発現カセットに使用する終結領域は主として便利のよいものの1つとされ、こ れは終結領域が比較的相互に交換可能であるようであるからである。終結領域は 、転写開始領域を有する天然のものでもよく、対象のＤＮＡ配列を有する天然の ものでもよく、別のソースから得たものでもよい。終結領域は、天然のものであ るか、あるいは完全に合成されたものもしくは部分的に合成されたものとするこ と ができる。便利な終結領域は、オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終 結領域のようなA．tumefaciensのTi-プラスミドから利用できる。いくつかの態 様においては、特定の構築物において使用される綿繊維転写開始領域の本来の3' 終結領域を使用するのが望ましい場合がある。 本明細書で記載するように、ある場合においては、追加のヌクレオチド配列を 構築物に存在させ、特定の遺伝子産物を特異的な細胞の位置へ向かわせる。例え ば、芳香族の着色顔料の合成のためのコード配列、特にチロシン及びインドール のような芳香族化合物をその基質とする酵素をコードする配列を構築物に使用す る場合、SSUシグナルペプチド配列のような、プラスチドへの酵素のデリバリー を与える配列を含めることが好ましい。また、メラニンのようなチロシンに由来 する顔料の合成については、液胞への標的化により色修飾を増強し得る。 メラニン産生については、Streptomyces antibioticusからのチロシナーゼとO RF438遺伝子(Bermanら、（1985）37:101-110)が、4-4及びRac13プロモーターか らの発現のための綿繊維細胞に与えられる。Streptomycesにおいては、ORF438及 びチロシナーゼタンパク質は、同じプロモーター領域から発現される。トランス ジェニック植物ゲノムにおける構築物からの発現のためには、コード領域は別の プロモーター領域の調節制御の下に与えられてもよい。プロモーター領域は、2 つの遺伝子について同じものであってもよく、異なるものであってもよい。ある いは、単一の植物プロモーターからの2つの遺伝子の協調発現が望ましい場合も ある。4-4及びracプロモーター領域からのチロシナーゼ及びORF438遺伝子産物の 発現のための構築物を以下の実施例において詳細に記載する。また、別のプロモ ーターが望ましい場合もあり、例えば、CaMV 35Sのような植物ウイルスプロモー ターを、綿繊維組織において4-4及びracプロモーターから発現される他の遺伝子 産物とともに、所望の遺伝子産物の1つを構成的に発現させるために使用するこ とができる。 同様に、その他の構成的プロモーターもある用途においては有用であり得、例 えばアメリカ特許5,106,739号及びComaiら、Plant Mol．Biol．（1990）15:373- 381により記載されたmas、Mac、あるいはDoubleMacプロモーターがある。複数の 遺伝子構築物を含む植物、例えば、メラニン遺伝子、ORF438及びチロシナー ゼを発現する植物が望まれる場合は、そのような植物を両方の構築物での同時形 質転換によって得てもよく、あるいは個々の構築物での形質転換とその後の植物 育種法により所望の遺伝子の両方を発現する植物を得てもよい。 植物細胞宿主への構築物の導入のための種々の方法が利用でき、当業者に知ら れている。そのような方法としては、A．tumefaciensあるいはA．rhizogenesを トランスフェクト剤として使用するＤＮＡのトランスフェクション、プロトプラ スト融合、注入、エレクトロポレーション、粒子加速等を使用するＤＮＡによる トランスフェクションが挙げられる。アグロバクテリウムによる形質転換につい ては、Ti-プラスミド、特にT-ＤＮＡと相同なＤＮＡを含む大腸菌中でプラスミ ドを調製することができる。プラスミドはアグロバクテリウム中で複製できても できなくてもよく、即ち、例えばpRK290のように広いスペクトルの原核生物複製 系を持ってもよく、また持っていなくてもよく、これは一つには転写カセットが Ti-プラスミドに組み込まれるのか、あるいは独立のプラスミド上に保持される のかに依る。アグロバクテリウム宿主は、植物細胞へのT-ＤＮＡの移入に必要な vir遺伝子を有するプラスミドを含み、完全なT-ＤＮＡを有してもよく、有して いなくてもよい。Ti-またはRi-プラスミドのT-ＤＮＡの少くとも右側の境界、多 くの場合は右及び左の両方の境界を、フランキング領域として転写構築物に結合 する。植物細胞の形質転換のためのT-ＤＮＡの使用は広く研究されており、EP出 願120,516，Hoekema，The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kant ers B.V.，Alblasserdam，1985，Chapter V，Knaufら、Genetic Analysis of Ho st Range Expression by Agrobacterium，Molecular Genetics of the Bacteria -Plant Interaction，Puhler，A．ed.，Springer-Verlag，NY，1983，p．245及 びAnら、EMBO J．（1985）4:277-284に詳細に記載されている。 感染、粒子加速及びエレクトロポレーションについては、特にT-ＤＮＡ領域に 見出される腫瘍遺伝子が欠落している無害化Ti-プラスミドを植物細胞に導入す ることができる。ヘルパープラスミドによって、構築物をA．tumefaciensに移し 、得られるトランスフェクトされた生物を、植物細胞をトランスフェクトするの に使用できる。外植物を形質転換されたA．tumefaciensあるいはA．rhizogenes と培養して転写カセットを植物細胞に移入することができる。あるいは、植物ゲ ノ ムへの組込みを増強するために、トランスポゾンの末端反復を境界としてトラン スポゼースとともに使用してもよい。この場合、トランスポゼースの発現は誘導 性で、転写構築物がゲノムに組込まれたときに比較的安定に組み込まれるもので なければならない。その後、トランスジェニック細胞の選択のための適当な選択 培地にトランスジェニック植物細胞を置き、選択されたトランスジェニック細胞 はその後カルス、成長した茎頂、及び定着培地で成長させることにより茎頂から 生成される苗に成長させる。 トランスジェニック細胞と植物における導入遺伝子の存在を確かめるために、 当業者に知られている方法を使用してサザンブロット分析を行うことができる。 導入遺伝子の発現産物は、産物の性質に従い、種々の方法の任意のものにより検 出することができ、そのような方法としては、免疫アッセイ、酵素アッセイ、あ るいは視覚観察等があり、それにより例えば適当な植物部分あるいは細胞におけ る顔料形成を検出することができる。トランスジェニック植物が得られると、そ れを成長させて所望の発現型を有する繊維を生産することができる。繊維を収穫 し、及び／または種子を採集することができる。