CN110106168A

CN110106168A - 基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法

Info

Publication number: CN110106168A
Application number: CN201910446843.7A
Authority: CN
Inventors: 李先碧; 裴炎; 范艳华; 牛国清; 肖月华; 侯磊; 金丹; 童胜; 林道尧
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110106168B

Abstract

本发明公开了基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，选择包括响应激素A诱导的多个顺式作用元件的天然启动子作为基本骨架，选择包括响应激素B诱导的顺式作用元件组合成响应元件盒，根据响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子与插入天然启动子中相邻顺式作用元件结合的转录因子之间都存在互作关系，确定响应元件盒插入天然启动子中的位置，便构建得到所述双激素响应启动子。利用本发明方法获得的启动子可以从多个信号途径或多类转录因子类型中获得信号，在调控基因表达时可以消除或削弱相互拮抗信号的影响，协同提高基因的表达水平。在抗病基因工程应用中，能更有效地提高转基因植物对不同生态类型病原菌的抗性。

Description

基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法。

背景技术

启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因转录的起始时间和表达的程度。启动子（Promoter）就像“开关”，决定着基因的活动。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与转录因子（transcription factor，TF）结合而控制基因活动的。基因工程中常用的启动子包括三种类型：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子调控的基因可在转基因植株的绝大多数组织中表达，它所调控的基因表达具有持续性， RNA 和蛋白质的表达量相对恒定，没有时空特异性，且活性高。组成型表达某些基因常常引起植物生长异常，甚至不育，或是引起内源基因沉默等现象（Vaucheret et al．，2001；Campbellet al．，2002）。特别是植物抗病基因工程中，组成型表达外源抗病基因常常产生抗性的代价问题。组织特异性启动子又称器官特异性启动子，是指只能在特定组织器官中启动基因表达的启动子，这类启动子实际上是特异组织中的组成型表达启动子。同时，抗病基因工程中，它与组成型启动子一样，当病原菌不存在时，它亦能够启动抗病基因表达。诱导启动子是受外界环境诱导后激活基因转录表达的一类启动子，这类启动子能定点定时地调控基因表达，一旦诱导条件丧失，基因停止表达。因此，这类启动子更适合基因工程。植物抗病基因工程中通常使用的是病原诱导启动子。

天然的病原诱导启动子常常来自于受病原菌或SA或JA诱导表达基因的启动子，通常在诱导条件和转录效率上存在某些局限，比如，病程相关蛋白基因PR1的启动子主要响应活体营养型病原菌的诱导，死体营养型病原菌诱导的时候活性非常低，甚至没有活性。此外，一些活性高的天然病原诱导启动子存在本底较高的活性，只能获得来自一个信号途径的信号，比如来自防御素PDF1.2基因的启动子PDF1.2，该启动子活性高，但是本底活性也高，且只能获得来自JA信号途径的信号。因此，在实际应用中受到限制。

随着分子生物学的发展，根据需要改造启动子或人工合成新的启动子已经很常见。人工合成启动子具有天然启动子不具备的许多优势。针对病原诱导启动子，人工合成启动子可以改变启动子的强度和病原诱导特性，可以优化启动子结构，可以在病原菌侵染部位调控基因高水平表达，而在病原菌未侵染部位基因表达水平低甚至没有表达，人工合成的启动子还可以从多个信号途径或多类转录因子类型中获得信号。

目前，文献报道的人工合成启动子的方法主要包括以下几种：（1）嵌合启动子（Chimeric promoter），也称为杂交启动子。这种方法是将两个或多个启动子的重要部分（比如，启动子核心序列，启动子上游的活性序列等）或重要的结构域（如TATA-box等）连接在一起；（2）定点突变（Site-directed mutagenesis）。这种方法常常是对启动子的顺式作用元件进行改变，以改变启动子的特性。这类启动子可以有目的地对启动子进行改造，但是目的性比较单一；（3）Shuffling。这是一种在体外进行DNA重组的方法，该方法是将两个或多个启动了片段混和在一起用DNA酶I将启动子消化成多个小片段，然后再用DNA聚合酶对片段进行随机重组，进而获得包含多拷贝的不同启动子片段的启动子。这种方法获得的启动子随机性大，目的性相对较小；（4）双向启动子（Bidirectional promoter）。将两个单向启动子的核心区域反向地连接在一起，反方向调控两个基因的表达。双向启动子可以同时调控两个转基因或报告基因；（5）接头诱变或扫描突变法（Linker-scanningmutagenesis）。这种方法是用带限制性内切酶酶切位点的接头连接不同的天然启动子，因为接头可以在启动子不同区域移动，因而连接后的启动子将产生突变，可以筛选获得带目标特性的启动子。这种方法主要手于分析启动子和增强子，也用于合成新的启动子。但利用上述方法得到的病原诱导启动子目的性不强，响应诱导信号单一，不能改变激素间相互拮抗的特性，无法满足植物抗病基因工程对病原诱导启动子的要求，也不能达到改变启动子的强度、病原诱导特性和优化启动子结构等目的。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，解决现有启动子响应诱导信号单一，不能改变激素间相互拮抗状况而无法满足植物抗病基因工程对病原诱导启动子要求的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，包括以下步骤：

1）按照实际需要，选择一个天然启动子作为基本骨架，所述天然启动子包括响应激素A诱导的多个顺式作用元件；选择包括响应激素B诱导的顺式作用元件组合成响应元件盒；所述激素A与激素B不相同；

2）将响应元件盒插入所述天然启动子中任一相邻两个顺式作用元件之间，即构建得到所述双激素响应启动子；所述响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子与所述相邻顺式作用元件结合的转录因子之间都存在互作关系。

作为优选的，所述互作关系的判定包括以下步骤：

S1：根据文献或数据库查找各个顺式作用元件结合的转录因子及其编码基因；

S2：将绿色荧光蛋白（GFP）分成N端部分（^NGFP）和C端部分（^CGFP），在所述N端部分的编码基因的5’末端分别与响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子的编码基因连接，形成不同融合基因片段TF-^NGFP；在所述C端部分的编码基因的5’末端分别与天然启动子中顺式作用元件结合的转录因子的编码基因相连，形成不同的融合基因片段TF-^CGFP；

S3：将任一所述融合基因片段TF-^NGFP和任一所述融合基因片段TF-^CGFP导入同一受体细胞中，得到转基因细胞，然后检测所述转基因细胞是否产生绿色荧光，若所述转基因细胞产生绿色荧光，则所述两个转录因子存在互作关系；若所述转基因细胞不产生绿色荧光，则所述两个转录因子不存在互作关系。

