ES2332456T3 - Promotor de un gen de una quitanasa del algodon. - Google Patents

Promotor de un gen de una quitanasa del algodon. Download PDF

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Abstract

Un promotor de ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo de la SEC DE ID Nº: 7, la SEC DE ID Nº: 8, la SEC DE ID Nº: 9, y la SEC DE ID Nº: 10.

Description

Promotor de un gen de una quitanasa del algodón.
La presente invención se refiere al promotor de un gen que se expresa en células con paredes secundarias durante la deposición de la pared celular secundaria.
Las células de la fibra de algodón (Gossypium hirsutum L. y otras especies de Gossypium entre las que se incluyen G. barbadense L., G. arboreum L., y G. herbaceous L.), un cultivo de enorme importancia económica en la agricultura mundial, son células epidérmicas diferenciadas de la cubierta de la semilla. En la madurez, la célula de la fibra, considerada desde el interior al exterior, está constituida por una luz celular, la pared celular secundaria, la pared celular primaria y una cutícula cérea delgada. La pared celular primaria está constituida por compuestos pécticos, componentes de hemicelulosa, celulosa, y proteínas. La pared celular está constituida principalmente (aproximadamente el 95%) por celulosa con pequeños porcentajes de otros componentes no identificados aún de manera
concluyente.
El desarrollo de la fibra de algodón está caracterizado por las etapas de iniciación, deposición de la pared celular primaria, deposición de la pared celular secundaria, y desecación. Durante la etapa de pared primaria del desarrollo de la fibra, se produce la deposición de la pared primaria para facilitar el alargamiento de la fibra. Durante la etapa de pared secundaria del desarrollo de la fibra, se produce la deposición de la pared secundaria para realizar el espesamiento de la fibra. La deposición de la pared primaria y la secundaria implica la síntesis de todos los componentes de la pared celular característicos de cada etapa y el ensamblaje de las moléculas en una pared celular organizada externa a la membrana plasmática. Se requieren muchos cientos de genes para la diferenciación y el desarrollo de la fibra de la planta. La investigación sobre las proteínas de la fibra traducidas in vitro (Delmer y col., "New Approaches to the Study of Cellulose Biosynthesis", J. Cell Sci. Suppl., 2: 33-50 (1985)), las proteínas aisladas de la fibra (Graves y Stewart, "Analysis of the Protein Constituency of Developing Cotton Fibers", J. Exp. Bot. 39: 59-69 (1988)), y el análisis de genes concretos Wilkins y col., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, p. 231-270 (1999)) sugieren claramente la expresión génica diferencial durante diversas etapas del desarrollo de la célula. Sin embargo, sólo se han identificado unos pocos de los genes implicados en la biosíntesis de gran número de proteínas, enzimas, polisacáridos, o ceras específicas de la fibra o que potencian la fibra (John y col., "Gene Expression in Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber: Cloning of the mRNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 5769-5773 (1992); John, "Characterization of a Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber mRNA (Fb-B6)", Plant Physiol., 107: 1477-1478 (1995)). Puesto que estos genes y sus interacciones con el entorno determinan la calidad de la fibra, se considera un aspecto importante su identificación y caracterización para la mejora de los cultivos de
algodón.
En particular, cómo se sintetizan las paredes celulares secundarias, cómo ayudan a la función, la adaptación, y la defensa de la planta, y cómo sus propiedades se traducen en la utilidad industrial, son preguntas importantes relacionadas con los mecanismos biológicos básicos, la ecología, y la mejora de la planta. Las paredes celulares secundarias de la planta se sintetizan en algunos tipos de células especializadas para facilitar funciones concretas, tales como la conducción a largo plazo del agua (elementos traqueales), control de la respiración (células oclusivas) y dispersión de las semillas (fibras de algodón). Estas paredes celulares secundarias tienen un contenido mayor de celulosa con elevada resistencia a la tracción, que excede normalmente del 40% en peso, y son mucho más gruesas que las paredes de las células primarias. Consiguientemente, su contenido de hemicelulosa, pectina, y proteína es reducido, produciéndose la reducción más extrema en el caso de las paredes celulares secundarias de la fibra de algodón, que tienen aproximadamente un 95% de celulosa. Por otra parte, durante la deposición de la pared primaria, el contenido de celulosa es normalmente del 9-30% (p/p) (Meinert y col., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59: 1088-1097 (1977); Darvill y col., "The Primary Cell Walls of Flowering Plants", The Biochemistry of Plants. 1: 91-162 (1980); Smook, Handbook for Pulp and Paper Technologists, Vancouver, Canada: Angus Wilde Publications, p. 15 (1992)). Debido a que las paredes celulares secundarias son fuertes y representan una fuente en volumen de celulosa química, se han explotado como importantes recursos renovables, por ejemplo, en fibras de madera y algodón.
Las células de las fibras de algodón tienen dos etapas de desarrollo distintas entre las que se incluye la deposición de la pared secundaria. Muchos estudios de aumento de longitud de la fibra y del peso, morfología, composición de la pared celular, velocidades de síntesis de la celulosa, y expresión génica han confirmado el resumen de las etapas del desarrollo de la fibra presentado a continuación, y revisiones recientes contienen referencias principales que confirman estos hechos (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, Nueva York: Haworth Press, pp. 85-112 (1999); Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", en Basra ed., Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Professing", Nueva York, Nueva York: Haworth Press, pp. 1-46 (1999); Wilkins y col., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers, en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, Nueva York: Haworth Press, pp. 231-270 (1999)). Tras el inicio de la fibra mediante abombamiento de una célula epidérmica por encima de la superficie, comienza el alargamiento de la fibra. Se requiere la deposición de la pared primaria para facilitar el alargamiento de la fibra, y la deposición de la pared primaria continúa sólo durante al menos 12 días tras el inicio de la fibra. Este periodo representa exclusivamente la etapa de la pared primaria del desarrollo de la fibra. A continuación, comienza la deposición de la pared secundaria a la vez que continúa la deposición de la pared primaria, aunque normalmente a una velocidad más lenta. Esta etapa de desarrollo de la fibra representa la transición entre la deposición de la pared primaria y la secundaria, y comienza normalmente en G. hirsutum L. entre los 14 - 17 días después de la antesis (DPA). Posteriormente, cesa el alargamiento de la fibra y la deposición de la pared primaria, normalmente entre 18 - 24 DPA, y persiste exclusivamente la deposición de la pared secundaria hasta 34 - 50 DPA. La variación en el tiempo de inicio y la duración de cada fase del desarrollo de la fibra depende del cultivar de algodón y de las condiciones de la temperatura (DeLanghe, "Lint Development" en Mauney, eds., Cotton Physiology. pp. 325-349, The Cotton Foundation, Memphis, Tennessee (1986); Haigler y col., "Cultured Cotton Ovules as Models for Cotton Fiber Development Under Low Temperatures", Plant Physiol., 95: 88-96 (1991); Thaker y col., "Genotypic Variation and Influence of Diurnal Temperature on Cotton Fiber Development", Field Crops Research, 22: 129-141 (1989)). Por ejemplo, en el G. barbadense L. que crece en campo, no se produce deposición extensiva de la pared secundaria hasta después de 20 DPA, el alargamiento continúa hasta 39 DPA, y la deposición de la pared secundaria cesa a 48 DPA (Schubert y col., "Growth and Development of the Lint Fibers of Pima S-4 Cotton", Crop Sci., 16: 539-543 (1976)).
Las velocidades de síntesis de celulosa cambian de baja, a media, alta, respectivamente, en las etapas de transición de la pared primaria y la secundaria del desarrollo de la fibra (Meinert y col., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59: 1088-1097 (1977); Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers", Tesis Doctoral, Texas Tech University, Lubbock, TX, EE.UU. (1999)). Un ejemplo se encuentra en el desarrollo de fibras en óvulos de algodón cultivados a una temperatura óptima constante de 34ºC, que maximiza la velocidad de progresión a través de las etapas del desarrollo de la fibra. Los resultados combinados procedentes de fibras en óvulos de dos cultivares de algodón de G. hirsutum L. cultivados bajo esta condición, deposición de la pared primaria junto con una velocidad baja de síntesis de celulosa se producen hasta 12 - 14 DPA, la transición entre la deposición de la pared primaria y la secundaria y una velocidad intermedia de síntesis de celulosa comienza a 14 - 16 DPA, y la deposición de la pared secundaria continua junto con una velocidad alta de síntesis de celulosa iniciándose a 16 - 21 DPA (Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers, Tesis Doctoral, Texas Tech University, Lubbock, TX, EE.UU. (1999)). Otras características bioquímicas demuestran que el inicio de la deposición de la pared secundaria mediante una velocidad intermedia de síntesis de celulosa en la etapa de transición marca un episodio de desarrollo distinto: el contenido de celulosa del nuevo material de la pared se eleva bruscamente de tal manera que el porcentaje global de celulosa en la pared de la fibra completa se dobla en un día (Meinert y col., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59: 1088-1097 (1977)), la velocidad de la respiración disminuye transitoriamente, y los combinados intercelulares en la fibra de la UDP-glucosa y la glucosa-6-P comienzan a elevarse (Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers, Tesis Doctoral, Texas Tech University, Lubbock, TX, U.S.A. (1999)). Estos son signos de un comienzo brusco de la deposición de la pared secundaria (DeLanghe, "Lint Development" en Mauney, eds., Cotton Physiology, pp. 325-349, The Cotton Foundation, Menfis, Tennessee
(1986)).
La deposición de la pared primaria y la secundaria parece estar controlada por diferentes factores genéticos (Kohel y col., "Fiber Elongation and Dry Weight Changes in Mutant Lines of Cotton", Crop Sci., 14: 471-474 (1974)), y se pueden manipular ambas etapas igualmente mediante ingeniería genética para conseguir una fibra más larga, más fuerte, más fina (diámetro más pequeño), y más madura (tal como se relaciona con el grosor de la pared secundaria) que la industria textil desea. Sin embargo, esta meta sólo se puede conseguir conociendo más acerca de los genes que controlan y contribuyen a cada etapa del desarrollo de la fibra.