種子は所望の特徴を有する植物 をさらに増殖させるためのソースとすることができる。トランスジェニック植物 及びトランスジェニック細胞の用語は、トランスジェニック植物あるいはトラン スジェニック細胞のいずれかから得た植物及び細胞を含む。 本発明において提供される種々の配列は、例えば同じであるか異なる植物ソー スから関連する転写開始領域を得るために、本発明で有用であるその他の配列の 単離用の分子プローブとして使用できる。本発明において提供された配列から得 られる関連した転写開始領域はプローブと少くとも約60%の相同性を示し、より 好ましい領域はより大きい相同性のパーセンテージを示す。特に重要なのは、本 明細書で記載したタイミングと組織パラメータを有する関連転写開始制御領域を 得る能力である。例えば、プローブ4-4及びracを使用して、少くとも7つの別の クローンが同定されたが、さらに特性化していない。このように、本出願に記載 した方法及び当分野で公知の方法(例えばManiatisら、Molecular Cloning，- A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor，New York）1982)を使用することによ り、本発明に記載したような綿繊維転写を起こすことができるその他の転写 開始領域を判定することができる。また、構築物を植物再生系と共に使用して細 胞及び植物を得ることができ、従って構築物は、繊維細胞の発現型を修飾し、こ れまで利用できなかった色相及び／または強度を遺伝子工学的に得た、着色され た綿繊維を提供することができる。 綿の種々の品種と系列を記載した方法で使用することができる。栽培された綿 の種としては新世界で進化したGossypium hirsutum及びG．babadense(非常に長 く安定した、即ちピーマ綿)、そして旧世界の作物であるG．herbaceum及びG．ar boreumが挙げられる。 色の発現型は、綿のサンプルの色の客観的な測定値を得るためにすでに使用さ れている装置である色彩計を使用することによって調べることができる。色彩計 は、光源とフィルタの組合せを使用してサンプル色の種々の評価をするものであ り、三刺激値と呼ばれることもある。 過去においては、そのような評価を使用して綿のサンプルの黄色さの程度を示 す値(下記するハンター＋b)を計算していた。黄色さと反射率(Rd、サンプルの明 るさあるいは暗さの程度からの)を使用して段階化するための綿の色の測定値を 得ていた。試験は、典型的にはサンプルの表面を制御された光源にさらすことに よって行われる。公式な等級基準がどのようにRd及び+b測定値に関連するかを示 す典型的なカラーチャートが、Cotton，RJ Kohel and CF Lewis，Editors #24,A GRONONY Series-American Soc．Agromonyに示されている(図12-6を参照)。 種々の色彩計測方法を使用して色を定量化し、それを数値的に表現することが できる。アメリカの学者A．Munsellにより作成されたMunsell法は、見本色との 視覚的比較のための、紙色票をそれらの色相(マンセルヒュー)、明度(マンセル バリュー)及び飽和(マンセルクロマ)に従って類別した分類系を使用している。 色を数値的に表現するためのその他の方法が、光及び色に関係する国際的な組 織、Commission Internationale de l'Eclairage(CIE)(Kegelgasse 27，A-1030 Vienna，AUSTRIAに本部を有する)によって開発されている。これらの方法で最も よく知られた2つのものは、CIEによって定義される、三刺激値XYZに基づいて193 1年に作成されたYxyカラースペース、及び視覚的差異と関連してより一様 な色差を与えるように1976年に工夫されたL*a*b*カラースペースがある。これら のようなカラースペース*は、色についてコミュニケーションするために世界中 で使用されている。ハンターLabカラースペースは、光電比色計により直接読み 込むことができる均一なカラースペースとしてR.S．Hunterにより1948年に開発 された(三刺激値法)。 L*C*hカラースペースは、L*a*b*カラースペースと同じダイヤグラムを使用す るが、直角座標の代わりに円柱座標を使用する。このカラースペースにおいては 、L*が明度を示し、L^*a^*b^*カラースペースのL^*と同じものであり、C^*は彩度であ り、hは色相角である。彩度Cの値は中央で0であり、中央からの距離に従って増 加する。色相角は、L*a*b*空間の+a軸で始まるものとして定義され、反時計方向 回転の程度で表される。このように、L^*a^*b^*空間に関し、0°及び360°が、+a* 線にあり、90°が+b^*であり、180°が-a^*であり、270°が-b^*である。 上記の方法は全て、綿繊維色発現型の詳細な測定値を得るために使用すること ができる。 実験 以下の実施例は、説明のために記載するものであり、限定するものではない。 実施例1 ｃＤＮＡライブラリー ｃＤＮＡ合成のための組織調製 8インチの高さの温室で成長させた実生から葉及び塊根組織を単離し、直ちに 液体窒素中で凍結させた。花は、急速に広がる３日開花前段階で集め、同様に凍 結させた。種子は、21日開花後の莢から取り出された子房室から集め、液体窒素 中で全体を凍結させた。凍結させた後、種子から繊維を取り除き、裸にした種子 をＲＮＡ単離のために使用した。全ての繊維を液体窒素下に種子から除去し、繊 維を粉末に粉砕した後にＲＮＡを単離した。繊維は、開花時に標識した莢からの ものであった。ＤＮＡ及びＲＮＡ操作 StratageneのラムダZapII^TMｃＤＮＡライブラリシステムをスクリーニングに 使用し、これはGossypium hirsutum栽培種Acala SJ-2の繊維から単離されたpoly -A^-ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから調製した。繊維は、イスラエルで野外生育 させた植物を使用して約21 dpaで収穫された莢から単離した。 全ＲＮＡを、Hughes及びGalau((1988)Plant Mol Biol Reporter，6:253-25 7) の方法を使用して21 dpa種子(繊維が取り除かれたG．hirsutum cv Coker 130)か ら単離した。全てのその他のＲＮＡは、Hallら((1978)，Proc Natl Acad Sci US A 75:3196-3200)に従って調製し、以下の変更を加えた。2M LiCl中での2回目の 洗浄の後、ペレットを10 mMトリスpH 7.5の1/10の当初容量中に溶解し、35 mM酢 酸カリウムpH 6.5とし、1/2容量のEtOHをゆっくりと加えた。混合物を15分間氷 上に置き、その後20,000×gで15分間4℃で遠心分離した。酢酸カリウム濃度を0. 2 Mとし、2 1/2容量のEtOHを加え、ＲＮＡを数時間-20℃に置いた。沈殿を12,00 0×g で30分間4℃で遠心分離し、ペレットをジエチルピロカーボネート処理水中 に再懸濁した。