作为优选的，步骤2）所述插入方式为重叠延伸PCR或同源重组等。

作为优选的，所述的A激素和B激素可以是存在拮抗关系的激素组合。

作为优选的，所述响应的激素组合为SA和JA。

本发明还提供了上述方法构建的双激素响应启动子。

本发明还提供了含有上述双激素响应启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明还提供了上述重组表达载体在提高植物病原菌抗性方面的应用。

作为优选的，所述病原菌为黄萎病菌、番茄早疫病菌或白粉病菌。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，是根据基因工程的需求，以一个天然启动子为基本骨架，再有目的地在基本骨架上组合响应不同信号诱导的顺式作用元件，然后根据顺式作用元件结合的转录因子间是否存在互作，以及互作信号的强弱确定需要整合的顺式作用元件插入的位置合成新的启动子。利用本方法得到的双激素响应启动子可以同时从不同激素信号途径或多类转录因子类型中获得信号，可以优化启动子结构、改变启动子的强度和病原诱导特性，还可以广泛地响应不同病原菌的诱导。在调控基因表达时可以消除或削弱相互拮抗信号的影响，协同提高基因的表达水平。这种设计和构建启动子的方法适用于基因工程需要的不同类型启动子的合成。本发明操作简单、诱导效果佳，具有较强的适用性。

2、利用本发明方法获得的双激素响应启动子SJ-541、SJ-609和SJ-621能同时响应SA和JA的诱导，不仅响应SA和JA诱导的效率更高，反应更快，而且保持了骨架启动子没有本底活性的特点；能响应不同类型病原菌的诱导；受病原菌诱导时，调控基因主要集中在病原菌侵染部位表达，而且活性高反应快；在调控基因表达时可以消除SA和JA信号分子的拮抗作用，协同提高基因的表达水平。

3、利用本发明方法构建的病原诱导启动子能高效快速响应活体营养和死体营养等不同生态类型病原菌的诱导。受病原菌和激素同时诱导时，同样能将拮抗的不同激素信号转换为协同作用，更有效地调控基因的表达；与天然启动子相比，本发明获得的启动子调控抗菌蛋白基因的表达能更有效地提高植物对不同类型病原菌的抗性，具有良好的应用前景和潜在的市场价值。

附图说明

图1为基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的模式解析图；

CS为顺式作用元件，TF为转录因子；表示邻近转录因子间存在相互作用；

图2为双分子荧光互补实验验证转录因子互作结果；

图A中从上到下依次是转录因子AtEREBP分别与转录因子AtOBF4、AtTGA1a、AtWRKY12、AtTRF和AtMYB1之间的互作；图B中从上到下依次是转录因子AtMYC1分别与转录因子AtOBF4、AtTGA1a、AtWRKY12、AtTRF和AtMYB1之间的互作；

图3为JA响应模块模式图和PR-1a启动子主要的SA响应元件；

图A为JA响应模块的结构示意图；图B为PR-1a启动子中响应SA诱导的顺式作用元件及其结合的转录因子的结构示意图；

图4为JA响应模块插入PR-1a启动子不同的位置及其构建启动子的结构示意图；

图A JA响应模块插入PR-1a骨架不同的位置；图B构建启动子结构示意图，相邻顺式作用元件结合转录因子互作的强弱用*的数量表示。****：每平方毫米 BiFC分析烟草叶片超过10个的荧光点，表示转录因子互作信号强；***：每平方毫米 BiFC分析烟草叶片有5-10个荧光点，表示转录因子互作信号较强；**：每平方毫米BiFC分析烟草叶片有2-5个荧光点，表示转录因子互作信号较弱； *：每平方毫米BiFC分析烟草叶片有1个荧光点，表示转录因子互作信号弱；

图5为pBI121-SJ-609::GUS转基因烟草PCR扩增检测结果；

M为DNA Marker（DL 2000）；1为阳性对照，pBI121-SJ-609::GUS质粒；2-11为pBI121-SJ-609::GUS转基因烟草植株；12为野生型烟草植株；

图6为利用转录因子互作设计的病原诱导启动子受SA和MeJA诱导的GUS染色结果；

Monck: 水处理对照；SA：1mmol/L水杨酸处理；MeJA：0.5mmol/L 茉莉酸甲酯处理；SA+MeJA：1mmol/L水杨酸＋0.5mmol/L 茉莉酸甲酯处理。第一类启动子为插入响应元件盒与两侧转录因子间都存在互作关系；第二类：插入响应元件盒只与一侧的转录因子间存在互作；第三类：插入元件盒与两侧转录因子间均不存在互作关系；

图7为SJ-609::GUS转基因烟草受病原菌诱导的GUS染色结果；

注：白色箭头示病原菌的接种点；

图8为SJ-609::GUS转基因拟南芥受病原菌和激素同时诱导的GUS基因转录表达水平；

Monck: 水处理对照；SA：1mmol/L水杨酸处理；MeJA：0.5mmol/L 茉莉酸甲酯处理；Ery.：接种白粉病菌；Ery.+MeJA：接种白粉病菌24h后喷施0.5mmol/L 茉莉酸甲酯；Alt.：接种赤星病菌；Alt.+SA：接种赤星病菌24h后喷施1mmol/L水杨酸；

图9为转基因番茄对不同类型病原菌的抗性。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图以合成同时响应SA和JA的病原诱导启动子为例对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。所用pBI121质粒为由日本信州大学小岛峰雄教授赠送。

实施例1

利用模式图进一步解析本发明的核心内容

基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，如图1所示，包括以下步骤：

1）选择一个天然启动子pA作为基本骨架，所述天然启动子pA包括响应激素A诱导的多个顺式作用元件CS1、CS2和CS3等；选择包括响应激素B诱导的顺式作用元件CS4和CS5组合成响应元件盒；所述激素A与激素B不相同。

2）根据文献或数据库查找CS1、CS2、CS3、CS4和CS5分别结合的转录因子为TF1、TF2、TF3、TF4和TF5。

3）利用双分子荧光互补（BiFC）等技术，分别检测转录因子TF4和TF5与转录因子TF1、TF2和TF3间是否存在互作关系。

4）根据步骤3）的结果来确定响应激素B诱导的顺式元件盒插入pA骨架的位置，即将响应元件盒插入所述天然启动子中任一相邻两个顺式作用元件之间，即构建得到所述双激素响应启动子；所述响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子与所述相邻顺式作用元件结合的转录因子之间都存在互作关系。优选的，响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子与所述相邻顺式作用元件结合的转录因子之间均存在互作关系的启动子pAB作为目标启动子。