Tras la maduración de las fibras, se abre la cápsula protectora y la fibra seca cuelga a menudo durante diversas semanas en la planta hasta que el cultivo completo madura (a no ser que se detenga por muerte con temperaturas frías) y se para el crecimiento vegetativo o se detiene químicamente para permitir la cosecha. Durante este periodo, las fibras se someten a degradación por la actividad enzimática de los hongos, que está potenciada por el tiempo otoñal húmedo (Simpson y col., "The Geographical Distribution of Certain Pre-Harvest Microbial Infections of Cotton Fiber in the U.S. Cotton Belt", Plant Disease Reporter, 55: 714-718 (1971)). En algunos años, este tiempo de espera en el campo produce un deterioro sustancial de la calidad de la fibra de tal manera que el productor recibe un precio reducido y se pone en peligro la producción de hilos y tejidos de calidad.
Debido particularmente a su papel defensivo en plantas (Gooday, "Aggressive and Defensive Roles for Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basel, pp. 157-170 (1999)), se han caracterizado numerosos genes y proteínas quitinasas en diversas especies de plantas. El gen de la quitinasa y la familia de proteínas han sido el sujeto de muchas revisiones (que incluyen Graham y col., "Cellular Coordination of Molecular Responses in Plant Defense", Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI, 4: 415-422 (1991); Cutt y col., "Pathogenesis-Related Proteins", en Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense Springer Verlag/Nueva York. pp. 209-243 (1992); Meins y col., "The Primary Structure of Plant Pathogenesis-Related Glucanohydrolases and Their Genes", en Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense, Springer Verlag/Nueva York, p. 245-282 (1992); Collinge y col., "Plant Chitinases", Plant J. 3: 31- 40 (1993); Sahai y coll., "Chitinases of Fungi and Plants: Their Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction", FEMS Microbiology Rev., 11: 317-338 (1993); Meins y col., "Plant Chitinase Genes", Plant Molecular Biology Reporter, 12: 522-528 (1994); Hamel y col., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", Journal of Molecular Evolution, 44: 614-624 (1997)) y un libro editado (Jolles, eds. Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basel, 340 pp (1999)). Estas Fuentes contienen muchas Referencias principales de los hechos bien conocidos resumidos a continuación. Las quitinasas están entre un grupo de genes que son inducibles en plantas mediante ataque patógeno, que corresponden a la frecuente incidencia de la quitina en las paredes de las células fúngicas y en los exoesqueletos de los insectos. En su papel defensivo, las quitinasas catalizan la hidrólisis de la quitina. La quitina estructural se produce como microfibrillas cristalinas compuestas de un homopolímero lineal de \beta-1,4 unido a residuos de N-acetil-D-glucosamina, (GlcNAc)_{n}. La hidrólisis de la quitina defiende la planta contra predadores o patógenos, concretamente hongos invasores, mediante debilitamiento o disolviendo su estructura corporal. Especialmente en combinación con las \beta-1,3-glucanasas, que sirven para descubrir las microfibrillas de quitina, las quitinasas pueden inhibir el crecimiento de muchos hongos produciendo lisis de la punta de las hifas debido a un debilitamiento de la pared de las hifas. Se ha demostrado esto mediante la inhibición del crecimiento celular en cultivos así como en plantas transgénicas que presentan daño reducido de patógenos en correlación con un aumento en la actividad de la quitinasa. Se ha caracterizado anteriormente la expresión o la actividad génica de las quitinasas con probable función defensiva en hojas y raíces de algodón (Liu y col., "Detection of Pathogenesis-Related Proteins in Cotton Plants", Physiological and Molecular Plant Pathology, 47: 357-363 (1995); Hudspeth y col., "Characterization and Expression of Chitinase and 1,3-b-Glucanase Genes in Cotton", Plant Molecular Biology, 31: 911-916 (1996); Dubery y col., "Induced Defence Responses in Cotton Leaf Disks by Elicitors From Verticillium dahliae", Phytochemistry, 44: 1429-1434 (1997)).
Se inducen algunas quitinasas tras invasión fúngica, y se acumulan alrededor de las hifas fúngicas invasoras (Benhamou y coll., "Subcellular Localization of Chitinase and Its Potential Substrate in Tomato Root Tissues Infected With Fusarium Oxysporium F. Sp. Radicislycopersici", Plant Physiology, 92: 1108-1120 (1990); Wubben y coll., "Subcellular Localization of Plant Chitinases and 1,3-b-Glucanases in Cladosporium Fulvum (Syn. Fulvia Fulva)-Infected Tomato Leaves", Physiological and Molecular Plant Pathology 41: 23-32 (1992)). Otras quitinasas se producen aparentemente de manera constitutiva en partes de la planta que son particularmente susceptibles a la invasión tales como células epidérmicas, células corticales de la raíz, estomas, partes de la flor, y células vasculares. Ambas conclusiones surgen de la localización del ARNm mediante hibridación in situ y análisis de los modelos de expresión del gen indicador GUS bajo el control de los promotores de las quitinasas (Samac y col., "Developmental and Pathogen-Induced Activation of the Arabidopsis Acidic Chitinase Promoter", The Plant Cell. 3: 1063-1072 (1991); Zhu y col., "Stress Induction and Developmental Regulation of a Rice Chitinase Promoter in Transgenic Tobacco", The Plant Journal, 3: 203-212 (1993); Büchter y col., "Primary Structure and Expression of Acidic (Class II) Chitinase in Potato", Plant Molecular Biology, 35: 749-761 (1997); Ancillo y col., "A Distinct Member of the Basic (Class I) Chitinase Gene Family in Potato is Specifically Expressed in Epidermal Cells",. Plant Molecular Biology, 39: 1137-1151 (1999)). En otro caso de posible anticipación de la invasión fúngica en tejidos perturbados, el etileno induce quitinasas en zonas de separación de la alubia (del Campillo y col., "Identification and Kinetics of Accumulation of Proteins Induced by Ethylene in Bean Abscission Zones", Plant Physiology 98: 955-961 (1991)). Ninguno de estos estudios incluyó el análisis de fibras de algodón o mostro la presencia de actividad de quitinasa o proteínas relacionadas con la quitinasa en fibras de algodón.
Otros estudios muestran que algunas quitinasas tienen un papel en el desarrollo en las plantas, aunque la auténtica quitina estructural no es una parte natural del cuerpo de la planta (Meins y col., "The Primary Structure of Plant Pathogenesis-Related Glucanohydrolases and Their Genes", In Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense, Springer Verlag/Nueva York, p. 245-282 (1992)). Se ha demostrado que las isoformas de la quitinasa con papeles en el desarrollo son al menos a veces distintas de aquellas con papeles en las respuestas al estrés y a la defensa (Mauch y col., "Antifungal Hydrolases in Pea Tissue. I. Purification and Characterization of Two Chitinases and Two b-1,3-Glucanases Differentially Regulated During Development and in Response to Fungal Infection", Plant Physiology 87: 325-333 (1988)). Las quitinasas defensivas se unen a tramos cortos (probablemente de 3-6 residuos) de una cadena de N-acetil-glucosamina única antes de romperse en la unión inter azúcares (Robertus y col., "The Structure and Action of Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases Birkhäuser Verlag: Basel, pp. 125-136 (1999)). Por tanto, las enzimas en la familia de las quitinasas se pueden unir también a oligómeros de N-acetil-glucosamina dentro de otras moléculas tales como glicoproteínas o moléculas de señalización. Dichas moléculas pueden tener papeles en la transducción de la señal para regular las cascadas de expresión génica requeridas para las transiciones en el desarrollo o en los procesos biosintéticos que implementan el programa de desarrollo.
Investigaciones anteriores sobre la regulación de la deposición de la pared secundaria o la función a nivel molecular se centraron en unos pocos genes implicados en la biosíntesis de celulosa, hemicelulosa, lignina, o proteínas. Entre estas rutas, la síntesis de lignina ha sido la más completamente explorada y manipulada en plantas transgénicas (Merkle y col., "Forest Biotechnology", Current Opinion in Biotechnology, 11: 298-302 (2000)). Sin embargo, las fibras de algodón no contienen lignina (Haigler, "The Functions and Biogenesis of Native Cellulose", en Zeronian, eds., Cellulose Chemistry and Its Applications, Ellis Horwood: Chichester, Inglaterra, pp. 30-83 (1985)). Los polisacáridos de la hemicelulosa dentro de algunas paredes secundarias incluyen xilanos y glucomananos, pero las paredes secundarias de la fibra de algodón no contienen cantidades significativas de ninguna molécula similar (Haigler, "The Functions and Biogenesis of Native Cellulose", en Zeronian, eds., Cellulose Chemistry and Its Applications, Ellis Horwood: Chichester, Inglaterra, pp. 30-83 (1985)). Únicamente se han identificado dos proteínas con posibles papeles estructurales en la pared secundaria de la fibra de algodón. Una de éstas, H6, es una proteína de tipo arabinogalactano que se acumula a niveles detectables durante la deposición de la pared secundaria, aunque la expresión de su gen comienza durante el alargamiento rápido, que incluye la deposición de la pared primaria (John y col., "Characterization of mRNA for a Proline-Rich Protein of Cotton Fiber", Plant Physiology, 108: 669-676 (1995)). La segunda, FbL2A, carece de homología con cualquier proteína conocida, pero su secuencia muy repetitiva y la elevada hidrofilicidad sugieren que puede tener un papel estructural o proteger las fibras de algodón durante la desecación. La expresión de su gen comienza débilmente en la transición de la pared primaria a la secundaria (15 DPA) y es más fuerte en el 20 DPA (Rinehart y col., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112: 1331-1341 (1996)).