オリゴ(dT)セルロースキット(Becton Dickenson)を使用し、製造 業者のプロトコールに従って、ポリ-A⁺ＲＮＡを全ｍＲＮＡから調製した。 綿のゲノムＤＮＡは、以下のように調製した。4グラムの若い綿の葉の組織(cv Coker 130)をN₂中で粉末に挽き、0.4 gのポリビニルピロリドンとともにOak Ri dgeチューブに入れ、20 mlの抽出バッファー(200 mM Ches/NaOH pH 9.1，200 mM NaCl，100 mM EDTA/NaOH pH 9.0，2% SDS，0.5% デオキシコール酸Na、2% Non idet NP-40，20 mM β-メルカプトエタノール)をサンプルに加え、穏やかに混合 し、65℃の振とう水浴中で10分間インキュベートした。5 M酢酸カリウムpH 6.5 の7.0 mlを加えて、慎重に混合した。5分毎に穏やかに攪拌しながら氷上で30分 間インキュベーションを行った。サンプルを20分間21,000×gで遠心分離し、上 清をMiraclothを通してもう一つのチューブ中にろ過し、前と同様に遠心分離し た。上清を再びMiraclothを通してOak Ridgeチューブ中の15 mlの室温のイソプ ロパノール中にろ過した。穏やかに攪拌した後、ＤＮＡが沈殿するまで サンプルを室温で10〜60分間インキュベートした。ＤＮＡを巻き取り、風乾した 後、氷上の4 mlのTE中に1時間再懸濁した。CsClを0.97 g/mlの最終濃度まで加え 、300μlの10 mg/mlエチジウムブロミドを加え、VTi80クイックシールチューブ に充填した。サンプルを225,000×gで一晩遠心分離した。ＤＮＡを水で飽和した ブタノールで抽出し、容量を4 mlとするのに十分な水を加え、その後２容量のEt OHを加えた。ＤＮＡを巻き取り、風乾した後、200μlの滅菌水中に再懸濁した。ノーザン及びサザン分析 ノーザン分析については、全ＲＮＡの10μgを種々の組織から単離し、1.2%ア ガロースーホルムアルデヒドゲル中での電気泳動によって分離し、Nytran Plus膜 (Schleicher及びSchuell)上へ移した。ハイブリダイゼーション条件は、50%ホル ムアミド(v/v)，5xSSC，0.1% SDS，5 mM EDTA，10Xデンハルト溶液、25 mMリン 酸ナトリウムpH 6.5及び250μg/ml キャリアーＤＮＡを含む溶液からなるものと した。洗浄は、2xSSC，0.1% SDS中42℃で3回、各回30分間行った。 綿のゲノムＤＮＡ(12 μg)を種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、0.9%ア ガロースゲル中で電気泳動にかけ、Nytran Plus膜上へブロットした。3'特異的 及び完全長ｃＤＮＡ挿入プローブの両方についてハイブリダイゼーション及びフ ィルター洗浄条件はノーザン分析について記載したものとした。 3'非翻訳領域に由来するプローブを、塩基600-619及び843-864(図4)に対応す るRac13 ｃＤＮＡからのオリゴヌクレオチドプライマーにより合成した。プライ マーの各セットをポリメラーゼ連鎖反応に使用して3'特異的ＤＮＡ配列のコピー を合成した。これらの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応におけるアンチセンス鎖か ら離れた単鎖³²P-標識プローブの生成においてテンプレートとして使用した。Ra c13の完全長ｃＤＮＡ挿入物を、Prime-Itキット(Stratagene)を使用する二本鎖 ランダムプライムドプローブのためのテンプレートとして使用した。 実施例2 綿からのcＤＮＡクローンの単離 4-4クローンに対するcＤＮＡを、上述の綿繊維ライブラリーから単離し、繊維 中では発現するが他の組織中では発現しないことを示した。この配列は、公知の タンパク質のいずれとも関連がない。このクローン中にはわずか400kbのコード 配列しか存在しなかったため、このcＤＮＡを用いてライブラリーを再スクリー ニングし、全長クローンを得た。全長コード配列は図1に示す。 ランダムに選んだcＤＮＡを、BLAST(National Center for Biotechnology Inf ormation service)を介して種々の配列データバンクと比較することにより、#10 5と名付けたクローンが、報告された脂質輸送タンパク質のコード配列と関連す るコード配列をもつことが分かった。 動物Racタンパク質と高い類似性を示したもう1つのクローンの配列を調べた。 Racと名付けたこのクローンには全長が含まれていなかったので、この最初のRac ＤＮＡセグメントをプローブとして用いてライブラリーを再スクリーニングした 。スクリーニングしたおよそ130,000個の一次プラークのうちの56個がスクリー ニングで陽性を示した。このうちの14個のクローンを単離して配列を決定した。 これら14個のクローンのうちの12個がもとのRacクローンと同等の配列類似性を 示し、これらのcＤＮＡクローンのうちの1つは全長cＤＮＡをコードしていた（ これにRac13という名称を付けた）。図4は、綿繊維中で発現されるRac13遺伝子 をコードするcＤＮＡ配列を示している。 他の部分長cＤＮＡクローンのうちの1つ（Rac9と名付けた）は明らかに関連性 があったが、ＤＮＡおよびアミノ酸の配列がRac13とは異なっていた。150,000個 のプラークを再スクリーニングし、36個の陽性のクローンを単離したところ、2 個のクローンだけがRac9配列に対応し（両方とも全長クローン）、残りのクロー ンはRac13に対応した。これらの結果から、綿には少なくとも2つの異なるRacタ ンパク質に対する遺伝子が含まれていることが示唆される。クローン単離の頻度 から判断して、開花21日後(dpa)の綿繊維中では、Rac13は比較的多く発現される が、Rac9の発現は少ない。この21日とは、ライブラリー作製のためにポリA⁺mＲ ＮＡを単離したときの年齢である。 Rac13由来のアミノ酸配列を他の低分子量G-タンパク質のものと比較したとこ ろ、綿Racタンパク質は、エンドウ豆から最近単離されたcＤＮＡクローン由来の Rho1タンパク質配列（Yang and Watson，supra）と非常に関連のあることが分か った。エンドウ豆Rho1に次いで、哺乳類Racタンパク質が綿Racタンパク質と高い 類似性を示す。イーストCDC42およびヒトRhoAなどのrhoサブファミリに属する他 のタンパク質もまた、綿Rac遺伝子と明らかに関連がある。比較を行うと、植物 から単離されたRab/YPTサブファミリに属する他の低分子量G-タンパク質（例え ば、タバコRAB5タンパク質など）およびヒトRasタンパク質は、比較したすべて の低分子量G-タンパク質の中で、綿Racタンパク質との類似性が最も少ない。綿 およびエンドウ豆、のタンパク質ならびに哺乳類Racタンパク質はすべてpIが9を 超えるが、他のrhoおよびrasタンパク質のpIは5.0〜6.5の範囲である。 