5）利用分子生物学方法，如重叠延伸PCR，同源重组等方法，将设计的响应元件盒插入到骨架载体，完成启动子的构建，形成一个新的响应双激素信号诱导的启动子。

实施例2

转录因子之间的互作分析

2.1 拟南芥植株RNA的提取

利用手术刀片损伤哥仑比亚野生型拟南芥植株的根，然后利用灌根接种法，浇灌10⁸个孢子/mL的黄萎病菌V991的孢子悬浮液，每株20mL，接种黄萎病菌24h，以接种拟南芥植株的叶片为材料，利用植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab），按说明书操作流程提取拟南芥植株的RNA。然后以RNA为模板，利用TaKaRa的反转录试剂盒按操作说明书合成一链cDNA，-20℃保存用于合成转录因子的编码序列。

2.2 转录因子编码序列的获得

通过http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html和http://bioinformatics. Psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html网站，利用植物启动子数据库对PR-1a启动子（SEQ ID NO.1所示）进行元件预测分析。PR-1a启动子包含响应SA的顺式作用元件W-box、MBSII、WK1和WK2各一个， TC- rich和AS-1各两个（图3B）。再结合NCBI数据库查找顺式作用元件结合的转录因子及其序列，W-box、MBSII、WK1、WK2、TC- rich和AS-1结合的转录因子分别为WRKY、MYB1、WRKY12（WK1和WK2）、TRF和OBF4/TGA1a。响应JA诱导的顺式作用元件GCC-box和G-box 结合的转录因子分别为AP2-EREBP 和 MYC。上述转录因子的基因登录号分别为AtEREBP:AY072471.1；AtMYC1:NM_116272.4；AtOBF4: X69899.1；AtTGA1a:AY087049.1；AtMYB1: NM_111757.4；AtWRKY12: NM_130039.3；AtTRF：AY519534。根据基因登录号获得转录因子的编码序列。

2.3 双分子荧光互作载体的构建

根据Gateway® BP Clonase™ II Enzyme Mix (Invitrogen)使用说明和转录因子编码序列设计引物，并去除每个转录因子的终止子。然后以步骤1）获得的cDNA为模板，分别PCR扩增获得转录因子基因编码序列AtEREBP、AtMYC1、AtOBF4、AtTGA1a、AtMYB1、AtWRKY12和AtTRF，并利用BP酶将扩增序列分别克隆到入门载体pDONR221，转化大肠杆菌DH5α后经氨苄抗性筛选获得转化子，提取转化子质粒进行测序验证，测序验证正确的转化子质粒利用LR酶将基因片段AtOBF4、AtTGA1a、AtMYB1、AtWRKY12和AtTRF分别重组到表达载体pEG201中，分别与YFP蛋白的N端片段（^NYFP）融合，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，经卡那霉素抗性筛选后提取抗性转化子质粒，再进行PCR或测序验证，经验证正确的转化子质粒再转入根癌农杆菌GV3101，筛选获得阳性克隆。测序验证正确的转化子质粒利用LR酶再基因片段AtOBF4、AtTGA1a分别重组到表达载体pRG202中，分别与YFP蛋白的C端片段（^CYFP）融合，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，经卡那霉素抗性筛选后提取抗性转化子质粒，再进行PCR或测序验证，经验证正确的转化子质粒再转入根癌农杆菌GV3101，筛选获得阳性克隆。

2.4 转录因子互作的研究

利用双分子荧光互补实验研究两个转录因子间是否存在相互作用。根据步骤2.3获得的包含转录因子的GV3101菌株，将两个含待测转录因子基因的农杆菌同时注射本明烟叶片进行瞬时表达。注射36-48h，取叶片在激光共聚焦显微镜下观察YFP荧光信号，如果产生YFP的荧光信号说明两个待检测蛋白间存在相互作用，否则，待检测的两个蛋白间没有相互作用。结果如图2所示。

从图2可以看出，AtEREBP分别与AtOBF4、AtTGA1a、AtWRKY12和AtTRF间存在很强的互作关系，与AtMYB1间存在较强的互作关系。AtMYC1分别与AtOBF4和AtTGA1a间存在较强的互作关系，与AtTRF和AtMYB1间互作关系较弱，与AtWRKY12间没有互作关系。

实施例3 病原诱导启动子的构建

3.1 响应元件盒的构建

典型响应JA诱导的顺式作用元件主要包括G-box和GCC-box。将顺式作用元件以双拷贝的形式组合在一起，且不同的顺式作用元件间需要存在一定的间隔距离，这样既可以提高启动子的强度，同时不会过多的扩大如本底活性高的负面影响。为了提高JA诱导反应的强度，GCC-box和G-box分别以双拷贝的形式组合在一起。由于烟草NtPMT启动子中G-box元件及GCC基序的中间连接对NtPMT启动子响应JA的诱导起着重要作用，因此，JA反应模块设计为：用一段来自烟草NtPMT启动子G-box元件及GCC 基序的中间连接序列连接两个加倍的JA反应主要元件（G-box和GCC-box），得到72bp的JA反应模块（图3A），具体序列见SEQ IDNO.2。

3.2 人工合成启动子骨架片段的获得

烟草DNA的提取：取山姆逊野生型烟草叶片约100mg，利用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab），按说明书步骤提取烟草基因组DNA。

人工合成启动子骨架片段的获得：为了构建双激素响应的病原诱导启动子SJ，首先要获得骨架启动子的序列，本发明根据研究结果，以本底活性低，响应SA诱导的烟草PR-1a启动子为基本骨架，根据根据SEQ ID NO.1所示PR-1a启动子的核苷酸序列，设计PCR扩增引物PR-F和PR-R。然后以提取的烟草基因组DNA为模板，利用PrimerSTAR（TaKaRa公司产品）扩增目标片段PR-1a启动子。

所述引物序列如下：

PR-F：5’- CCCAAGCTTAAGGACTAAGATATACGAGG -3’

PR-R：5’- CGCGGATCCGGACTATAGGAGAAATGTTG -3’

扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用回收试剂盒（BioSpin Plasmid DNAExtraction Kit）进行目的片段的回收。然后利用T4连接酶（Promega），将回收片段连接入pTOPO-Blunt载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，获得pTOPO-PR-1a载体，经测序验证后获得PR-1a启动子序列。