Las enzimas que aumentan la expresión génica y/o la actividad durante la deposición de la pared secundaria y que se refieren a la regulación de la síntesis de celulosa incluyen la celulosa sintasa, la sacarosa sintasa, la sacarosa fosfato sintasa, y la UDP-glucosa fosforilasa (Basra y col., "Sucrose Hydrolysis in Relation to Development of Cotton (Gossypium spp.) Fibres", Indian Journal of Experimental Botany, 28: 985-988 (1990); Wäfler y col., "Enzyme Activities in Developing Cotton Fibers", Plant Physiology and Biochemistry, 32: 697-702 (1994); Amor y col., "A Membrane-Associated Form of Sucrose Synthase and its Potential Role in Synthesis of Cellulose and Callose in Plants", Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 92: 9353-9357 (1995); Pear y col., "Higher Plants Contain Homologs of the Bacterial celA Genes Encoding the Catalytic Subunit of Cellulose Synthase", Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 93: 12637-12642 (1996); Tummala, "Response of Sucrose Phosphate Synthase Activity to Cool Temperatures in Cotton", tesis de licenciatura, Texas Tech University, Lubbock, TX (1996)). UDP-glucosa pirofosforilasa convierte la glucosa-1-P en UDP-glucosa o media la reacción inversa. En el contexto de la síntesis de celulosa, se cree que la sacarosa sintasa degrada la sacarosa y suministra UDP-glucosa a la celulosa sintasa. La celulosa sintasa transfiere la glucosa al polímero de celulosa \beta-1,4 unido alargado mientras que la UDP libre se recicla a sacarosa sintasa. La sacarosa fosfato sintasa puede usar fructosa-6-P (que deriva, por ejemplo, de la fructosa liberada mediante la acción degradativa de la sacarosa sintasa) y la UDP-glucosa para sintetizar sacarosa adicional para apoyar la síntesis de celulosa (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, pp. 85-112 (1999)).
Todas las enzimas descritas hasta el momento operan con las rutas del metabolismo de los azúcares que conduce a la formación del polímero de glucano \beta-1,4-unido. La evidencia de otros sistemas y fibras de algodón implica otros puntos posibles de regulación de la síntesis de celulosa coincidentes o después de la formación del polímero de glucano, aunque las rutas y proteínas relevantes se comprenden de manera incompleta. Los ejemplos de otras proteínas relevantes incluyen \beta-1,4-glucanasa, que puede actuar como una editora de cadena de glucano o en algún otro papel (Delmer, "Cellulose Biosynthesis: Exciting Times For a Difficult Field of Study", Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol., 50: 245-276 (1999)) y las glicoproteínas, que pueden actuar como cebadores para la biosíntesis de celulosa (Lukowitz y coll., "Arabidopsis cyt1 Mutants are Deficient in a Mannose-1-Phosphate Guanyltransferase and Point to a Requirement of N-Linked Glycosylation for Cellulose Biosynthesis", Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 98: 2262-2267 (2001)). Las mutaciones que infrarregulan la síntesis de \beta-1.4-glucanasa o la glicoproteína producen un contenido de celulosa reducido en otros sistemas (Nicol y col., "Plant Cell Expansion: Scaling the Wall", Current Opinion in Cell Biology, 1: 12-17 (1998); Lukowitz y col., "Arabidopsis cyt1 Mutants are Deficient in a Mannose-1-Phosphate Guanyltransferase and Point to a Requirement of N-Linked Glycosylation for Cellulose Biosynthesis", Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 98: 2262-2267 (2001)). En Arabidopsis, la mutación de los genes de la celulosa sintasa específicos de la pared secundaria del xilema produce un contenido de celulosa reducido y paredes del xilema débiles (Turner y col., "Collapsed Xylem Phenotype of Arabidopsis Identifies Mutants Deficient in Cellulose Deposition in the Secondary Cell Wall", Plant Cell, 9: 689-701 (1997)). En el algodón, el aumento en la expresión de la sacarosa fosfato sintasa de espinaca produce un aumento en el contenido de celulosa en las paredes de las fibras de las plantas que crecen en un ciclo nocturno frío (Haigler y col., "Transgenic Cotton Over-Expressing Sucrose Phosphate Synthase Produces Higher Quality Fibers With Increased Cellulose Content and Has Enhanced Seed Cotton Yield", Abstract 477. En: Proceedings of Plant Biology 2000, 15-19 de Julio, San Diego, CA, American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, (2000)). Estos hallazgos indican que es posible manipular la cantidad de celulosa en las paredes secundarias, pero actualmente existe una identificación insuficiente de los genes diana que se pueden manipular
beneficiosamente.
Los estudios que identifican genes que están bajo regulación específica de tejido y del desarrollo son importantes en la comprensión de los papeles de las proteínas en el desarrollo de la fibra y la arquitectura de la pared celular (John, "Structural Characterization of Genes Corresponding to Cotton Fiber mRNA, E6: Reduced E6 Protein in Transgenic Plants by Antisense Gene", Plant Mol. Biol. 30: 297-306 (1996)). Además, dichos genes y sus elementos reguladores son herramientas importantes para la modificación de la fibra mediante ingeniería genética (John, "Prospects for Modification of Fibers Through Genetic Engineering of Cotton", en Gebelein, eds., Industrial Biotechnological Polymers, Lancaster, PA: Technomic, pp. 69-79 (1995); John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 271 - 289 (1999)).
En muchos casos, sería deseable regular el desarrollo de un transgén para tener una expresión exclusiva o preferente en las células de la fibra en una etapa de desarrollo apropiada. Esta regulación se puede llevar a cabo con la mayor prontitud por un promotor capaz de promoción preferente.
Los promotores son elementos de ADN que dirigen la transcripción del ARN en las células. Junto con otros elementos reguladores que especifican la expresión génica del tejido y la especificidad temporal, los promotores controlan el desarrollo de los organismos. De esta manera, existe un esfuerzo concertado en la identificación y el aislamiento de promotores procedentes de una amplia variedad de plantas y animales.
Muchos promotores funcionan adecuadamente en sistemas heterólogos. Por ejemplo, los promotores tomados de genes de plantas tales como rbcS, Cab, calcona sintasa, y el inhibidor de la proteasa de tabaco y Arabidopsis son funcionales en plantas transgénicas heterólogas. (Benfey y col., "Regulated Genes in Transgenic Plants", Science. 244: 174-181, (1989)). Los ejemplos específicos de plantas transgénicas incluyen la expresión regulada específica de tejido y del desarrollo del gen de la proteína de almacenamiento de las semillas de soja 7s en las plantas transgénicas de tabaco (Chen y col., "A DNA Sequence Element That Confers Seed-Specific Enhancement to a Constitutive Promoter", EMBO J., 7: 297-302, (1988)) y la expresión específica de órgano dependiente de la luz del promotor del gen de la proteína de unión con la clorofila a/b de Arabidopsis thaliana en tabaco transgénico. (Ha y col., "Identification of Upstream Regulatory Elements Involved in the Developmental Expression of the Arabidopsis thaliana Cab-1 Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:8017-8021, (1988)). De manera similar, se demostró la actividad del promotor de la sacarosa sintasa-1 de maíz inducible anaeróbicamente en tabaco transgénico (Yang y col., "Maize Sucrose Synthase-1 Promoter Directs Phloem Cell-Specific Expression of Gus Gene in Transgenic Tobacco Plants", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 4144-4148, (1990)). Se encontró que los promotores del polen de tomate dirigían la expresión génica específica de tejido y del desarrollo en Arabidopsis y tabaco transgénicos (Twell y col., "Pollen-Specific Gene Expression in Transgenic Plants Coordinate Regulation of Two Different Tomato Gene Promoters During Microsporogenesis", Development, 109: 705-714, (1990)). De esta manera, se pueden utilizar algunos promotores de plantas para expresar proteínas extrañas en tejidos de plantas en una manera de desarrollo
regulado.
Se ha mostrado la expresión regulada específica de tejido y del desarrollo de los genes en fibras de plantas. Algunos de estos, tales como E6, ATPasa vacuolar, y proteínas de tipo transferencia de lípidos, tienen una fuerte expresión en las fibras de algodón durante la deposición de la pared primaria (Wilkins y col., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, p. 231-270 (1999); Orford y col., "Expression of a Lipid Transfer Protein Gene Family During Cotton Fibre Development", Biochimica and Biophysica Acta, 1483: 275-284 (2000)). Otros genes muestran expresión transitoria durante el desarrollo de la fibra. Por ejemplo, Rac se expresa transitoriamente en la transición de la etapa de la pared primaria a la secundaria (Delmer y col., "Genes Encoding Small GTP-Binding Proteins Analogous to Mammalian Rac are Preferentially Expressed in Developing Cotton Fibers", Mol. Gen. Genet., 248: 43-51 (1995)) y otra proteína de tipo transferencia de lípidos, FS18A (Orford y col., "Characterization of a Cotton Gene Expressed Late in Fibre Cell Elongation", Theoretical and Applied Genetics, 98: 757-764 (1999)), se expresa transitoriamente a los 24 DPA durante la deposición de la pared secundaria, pero, después de que el promotor de este gen haya comenzado la actividad durante la deposición de la pared primaria, existe un control postraduccional de la expresión génica de tal manera que la proteína H6 se acumula sólo durante la deposición de la pared secundaria a los 15 - 40 DPA (John y col., "Characterization of mRNA for a Proline-Rich Protein of Cotton Fiber", Plant Physiology, 108: 669-676 (1995)). Al nivel de la expresión génica, únicamente se ha mostrado anteriormente que algunos genes de la celulosa sintasa tienen la expresión preferente y prolongada en las fibras de algodón durante la deposición de la pared secundaria, aunque existen bajos niveles de expresión durante la deposición de la pared primaria y en otras partes de la planta. Además, la celulosa sintasa no muestra una expresión fuerte hasta los 20 DPA, con sólo una expresión débil observada a los 17 DPA (Pear y col., "Higher Plants Contain Homologs of the Bacterial celA Genes Encoding the Catalytic Subunit of Cellulose Synthase", Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 93: 12637-12642 (1996)). Otro gen, FbL2A, está sobrerregulado en la transición de la pared primaria a la secundaria (débilmente a los 15 DPA y fuertemente a los 20 DPA) (Rinehart y col., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112: 1331-1341 (1996)).
Cualquiera de los genes expresados en las fibras de algodón son candidatos para contener promotores útiles, siendo un tipo concreto de promotor útil aquellos que se expresan en fibras y/o células de la pared secundaria en comparación con otros tipos celulares y/o etapas de desarrollo. Los promotores que se expresan preferentemente durante la etapa de la pared primaria del desarrollo de la fibra tendrán usos concretos. Puede ser ventajoso tener promotores que se expresen en algodón y algunos tipos restringidos de células (por ejemplo, células de la pared secundaria) en otras partes de la planta de algodón. Son también valiosos los promotores con diferente fuerza debido a que las diferentes metas de la ingeniería genética se pueden mejor llevar a cabo teniendo diferentes cantidades de la proteína extraña presentes en la célula o el tejido. La industria de la biotecnología que trata con cualquier especie concreta deseará y necesitará de manera última una "secuencia herramienta" de los promotores con el fin de que se puedan escoger los más apropiados para un uso concreto. Cada promotor tendrá una combinación de características únicas en términos de célula, tejido o especificidad del desarrollo de impulsión de la expresión génica, fuerza de la expresión génica, grado de susceptibilidad a efectos posicionales de la inserción génica en el nivel de la expresión génica, susceptibilidad al silenciamiento del gen, y cualquier número de otros fenómenos similares que afectan a la
transcripción.
