JP2019024497A - 形質転換用ベクターおよび形質転換体ならびに形質転換体由来製品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現する少なくとも1以上のプロモータと、該プロモータからの転写を活性化する少なくとも1つのトランス活性化因子を含む、ベクター。該ベクターを形質転換したアグロバクテリウムを用いて形質転換された細胞、組織、カルス、形質転換植物、および/またはその種子。
【選択図】図2
Description
ワタの形質転換方法については、1980年代には開発されていたが(特許文献1、2)、多色化については、まだ成功していない。
そこで、ワタ繊維を発色させることに適したベクターおよび/または形質転換方法の開発が求められていた。
(1)ワタの種子表面および/もしくはワタ繊維特異的に発現する少なくとも1以上のプロモータを含む、ベクター、または、ワタ繊維特異的に発現する少なくとも1以上のプロモータと、該プロモータからの転写を活性化する少なくとも1つのトランス活性化因子遺伝子を含む、ベクター。
(2)前記ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現するプロモータが、
(i)RDL1および/またはEXPAプロモータ
(ii)GhRDL1またはGhEXPAプロモータとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現するプロモータ
(iii)GhRDL1またはGhEXPAプロモータと70%以上の相同性を有し、ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現するプロモータ
のいずれかである、(1)のベクター。
(3)前記トランス活性化因子遺伝子が、
(i)GhHOX3タンパク質をコードするDNA
(ii)GhHOX3タンパク質と60%以上のアミノ酸同一性を有し、GhHOX3タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(iii)(i)のDNAと70%以上の相同性を有し、GhHOX3タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(iv)(i)のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、GhHOX3タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
のいずれかである、(1)または(2)のベクター。
(4)さらに、機能するように連結された、色素生合成遺伝子群の発現を促進する転写因子遺伝子および/または色素生合成遺伝子を少なくとも1つ含む、(1)〜(3)のいずれかのベクター。
(5)前記色素生合成遺伝子群の発現を促進する転写因子が、
(i)Atpap1タンパク質をコードするDNA
(ii)Atpap1タンパク質と60%以上のアミノ酸同一性を有し、Atpap1タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(iii)(i)のDNAと70%以上の相同性を有し、Atpap1タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(iv)(i)のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、Atpap1タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
のいずれかである、(4)のベクター。
(6)配列番号1〜3のいずれかの配列を有するベクター。より好ましくは、配列番号1〜3のいずれかの配列からなるベクターである。
(7)T−DNAの境界領域を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載のベクター。
(8)(7)に記載のベクターを形質転換したアグロバクテリウム。
(9)(8)に記載のアグロバクテリウムを用いて形質転換された、組織、カルス、形質転換植物、および/またはその種子。
(10)(9)に記載の形質転換植物またはその種子由来のクローン植物、後代植物および/またはそれらの種子。
(11)前記形質転換された細胞、組織、カルス、形質転換植物および/またはその種子、ならびに、クローン植物、後代植物およびそれらの種子が、ワタ由来である、(9)または(10)の細胞、組織、カルス、形質転換植物、および/またはその種子ならびに、クローン植物、後代植物およびそれらの種子。
(12)(4)、(6)もしくは(7)に記載のベクター、および/または、(7)に記載のアグロバクテリウムを用いて形質転換されたワタ細胞、組織、カルス、形質転換植物および/またはその種子、ならびに、クローン植物、後代植物およびそれらの種子を生産する方法。
(13)(11)又は(12)記載の前記形質転換植物体から得られた綿繊維、生地、または衣類。
(14)外来花色関連遺伝子を含む、綿繊維、生地、または衣類。
また、形質転換体から胚を誘導し、人工種子を作成してもよい。
pRI-GhRDL1p-Atpap1/35Sp-GhHOX3(図2、配列番号1)
pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3(図3、配列番号2)
pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3(図4、配列番号3)
用いたプライマー配列を以下に示す。
プライマー配列:
Atpap1 U-XbaI:CCAGTGTCTAGACTATCTTTGTTCCATGGAGGG(配列番号4)
Atpap1 L-SacI:CCAGTGGAGCTCCACAAACGCAAACAAATGTTC(配列番号5)
GhRDL1p U-HindIII:CCAGTGAAGCTTAATTAGTTATGTTTGGTAAAT(配列番号6)
GhRDL1p L-XbaI:CCAGTGTCTAGACTAGAACAGGAGTGACTAATT(配列番号7)
GhEXPAp U-HindIII:CCAGTGAAGCTTTTTAAGCAAAAAATTAATAGT(配列番号8)
GhEXPAp L-XbaI:CCAGTGTCTAGATTGAGTAAGAGCTAGCTAGCT(配列番号9)
GhHOX3 U-XbaI:CCAGTGTCTAGAATGGATTGCGGAAGCGGCGGC(配列番号10)
GhHOX L-SacI:CCAGTGGAGCTCTCAAGAACTAGGACAATTCAA(配列番号11)
hspT L-PstI:ACTACTCTGCAGAATTCCTTATCTTTAATCATA(配列番号12)
GhRDL1p U-SphI:CCAGTGGCATGCAATTAGTTATGTTTGGTAAAT(配列番号13)
プロモータ領域の塩基配列:
GhRDL1プロモータ領域および(配列番号14)、GhEXPAプロモータ領域(配列番号15)の塩基配列およびシス因子を図5および図6に示す。
また、Atapa1(accession No.AK221639)およびGhHOX3(accession No.KJ595847)のタンパク質をコードする領域の塩基配列を配列番号16および17に示す。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のcDNAより、Atpap1遺伝子(787bp、 アントシアニン生合成転写因子)を、プライマーAtpap1 U-XbaIおよびAtpap1 L-SacIを用いてPCR法により増幅した。ワタ(Gossypium hirsutum)ゲノムDNAより、ワタ繊維特異的プロモータ配列のGhRDL1p(302bp)およびGhEXPAp(2000bp)、ワタ繊維特異的転写因子のGhHOX3遺伝子(2142bp)を、以下のプライマーを用いPCR法により増幅した。GhRDL1p U-HindIIIおよびGhRDL1p L-XbaI、GhEXPAp U-HindIIIおよびGhEXPAp L-XbaI、GhHOX3 U-XbaIおよびGhHOX L-SacI。
以下のPCRプライマー、GhRDL1p U-HindIIIおよびhspT L-PstI、GhEXPAp U-HindIIIおよびhspT L-PstIを用い、pRI-GhRDL1p-Atpap1からHindIII-[pRI-GhRDL1p-Atpap1]-PstI断片を、pRI-GhEXPAp-Atpap1からHindIII-[GhEXPAp-Atpap1]-PstI断片を増幅した。それぞれのインサート断片を、制限酵素HindIIIおよびPstIで切断したpRI-35Sp-GhHOX3ベクターに挿入し、pRI-GhRDL1p-Atpap1/pp-GhHOX3およびpRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3を作成した。
以下のPCRプライマー、GhRDL1p U-SphIおよびhspT L-PstIを用い、pRI-GhRDL1p-Atpap1からSphI -[pRI-GhRDL1p-Atpap1]-PstI断片を増幅した。この断片をインサートとして、制限酵素SphIおよびPstIで切断したpRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3ベクターに挿入し、pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3を作成した。
50 μLのディスアーム型Tiプラスミドを持つアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)EHA105またはLBA4404と、プラスミド溶液 2 μLをキュベット内で混合し、ジーンパルサーGENEPULSER II(BIORAD)を用い、2.5KV、125μFDおよび200Ωの条件でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後のアグロバクテリウム菌液を1.5 mlチューブ内の500 μLのSOC液体培地に移し、28℃で1時間培養した。この培養液を、カナマイシン30 ppmに調整したYEP培地プレート上にコンラージ棒を用いて塗り広げた。プレートをパラフィルムでシールし、28℃で一晩インキュベートし、翌日コロニーの形成を確認した。バイナリープラスミドの導入確認は、コロニーPCR法により目的遺伝子配列を増幅することにより行った。
接種材料の準備:
ワタ(Gossypium hirsutum)種子を1.5mlエッペンドルフチューブに入れ80%エタノールに30秒間浸漬し表面殺菌を行い、エタノールを捨て蒸発させた後、tween 20を少量添加した有効塩素濃度1%のアンチホルミンを加え、転倒混和させながら10 分間殺菌を行った。クリーンベンチ内でアンチホルミンを除き、滅菌水で10回洗浄した。滅菌した種子をMS培地に播種し培養した。培養条件は90 mm ×20 mm 滅菌シャーレを用い、25℃、暗黒下で培養した。
グリセロールストックにより凍結保存していた、各ベクターが導入されたアグロバクテリウムを解凍後、カナマイシン30ppm添加YEP培地10mLに加え、28℃で24時間振とうし、選抜および増殖を行った。その後3000rpmで10分間遠心し、上澄みを取り除いた。沈殿した菌体に10ppmアセトシリンゴンを添加したYEP培地10mLを加え再懸濁し、アグロバクテリウム懸濁液を作成した。
無菌播種した種子を25℃無菌播種後暗黒下で3日目培養した実生の胚軸を準備した。クリーンベンチ内にて、濾紙を敷いた滅菌シャーレ90mm×20mmに実生を置き、そこに作成したアグロバクテリウム懸濁液を流し入れた。実生の胚軸をアグロバクテリウム懸濁液に浸した状態で2〜3mmに切断し、アグロバクテリウムを接種した。その後、胚軸に付着した余分なアグロバクテリウム懸濁液を濾紙で吸い取り、共存培養用培地(1)に置床し培養した。培養条件はシャーレを用い25℃暗黒下とし、3日間培養を行った。
共存培養後、胚軸を滅菌水で3回すすぎ、アグロバクテリウムの除菌と形質転換体の選抜のため、胚軸をカルス誘導選抜培地(2)に移植した。継代は5〜7日ごとに行った。誘導されたカルスが十分肥大したところ(接種2か月以降)で、カルスを不定芽誘導選抜培地(3)へと移植した。カルスから発生した約1〜2cmの不定芽をカルスから切り取り、発根を促すために不定根誘導培地(4)に移植した。不定芽が十分に伸長するまで25℃連続照明下にて培養した。カルス誘導から不定芽発生に至るまでの過程での培養条件は、すべて滅菌シャーレ90mm×20mmを用い、25℃連続照明下とした。不定根誘導培地のみプラントボックス(72×72×100mm)で培養を行った。
十分に不定根が伸長した個体は培地から取り出し、根を流水で洗浄した後に、滅菌した園芸植物用土壌を用いて直径90mmポットへ移植した。湿度を保つため、ビニールの袋で被覆し、25℃の人工気象室(14h/10h日長)で育成した。その後、ビニールの袋を徐々に取り除き、順化を行った。
得られた植物体の葉からDNAを抽出し、PCR法によりカナマイシン耐性遺伝子(nptII遺伝子)の一部を増幅することにより、形質転換の確認を行なった。
(2)カルス誘導選抜培地:MS培地+0.1ppm NAA +0.1ppm BAP+75ppm カナマイシン+10ppmメロペン(Meropenem Hydrate)
(3)不定芽誘導選抜培地:MS培地+1ppm GA3(Gibberellin)+75ppm カナマイシン+10ppmメロペン
(4)不定根誘導培地:1/2 MS培地+0.3ppm IBA(indole-3-acetic acid)+10ppmメロペン
pRI-35Sp-Atpap1の作成
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のcDNAより、Atpap1遺伝子(787bp、アントシアニン生合成転写因子)を、プライマーAtpap1 U-XbaIおよびAtpap1 L-SacIを用いてPCR法により増幅した。制限酵素XbaIおよびSacIでGUS遺伝子を除去したpRI201-AN-GUS(TaKaRa)ベクターに、インサート配列のXbaI-Atpap1-SacI断片を挿入しpRI-35Sp-Atpap1を作成した(図7)。
目的遺伝子の導入と一過性発現の確認には、パーティクルガン式遺伝子導入装置(PDS-1000/He、 Bio-Rad)を用いた。
12mgの金粒子(直径1 μm)をはかりとり、200 μLの100%エタノールを加え、5分間ボルテックスした。約5分間室温で静置した後、5000 rpmで遠心した。上清を捨て、250 μLの75%エタノールを加え、指で強く弾きよく混合し、3分ボルテックスをした後、約5分静置し、5000 rpmで遠心し、上清を捨てた。その後、300 μLの滅菌水を加え、指で強く弾きよく混合し1分間ボルテックス、静置1分、5000 rpmで遠心して上清を捨てるという工程を3回繰り返した。50%グリセロールを200 μL加えてボルテックスし混合した。
各種プラスミドはあらかじめ1 μg/μLに調製しておき、1.5 mLのチューブにプラスミドを5 μg入れ、上記により調整した60 mg/mL金属粒子を50 μL加え、ピペッティングで混合した。ふたを開けたままボルテックスし、よく混合していることを確認してから2.5M CaCl2を50 μL、さらに素早く0.1M スペルミジンを10 μL加え、ふたをして3分間ボルテックスし、1分間静置した。その後、5000 rpmで遠心を行い、上清を取り除いた。140 μLの70%エタノールを、金粒子の沈殿を乱さないようにゆっくり入れ、すぐに吸い出して捨てた。同様に100%エタノールで2回洗浄を行い、80 μLの100%エタノールを加え、チューブを強く弾いて金属微粒子を舞い上がらせ、コーティングを行った。