3.3 JA响应元件插入骨架载体位置的确定

选定了骨架载体后，构建新启动子的关键在于确定响应元件盒插入骨架中的位置，这个位置的选定决定着启动子的活性和特点。根据骨架启动子中顺式作用元件的位置（图3B），设计JA插入PR-1a的位置如图4A所示。PR-1a启动子插入JA响应元件盒后，根据反式作用因子的互作有无可以将设计的启动子分为三类。第一类：插入响应元件盒与两侧反式作用因子均存在互作关系，包括图4B中的双激素响应启动子SJ-541、SJ-609和SJ-621；第二类：插入响应元件盒只与一侧的反式作用因子间存在互作关系，包括图3B的双激素响应启动子SJ-575和SJ-713；第三类：插入响应元件盒与相邻的反式作用因子间没有互作关系关系，包括图4B的双激素响应启动子SJ-225。设计的最理想启动子为第一类。

3.4 双激素启动子SJ的获得

以设计第一类启动子SJ-609为例，说明双激素启动子SJ的获得。根据PR-1a启动子和JA响应元件盒的序列，以及JA元件盒插入PR-1a的位置，设计引物PR-2R和PR-2F，然后利用重叠延伸PCR方法，以PR-F和PR-2R扩增SJ-609序列的5’端片段，以PR-2F和PR-R扩增SJ-609序列的3’端片段，然后将获得的两个片段混和，再以PR-F和PR-R为引物进行PCR扩增，得到JA元件盒插入PR-1a的融合片段。

所述引物序列如下：

PR-2F：

5’-TGTAATATGCACGTTGTAATGAATTTTTAACTATTATATTATATCGAGTTGCGCCCTGCCGCCATGTTCAAGTTTTCCAC -3’

PR-2R：

5’-ATTCATTACAACGTGCATATTACAACGTGCAGTGGCCGTCATCTCGATGACG -3’

将扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒（BioSpin Plasmid DNAExtraction Kit）回收扩增产物。然后利用T4连接酶（Promega），将回收片段连接到pTOPO-Blunt载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，获得pTOPO-SJ-609载体，经测序验证后获得SJ-609启动子序列，该启动子含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。利用相同的方法可以获得其他插入位点的启动子序列。

实施例4 转基因烟草的获得

4.1 植物表达载体的构建

为了研究人工合成启动子的特性，将SJ-609启动子序列替换pBI121植物表达载体中的35S序列。pTOTO-SJ-609和pBI121质粒分别用Hin dⅢ和Bam HI进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，前者回收约1600bp的小片段，后者回收大片段，然后利用T4 DNA连接酶连接回收的片段，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒再利用Hin dⅢ和BamHI进行双酶切验证，获得pBI121-SJ-609::GUS植物表达载体。

4.2 含有pBI121-SJ-609::GUS植物表达载体的重组农杆菌的获得

利用电转化法，将步骤4.1获得的pBI121-SJ-609::GUS植物表达载体质粒转入农杆菌LBA4404感受态细胞，利用抗生素筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农杆菌质粒并用Hin dⅢ和Bam HI进行双酶切验证，获得含有pBI121-SJ-609::GUS植物表达载体的重组农杆菌。

4.3 烟草的遗传转化

将含SJ-609::GUS植物表达载体的重组农杆菌接种入液体YEB培养基，28℃、200rpm 振荡培养过夜至OD600 1.0~1.2。菌液离心后收集菌体，并用等体积MSB液体培养基重悬菌体，重悬液即为转化用浸染液。

烟草无菌苗叶片，切成3-5mm介方的叶盘，于浸染液内浸染1hr，去除菌液，然后将叶盘接种入共培养基，24℃暗培养48hr。共培养完成后，外植体继代入附加100mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的筛选脱菌培养基，25℃、16hr光照/8hr暗培养的光周期培养2周继代一次，至叶盘边缘产生幼芽，将幼芽切下继代入MSB培养基生根成苗，幼苗生长至3-4叶移栽入花盆做进一步的分析。

4.4 烟草的PCR验证

以再生烟草植株幼嫩叶片为材料，利用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab），按说明书步骤提取再生烟草基因组DNA。

以SJ::GUS的序列设计扩增引物SJ::GUS-F（上游引物）和SJ::GUS-R（下游引物），以烟草基因组DNA为模板，扩增SJ::GUS的部分序列。

所述引物序列如下：

SJ::GUS-F：5’- TCAGGAAGTGATGGAGCA -3’

SJ::GUS-R： 5'- GCGTCGCAGAACATTACA -3'

20μL PCR扩增体系包括：2×Taq Plus Master Mix 10μL，模板DNA 1μL（约10ng），上下游引物各1μL（5μmol/L），双蒸水7μL。

PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 60S，30个循环；72℃10min。

将PCR扩增产物进行凝胶电泳验证，结果如图5所示。从图中可以看出，转基因烟草植株中扩增目的片段大小为1051bp ，与目标片段大小相同，阴性对照中未能扩增出目的片段。说明SJ-609::GUS序列已经成功整合入烟草植株。

实施例5 SJ-609等人工合成启动子受SA和JA的诱导特性

5.1 GUS组织化学染色

GUS组织化学染色参照Jefferson和Bevan（1987）的方法进行，具体方法如下：取少许植物组织材料浸入GUS染色液，37℃避光染色12h，然后用95%的乙醇脱色至材料绿色完全褪去，最后用体视镜观察并拍照。

5.2 SJ-609等人工合成启动子受SA和JA诱导的反应特性分析

以转基因烟草离体无菌叶片为材料，分别用1 mmol/L水杨酸（SA）、0.5mmol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）、以及1 mmol/L SA+0.5mmol/L MeJA分别浸泡叶片6hr，然后用自来水漂洗干净，再用湿润的脱脂棉包裹叶柄进行保湿培养，以同期水处理作对照。自处理开始，间隔12hr分别用约6mm直径的打孔器切取叶圆片，按上述步骤5.1的方法进行GUS组织化学染色。GUS染色结果表明（图6），插入的JA响应盒两侧或一侧的转录因子存在互作关系的人工合成启动子都能响应SA，MeJA或SA+MeJA的诱导，但是互作关系不同启动子活性存在很大的差异。结果显示：（1）处理12h，SA＋MeJA与SA单独处理相比，GUS染色蓝色更深，表明第一类启动子受SA和MeJA同时诱导时，调控的GUS基因表达水平比SA诱导的GUS活性更高，SA和MeJA信号的拮抗消失，表现出协同增强作用。（2）受SA和MeJA单独诱导时，第一类和第二类启动子获得的GUS染色没有明显差异，但是SA和MeJA同时处理时，第一类启动子获得的GUS染色的蓝色较第二类的更深，说明，第一类启动子受相互拮抗的两个信号分子诱导时，启动子的活性更高。（3）第三类启动子只有SA诱导时，GUS染色出现了蓝色，说明第三类启动子只响应SA的诱导，即这类启动子与构建的骨架启动子没有差异。（4）第一类启动子都不存在本底活性，保持了骨架载体的特点。