Se han aislado y ensayado unos pocos promotores de genes expresados en fibras de algodón en algodón transformado de manera estable y con relación a dos o más puntos temporales en el curso de tiempo del desarrollo de la fibra, en el que las fusiones de los promotores implicados en el ensayo con genes "indicadores" o genes que son parte de estrategias de ingeniería genética presuntamente útiles. Se observaron tres modelos principales, uno tipificado por el promotor Gh10 (para una proteína vehículo de acilo), que impulsa la expresión del gen extraño a lo largo del desarrollo de la fibra (Song y col., "Expression of a Promoter from a Fiber-Specific Acyl Carrier Protein Gene in Transgenic Cotton Plants", Proc. Beltwide Cotton Conf., 1: 486-488 (1998)). Se tipificó un segundo modelo mediante el promotor E6, que impulsa la expresión génica preferentemente en la etapa de la pared primaria del desarrollo de la fibra de algodón (Patente de los Estados Unidos Nº 5.521.078 de John). Se muestra un tercer modelo mediante el promotor del gen FbL2A. Se ensayó este promotor mediante la fusión de dos genes indicadores (ácido polihidroxialcanoico sintasa o PHA sintasa, una enzima que se detectó con un anticuerpo específico, y acetoacetil-CoA reductasa, un enzima con actividad que se vigiló mediante el ensayo del enzima y la transformación del algodón (Rinehart y col., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology 112: 1331-1341 (1996)). Sin embargo, mediante el uso de dos constructos del promotor/gen indicador, se proporcionaron datos parcialmente contradictorios sobre la utilidad del promotor del FbL2A. Cuando el gen de la acetoacetil-CoA reductasa estuvo bajo el control del promotor FbL2A, se detectó la actividad de la acetoactil-CoA reductasa en las fibras de algodón durante la deposición de la pared primaria a los 5 - 10 DPA, y fueron consistentes, la actividad sustancial en los 20 DPA durante la deposición de la pared secundaria, la actividad del pico a los 35 DPA, y la actividad continuada hasta los 45 DPA entre una familia de plantas transformadas independientemente (Rinehart y col., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112: 1331-1341 (1996)). Sin embargo, la actividad del enzima tras los 20 DPA podría deberse al ARN mensajero de vida larga o a la proteína sintetizada a los 15-20 DPA, que es el periodo en el que los datos muestran directamente la expresión del gen FbL2A bajo el control de su propio promotor. En contraste, cuando el gen de la PHA sintasa estuvo bajo el control del promotor FbL2A, la transferencia Western para detectar inmunológicamente la PHA sintasa en una planta transformada mostro sólo una señal muy débil durante la deposición de la pared secundaria a los 20 DPA, una señal traza a los 25 DPA, y sin señal a los 30 o 35 DPA (Rinehart y col., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112: 1331-1341 (1996)). Además, se correlacionó el gen de la PHA sintasa bajo el control del promotor 35S presuntamente constitutivo del virus CaMv con la detección de la proteína PHA sintasa fuertemente durante la deposición de la pared primaria a los 10 DPA y continuando débilmente hasta los 35 DPA de la deposición de la pared secundaria. Los modelos comparativos durante la deposición de la pared secundaria son consistentes con la expresión transitoria del promotor FbL2A alrededor de los 20 DPA de la deposición de la pared secundaria. Los datos muestran también que el promotor FbL2A impulsará débilmente la expresión del gen extraño en las fibras de algodón durante la deposición de la pared primaria (Rinehart y col., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112: 1331-1341 (1996)). Además, los datos de la gráfica en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.211.430 de John mostraron que la actividad del promotor FbL2A no fueron sustanciales hasta los 20 DPA (aproximadamente, pasados 5 días del comienzo de la deposición de la pared secundaria) y que el 50% de la actividad máxima de la acetoacetil-CoA reductasa extraña no fue detectable hasta los 31 DPA (aproximadamente, pasados 16 días del comienzo de la deposición de la pared secundaria).
De esta manera, sería útil tener un promotor que impulsara la expresión génica preferible y fuertemente en las fibras de las células de la pared secundaria, en particular, la deposición a través de la pared secundaria, es decir, fuerte y continuamente (por ejemplo, a \geq 50% de su actividad máxima) a partir del inicio de la deposición de la pared secundaria hasta su terminación. El inicio de la deposición de la pared secundaria se define como el tiempo en el que la unidad de peso/longitud de una fibra de algodón comienza a aumentar cuando el peso seco/área superficial del órgano de cualquier célula comienza a aumentar mediante la síntesis de nuevo material de la pared que contiene más de un 30% (p/p) de celulosa. En el caso de la fibra de algodón de G. hirsutum L., se espera que esto se produzca entre los 14 - 17 DPA cuando las plantas de algodón se hacen crecer en condiciones normales en el invernadero o el campo (temperatura durante el día de 26-34ºC, temperatura durante la noche de 20-26ºC, intensidad de la luz mayor que o igual a 1000 \mueinsteins/m^{2}/s, con agua y nutrición mineral adecuadas). Además, sería útil tener un promotor que impulsara la expresión génica sólo o preferentemente en las células de la pared secundaria tales como fibras excluyendo o minimizando a la vez la expresión en otros tipos de células.
La presente invención se dirige a conseguir estos objetivos.
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Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un promotor de ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 9, y la SEC DE ID Nº: 10.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un constructo de ADN que comprende: un promotor de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC DE ID Nº: 7, SEC DE ID Nº: 8, SEC DE ID Nº: 9, y la SEC DE ID Nº: 10; un segundo ADN que codifica una proteína o polipéptido heterólogo, en el que el promotor de ADN se une de manera operable 51 al segundo ADN para inducir la transcripción del segundo ADN; y una región 3' reguladora que se une de manera operable al segundo ADN.
En una forma de realización preferida, la segunda molécula de ADN se expresa durante la deposición de la pared secundaria. En otra forma de realización, las células de la pared secundaria son fibras de algodón. En otras formas de realización, la segunda molécula de ADN se puede expresar en las fibras de algodón comenzando de los 14 a los 17 DPA (días después de la antesis), o se puede expresar en las fibras de algodón hasta la terminación de la deposición de la pared secundaria o se puede expresar en las fibras de algodón hasta los 40 DPA.
Se puede seleccionar el segundo ADN del constructo de ADN anteriormente mencionado de acuerdo con la presente invención entre el grupo constituido por las celulosa sintasas heterólogas, tanto en forma normal como mutada; los genes que modulan la repartición del carbono en la celulosa; los genes para cristalizar simultáneamente los polímeros de proteínas o las regiones de unión con la celulosa y que sintetizan polisacáridos y otros enzimas que pueden afectar las propiedades moleculares y biofísicas de la celulosa, los factores de transcripción que prolongan el alargamiento del crecimiento y/o cambian el momento oportuno o la extensión de la deposición de la pared secundaria; los genes que afectan la síntesis de las hormonas de la planta y cambian las propiedades de la fibra; los genes de elementos citoesqueléticos o proteínas asociadas al citoesqueleto que afectan las propiedades de la fibra; los genes que sintetizan lípidos o modifican las enzimas que cambian las propiedades de la membrana y mejoran la calidad de la fibra; los genes de los enzimas que, a través del aumento o la disminución de la actividad, prolongan o aumentan la extensión del crecimiento durante la deposición de la pared secundaria, los genes de proteínas o polímeros plásticos que se retienen en la luz de la fibra o se integran en la pared celular para aumentar la resistencia de la fibra o cambiar sus propiedades textiles, los genes de las enzimas biosintéticas de la matriz de la pared celular de la planta o sus proteínas reguladoras de tal manera que podrían integrarse otros carbohidratos en la pared celular y cambiar las propiedades de la fibra; los genes de moléculas que confieren color a las fibras: los genes de moléculas que cambian la absortividad y la resistencia de las fibras de algodón, o los genes de la moléculas de transducción de la señal que regulan los cambios entre las etapas de desarrollo de las fibras. En una forma de realización preferida, el segundo ADN es un gen que modula la repartición del carbono en la celulosa y codifica la celulosa sintasa, la sacarosa sintasa, la sacarosa fosfato sintasa, la UDPG-pirofosforilasa, la pirofosfatasa inorgánica, las hexoquinasas, y las invertasas.
La presente invención se refiere también a un sistema de expresión que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la presente invención y una célula huésped, preferiblemente una célula bacteriana tal como una célula de Agrobacterium o la célula de la planta transformada con dicho constructo de ADN. La célula huésped puede ser también una célula de planta procedente de una planta seleccionada entre un grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.
En otra forma más de realización, la presente invención proporciona una planta, tal como una planta seleccionada entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp, que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la presente invención.
La invención se refiere también a una semilla de planta que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para expresar un gen preferentemente en las células de la pared secundaria, tales como las fibras de algodón, durante la deposición de la pared secundaria en una planta tal como una planta procedente del grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp, que comprende: transformar una planta con el constructo de ADN de acuerdo con la presente invención.
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Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una imagen autorradiográfica en película de un gel de los fragmentos de ADNc marcados que surgen a lo largo de la técnica de muestreo diferencial del ARN aislado procedente de fibras de algodón de 18 y 12 DPA, respectivamente, de Gossypium hirsutum cv. Coker 312. Las flechas apuntan a la única banda de las fibras de algodón a los 18 DPA que corresponde al gen denominado posteriormente F285 y que muestra tener homología con las quitinasas.
La Figura 2 muestra una transferencia Northern expuesta a película durante la noche que muestra el ARN total aislado procedente de diversos tejidos de algodón. El marco superior muestra la incubación con una sonda con F285, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda con ARN de 18 S para mostrar el nivel comparativo de carga de ARN en cada banda, que se pretenda que sea 15 \mug/banda.