実施例3 発育中の繊維における綿繊維遺伝子の発現 Rac13遺伝子および4-4遺伝子の発現を、種々の綿組織から、ならびに異なる発 育段階における繊維から調製されたmＲＮＡを用いて評価した。Ltp遺伝子、Rac1 3遺伝子、および4-4遺伝子の非翻訳領域由来のプローブを用いて、ブロットをハ イブリッド化した。Rac13に対する遺伝子は繊維中において発現が大きく促進さ れる。実際に、発育期間を延長した場合でも、葉、根、または花の部分にはmＲ ＮＡが検出されない。種子中でのRac13の発現の検出を行う年齢は、種子から得 られた繊維組織において最大の発現レベルを示した年齢に対応する。繊維中での Rac13の発現パターンは、発育段階に大きく依存する。一次壁合成の段階では発 現が非常に少なく（0〜14dpa；Meinert and Delmer，1977を参照されたい）、二 次壁合成への移行中（約15〜18dpa）に最大に達し、二次壁セルロース合成が最 大となる段階（約24〜28dpa）で減少する。 4-4mＲＮＡは、開花17日後の繊維細胞中でのみ蓄積が開始され、少なくとも開 花35日後まで蓄積が続く。21日後のレベルをピークとして高いレベルが保たれる 。4-4mＲＮＡは、他の綿組織中では検出されず、しかも開花17日後の開始までは 繊維組織中においても検出されない。 #105脂質輸送タンパク質cＤＮＡクローンを、綿組織に対するプローブとして 綿繊維ノーザンに使用した。ノーザンの結果から、綿繊維Ltpが綿繊維中で多く 発現されることが示された。このタンパク質をコードするmＲＮＡは、繊維の発 育期間全体にわたり非常に高レベルで発現される。ノーザンブロットから、この mＲＮＡは5dpaで発現されて徐々に増加し、40dpaでは高レベルで発現されること が示される。 実施例4 ゲノムＤＮＡ 4-4およびRac13の両方に対するcＤＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡを調べた。両 方に対して、全長ゲノムＤＮＡは、Stratagene^TMからλ'2ベクターを利用して作 製されたライブラリーより得た。また、これを利用してCoker130綿（Gossypiumh irsutum cv．coker 130）からゲノムＤＮＡライブラリーを作製したが、この際 、発芽実生苗から得られたＤＮＡを使用した。 3'-特異性Ltpプローブを用いて綿ゲノムライブラリーを調べ、6個のゲノムフ ァージ候補の同定および精製を行った。図7は、Ltpコード領域の5'末端のすぐ近 くにあるおよそ2kbの配列のLtpプロモーター領域を示している。 Ltp mＲＮＡに対する3'-特異性プローブを用いて、綿ゲノムライブラリーの中 から6個のゲノムファージクローンを同定した。これにより、綿のLtp遺伝子のフ ァミリーのうちで綿繊維中で最も多く発現されるLtp遺伝子のプロモーターを選 択した。このLtpプロモーターは、繊維の発育期間全体にわたり活性である。 実施例5 4-4 プロモーター構築物pCGN5606の調製 4-4プロモーター構築物は、第1のタイプ（タイプI）中に4-4綿繊維発現カセッ トを含む（図2）。nt1〜nt65およびnt5,494〜nt5,547の配列は、このカセットの クローニングが行われるpBluescriptIIポリリンカーの断片に対応する。このカ セットの端部に位置するこれらの領域中に存在するユニークな制限酵素部位によ り、pCGN5138シリーズおよびpCGN1547シリーズを含むバイナリーベクター中へ繊 維発現カセットを組入れてクローニングすることが可能となる。 nt57〜nt5,494の配列は、Coker130綿ゲノムライブラリーのλファージクロー ン中に含まれている。このλゲノムクローンは、4-4(6)と記した。 nt65〜nt4,163の領域は、4-4(6)遺伝子の5'末端側領域に対応する。nt4,163に は、4-4(6)ORFの第1コドンに対応するNcoI制限部位配列が存在する。 ヌクレオチド4,163〜ヌクレオチド4,502の配列は、4-4(6)ORFの一部分に対応 する。nt4,502〜nt4,555の配列は、制限酵素EcoRI、SmaI、SalI、NheI、およびB glIIに対するユニークな標的部位を含む合成ポリリンカーオリゴヌクレオチドで ある。nt4,163〜nt4,555のこの断片はスタファー断片であり、所定の位置に残存 させてクローニング操作のモニタリングを容易にする。 このカセットを使用して綿繊維細胞中で発現される遺伝子は、NcoI制限部位と 任意のポリリンカー部位との間でクローン化することができる。この操作により スタファー断片が目的の遺伝子と置き換えられる。nt4,555〜nt5,494の領域は、 先端コドンの下流の940個のヌクレオチドに対応し、4-4(6)遺伝子の3'末端側領 域を構成する。nt5483にはユニークなAscI制限酵素部位が存在する。pCGN5610 pCGN5610構築物は、pCGN5606の修飾型である4-4綿繊維発現カセットの第2のタ イプ(タイプII)である。2つのタイプの4-4綿繊維発現カセットは、1つのバイナ リープラスミド中の2つの繊維カセットの縦列アレイのクローニングができるよ うにデザインされている。pCGN5606との差異は非常に少なく、これについては以 下に説明する。 nt1〜nt65の領域にあるXbaI制限部位は、標準的なクローニング操作により除 去した。ポリリンカー領域は、pCGN5606と逆向きである。nt5484にはユニークな XbaI制限酵素部位が存在する。pCGN5610のnt1〜nt57およびnt5,494〜5,518の配 列は、このカセットのクローニングが行われるpBluescriptIIポリリンカーの断 片に対応する。この領域に存在するユニークな制限酵素部位により、pCGN5138シ リーズおよびpCGN1547シリーズのバイナリーベクター中へ繊維発現カセットを組 入れてクローニングすることが可能となる。 nt57〜nt5,494の配列は、Coker130ゲノムライブラリーのλファージクローン に含まれる。このクローンは、本明細書中ではλゲノムクローン4-4(6)と記され ている。nt57〜nt4,155の領域は、5'側領域に対応する。nt4,155には、4-4ORFの 第1コドンに対応するNcoI制限部位配列が存在する。ヌクレオチド4,156〜ヌクレ オチド4,550の領域は、4-4ORFの一部分に対応する。nt4,156〜nt4,550のこの断 片はスタファー断片であり、所定の位置に残存させてクローニング操作のモニタ リングを容易にする。nt4,500〜nt4,550の配列は、制限酵素BglII、NheI、SalI 、SmaI、およびEcoRIに対するユニークな標的部位を含む合成ポリリンカーオリ ゴヌクレオチドである。 このカセットを使用して綿繊維細胞中で発現される遺伝子は、NcoI制限部位と 任意のポリリンカー部位との間でクローン化することができる。この操作により スタファー断片が目的の遺伝子と置き換えられる。