结果表明，利用转录因子互作方法构建的新启动子具有以下特点：（1）获得的插入元件盒两侧都存在互作的启动子活性较骨架启动子活性更强。（2）具有获得的插入元件盒两侧都存在互作的启动子能同时响应两个信号激素的诱导。（3）获得的插入元件盒两侧都存在互作的启动子能消除相互拮抗的两个信号分子的拮抗作用，增加启动子活性更有效地调控基因的表达。（4）获得的插入元件盒两侧都存在互作的启动子能保持骨架启动子的特性。

实施例6 SJ-609等人工合成启动子受病原菌诱导的特性

6.1 接种病原菌的制备

人工合成启动子的目的是为了更有效地应用于基因工程，作为病原诱导启动子则必须要响应不同类型病原菌的诱导。本实施实例以活体营养型的白粉病菌和死体营养型的烟草赤星病菌作为致病菌，用以研究人工合成启动子对病原菌诱导的响应情况。

白粉病菌接种液的制备：人工气候箱内用烟草繁殖的白粉病菌收集到培养皿内，加入0.1%的土温80溶液悬浮白粉病菌，并调整孢子浓度至10⁷个孢子/mL，重悬液即为接种用孢子液。

赤星病菌接种液的制备：90mm PDA平板活化保存的赤星病菌，待病原菌长满平板时，平板内加入适量无菌水，用手术刀背轻轻刮下菌丝表面的孢子，并用擦镜纸过滤收集的菌液。滤液3000rpm 离心5min，收集菌体，再用0.1%无菌吐温溶液重悬菌体并调整孢子浓度至10⁵个孢子/mL，重悬液即为接种用孢子液。

6.2 SJ-609人工合成启动子受病原菌诱导的特性

为了明确人工合成启动子受活体营养型病原菌诱导的特性，以无菌SJ-609::GUS转基因烟草叶片为材料，喷施步骤6.1制备的白粉病菌孢子悬浮液，然后于16h光照/8h暗培养的光周期，温度为22℃（暗培养条件）~26℃（光照条件），80%湿度条件的光照培养箱内培养，间隔一定时间取样进行GUS组织化学染色。活体营养型病原菌接种以PR-1a::GUS转基因烟草为对照。GUS染色结果显示（图6），接种12h，SJ-609::GUS烟草叶片已经出现蓝色，而PR-1a::GUS却没有蓝色出现，接种24h，SJ-609::GUS染出的蓝色较PR-1a::GUS的更深，接种48h，SJ-609::GUS和PR-1a::GUS染色的蓝色都较深。这些结果说明，SJ-609启动子能快速响应活体病原菌的诱导且活性高。此外，GUS染色的蓝色呈点状分布，说明受病原菌诱导，SJ-609启动子调控基因在病原菌侵染部位表达。为明确去除病原菌后SJ-609启动子的反应，接种白粉病菌3d，接种的叶片喷施敌磺钠，72h后再次取叶片进行GUS染色，结果显示SJ-609::GUS和PR-1a::GUS染出的蓝色已经很浅，表明，SJ-609启动子不仅能快速响应活体病原菌的诱导，同时病原菌去除后能快速关闭信号。

为了明确人工合成启动子受死体营养型病原菌诱导的特性，以无菌SJ-609::GUS转基因烟草叶片为材料，于叶片主叶脉中部定点接种步骤6.1制备的赤星病菌孢子悬浮液，然后于16h光照/8h暗培养的光周期，温度为22℃（暗培养条件）~26℃（光照条件），80%湿度条件的光照培养箱内培养，间隔一定时间取样进行GUS组织化学染色。死体营养型病原菌接种以PDF1.2::GUS转基因烟草为对照。结果显示（图7），死体营养型病原菌侵染后，SJ-609调控基因集中在病原菌侵染部位表达，接种12h，GUS染色出现了蓝色，去除病原菌后，GUS染色的蓝色渐渐褪去并逐渐消失，而对照PDF1.2启动子则表现出组成型启动子的特性。结果表明，SJ-609启动子能快速响应死体营养型病原菌的诱导，且病原菌去除后能快速关闭信号。

GUS染色结果还显示，0h SJ-609::GUS转基因烟草叶片GUS染色没有出现蓝色，表明，SJ-609启动子没有本底活性。

上述研究结果表明，SJ-609启动子是一种能快速高效响应不同类型病原菌诱导的理想型病原诱导启动子。

实施例7 SJ-609等人工合成启动子同时受病原菌和激素诱导的特性

植物与病原菌在长期的相互作用过程中，形成了自身防御机制。通常情况下，植物受活体病原菌侵染后会产生SA，进而提高自身对活体病原菌的防御能力；而受死体营养型病原菌侵染后，植物会产生MeJA，从而提高自身对死体病原菌的防御能力。但当植物受活体病原菌侵染的同时用MeJA处理，植物对活体病原菌的抗性将降低，而受死体营养型病原菌侵染的同时用SA处理，植物对死体病原菌的抗性将降低。为了明确利用转录因子互作获得的病原诱导启动子能否消除植物防御信号分子间的这种拮抗作用，本实施实例以转基因拟南芥为材料，接种不同类型病原菌后再用不用的激素进行处理，然后检测GUS基因的转录表达水平，比较天然启动子和人工合成启动子调控GUS基因表达水平的差异，以明确相互拮抗的SA和JA信号分子同时存在时人工合成启动子的响应特性。

7.1、拟南芥的遗传转化

参照Steven J. Clough and Andrew F. Bent（1998）的浸花转化法，以哥仑比亚野生型拟南芥为材料进行遗传转化，然后利用转化质粒上的NPTII标记基因赋予植物的卡那霉素抗性进行筛选，并按步骤4.4的方法对转基因植株进行PCR鉴定，获得转基因阳性植株。