La Figura 3 muestra una transferencia Northern, que ilustra un curso de tiempo más detallado de desarrollo de la fibra. El marco superior muestra la incubación con una sonda con F285, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda con ARN de 18S para mostrar el nivel comparativo de carga de ARN en cada banda.
La Figura 4 ilustra la detección de la actividad de la quitinasa en extractos de proteínas de diversos tejidos como sigue:
Zona 1:
Fibras en crecimiento en invernadero a los 8 DPA, no tratadas antes de la extracción de las proteínas
Zona 2:
Fibras en crecimiento en invernadero a los 17 DPA, no tratadas antes de la extracción de las proteínas
Zona 3:
Fibras en crecimiento en invernadero a los 24 DPA, no tratadas antes de la extracción de las proteínas
Zona 4:
Fibras en crecimiento en invernadero a los 31 DPA, no tratadas antes de la extracción de las proteínas
Zona 5:
Hojas de 18 días, no tratadas antes de la extracción de las proteínas
Zona 6:
Hojas de 18 días, tratadas con agua a los 16 días después de la plantación
Zona 7:
Hojas de 18 días, tratadas con ácido salicílico (SA) a los 16 días después de la plantación
Zona 8:
Control negativo (Agua)
Zona 9:
Fibras cultivadas a los 8 DPA, tratadas con agua
Zona 10:
Fibras cultivadas a los 8 DPA, tratadas con SA en los 6 DPA
Zona 11:
Control negativo (solución BSA)
Zona 12:
Control positivo (Quitinasa bacteriana comercial)
La Figura 5 muestra una transferencia Northern, que ensaya la inducción por SA o etefón (ETH) de la expresión de F285. El marco superior muestra la incubación con una sonda con F285, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda con ARN de 18S para mostrar el nivel comparativo de carga de ARN en cada banda. Se indicaron el tejido y el pretratamiento, si acaso, anteriormente en cada banda. Se aplicaron los tratamientos, si acaso, a los semilleros 16 días después de la plantación, y se cosecharon lo órganos dos días más tarde. Se aplicaron los tratamientos, si acaso, a los óvulos a los 6DPA produciéndose la cosecha a los 8 DPA.
La Figura 6 muestra una transferencia Southern de un ADN genómico de algodón digerido con los enzimas de restricción EcoRI e Hind III y sondado con el ADNc de longitud completa de F285 y, posteriormente, con un fragmento de otro miembro de su familia de genes, TAG1.
La Figura 7 muestra una transferencia Northern que ensaya la expresión con TAG 1. El marco superior muestra la incubación con una sonda con TAG1, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda con ARN de 18S para mostrar el nivel comparativo de carga de ARN en cada banda. Se indicaron anteriormente en cada banda los tejidos ensayados, incluyendo raíces, tallos, y hojas, y óvulos desnudos a los 18 DPA, fibras a los 8 DPA, y fibras a los 24 DPA.
La Figura 8 es una representación esquemática de los constructos de plásmidos que contienen promotores de diferente longitud que se usaron para los experimentos de transformación.
Las Figuras 9A-B muestran semillas de algodón con fibra unida de plantas transformadas con el promotor/GUS. Se señala la edad de las semillas (DPA) en las fotografías. La fotografía de 13 - 17 DPA (Figura 9A) es desde la línea 1,8-16-17b. La fotografía de 21, 27 y 40 DPS (Figura 9B) es desde las línea 2,2-7-14b, 2,2-47-5a, y 2,2-55-1a, respectivamente. Se observaron resultados consistentes para muchas líneas de las tres longitudes del promotor. Se produjo la incubación con sustrato durante 1 h. No fue evidente color azul en los 13 DPA. Se produjo color muy ligeramente azul en algunas zonas de la fibra en los 14 DPA, se desarrolló un azul intenso en algunas zonas en los 16 DPA, y se produjo azul brillante uniforme en los 17 DPA. En las fibras vivas, persistió el color azul intenso hasta al menos los 40 DPA, el último día del ensayo. Se apartaron algunas fibras procedentes de las semillas de 27 DPA para mostrar que las células sin fibra de la epidermis de la semilla no expresan GUS.
Las Figuras 10A-D ilustran que las hilas cortas permanecieron blancas, mientras que la fibre de hila fue intensamente azul. La Figura 10A muestra que, cuando se eliminó la fibra de hila procedente de la semilla, unos flecos de hilas blancas revisten la fibra de hila restante (línea 2,2-47-1c). La Figura 10B muestra que las hilas cortas (centro de la fotografía) se arrancaron selectivamente y se colocaron próximas a la fibra de hila azul que se mantenía unida todavía a la semilla (esquina derecha superior) (línea 2,2-47-5a). Las Figuras 10C-D muestran que las hilas (línea 1,4-8-8a) estuvieron vivas y encastradas en la deposición de la pared secundaria, tal como se muestra por las microfibrillas helicoidales (Figura 10C, DIC y flecha) y las gruesas paredes que rodean un protoplasto granular (Figura 10D, campo luminoso).
Las Figuras 11A-B muestran micrografías de la misma zona de tejido de peciolo incluido y seccionado (línea 2,2-2-2a) que muestran óptica de campo luminoso (Figura 11A) y óptica de polarización (Figura 11B). La birrefringencia blanca en la óptica de polarización indica la presencia de material cristalino tal como celulosa, y gruesas paredes secundarias con microfibrillas de celulosa muy ordenadas que muestran birrefrigencia mucho más luminosa. Un procedimiento de parafina incluida estimulado por microondas (Ruzin, Plant Microtechnique and Microscopy, 322 pp, Oxford Univ. Press, Oxford (1999), que se incorpora por tanto por referencia en su totalidad, permitió preservar el cambium delicado (Figura 11A, flecha doble), que contiene cristales birrefringentes. El xilema está en la parte inferior, y el floema en la parte superior, esquina izquierda. En la Figura 11A, el color azul surge de que la actividad de GUS en dos células de floema e intensa en algunas células de xilema. La comparación de la imagen de polarización muestra que todas las células azules tienen paredes celulares más gruesas, tal como se indicó mediante la birrefringencia blanca luminosa, y que GUS a menudo no se expresa en las células adyacentes que no han comenzado a engrosar sus paredes. Las células con las paredes más gruesas (visibles mediante DIC y polarización) no expresaron GUS debido a que su programa de desarrollo estaba ya completo y murieron para convertirse en células conductoras o fibras de soporte en el tejido vascular.
Las Figuras 12A-B ilustran la comparación de la intensidad de tinción en fibras en comparación con otros tejidos. La fibra con \geq 17 DPA se tió de azul oscuro tras 1h (Figuras 12A y B), pero los tejidos vegetales en líneas con expresión moderada tuvieron teñido visible únicamente tras 4-24 h (Figura 12A; línea 1.8-16-7b). (La tinción durante 4 h era usualmente equivalente a la tinción durante 24 h. Las secciones de 1h y de 24 h son adyacentes en la planta.) En las líneas que expresan más fuerte, los tegidos vegetales también tuvieron tinción visible tras 1 h (Figura 12B; línea 2.2-47-5a).
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Descripción detallada de la invención
Se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico aislada de algodón que codifica una quitinasa endógena de algodón. La molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria.
La expresión preferente en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria significa la expresión génica en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria a un nivel de más de 100 veces mayor que en otros tipos de células o en otras etapas del desarrollo celular. Se pueden evaluar los niveles comparativos de expresión génica mediante diversas técnicas moleculares normalizadas que incluyen la transferencia Northern semicuantitativa y la PCR cuantitativa en tiempo real.
"Pared secundaria" define una pared de una célula de planta que tiene un grosor normalmente mayor de o igual a 0,2 \mum y contiene celulosa en más o igual a un 30% (p/p), entre otros componentes, que pueden incluir diferentes polisacáridos, proteínas, moléculas fenólicas, y/o lignina. Las células con paredes secundarias pueden tener cualquier forma y pueden estar vivas o muertas en la madurez. Normalmente, las células de pared secundaria se encuentran comúnmente en las fibras pero también se encuentran en otros tipos de células que incluyen algunas células epidérmicas o del parénquima engrosadas.
La palabra "fibra" se usa a menudo para unificar un grupo diverso de tipos de células de plantas que comparten en común las características de tener una forma alargada y abundante celulosa en las paredes celulares gruesas, normalmente, pero no siempre, descritas como paredes secundarias. Dichas paredes pueden estar o no lignificadas, y el protoplasto de dichas células puede permanecer vivo o no en la madurez. Dichas fibras pueden tener usos industriales, por ejemplo, en productos fabricados con madera y de explotación de bosques, papel, productos textiles, material de para cajas y sacos de arpillera, cordaje, cepillos y escobas, relleno y borra, calafateado, refuerzo de otros materiales, y fabricación de derivados de celulosa. En algunas industrias, el término "fibra" incluye normalmente las células conductoras de paredes gruesas tales como vasos y traqueidas y los agregados fibrilares de muchas células de fibras individuales. Aquí, el término fibra se usa en el sentido más global, incluyendo por ejemplo: (a) células conductoras y no conductoras de pared gruesa del xilema; (b) fibras de origen extraxilario, que incluyen las células de floema, corteza, tejido profundo, y epidermis; y (c) fibras de tallos, hojas, raíces, semillas, y flores o inflorescencias (tales como las de Sorghum vulgare usadas en la fabricación de cepillos y escobas). Además de la madera de los árboles, el algodón, y los cultivos forrajeros, la invención es aplicable a todas las fibras, incluyendo, pero no exclusivamente, las de los residuos agrícolas tales como los tallos de maíz, caña de azúcar, y arroz que se pueden usar en la reducción a pulpa, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp. (por ejemplo, sisal).
En una forma de realización de la presente invención, las células de la pared secundaria son fibras de algodón. Normalmente, la fibra de algodón es fibra de hila. Las fibras de hila inician el alargamiento unos pocos días antes que las hilas (denominadas también fibras de borra). Las fibras de borra permanecen muy cortas y no son valiosas como fibras textiles, proporcionando a su vez una fuente de celulosa química. Las fibras de borra se eliminan de las semillas de algodón antes del aplastamiento para el aceite, y tienen un valor de sólo 9,7 céntimos de dólar por libra (0,45 kg), mientras que la fibra de hila de longitud se vende normalmente a 40-60 céntimos de dólar por libra (0,45 kg). En otra forma de realización, las células de la pared secundaria son células de xilema y floema de los tallos, hipocótilos, o las raíces.