nt4,550〜nt5,494の領域は、 先端コドンの下流の940個のヌクレオチドに対応し、4-4(6)遺伝子の3'側領域を 構成する。 実施例6 Rac13 プロモーター構築物の調製 ゲノムクローン 15-1と名付けたゲノムクローンに対して、制限エンドヌクレアーゼを用いてマ ッピングを行った。Rac13コード領域をもつ最大の断片を同定した。これはpst断 片であった。また、これをBluescript^TMKS+ベクター(BSKS+; Stratagene)中でサ ブクローン化したものをpCGN4722と名付けた。この挿入断片の長さは9.2kbであ った。 Rac13コード配列をもつPst断片の領域を同定した。開始コドンの5'側およそ1. 7kbおよび終止コドンの3'側およそ1.2kbに対して、ＤＮＡ配列を決定した。全Ra cコード領域(エキソンおよびイントロン)は、便利なことにNde1部位が端部に位 置していた。 pCGN4722をXba1で消化させて2.7kb断片を取り出した。再連結を行ってpCGN473 0を得た。次に、これをNde1で消化させて、全Racコード領域を含有する1.7kb断 片を切り出した。再連結を行ってpCGN4731を得た。 オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドを使用して、ポリリンカー領域を形成 した。このオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドは、再合成されたセクション の5'末端および3'末端と類似したプライマーを用いてPCR処理した。得られた生 成物をEcooR1およびHind IIIを用いて消化させ、BSKS+のEcoR1部位およびHind I II部位に連結させた。得られたプラスミドをpCGN4733と名付けた。 Nde1を用いてpCGN4731およびpCGN4633を消化させ、pCGN4733から得られた合成 ポリリンカー領域を含有するNde1断片を4731のNde1部位に結合させてpCGN4734を 得た。この最後のプラスミドをSa1およびXbaを用いて消化させ、また同様にpCGN 5133も消化させた。pCGN5133はBSKS+中の9.2kbのpst断片であったが、操作を容 易にするために、この挿入断片の端部に位置するポリリンカー部位を、異なる部 位に変更した。次に、pCGN4734から得られた断片をpCGN5143の等価な部位に配置 してpCGN4735を得た。 プロモーター構築物pCGN4735のおよそ3kbに対する配列を図5に示す。再合成さ れた配列は、配列の塩基1706および塩基1898の位置にあるNde1部位の間に入る。 従って、図5の配列には、再合成されたポリリンカーの5'末端にあるNde1部位の5 '側のおよそ1.7kbが含まれている。図5には示されていないが、全挿入断片9.2kb に対して、この配列から5'側におよそ2.5kbの配列が存在する。図5の配列にはま た、3'Nde1部位の3'側のおよそ1.1kbが含まれている。Rac13挿入断片中の最も3' 末端側にあるおよそ3kbは図5に示されていない。pCGN4735に対するマップを図6 に示す。 実施例7 色素合成遺伝子 メラニン メラニン合成に対する遺伝子を発現する植物形質転換のためのバイナリー構築 物を次のように調製した。メラニン遺伝子は、最初に、普通の土壌細菌Streptom yces antibioticus（Bernan et al．（1985）34:101-110）から単離した。メラ ニン産生には、二遺伝子系が関与する。第1の遺伝子tyrAは、一次基質であるア ミ ノ酸チロシンの重合に関与する触媒ユニットをコードし、チロシナーゼと呼ばれ る。第2の遺伝子ORF438は、銅を結合するとともに銅をチロシナーゼまで送達し て酵素を活性化することに関与する。ORF438遺伝子およびtyrA遺伝子を発現させ ると、チロシナーゼの活性が最大になることが確認される。 ORF438およびtyrAの両方に対する遺伝子を完全に再合成した（それらのＤＮＡ 配列に関して）。この再合成を行ったのは、Streptomycesから単離される最初の ＤＮＡ配列中のグアニンおよびシトシン(G+C)ＤＮＡの含有量が非常に高いから である。従って、再合成されたORF438遺伝子およびtyrA遺伝子は、対応するアミ ノ酸をコードする植物優先コドンに関して、より「植物に類似」したものとなる （G+C含有量が減少）。インジゴ インジゴ産生には、一次基質であるアミノ酸トリプトファンからインドールへ の転化（インドールは次にインドキシルに転化される）が含まれる。インドキシ ル分子は、酸素の存在下で自然にインジゴへ転化される。二遺伝子系を使用して 繊維細胞中でインジゴの産生を行った。第１の遺伝子(tna)は細菌E．coliから得 たものであるが、この遺伝子はトリプトファナーゼ酵素をコードする。tnaとい う表記は、E．coliから得られたトリプトファナーゼ（トリプトファンをインド ールへ転化する酵素）をコードする遺伝子を表している（Stewart et al.，（19 86）J Bacteriol 166:217-233）。 pigという表記は、Rhodococcusから得られたインジゴ産生用タンパク質に対す るコード配列を表すために使用するが、これによりインドールからのインジゴの 産生が行われる（Hart et al.，（1990）J Gen Microbiol 136:1357-1363）。tn aおよびpigはいずれもPCRにより調製した。トリプトファナーゼはトリプトファ ンをインドールに転化する働きをし、一方、第2の遺伝子(pig)はインドールをイ ンドキシルに転化する働きをするインドールオキシゲナーゼ酵素をコードする。 これらの細菌性遺伝子はいずれも、それらの天然の形態で利用した。 実施例8 標的色素合成遺伝子の構築物 色素体標的のために、この構築物には、成熟タンパク質(Tssu)のトランジット ペプチドおよび12個のアミノ酸をコードするタバコリブロースビスホスフェート カルボキシラーゼ低分子量サブユニット遺伝子の断片が含まれ、適切なコード配 列をもつ読み枠中に配置されている。 メラニン合成遺伝子の液胞標的のために、この構築物には、該当タンパク質に 含まれる全部で32個のアミノ酸のN末端シグナルペプチドと成熟タンパク質(CPI+ 6)の6個のアミノ酸とをコードするメタロカルボキシペプチダーゼ抑制遺伝子の 断片が含まれ（Martineau et al.，supra）、適切なコード配列をもつ読み枠中 に配置されている。 シグナルペプチドの他に、液胞局在化シグナル(VLS)をコードする配列がタン パク質コード配列の3'末端に挿入されている。 色素化合物の生合成に関与する細菌性遺伝子に対するコード配列と、コードさ れたタンパク質を色素体または液胞へ誘導輸送するための配列と、を含む構築物 は、次のように調製する。メラニン 再合成されたORF438遺伝子およびtyrA遺伝子を2つの異なる方法で処理した。 どちらの方法を使用するかは、繊維細胞中のどの区画に最終タンパク質生成物を 局在化させるかに依存する。