7.2、白菜黑斑病菌接种液的制备

90mm PDA平板活化保存的白菜黑斑病菌，待病原菌长满平板时，平板内加入适量无菌水，用手术刀背轻轻刮下菌丝表面的孢子，并用擦镜纸过滤收集的菌液。滤液3000rpm 离心5min，收集菌体，再用0.1%无菌吐温溶液重悬菌体并调整孢子浓度至10⁷个孢子/mL，重悬液即为接种用孢子液。

7.3、SJ-609等人工合成启动子同时受病原菌和激素诱导的特性

本实施实例以SJ-609::GUS转基因拟南芥植株为材料，步骤6.1和步骤7.2制备的烟草白粉病菌和白菜黑斑病菌涂抹至植株叶片表面，16h光照/8h暗培养的光周期，温度为22℃（暗培养条件）~26℃（光照条件），80%湿度条件的光照培养箱内培养24h后，接种白粉病菌的植株中的一部分喷施0.5mmol/L MeJA，接种白菜黑斑病菌植株中的一部分喷施1mmol/LSA，植株继续在培养箱内光照培养，处理24h后取样提取转基因拟南芥植株叶片的RNA。

RNA的提取：使用Aidlab公司的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取，并严格按试剂盒使用说明书进行。

cDNA的合成：选用TaKaRa公司的RT-PCR反转录试剂盒合成。

Real-time PCR的20 μL反应体系包括：cDNA模板1 μL，GUS基因上下游引物各1 μL，2×iQ SYBR Green Supermix 10 μL，ddH₂O 7 μL。

Real-time PCR扩增条件：95℃ 3 min；95℃ 10 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析GUS基因的转录表达水平。

Real-time PCR扩增结果显示（图8），SJ-609::GUS接种活体营养型病原菌后再喷施MeJA（Ery.+MeJA），GUS基因的表达水平较只接种活体营养型病原菌（Ery.）或只喷施MeJA的表达水平均更高，说明SJ-609启动子的活性，受活体营养型病原菌诱导后没有受到MeJA的抑制，而PR-1a::GUS对照则恰好相反，接种活体营养型病原菌后再喷施MeJA（Ery.+MeJA），GUS基因的表达水平与只接种活体营养型病原菌（Ery.）的表达水平相比，下降明显。

同时，SJ-609::GUS接种死体营养型病原菌后再喷施SA（Alt.+SA），GUS基因的表达水平较只接种死体营养型病原菌或只喷施SA的表达水平均更高，说明SJ-609启动子的活性，受死体营养型病原菌诱导后没有受到SA的抑制，而PDF1.2::GUS对照则恰好相反，接种死体营养型病原菌后再喷施SA（Alt.+SA），GUS基因的表达水平与只接种死体营养型病原菌（Alt.）的表达水平相比，下降明显（图8）。

GUS基因表达水平检测结果表明：利用转录因子互作获得的SJ-609启动子在调控基因表达时，相互拮抗的SA和JA信号可以转换为协同作用，进而更有效地调控基因的表达。

实施例8 SJ-609等人工合成启动子在植物抗病基因工程中的应用

CEMA基因是一个抗病效果好的抗菌蛋白基因，但是表达量过高会影响植株生长发育。为了验证本专利合成的启动子在植物抗病基因工程中的应用前景，拟用SJ-609启动子调控在CEMA基因前面添加信号肽序列的改造基因spCEMA，并转化植物，然后鉴定转基因植株的抗病性。

8.1、植物表达载体的构建

利用酶切连接的方法构建p5-SJ-609::spCEMA植物表达载体。根据载体结构特点，利用HindIII和BamHI分别双酶切p5-35S-spCEMA和pGENT-SJ-609质粒，1%琼脂糖电泳后，前者回收酶切后的大片段，后者回收酶切后的小片段，然后用T4 DNA连接酶连接回收的片段，并转化大肠杆菌，经卡那霉素抗性筛选和酶切验证，获得转化阳性克隆。提取转化子的质粒后，利用电转化法将质粒转入农杆菌LBA4404。

以相同的方法构建p5-PR-1a::spCEMA和p5-PDF1.2::spCEMA植物表达载体。

8.2、番茄的遗传转化

以番茄子叶为受体，利用根癌农杆菌遗传转化方法转化番茄。将含p5-SJ-609::GUS、p5-PR-1a::spCEMA和p5-PDF1.2::spCEMA植物表达载体的重组农杆菌分别接种入液体YEB培养基，28℃、200rpm 振荡培养过夜至OD600 1.0~1.2。菌液离心后收集菌体，并用等体积MSB液体培养基重悬菌体，重悬液即为转化用浸染液。

番茄无菌子叶，切去两端约1/5的部分，留取中间部分做转化受体。子叶受体于浸染液内浸染1hr，去除菌液，然后将叶盘接种于共培养基（叶片阳面朝上），25℃暗培养48hr。共培养完成后，外植体继代入附加100mg/L卡那霉素和200mg/L羧卞青霉素的筛选脱菌培养基，25℃、16hr光照/8hr暗培养的光周期培养2周继代一次，至外植体边缘产生幼芽，将幼芽切下继代入MSB培养基生根成苗，幼苗移栽入花盆做进一步的分析。

8.3、棉花的遗传转化

以下胚轴为受体的根癌农杆菌介导法转化棉花。操作流程如下：

棉花种子去壳后，籽仁经酒精（75%）灭菌 1min 后，再用 3%的双氧水灭菌30min，期间不停的振荡，然后无菌水冲洗 3-4 次，25℃ 120rpm振荡水培养至种子露白后接种于 MSB培养基中， 25℃暗培养 2-3d，至下胚轴长 2-3cm；超净台上将下胚轴切成 5mm 左右的小段，作为外植体；将外植体加入制备好的农杆菌侵染液中，浸染30min；弃菌液，将下胚段继代入共培养培养基，暗培养2d；将下胚段继代入筛选培养基，约15d 继代一次；经愈伤诱导，胚性愈伤诱导和体胚诱导培养，以及体胚伸长培养和成苗培养获得再生植株，再经GUS组织化学染色鉴定获得转基因植株。

8.4、抗病鉴定接种致病菌的制备

黄萎病菌：PDA 试管保存的强致病力黄萎病菌 V991 菌株，挑取少许接种入新配制并附加 250 mg/L 头孢青霉素的 PDA 平板进行活化， 26℃培养10d，再切取适量菌块接种入附加相同抗生素的 PDB 液体培养基进行繁殖培养，26℃振荡培养 7d。四层纱布过滤去除菌丝，并将孢子悬浮液调整到孢子浓度至 10⁷ 个孢子/mL，作为接种的致病菌。