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La molécula de ácido nucleico aislado identificada como F285 puede tener una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 1, como sigue:
1 
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La molécula de ácido nucleico aislada identificada en el presente documento como F286 puede tener una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 3, como sigue:
2
La molécula de ácido nucleico aislado de la SEC DE ID Nº: 1 codifica una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC DE ID Nº: 2 como sigue:
3 
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La molécula de ácido nucleico aislado de la SEC DE ID Nº: 3 codifica una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC DE ID Nº: 4 como sigue:
4 
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Las secuencias de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 y la SEC DE ID Nº: 4 muestran homología con las quitinasas de la planta que son importantes en la defensa o en el desarrollo de la fibra de algodón.
La molécula de ácido nucleico aislado que se describe en el presente documento se expresa preferentemente en las fibras de algodón que comienzan de los 14 a los 17 DPA expresándose preferentemente a lo largo de la terminación de la deposición de la pared secundaria. Lo más preferible, la molécula de ácido nucleico aislado se expresa preferentemente en las fibras de algodón que comienzan de los 14 a los 17 DPA hasta los 40 DPA. La molécula de ácido nucleico aislado que se describe en el presente documento es el primer gen del algodón con homología con la quitinasa que se conoce que se expresa preferentemente en las fibras durante la deposición de la pared secundaria. La regulación temporal precisa del gen con la deposición de la pared secundaria sugiere que podría manipularse el gen para cambiar el desarrollo de la fibra o las propiedades defensivas.
En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un constructo de ADN que incluye un promotor de ADN de acuerdo con la invención que se une en 5' de manera operable con un segundo ADN que codifica una proteína o polipéptido heterólogo para inducir la transcripción del segundo ADN. Una región 3' reguladora se une de manera operable con el segundo ADN.
En otra forma de realización, la presente invención es un sistema de expresión que incluye un vector adecuado que contiene el constructo de ADN de la invención. En la preparación del constructo de ADN para la expresión, se pueden insertar o sustituir normalmente las diversas secuencias de ADN en un plásmido bacteriano. Se puede emplear cualquier plásmido conveniente, que se caracterizará por tener un sistema de replicación bacteriana, un marcador que permita la selección en una bacteria, y generalmente, uno o más emplazamientos de restricción únicos, convenientemente localizados. Están disponibles numerosos plásmidos, denominados como vectores de transformación, para la transformación de la planta. La selección de un vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de las especies diana para la transformación. Están disponibles una variedad de vectores para la transformación estable que usan Agrobacterium tumefaciens una bacteria que se transmite a través del suelo que produce la agalla de la corona. La agalla de la corona se caracteriza por tumores o agallas que se desarrollan en el tallo inferior y las raíces principales de la planta infectada. Estos tumores se deben a la transferencia y a la incorporación de parte del ADN plásmido de la bacteria en el ADN cromosómico de la planta. Este ADN de transferencia (ADN-T se expresa junto con los genes normales de la célula de la planta. El ADN plásmido, pTI, o ADN-Ti, del "plásmido que induce el tumor", contiene los genes vir necesarios para el movimiento del ADN-T en la planta. El ADN-T trasporta los genes que codifican las proteínas implicadas en la biosíntesis de los factores reguladores de la planta, y los nutrientes bacterianos (opinas). El ADN-T está delimitado por dos secuencias de repetición directa imperfecta denominadas "secuencias frontera". Eliminando el oncogén y los genes de opina, y sustituyéndolos con un gen de interés, es posible transferir ADN extraño en la planta sin formación de tumores o la multiplicación de A. tumefaciens (Fraley y col., "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells", Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU., 80: 4803-4807 (1983)).
La mejora adicional de esta técnica conduce al desarrollo del sistema de vector binario (Bevan, M., "Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation", Nucleic Acids Res., 12: 8711-8721 (1984)). En este sistema, se eliminan todas las secuencias de ADN-T (incluyendo las fronteras) del pTi, y se introduce en A. tumefaciens un segundo vector que contiene ADN-T. Este segundo vector tiene la ventaja de replicarse en E. coli así como en A. tumefaciens y contiene un emplazamiento de clonación múltiple que facilita la clonación de un transgén. Un ejemplo de vector comúnmente usado es pBinI9 (Frisch, y col., "Complete Sequence of the Binary Vector Bin19", Plant Molec. Biol., 27: 405-409 (1995)). Cualquier vector apropiado conocido ahora o descrito posteriormente es adecuado para el uso con la presente invención.
La Patente de los Estados Unidos Nº 4.237.224 otorgada a Cohen y Boyer, describe la producción de sistemas de expresión en forma de plásmidos recombinantes usando la rotura con el enzima de restricción y la ligadura con la ADN ligasa. A continuación se introducen estos plásmidos recombinantes por medio de transformación y se replican en cultivos unicelulares, que incluyen organismos procarióticos y células eucarióticas que crecen en el cultivo de tejido.
Una vez que el constructo de ADN de la presente invención se ha clonado en un sistema de expresión, tal como se describe anteriormente, está listo para incorporarse en una célula huésped Se pueden introducir las moléculas recombinantes en las células mediante transformación, particularmente transducción, conjugación, movilización, o electroporación. Las secuencias de ADN se clonan en el vector usando procedimientos de clonación normalizados en la técnica, tal como se describe por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989). Las células huéspedes adecuadas pueden incluir, pero no limitarse a, bacterias, virus, levaduras, células de mamíferos, insectos, plantas, y similares. Preferiblemente, las células huéspedes adecuadas son tanto una célula bacteriana (por ejemplo, Agrobacterium) como una célula de planta, Los ejemplos de células de plantas incluyen células de árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp. (por ejemplo, sisal). Lo más preferible, la célula de planta es de algodón.
En otras formas de realización de la presente invención, las plantas o semillas se producen mediante transformación con el constructo de ADN de la presente invención.
Un enfoque para transformar las células de la planta con la molécula de ácido nucleico de la presente invención es el bombardeo de partículas (conocido también como transformación biolística) de la célula huésped. Esto se puede llevar a cabo de una de las diversas maneras. La primera implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células. Esta técnica se da a conocer en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.945.050, 5.036.006, y 5.100.792, todas de Sanford y col. Generalmente, este procedimiento implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células en condiciones efectivas para penetrar en la superficie externa de la célula e incorporarse dentro del interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inerte, se puede introducir el vector en la célula recubriendo las partículas con el vector que contiene el ADN heterólogo, Alternativamente, se puede rodear la célula diana por el vector de tal manera que el vector se trasporta en la célula por la estela de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células bacterianas secas que contienen el vector y el ADN heterólogo) se pueden impulsar en las células de la planta. Se pueden usar también otras variaciones del bombardeo de partículas, conocidas ahora o desarrolladas en el presente documento.
La expresión transitoria en protoplastos permite estudios cuantitativos de la expresión génica debido a que la población de células es muy alta (del orden de 10^{6}). Para liberar el ADN en el interior de los protoplastos, se han propuesto diversas metodologías, pero las más comunes son la electroporación (Fromm y col., "Expression of Genes Transferred Into Monocot and Dicot Plants by Electroporation", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:5824-5828 (1985)) y la captación de ADN mediada por polietilenglicol (PEG) (Krens y col., "In Vitro Transformation of Plant Protoplasts with Ti-Plasmid DNA", Nature 296: 72-74 (1982)). Durante la electroporación, se introduce el AND en el interior de la célula por medio de un cambio reversible en la permeabilidad de la membrana celular debido a la exposición a un campo eléctrico. La transformación mediante PEG introduce el ADN cambiando la elasticidad de las membranas. A diferencia de la electroporación, la transformación mediada por PEG no requiere ningún equipo especial y las eficiencias de transformación pueden ser igualmente altas. Otro procedimiento apropiado para introducir el constructo génico de la presente invención en el interior de una célula huésped es la fusión de los protoplastos con otras entidades, tanto minicélulas, células, lisosomas como otros cuerpos fundibles revestidos de lípidos que contienen el gen quimérico (Fraley, y col., "Liposome-Mediated Delivery of Tobacco Mosaic-Virus RNA Into Tobacco Protoplasts - A Sensitive Assay for Monitoring Liposome-Protoplast Interactions", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 79: 1859-1863
(1982)).
Son preferibles los transformantes estables para los procedimientos de la presente invención. Un procedimiento apropiado de introducir de manera estable el constructo de ADN en el interior de las células de la planta es infectar una célula de la planta con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes transformados anteriormente con el constructo de ADN. Bajo las condiciones apropiadas conocidas en la técnica, las células de la planta transformada se hacen crecer para formar retoños o raíces, y desarrollarse además en el interior de las plantas. En una forma de realización de la presente invención, se generaron los transformantes usando el procedimiento de Frary y col., Plant Cell Reports, 16: 235 (1996), para transformar los explantes del semillero.
Los tejidos de la planta adecuados para la transformación incluyen, pero no se limitan a, yemas florales, tejido de la hoja, tejido de la raíz, tejido del hipocótilo, meristemas, embriones zigóticos y somáticos, megaesporas, y anteras.
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Tras la transformación, las células transformadas de la planta se pueden seleccionar y regenerar. Preferiblemente, las células transformadas se identifican en primer lugar usando un marcador de selección introducido simultáneamente en las células huéspedes junto con el constructo de ADN de la presente invención. El gen indicador más ampliamente usado para los experimentos de fusión génica ha sido uidA, conocido también como gusA o GUS, un gen de Escherichia coli que codifica la proteína \beta-glucuronidasa, conocida también como GUS (Jefferson y col., "GUS Fusions: \beta Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants", EMBO Journal 6: 3901-3907 (1987)). GUS es una proteína de 68,2 kd que actúa como un tetrámero en su forma natural. No requiere cofactores o condiciones iónicas especiales, aunque puede ser inhibida por cationes divalentes del tipo Cu^{2+} o Zn^{2+} GUS es activa en presencia de agentes que reducen el tiol del tipo \beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT).