1つのキメラ遺伝子／植物バイナリー構築物（pCGN5 148と記す）には、繊維細胞の色素体を標的とする遺伝子を含有させた。このた めに、カルボキシラーゼの低分子量サブユニット(SSU)に対する遺伝子の12個の アミノ酸、および在来の54個のアミノ酸のSSUトランジットペプチドを、それぞ れORF438遺伝子産物およびtyrA遺伝子産物の両方のアミノ末端に融合させた。こ れらのペプチド配列によって、ORF438遺伝子産物およびtyrA遺伝子産物（タンパ ク質）は色素体に対する標的化が効率的に行われる。こうした標的化を開始させ たのは、色素体が繊維細胞内のチロシン産生場所だからである。 第2のキメラ遺伝子／植物バイナリー構築物（pCGN5149と記す）には、繊維細 胞内の液胞を標的とするORF438遺伝子およびtyrA遺伝子を含有させた。他の生体 系からの情報に基づいて、繊維細胞の液胞には、メラニン重合のために高濃度の チロシンが含まれている可能性があると考えた。ORF438遺伝子およびtyrA遺伝子 にはいずれも、アミノ末端遺伝子融合用として、トマトカルボキシペプチダーゼ 抑制(CPI)タンパク質から得られた28個のアミノ酸のシグナルペプチドが含まれ ており、これによりこれらのタンパク質が繊維細胞の小胞体(ER)分泌系へ誘導さ れる。 この他、tyrA遺伝子では、CPIから得られた8個のアミノ酸の液胞標的化ペプチ ド(VTP)がカルボキシ末端に融合されており、この結果、成熟銅活性化チロシナ ーゼは実際に繊維細胞の液胞を標的とするようになる。また、ORF438タンパク質 およびtyrAタンパク質はいずれも、それぞれORF438遺伝子およびtyrA遺伝子の位 置指定突然変異誘発を介して、グリコシル化を起こす可能性のある部位を取り除 いた。繊維細胞中でこれらのタンパク質が発現されて、その植物細胞グリコシル 化が起こると、チロシナーゼが不活性化される恐れがある。従って、グリコシル 化を起こす可能性のある部位を取り除くことが必要であると考えた。インジゴ インジゴ遺伝子に対する唯一の修飾は、タバコSSUトランジットペプチドをコ ードするＤＮＡ配列を、tna遺伝子およびpig遺伝子の両方のアミノ末端領域に融 合させたことであった。これによりトリプトファナーゼタンパク質およびインド ールオキシナーゼタンパク質がいずれも、繊維細胞の色素体を標的とするように なる。この融合は、構築物5148においてメラニン産生用色素体指向性タンパク質 に対して行ったものと同一の正確な遺伝子融合である。tna遺伝子産物およびpig 遺伝子産物が繊維細胞の色素体を標的とするように処理したのは、色素体がトリ プトファン合成の一時的な場所だからである。 実施例9 発現構築物 メラニン 色素体および液胞を標的とするORF438タンパク質およびチロシナーゼタンパク 質の両方に対する修飾遺伝子を繊維発現カセット中に配置して、綿繊維細胞の発 育中に「スイッチ」が入るようにした。メラニン構築物に利用した「スイッチ」 （プロモーター）は4-4であった。修飾されたORF438遺伝子およびtyrA遺伝子を4 -4プロモーターカセット中へ組入れてクローニングし、次に、これらのキメラ遺 伝子をバイナリープラスミド中へ挿入して、色素体および液胞を標的とするORF4 38タンパク質およびチロシナーゼタンパク質をそれぞれ含有するプラスミドpCGN 5148およびpCGN5149を作製した。これらのバイナリープラスミドにはまた、E．c oliおよびAgrobacterium中でこれらの安定性が保たれるようにするための遺伝子 的決定基が含まれているとともに、細菌性カナマイシン耐性遺伝子の植物細胞発 現のためのキメラ遺伝子も含まれている。このカナマイシン耐性マーカーにより 、このバイナリープラスミドを含有するAgrobacteriumを植物胚軸セグメントま たは葉セグメントに感染させたとき、形質転換されていない綿細胞に対して形質 転換された綿細胞を選択することが可能になる。 液胞標的化配列を有するプラスミドpCGN5149のブロック図が図8に示されてい る。プラスミドpCGN5148（図示せず）は、5149と同じと考えられる。ただし、プ ラスミドpCGN5148は色素体標的化配列を有する。インジゴ メラニン遺伝子の場合と同じように、色素体指向性のtna遺伝子およびpig遺伝 子を繊維特異性4-4プロモーターカセット中に配置し、これらのキメラ遺伝子を バイナリープラスミド中に連続的に挿入してプラスミドpCGN5616を作製した。プ ラスミドpCGN5616のブロック図は図8に示されている。アンシアニン トウモロコシのR遺伝子およびCI遺伝子を発育中の綿繊維中で発現させるため の構築物を作製した。これらの遺伝子は、アントシアニン色素の産生に関与する ことが知られている。この産生において、これらの遺伝子は調節的に作用してア ントシアニン（スペクトル色は赤色）産生のカルコン経路を作動させる。R遺伝 子およびCI遺伝子は、Rac13プロモーターカセットの制御下に配置した。pCGN474 5と名付けたバイナリープラスミド（図示せず）には、いずれもRac13プロモータ ーの制御下にあるR遺伝子およびCI遺伝が両方とも含まれている。 実施例10 綿形質転換 外植片作製 50% Clorox(2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液)中に20分間入れ、無菌蒸留水で3 回洗浄することによって、Coker315種子の表面を消毒する。表面を消毒した後、 1/2×MS塩：1/2×ビタミンB5：1.5%グルコース：0.3%ゲルライト(gelrite)が25m l入った25×150無菌管中で発芽させる。暗所において28℃で7日間にわたり芽生 えを発芽させる。７日目に芽生えを28±2℃の明所に置く。共生培養および植物再生 バイナリープラスミドpCGN2917およびpCGN2926を含有するA．tumefaciens株27 60の単一コロニーを5mlのMG/Lブロスへ移して、30℃で一晩増殖させる。細菌培 養株をMG/Lで1×10⁸細胞/mlに希釈してから共生培養する。8日目の芽生えから胚 軸を切除し、0.5-0.7cmのセクションに切断し、タバコフィーダープレート上に 置いた（Horsch et al．1985）。フィーダープレートは、抗生物質を含まないカ ルス開始培地CIM（MS塩：ビタミンB5：3%グルコース：0.1mg/L 2,4-D：0.1mg/L カイネチン：0.3%ゲルライト；pHを5.8に調節してからオートクレーブにかけた ）を含有するペトリプレート上でタバコ培養懸濁液1.0mlを平板培養することに よって、使用1日前にフィーダープレートを作製する。無菌円形濾紙(Whatman#1) を支持細胞の上に配置してから使用した。すべてのセクションを作製した後、各 セクションをA．tumefaciens培養株に浸漬し、無菌ペーパータオルで拭いてタバ コフィーダープレートに戻した。 フィーダープレート上で2日間共生培養した後、75mg/Lのカナマイシンおよび5 00mg/Lのカルベニシリンを含有するカルス開始培地上に胚軸セクションを置く。 