クリーンベンチ内で、マクロキャリアーをペーパータオルの上に載せ、プラスミドをコーティングした金粒子のエタノール溶液12 μLをマクロキャリアーの中央に置き、風乾させた。1回の打ち込みにより、0.45mgの金粒子と750ngのプラスミドDNAを使用した。乾燥後、マクロキャリアーとストッピングスクリーンを装置にセットした。打ち込みのガス圧は900psiとし、900psi用のラプチャーディスクを使用した。ストッピングスクリーンからターゲットのワタ未熟種子までの距離は、6cmとした。
未熟種子を含む長さ約10 mmのワタ子房器官をメスで縦方向に切断し、切断面が上になるように粘土に固定した。切断面には、約2 mmの未熟種子が5〜8個見える状態で、未熟種子表面の繊維細胞の長さは0.5 mm以下となる。固定したサンプルを本体装置のステージにセットし、打ち込みを行った。
打ち込み処理後、滅菌水で十分に湿らせたキプワイプ上に未熟種子を載せ、そのままプラスチックシャーレに入れ、25℃の弱光条件下においた。処理後、1日おきに未熟種子の状態を観察した。
タバコに対し、プラスミドpRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3またはpRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1を含むアグロバクテリウムを感染させ、常法により、形質転換体を得た。
Claims (14)
- ワタの種子表面および/もしくはワタ繊維特異的に発現する少なくとも1以上のプロモータを含む、ベクター、または、ワタの種子表面および/もしくはワタ繊維特異的に発現する少なくとも1以上のプロモータと、プロモータに機能するように連結された該プロモータからの転写を活性化する少なくとも1つのトランス活性化因子遺伝子を含む、ベクター。
- 前記ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現するプロモータが、
(1)GhRDL1および/またはGhEXPAプロモータ、
(2)GhRDL1またはGhEXPAプロモータとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現するプロモータ
(3)GhRDL1またはGhEXPAプロモータと70%以上の相同性を有し、ワタの種子表面および/またはワタ繊維特異的に発現するプロモータ
のいずれかを含む、請求項1のベクター。 - 前記トランス活性化因子遺伝子が、
(1)GhHOX3タンパク質をコードするDNA、
(2)GhHOX3タンパク質と60%以上のアミノ酸同一性を有し、GhHOX3タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(3)(1)のDNAと70%以上の相同性を有し、GhHOX3タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(4)(1)のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、GhHOX3タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
のいずれかである、請求項1または2のベクター。 - さらに、機能するように連結された、色素生合成遺伝子群の発現を促進する転写因子遺伝子および/または色素生合成遺伝子を少なくとも1つ含む、請求項1〜3のいずれかのベクター。
- 前記色素生合成系遺伝子群の発現を促進する転写因子遺伝子が、
(1)Atpap1タンパク質をコードするDNA
(2)Atpap1タンパク質と60%以上のアミノ酸同一性を有し、Atpap1タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(3)(1)のDNAと70%以上の相同性を有し、Atpap1タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
(4)(1)のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、Atpap1タンパク質と同等の転写活性化機能を有するタンパク質をコードするDNA
のいずれかである、請求項4のベクター。 - 配列番号1〜3のいずれかの配列を有するベクター。
- T−DNAの境界領域を含む請求項1〜6のいずれかに記載のベクター。
- 請求項7に記載のベクターを形質転換したアグロバクテリウム。
- 請求項8に記載のアグロバクテリウムを用いて形質転換された細胞、組織、カルス、形質転換植物、および/またはその種子。
- 請求項9に記載の形質転換植物またはその種子由来のクローン植物、後代植物および/またはそれらの種子。
- 前記形質転換された細胞、組織、カルス、形質転換植物および/またはその種子、ならびに、クローン植物、後代植物およびそれらの種子が、ワタ由来である、請求項9または10の細胞、組織、カルス、形質転換植物、および/またはその種子、ならびに、クローン植物、後代植物およびそれらの種子。
- 請求項4、6もしく7に記載のベクター、および/または、請求項7に記載のアグロバクテリウムを用いて形質転換されたワタ細胞、組織、カルス、形質転換植物および/またはその種子、ならびに、クローン植物、後代植物およびそれらの種子を生産する方法。
- 請求項11または12に記載の前記形質転換植物体から得られた綿繊維、生地、または衣類。
- 外来花色関連遺伝子を含む、綿繊維、生地、または衣類。
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