Otros marcadores de selección adecuados incluyen, sin limitación, los marcadores que codifican la resistencia a antibióticos, tales como el gen nptII que confiere resistencia a la kanamicina (Fraley y col., "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells, "Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 4803-4807 (1983)) y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis y col., "Vectors Containing a Prokaryotic Dihydrofolate Reductase Gene Transform Drosophila Cells to Methotrexate-Resistance", EMBO J., 2: 1099-1104 (1983)).
Una vez se ha obtenido la célula o el tejido de la planta, es posible regenerar una planta de crecimiento completo a partir de la misma. Los medios para la regeneración varían de especie a especie de plantas, pero generalmente, se proporcionan en primer lugar una suspensión de protoplastos transformados o una placa petri que contiene los explantes transformados. Se forma el tejido del callo y se pueden inducir retoños a partir del callo y posteriormente enraizarse. Alternativamente, se puede inducir la formación embriónica en el tejido del callo. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquininas. Es también ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para tales especies como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y y del historial del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es normalmente reproducible y repetible.
Se describe en Evans, y col., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., Nueva York, 1983); y Vasil I.R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984, y Vol. III (1986) la regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados.
Se sabe que prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados, que incluyen, pero no se limitan a, todas las especies principales de algodón, arroz, trigo, cebada, centeno, girasol, cacahuete, maíz, patata, boniato, judía, guisante, achicoria, lechuga, endivia, col, coliflor, brécol, nabo, rábano, espinacas, cebolla, ajo, berenjena, guindilla, apio, zanahoria, calabaza, calabacera, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo, y caña de azúcar.
Una vez que la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento se incorpora de manera estable, se puede transferir a otras plantas mediante cruzamiento sexual o preparando cultivares. Con respecto al cruzamiento sexual, se pueden usar cualquier número de técnicas de reproducción normalizadas dependiendo de las especies que se van a cruzar. Se pueden propagar los cultivares de acuerdo con los procedimientos agrícolas comunes conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, las semillas transgénicas se recuperan de las plantas transgénicas. A continuación se pueden plantar las semillas en el suelo y cultivarse usando procedimientos convencionales para producir plantas transgénicas.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un promotor de ADN aislado adecuado para inducir la expresión de una proteína codificada por un segundo ADN asociado de manera operable con el promotor de ADN. El promotor de ADN se aísla del algodón y se impulsa la expresión preferentemente en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria. Normalmente las células de la pared secundaria son fibra de hila de fibra de algodón, en concreto. En otra forma de realización, las células de la pared secundaria son células de xilema y floema de tallos, hipocótilos, o raíces. Se puede usar el promotor de ADN aislado de la presente invención para impulsar la expresión de las proteínas heterólogas única o preferentemente en las células de la pared secundaria tales como fibras durante la deposición de la pared secundaria. Esto es especialmente importante si las proteínas pueden tener efectos pleiotrópicos adversos si se expresan fuertemente en otras etapas o en otros tipos celulares. Este promotor debería ser similarmente útil a los otros, debido a que muchas propiedades críticas de la fibra se determinan en la etapa de la pared secundaria del desarrollo y la pared secundaria masiva representa un punto de "almacenamiento" potencial para novedosos componentes de la fibra que incluyen enzimas o moléculas estructurales.
La regulación y la expresión génica es una interacción compleja de factores intracelulares y extracelulares. Arabidopsis thaliana, con un tamaño de genoma de 145 Mb, contiene aproximadamente 25.000 genes (Ausubel, "Arabidopsis Genome: A Milestone en Plant Biology", Plant Physiology, 124: 1451-1454 (2000)). Estos genes deben expresarse en perfecta coordinación con el fin de tener crecimiento organizado y respuestas apropiadas al entorno. Esto se consigue mediante la expresión génica diferencial en la que la planta es capaz de activar y desactivar diferentes genes dependiendo de la etapa de desarrollo, el tipo de tejido, y los inductores específicos procedentes del
entorno.
Las células de las plantas tienen diversos mecanismos para controlar la expresión génica, y los pueden ejercer a niveles transcripcionales, postranscripcionales, traduccionales, y postraduccionales. Sin embargo, mucha de la expresión diferencial se puede explicar al nivel transcripcional cuando la ARN polimerasa II interactúa con el ADN y múltiples factores de proteínas para iniciar la síntesis del ARNm (Roeder, "The Role of Initiation Factors in Transcription by RNA Polymerase II", Trends in Biochemical Science, 21: 327-335 (1996)). La región del ADN implicada en esta interacción pretranscripcional se denomina el "promotor". Los promotores se localizan normalmente próximos al extremo 5' de la región de codificación de un gen.
Secuenciando, comparando, y modificando los promotores de la planta, ha sido posible identificar los componentes funcionales en su secuencia de ADN. Todos los promotores conocidos están hechos de dos componentes generales: la región núcleo y la región reguladora (Kornberg, "RNA Polymerase II Transcription Control", Trends in Biochemical Science 21: 325-326 (1996)).
La región núcleo se localiza inmediatamente en la dirección 5' del extremo 5' de la región de codificación y es esencial para el proceso de la transcripción; sin embargo, en términos cuantitativos es sólo responsable de un pequeño porcentaje de la expresión génica total. La región núcleo tiene aproximadamente 100 pb de longitud y comprende una secuencia TATA y el emplazamiento de inicio de la transcripción. La secuencia TATA es una secuencia de aproximadamente 13 pb, rica en restos de timidina y adenina con una TC/GTATAT/AA_{1-3}C/TA consenso. La secuencia TATA está presente en la mayoría, pero no en todos, los promotores de genes que codifican proteínas (Roeder, "The Role of Initiation Factors in Transcription by RNA Polymerase II", Trends in Biochemical Science. 21: 327-335 (1996)). Este es el emplazamiento de interacción directa con la ARN polimerasa II (ARN Pol II) y con los factores de transcripción universales (TAF), que son parte necesaria del complejo de transcripción (Verrijzer y col., "TAFs Mediated Transcriptional Activation and Promoter Selectivity", Trends in Biochemical Science, 21: 338-342 (1996)). Los factores generales son las proteínas presentes en todas las células y están muy conservados de levaduras al hombre (Guarente y col., "Conservation and Evolution of Transcriptional Mechanisms in Eukaryotes", Trends in Genetics. 8: 27-32 (1992)). La región reguladora se localiza adicionalmente en la dirección 5' desde la región núcleo y puede ser tan larga como 2 kb o incluso más. Esta región es responsable del control de la expresión génica tanto suprimiendo como potenciando la actividad de la ARN polimerasa II. La región reguladora está compuesta por diversas "secuencias" o elementos que varían en tamaño desde 4 a 300 pb. Estos elementos son los emplazamientos de unión de proteínas específicas que están implicadas en la modulación de la expresión diferencial de los genes y confieren expresión específica de célula o específica de gen. las proteínas en este nivel interactúan con TFIID, aumentando su estabilidad en la unión con el promotor, potenciando la transcripción. La presencia de múltiples elementos y sus factores correspondientes produce un efecto sinérgico en la transcripción.
La parte más dinámica del sistema promotor es la interacción de los factores de proteínas con el ADN y con el resto de proteínas del complejo. Para estas interacciones, las proteínas deben contener regiones estructurales que reconozcan las características superficiales específicas de los canales menores o mayores y del esqueleto de azúcar-fosfato del ADN (Travers, "DNA-Protein Interactions", St. Edmundsbury Press, Bury St. Edmunds, Great Britain (1993)). Las regiones más comunes asociadas con esta función son el motivo hélice-giro-hélice (HTH), la región de unión con Zn o los dedos de Zinc, y la cola de leucina enrollada en cremallera (b-ZIP) (Brunelle y col., "Transcription Regulatory Proteins in Higher Plants", Current Opinions in Genetics and Development, 3: 254-258 (1993)). No todos los reguladores de la transcripción se unen al ADN. Las interacciones proteína a proteína son responsables de la formación de heterodímeros u homodímeros, que funcionan a la vez como reguladores positivos, o como reguladores negativos, evitando la formación de dímeros activos. La síntesis o la activación de estos factores están inducidos por estímulos concretos y, en algunos casos, implica cascadas de fosforilación (Brunelle y col., "Transcription Regulatory Proteins in Higher Plants", Current Opinions in Genetics and Development, 3: 254-258
(1993)).
En el modelo actual de iniciación de la transcripción, TBP se une a la secuencia TATA a través del canal menor de la hélice de ADN. TFIIA estabiliza la unión que se puede debilitar mediante condiciones iónicas alteradas o mutaciones en el elemento de unión del ADN. TFIIB se une a TBP y orienta su región amino terminal hacia el emplazamiento de inicio en la dirección 3'. Esta secuencia amino terminal no se conserva entre diferentes especies, lo que sugiere diferentes rutas reguladoras (Roeder, "The Role of Initiation Factors in Transcription by RNA polymerase II", Trends in Biochemical Science, 21: 327-335 (1996)). También, plantas de tipo Arabidopsis pueden contener dos diferentes TBP (Gasch y col., "Arabidopsis Thaliana Contains Two Genes for TFIID", Nature, 346: 390-394
(1990)).
En el mismo momento que TBP se une a la secuencia TATA, TFIIF se une a la ARN polimerasa II para crear un complejo que se une a continuación con la región amino terminal de TFIIB, cubriendo una zona del promotor de aproximadamente 40 pb. Finalmente, TFIIE y TFIIH se unen al complejo exactamente en la dirección 5' del emplazamiento de inicio para inducir la fusión del promotor (abriendo la doble cadena) y continuar con la transcripción y el alargamiento (Roeder, "The Role of Initiation Factors in Transcription by RNA Polymerase II", Trends in Biochemical Science. 21: 327-335 (1996)).
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Una molécula promotora de ADN adecuada de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ID Nº: 7 como sigue:
5
Esta secuencia de nucleótidos tiene 1,0 kb de longitud (1.029 pb). Están subrayadas la secuencia TATAAA para la unión de la ARN polimerasa así como el elemento potenciador de la secuencia CAAT. Inmediatamente después de la secuencia de nucleótidos está una secuencia de inicio candidata, ATGGA. Doce bases después de la secuencia de inicio candidata está otra secuencia de inicio candidata, ATGGC.