28±2℃、30uE 16:8 明所時間：暗所時間、4週間の条件で組織をインキュベート した。4週間目に、外植片全体を抗生物質を含む新しいカルス開始培地へ移した 。 この2度目の培地に移してから2週間後に、外植片からカルスを取り出して、カル ス開始培地に残すものと再生培地(MS塩：40mM KNO₃：10mM NH₄Cl：ビタミンB5： 3%グルコース：0.3%ゲルライト：400mg/L カルブ(carb)：75mg/Lカナマイシン) に移すものとに分けた。 開始2〜6ヶ月後に胚カルスを同定し、新しい再生培地上で継代培養した。発芽 させる胚を選択し、静置液体胚パルス培地（Stewart‐Hsu培地：0.01mg/l NAA： 0.01mg/Lカイネチン：0.2mg/L GA3）に入れて、30℃で一晩インキュベートする 。胚をペーパータオルで拭いて、ゲルライトで固化させたStewart‐Hsu培地40ml を含有するMagentaボックスに入れる。発芽中の胚を、28±2℃、50 uE m^-2s^-116 :8 明所時間の条件で保存する。発根した植物体を土壌に移し、温室に定着させ る。 栽培室中の綿栽培条件は次の通りである：明所時間16時間、温度約80°〜85° 、光の強度約500μアインシュタイン。温室中の綿栽培条件は次の通りである： 明所時間14〜16時間（ただし、光の強度は少なくとも400μアインシュタイン） 、昼間温度90Ｆ〜95Ｆ、夜間温度70F〜75F、相対湿度約80%。植物分析 温室中で開花時に、温室栽培T1植物から得られた花にタグ付けする。種々の発 育段階のこれらの植物から、スクェア（綿花の蕾）、花、ボールなどを収穫し、 酵素活性を調べる。上述のMartineauらに付与された同時係属出願に記載されて いるように、手で裁断したセクションに対して、GUS蛍光アッセイおよび組織化 学アッセイを行う。繊維の色の特性を調べるために、目視検査を行うか、または 必要な場合には、ノーザン分析もしくはウェスタン分析を行うことができる。 実施例11 形質転換色素合成遺伝子の発現 メラニン 葉のアッセイおよび対応するウェスタン分析でカナマイシン選択性マーカーに 耐性を示した植物は、形質転換されたものとみなした。繊維のいろいろな発育段 階で、形質転換された繊維を個々の植物形質転換体から採集し、2つの方法で分 析した。一方は、形質転換された各綿植物に対して単一の発育時点で繊維を分析 し、形質転換イベント間でチロシナーゼ発現を比較する方法であった。他方は、 所定の植物から発育中の繊維をスクリーニングし、精製チロシナーゼタンパク質 に対して調製された抗血清を使用するウェスタンブロットにより、繊維特異性4- 4プロモーターの制御下でチロシナーゼ発現のタイミングを分析する方法であっ た。 色素体標的化構築物pCGN5148に対してスクリーニングした13個のイベントのう ちの9個が陽性であり、一方、スクリーニングした16個の形質転換された液胞標 的化構築物pCGN5149イベントのうちの13個が陽性であった。チロシナーゼ陽性植 物の繊維中での発現レベルは、およそ0.1%〜0.5%繊維細胞タンパク質である。こ のＤＮＡ、すなわち、色構築物ＤＮＡを含む綿繊維細胞が色素の合成に必要なタ ンパク質を産生することは明らかである。 視覚的には、チロシナーゼ陽性イベントから得られたリントはいろいろな濃度 の色を呈するが、この酵素を発現しない植物はまったく色を示さない。対照Coke r130植物およびpCGN5148で形質転換された種々のイベントから得られた植物より 採取した綿繊維を比色計で測定した結果を、それぞれ表9および表10に示す。 pCGN5148(色素体指向性)植物から得られた繊維は、青緑色の表現型を示す。１ 個のイベント5148-50-2-1には、L^*a^*b^*カラースペースで測定した場合のa*値が- 8.0未満の負の値を有する着色した綿繊維細胞(リンター)が含まれていた。Coker 130綿繊維細胞は、典型的には負のa^*値を示さない。 これらの着色した綿細胞はまた、135°を超える比較的大きい色相角度値hをも つL*C*hカラースペース上に位置する色を有していた。普通のCoker130繊維は、 この方法で測定した場合、類似の値を有するが約90°を超えることはない。 pCGN5149で形質転換した植物から採取した綿繊維を比色計で測定した結果を図 11に示す。構築物pCGN5149(液胞標的化)から得られたチロシナーゼを発現する植 物の繊維は、淡褐色の表現型を有する傾向がある。インジゴ 葉のアッセイおよびウェスタン分析によるカナマイシン選択性マーカーに対す る耐性を、pCGN5616により形質転換された植物の選別の判定基準として再び利用 した。繊維のいろいろな発育段階で、形質転換された繊維を個々の植物形質転換 体から採集した。形質転換された発育中の繊維を所定の植物からスクリーニング し、繊維特異性4-4プロモーターの制御下でtna遺伝子およびpig遺伝子の発現の タイミングを分析する。また形質転換された各綿植物に対して単一の発育時点で 繊維を分析し、トリプトファナーゼタンパク質およびインドールオキシゲナーゼ タンパク質に対して調製された抗血清を使用するウェスタンブロットにより、形 質転換イベント間でトリプトファナーゼおよびインドールオキシゲナーゼの発現 を比較する。 インジゴイベントに対してスクリーニングした24個の植物のうち15個が、トリ プトファナーゼ酵素およびインドールオキシゲナーゼ酵素の発現に対して陽性で あった。繊維中でのこれらのタンパク質の発現レベルは、0.05%〜0.5%繊維細胞 タンパク質である。これらの形質転換体のうちのおよひ半分が繊維中で両方の遺 伝子を発現し、その結果、非常に薄い明青色の表現型が得られる。視覚的には、 これらの陽性イベントのほとんどで、特に、開いていないボール中の20dpa〜30d paの繊維で、薄い青色が生じる。pCGN5616で形質転換された植物の種々のイベン トから採取した綿繊維を比色計で測定した結果を、表12に示す。これらのイベン トの多くは、L*a*b*カラースペースで測定した場合、a*値は比較的小さく(2未満 )、b*値は大きい(10を超える)。同様に、いくつかの5149イベントもまた、a*の 測定値が2未満で、しかもb^*値は10を超える値が保たれた。BC 綿 4つの別々のBC綿系統から得られた天然の着色繊維に対する比色計による測定 値を図13に示す。 上記の結果は、色素合成遺伝子を発現させることによって、形質転換された綿 繊維細胞の色の表現型を変えることができることを示唆する。形質転換された綿 繊維細胞には、色素合成タンパク質およびこの色素合成タンパク質により産生さ れた色素が含まれている。図9〜図13の結果から分かるように、目的の色素遺伝 子を発現させると、次のような綿繊維細胞を得ることができる。すなわち、適切 な標的化配列と組み合わされて色素が合成され、その結果、所定の植物組織中で の色の表現型が変わる綿繊維細胞が得られる。こうして遺伝子操作された構築物 から発現によって着色綿繊維が得られる。 本明細書中で引用したすべての出版物および特許出願は、引用により本明細書 中に含まれるものとし、しかも引用により個々の出版物および特許出願がそれぞ れ具体的かつ独立に含まれるものとする。 明確化および理解を目的として解説および実施例により上述の発明をいくらか 詳細に記述してきたが、添付の請求の範囲から逸脱することなしに所定の変更お よび修正を加えることができることは当業者には自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペアー，ジュリー アール. アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア 州 デイヴィス，ダグラス アヴェニュー 818 (72)発明者 ペレズ−グラウ，ルイス アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア 州 デイヴィス，エルク プレイス 1230