番茄早疫病菌：90mm PDA平板活化保存的番茄早疫病菌，待病原菌长满平板，用紫外灯照射24h诱导产孢，然后再培养24h，平板内加入适量无菌水，用手术刀背轻轻刮下菌丝表面的孢子，并用擦镜纸过滤收集的菌液。滤液3000rpm 离心5min，收集菌体，再用0.1%无菌吐温溶液重悬菌体并调整孢子浓度至10⁷个孢子/mL，重悬液即为接种用孢子液。

白粉病菌：同实施实例5的步骤5.1的白粉病菌接种液的制备。

8.5、转基因植株抗病鉴定

棉花对黄萎病抗性的抗病鉴定：随机选取10个SJ-609::GUS转基因棉花T1代株系3-4叶幼苗，每株系30株，洗去根部土壤，将根浸入黄萎病菌接种液中1h，然后移栽入土壤中，22~26℃光照培养14d，统计转基因株系的病情指数，并以10个株系的平均病情指数评价抗病效果。以10个WT、10个PR-1a::spCEMA和10个PDF1.2::spCEMA对照棉花的平均指数做比较。

烟草对白粉病抗性的抗病鉴定：随机选取30个SJ-609::GUS转基因烟草T0代株系幼苗，选取植株顶上部第3和第4叶，喷施白粉病菌接种液，然后于温室内培养，接种7d，统计叶片病原菌的覆盖率（PACF），以30个植株平均PACF评估转基因烟草对白粉病的抗性。以30个WT、30个PR-1a::spCEMA和30个PDF1.2::spCEMA对照烟草的平均PACF做比较。

番茄对早疫病抗性的抗病鉴定：随机选取10个SJ-609::GUS转基因番茄T0代株系幼苗，每植株取10个离体全叶作为接种材料，均匀喷施番茄早疫病菌接种液，然后22-26℃光照保湿培养7d，统计转基因株系的病情指数，并以10个株系的平均病情指数评价抗病效果。以10个WT、10个PR-1a::spCEMA和10个PDF1.2::spCEMA对照番茄的平均指数做比较。

8.6、转基因植株的抗病性

转基因烟草抗病鉴定结果显示，SJ-609::spCEMA转基因烟草10个株系的平均PACF为27.3 %，PR-1a::spCEMA, PDF1.2::spCEMA 和WT的平均PACF分别为34.5 %，46.3 %和65.0%，同时结果显示，SJ-609::spCEMA, PR-1a::spCEMA和PDF1.2::spCEMA转基因烟草PACF为0的株系比率分别为20.0 %, 13.3 %和0.0 %（图9 A）。结果表明：SJ-609调控spCEMA的表达能更有效地提高烟草对活体营养型病原菌的抗性。

转基因番茄抗病鉴定结果显示，SJ-609::spCEMA转基因番茄10个株系的平均病情指数为34.2，PR-1a::spCEMA，PDF1.2::spCEMA 和WT的平均病情指数分别为52.5, 52.0和86.2，同时结果显示，SJ-609::spCEMA, PR-1a::spCEMA和PDF1.2::spCEMA转基因番茄平均病情指数低于10的株系比率分别为30.0 %, 10.0 %和0.0 %（图9 B）。结果表明：SJ-609调控spCEMA的表达能更有效地提高番茄对死体营养型病原菌的抗性。

转基因棉花抗病鉴定结果显示，SJ-609::spCEMA转基因棉花10个株系的平均病情指数为32.2，PR-1a::spCEMA，PDF1.2::spCEMA 和WT的平均病情指数分别为45.9，40.8和81.5，同时结果显示，SJ-609::spCEMA转基因棉花有2个株系的病情指数低于10，而PR-1a::spCEMA和PDF1.2::spCEMA转基因棉花却没有病情指数低于10的株系（图9 C）。结果表明：SJ-609调控spCEMA的表达能更有效地提高棉花对兼性营养型病原菌的抗性。

转基因棉花、番茄和烟草的抗病鉴定结果显示，SJ-609启动子调控抗菌蛋白基因spCEMA较天然启动子PR-1a和PDF1.2能更有效地提高植物对不同类型病原菌的抗性。

综上，本发明所提供的基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法获得的病原诱导启动子，能快速地响应SA和JA等信号分子的诱导，受SA和JA同时诱导时，能消除信号分子的拮抗作用，协同增强调控基因的表达; 能高效快速响应活体营养和死体营养等不同生态类型病原菌的诱导，诱导基因表达主要集中在病原菌的侵染部位。同时受病原菌和激素同时诱导时，同样能将拮抗的SA和JA信号转换为协同作用，更有效地调控基因的表达; 用本专利的方法获得的启动子调控抗菌蛋白基因的表达较天然启动子能更有效地提高植物对不同类型病原菌的抗性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学；

<120> 基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1583

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccaagctta aggactaaga tatacgagga tgtcaattat cataatgtag ggtctaagtt 60