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．綿繊維転写因子と、目的のタンパク質をコードするオープンリーディング フレームとを、転写方向に機能的に連結された成分として含有するＤＮＡ構築物 であって、該転写因子は、Ltp、4-4、およびracプロモーター配列から成る群よ り選ばれる前記ＤＮＡ構築物。 ２．植物核コード化遺伝子から得られた輸送シグナルコード配列を更に含む請 求項１に記載のＤＮＡ構築物。 ３．前記輸送シグナルコード配列が色素体トランジットペプチドを含む請求項 ２に記載のＤＮＡ構築物。 ４．前記輸送シグナルコード配列が、粗面小胞体を横切る輸送を可能にするシ グナルペプチドをコードする請求項１に記載のＤＮＡ構築物。 ５．前記配列が前記オープンリーディングフレームの3'側に液胞局在化シグナ ルを更に含む請求項４に記載のＤＮＡ構築物。 ６．前記色素がメラニンまたはインジゴである請求項１に記載のＤＮＡ構築物 。 ７．前記オープンリーディングフレームが細菌性遺伝子から得られる請求項６ に記載のＤＮＡ構築物。 ８．前記細菌性遺伝子が、ORF438、tyrA、アントシアニンR遺伝子、アントシ アニンCl遺伝子、pig、およびtnaから成る群より選ばれる請求項７に記載のＤＮ Ａ構築物。 ９．請求項１のＤＮＡ構築物を含んでなる植物細胞。 １０．請求項９に記載の綿植物細胞。 １１．請求項１０に記載の綿繊維細胞。 １２．請求項９〜１１のいずれか１つの細胞を含んでなる植物。 １３．綿植物中で繊維表現型を変える方法であって、該方法は、 色素生合成経路中のタンパク質を発現させるための構築物を含んでなるＤＮＡ を用いて植物細胞を形質転換し、ここで該構築物は、機能的に連結された成分と して、 該綿植物の細胞中で機能する転写開始領域と、 目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、 該綿植物の細胞中で機能する転写終止領域と、 を含み、さらに該植物細胞は該タンパク質の基質を含むものであり、 該植物細胞を成長させて綿植物を得ることを含んでなり、ただし、該タンパク 質は該基質と反応して該色素を生成するものである前記方法。 １４．前記構築物が、植物核コード化遺伝子から得られた輸送シグナルコード 配列を更に含む請求項１３に記載の方法。 １５．前記輸送シグナルコード配列が、粗面小胞体を横切る輸送を可能にする シグナルペプチドをコードする請求項１３に記載の方法。 １６．前記ＤＮＡが色素生合成経路中の2つのタンパク質を発現する構築物を 含み、該構築物の各々が成分i)〜iv)を含み、更にこの2つのタンパク質が同じ遺 伝子によりコードされない請求項１３の方法。 １７．前記色素がメラニンであり、かつ前記タンパク質がtyrAおよびORF438に よりコードされる請求項１６の方法。 １８．前記色素がインジゴであり、かつ前記タンパク質がtnaおよびpigにより コードされる請求項１６の方法。 １９．前記色素がアントシアニンであり、かつ前記構築物がアントシアニンR 調節遺伝子およびアントシアニンCl調節遺伝子を含む請求項１６の方法。 ２０．前記植物細胞が綿繊維細胞であり、かつ前記転写領域が繊維組織転写開 始領域である請求項１３の方法。 ２１．前記転写領域が、Ltpプロモーター配列、4-4プロモーター配列、および racプロモーター配列から成る群より選ばれる請求項２０の方法。 ２２．図2に示される綿組織転写配列を含んでなる組換えＤＮＡ構築物。 ２３．図5に示される綿組織転写配列を含んでなる組換えＤＮＡ構築物。 ２４．図1の配列をコードする単離されたＤＮＡ。 ２５．図4の配列をコードする単離されたＤＮＡ。 ２６．目的とする前記タンパク質が植物ホルモンの合成に関与する請求項１３ の方法。 ２７．綿脂質輸送タンパク質をコードする図7の配列を含んでなる単離された ＤＮＡ。 ２８．転写方向に機能的に結合された成分として、綿繊維転写因子と、色素の 合成に必要なタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、を含有 するＤＮＡ配列を含んでなる綿繊維細胞。 ２９．前記色素合成タンパク質によって産生された色素を含んでなる請求項２ ７に記載の綿繊維細胞。 ３０．前記ＤＮＡ配列が、植物核コード化遺伝子から得られた輸送シグナルコ ード配列を更に含む請求項２７に記載の綿繊維細胞。 ３１．前記輸送シグナルコード配列が色素体トランジットペプチドである請求 項２９に記載の綿繊維細胞。 ３２．前記輸送シグナルコード配列が、粗面小胞体を横切る輸送を可能にする シグナルペプチドをコードする請求項２９に記載の綿繊維細胞。 ３３．前記配列が前記オープンリーディングフレームの3'側に液胞局在化シグ ナルを更に含む請求項３１に記載の綿繊維細胞。 ３４．前記転写因子が、綿繊維脂質輸送プロモーター配列、4-4プロモーター 配列、およびracプロモーター配列から成る群より選ばれる請求項２７に記載の 綿繊維細胞。 ３５．前記色素がメラニンまたはインジゴである請求項２７に記載の綿繊維細 胞。 ３６．前記オープンリーディングフレームが細菌性遺伝子から得られる請求項 ２７に記載の綿繊維細胞。 ３７．前記細菌性遺伝子が、ORF438、tyrA、アントシアニンR遺伝子、アント シアニンCl遺伝子、pig、およびtnaから成る群より選ばれる請求項３５に記載の 綿繊維細胞。 ３８．メラニンを含んでなる綿繊維細胞。 ３９．インジゴを含んでなる綿繊維細胞。 ４０．遺伝子工学的手法により着色され、かつL^*a^*b^*カラースペースで測定し たとき、-1.0未満の負のa^*値を有する綿繊維細胞。 ４１．前記負のa^*値が-5.0未満である請求項４０に記載の綿繊維細胞。 ４２．前記負のa^*値が-8.0未満である請求項４０に記載の綿繊維細胞。 ４３．遺伝子工学的手法により着色され、かつL^*a^*b^*カラースペースで測定し たとき、２未満のa^*値と10を超えるb^*値とを有する綿繊維細胞。 ４４．遺伝子工学的手法により着色され、かつL^*C^*hカラースペースで測定し たとき、100°を超える色相角度値hを有する綿繊維細胞。 ４５．前記h値が135°を超える請求項４３に記載の綿繊維細胞。