ttcatttttt tttttgcatc taatagagta taattttttt taatcatcac gataacttga 120

tctacaataa tatgtactct gtttactttt acttgacacg ttttgatttt tcacgccctt 180

taagaaaaaa tgattgaaat gcataattta ccatgatact catattaatt gatgcatatt 240

ttattggatt tgagaaaatg atttgaaatg agtaataaat actgtgggta taacaggaaa 300

aaaaaattgt cttctcttaa catgcataaa gtgaagagta aaaatgaaaa tctattttta 360

gtatacatgt caaacaaaag tgaacggagg agatgacaaa ttgctaaatg gcaatagtta 420

caaaattctt caattactct ttttgcataa caaaaacact ggtctctctt gtaagtattg 480

ggtctatact tcaccaccta aagcattggc cgaagtcttt ttaaggagtt tggtagtcat 540

ttatccattt aaattaaagg gaaaataagt gaacgccatt acagcgagat gctttagggt 600

gctatttctt ggaaaaataa agtagttaaa tcttaaaaca ccctcgagga tttcaaactc 660

tagcttcact aaaacttgag ctttcttttc cactaatgtc gaaaaacgaa ataaacataa 720

gctatttaca aaaaataaaa aaatactcca tttgaatcta aagtcaagtc gtgattggga 780

taagaagata gaaatttatt tatactccag atcaagccgt gattggaatg agataataga 840

aaagtatgat agtacatgag taacatcaag ttggaaatta agggaaggaa attagagaaa 900

gaactgaaga atatccaaat attctttgcg tccaaatttg atagttattt aacgtcatcg 960

agatgacggc catgttcaag ttttccacaa atattgagaa aagaaagaag aagacacaaa 1020

ctgtgtttgg tattattata gttttttctt ttagagaatt gattgtacat ataagaaata 1080

taatataaga tttagaaata agattattag aaaaatcata catcaaagta tttattttaa 1140

attctttttc caatggacat tcccattctg aaaaaaaaga gatataagta tggaagtaaa 1200

aattaatcag atcgttaaat gtagaaaata ttaattaaca cattaaccat aaccaatcta 1260

ctttatttaa caaaaagcac atctgataga tcaaaaaagt gtttaacttc atgcattgac 1320

aatttaaaat tattttgcaa catcgggtaa aactatttta caacaattgg taactgcata 1380

tataagttta atatggtaac ctagaaaata ggataaatta tctataacag gatatattac 1440

attgatatta ccatgtcaaa aaatttagta agtacatgaa taatcaccgt gaaatcttca 1500

agatttctcc tataaatacc cttggtagta aatctagttt ttccattcaa gatacaacat 1560

ttctcctata gtccggatcc gcg 1583

<210> 2

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actgcacgtt gtaatatgca cgttgtaatg aatttttaac tattatatta tatcgagttg 60

cgccctgccg cc 72

<210> 3

<211> 21

<212> 1655

<213> 人工序列

<400> 3

cccaagctta aggactaaga tatacgagga tgtcaattat cataatgtag ggtctaagtt 60

ttcatttttt tttttgcatc taatagagta taattttttt taatcatcac gataacttga 120

tctacaataa tatgtactct gtttactttt acttgacacg ttttgatttt tcacgccctt 180

taagaaaaaa tgattgaaat gcataattta ccatgatact catattaatt gatgcatatt 240

ttattggatt tgagaaaatg atttgaaatg agtaataaat actgtgggta taacaggaaa 300

aaaaaattgt cttctcttaa catgcataaa gtgaagagta aaaatgaaaa tctattttta 360

gtatacatgt caaacaaaag tgaacggagg agatgacaaa ttgctaaatg gcaatagtta 420

caaaattctt caattactct ttttgcataa caaaaacact ggtctctctt gtaagtattg 480

ggtctatact tcaccaccta aagcattggc cgaagtcttt ttaaggagtt tggtagtcat 540

ttatccattt aaattaaagg gaaaataagt gaacgccatt acagcgagat gctttagggt 600

gctatttctt ggaaaaataa agtagttaaa tcttaaaaca ccctcgagga tttcaaactc 660

tagcttcact aaaacttgag ctttcttttc cactaatgtc gaaaaacgaa ataaacataa 720

gctatttaca aaaaataaaa aaatactcca tttgaatcta aagtcaagtc gtgattggga 780

taagaagata gaaatttatt tatactccag atcaagccgt gattggaatg agataataga 840

aaagtatgat agtacatgag taacatcaag ttggaaatta agggaaggaa attagagaaa 900

gaactgaaga atatccaaat attctttgcg tccaaatttg atagttattt aacgtcatcg 960

agatgacggc caactgcacg ttgtaatatg cacgttgtaa tgaattttta actattatat 1020

tatatcgagt tgcgccctgc cgcctgttca agttttccac aaatattgag aaaagaaaga 1080

agaagacaca aactgtgttt ggtattatta tagttttttc ttttagagaa ttgattgtac 1140

atataagaaa tataatataa gatttagaaa taagattatt agaaaaatca tacatcaaag 1200

tatttatttt aaattctttt tccaatggac attcccattc tgaaaaaaaa gagatataag 1260

tatggaagta aaaattaatc agatcgttaa atgtagaaaa tattaattaa cacattaacc 1320

ataaccaatc tactttattt aacaaaaagc acatctgata gatcaaaaaa gtgtttaact 1380

tcatgcattg acaatttaaa attattttgc aacatcgggt aaaactattt tacaacaatt 1440

ggtaactgca tatataagtt taatatggta acctagaaaa taggataaat tatctataac 1500

aggatatatt acattgatat taccatgtca aaaaatttag taagtacatg aataatcacc 1560

gtgaaatctt caagatttct cctataaata cccttggtag taaatctagt ttttccattc 1620

aagatacaac atttctccta tagtccggat ccgcg 1655

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagctta aggactaaga tatacgagg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatccg gactatagga gaaatgttg 29

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attcattaca acgtgcatat tacaacgtgc agtggccgtc atctcgatga cg 52

<210> 7

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtaatatgc acgttgtaat gaatttttaa ctattatatt atatcgagtt gcgccctgcc 60

gccatgttca agttttccac 80

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcaggaagtg atggagca 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgtcgcaga acattaca 18

Claims

1.基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）将响应元件盒插入所述天然启动子中任一相邻两个顺式作用元件之间，即构建得到所述双激素响应启动子；所述响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子与天然启动子中所述相邻顺式作用元件结合的转录因子之间都存在互作关系。

2.根据权利要求1所述基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，其特征在于，所述互作关系的判定包括以下步骤：

S1：根据文献或数据库查找每个顺式作用元件结合的转录因子及其编码基因；

S2：将绿色荧光蛋白GFP分成N端部分（^NGFP）和C端部分（^CGFP），在所述N端部分的编码基因的5’末端分别与响应元件盒中顺式作用元件结合的转录因子的编码基因连接，形成不同融合基因片段TF-^NGFP；在所述C端部分的编码基因的5’末端分别与天然启动子中顺式作用元件结合的转录因子的编码基因相连，形成不同的融合基因片段TF-^CGFP；

3.根据权利要求1所述基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，其特征在于，步骤2）所述插入方式为重叠延伸PCR或同源重组等。

4.根据权利要求1所述基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，其特征在于，所述的A激素和B激素可以是存在拮抗关系的激素组合。

5.根据权利要求4所述基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法，其特征在于，所述响应的激素组合为SA和JA。

6.如权利要求1~5所述方法构建的双激素响应启动子。

7.含有权利要求6所述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

8.如权利要求7所述重组表达载体在提高植物病原菌抗性方面的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述病原菌为黄萎病菌、番茄早疫病菌或白粉病菌。