Otra molécula promotora de ADN adecuada de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID N: 8 como sigue:
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Esta secuencia de nucleótidos tiene 1,4 kb de longitud (1.403 pb). Están subrayadas una secuencia TATAAA para la unión de la ARN polimerasa así como un elemento potenciador de la secuencia CAAT. Inmediatamente después de la secuencia de nucleótidos está una secuencia de inicio candidata, ATGGA. Doce bases después de la secuencia de inicio candidata está otra secuencia de inicio candidata, ATGGC.
Otra molécula promotora de ADN adecuada de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 9 como sigue:
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7
8 
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Esta secuencia de nucleótidos tiene 1,8 kb de longitud (1.815 pb). Están subrayadas una secuencia TATAAA para la unión de la ARN polimerasa así como un elemento potenciador de la secuencia CAAT. Inmediatamente después de la secuencia de nucleótidos está una secuencia de inicio candidata, ATGGA. Doce bases después de la secuencia de inicio candidata está otra secuencia de inicio candidata, ATGGC.
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Otra molécula promotora más de ADN adecuada de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 10 como sigue:
9
10
Esta secuencia de nucleótidos tiene 2,1 kb de longitud (2.105 pb). Están subrayadas una secuencia TATAAA para la unión de la ARN polimerasa así como un elemento potenciador de la secuencia CAAT. Inmediatamente después de la secuencia de nucleótidos está una secuencia de inicio candidata, ATGGA. Doce bases después de la secuencia de inicio candidata está otra secuencia de inicio candidata, ATGGC.
Además de las cuatro moléculas promotoras de ADN anteriores, se pueden usar otras longitudes de promotor que sean: (a) más largas que pero que incluyan la SEC DE ID Nº: 10; o (b) cualquier número de bases más cortas que la SEC DE ID Nº: 10 para la presente invención. Es también posible crear polímeros útiles de nucleótidos artificiales que contengan elementos reguladores clave incluidos dentro de la SEC DE ID Nº: 10 que son necesarios y suficientes para impulsar la expresión génica que se muestra para el promotor que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 10 o cualquier fragmento más corto o para modificar el modelo demostrado de expresión génica de otras modos útiles. Por ejemplo, se pueden identificar elementos reguladores seleccionados dentro de la SEC DE ID Nº: 10 y fusionarse artificialmente para crear un promotor modificado que podría a continuación restringir la expresión génica de uno cualquiera de los tipos celulares específicos en los que el promotor es actualmente útil, por ejemplo sólo en la etapa de la pared secundaria del desarrollo de la fibra de hila del algodón. Similarmente, se podrían identificar motivos o regiones reguladoras concretas para la delección para proporcionar más especificidad de tipo célula a los fragmentos descritos del promotor. Está bien establecido que diferentes combinaciones de motivo o regiones reguladora dentro de los promotores dirigen la expresión de los genes en diferentes poblaciones celulares dentro de un tejido (Capone y col., "Expression in Different Populations of Cells of the Root Meristem is Controlled by Different Domains of the rol B Promoter", Plant Mol. Biol., 25: 681-691 (1994)). Los "motivos" o las "regiones" significan, respectivamente, secuencias más cortas (por ejemplo, normalmente de 4-11) o más largas (por ejemplo, normalmente de 12-300) de bases nitrogenadas en el ADN del promotor que son emplazamientos de unión o emplazamientos de otras respuestas que implican los factores complementarios de transcripción de de proteína u otros factores reguladores que son parte del control celular y del desarrollo de la transcripción. La manipulación artificial de los promotores naturales mediante fusión o delección de los motivos o regiones que afectan la resistencia, la especificidad y/o la respuesta de algunos factores de transcripción es bien conocida por aquellas personas expertas en la materia (Ohneda y col., "A Minigene Containing Four Discrete Cis Elements Recapitulates GATA-1 Gene Expression in vivo", Genes Cells, 7: 1243-1254 (2002); Lee y col., "Transcriptional Regulation of Xbr-1a/X-vent 2 Homeobox Gene: Analysis of its Promoter Region", Biochem. Biophys. Res. Commun., 298: 815-823 (2002); Buzeli y col., "Tissue-Specific Regulation of BiP Genes: A Cis-Acting Regulatory Domain is Required for BiP Promoter Activity in Plant Meristems", Plant Mol. Biol., 50: 757-71 (2002)). Como ejemplo particular en el promotor F286, es posible que el motive AXTTTA (nº 140 en la Tabla 9), que se requiere para la expresión vascular del rol B en tabaco (Baumann y col., "The DNA Binding Site of the Dof Protein NtBBF1 is Essential for Tissue-Specific and Auxin-Regulated Expression of the Rol B Oncogene in Plants", Plant Cell, 11: 323-333 (1999)), podría eliminarse o mutarse para ayudar a la actividad restringida del promotor F286 de la fibra de hila en la etapa de desarrollo de la pared secundaria. Es también posible que se pueda conferir utilidad adicional al promotor F286 o a sus derivados artificiales mediante la inclusión en el constructo de expresión génica de las regiones procedentes del intrón del gen F286 o procedente del extremo 3' no traducido del
gen.
El promotor del ADN aislado de la presente invención puede impulsar la expresión de las moléculas de ADN acopladas operativamente en el inicio de las fibras de algodón al comienzo de la deposición de la pared secundaria, normalmente de los 14 a los 17 DPA, extendiéndose preferiblemente a lo largo de la finalización de la deposición de la pared secundaria. Lo más preferible, el promotor del ADN aislado de la presente invención impulsa la expresión de la molécula de ADN acoplada operativamente en las fibras de algodón al comienzo de los 14 a los 17 DPA hasta los 40 DPA, para identificar los promotores capaces de regulación preferente en cualquier tipo de célula o etapa del desarrollo seleccionadas, la persona experta en la técnica sabe bien que debe buscar en primer lugar los ARNm que se transcriben preferentemente de la manera deseada. Esto potencia mucho las posibilidades de que el promotor aislado del gen correspondiente impulse la expresión génica extraña de la misma manera una vez que el promotor y el gen extraño se unen de manera operable en un constructo de expresión génica que se incorpora en el ADN del huésped mediante transformación. Se produce a menudo un modelo conservado de actividad del promotor se produce a menudo en especies heterólogas así como en las especies fuente del promotor aislado, pero debe determinarse de manera última el comportamiento del promotor mediante ensayo empírico.
En la actualidad están normalizadas en la técnica diversas prácticas para la identificación de genes expresados diferencialmente entre dos tejidos, tipos celulares, condiciones del entorno, y así sucesivamente, suponiendo que se pueda aislar el material vivo que representa los dos estados y separarse en condiciones razonables para la extracción y purificación del ARN. Las fibras de algodón son idealmente apropiadas para esta meta, debido tanto a que tienen células únicas largas como a que se pueden separar fácilmente de la semilla y debido a dos importantes etapas del desarrollo de la fibra, la deposición de la pared primaria y la secundaria se producen sólo con superposición parcial en el tiempo de desarrollo Estos hechos y los detalles metodológicos apropiados del algodón quedan bien demostrados mediante el trabajo previo de los genes aislados con expresión preferente y los promotores génicos capaces de promoción preferente en las fibras de algodón (Patente de los Estados Unidos Nº. 5.474.925 de John y col; patente de los Estados Unidos Nº. 5.521.078 de John). Dicho trabajo tiene también un doble objetivo en el que los genes que se expresan preferente o diferencialmente en la fibra en comparación con otras células y tejidos o en distintas etapas del desarrollo de la fibra serán a menudo los que tengan papeles críticos en la determinación del desarrollo de la fibra y los atributos de la fibra que se traducen en la calidad de la fibra para uso industrial. El ARN total de los dos estados que se van a comparar contendrá diferentes poblaciones de ARNm que representan sólo los genes que se expresan en cada estado. Las dos poblaciones de ARNm (o sus ADN correspondientes tras la transcripción inversa) se pueden comparar a continuación mediante cualquier número de técnicas normalizadas que incluyen: (a) muestra diferencial de los ADNc; (b) rastreo diferencial de bibliotecas de ADNc; (c) comparación de las etiquetas expresadas en la secuencia (EST) entre dos bibliotecas de ADN preparadas por separado, (d) secuenciación de la EST de una biblioteca sustraída de ADNc, en la que el ARNm que se expresa preferentemente en un tejido se enriquece antes de la preparación de la biblioteca de ADNc; (e) AFLP del ADNc, (f) análisis en serie de la expresión génica (SAGE); o (g) análisis de micromatriz. La elección entre estas técnicas en cualquier caso concreto se lleva a cabo ampliamente ahora de acuerdo con la conveniencia, la personalización y/o la disponibilidad de los recursos necesarios, y los detalles técnicos necesarios están ampliamente publicados (Hunt y col. (eds) "Functional Genonvcs", 253 pp Oxford University Press: Oxford (2000)).
En la mayor parte de estas técnicas son posibles los falsos positivos, de tal manera que debe verificarse la expresión preferente de cada gen de interés mediante técnicas normalizadas tales cono la transferencia Northern o la RT-PCR, usando el ARN aislado procedente de cada estado como la diana para las sondas o los cebadores basados en la secuencia de interés. O, más eficazmente, el ensayo de micromatriz permite rastrear simultáneamente muchos genes candidatos expresados diferencialmente con sondas derivadas del ARN o de los dos estados de interés. Si el modelo de expresión génica prueba ser preferente en el modelo esperado, es razonable proceder con el aislamiento del promotor para dirigir del ensayo de su utilidad en la impulsión de la expresión del gen extraño en una célula o tejido (en el caso de transformación transitoria) u organismo (en el caso de transformación estable) construidos mediante ingeniería genética. Estas técnicas están normalizadas en la técnica, incluyendo en el algodón, para el cual se pueden encontrar fácilmente muchos procedimientos detallados (Patente de los Estados Unidos Nº 5.474.925 de John y col; Patente de los Estados Unidos Nº. 5.521.078 de John).
Se pueden aislar promotores de genes a partir del ADN genómico mediante diversas técnicas normalizadas que incluyen: (a) rastreo por hibridación de una biblioteca genómica con una sonda del ADNc de interés y (b) la PCR. Las personas expertas en la técnica conocen bien estos procedimientos, y se puede escoger fácilmente un procedimiento adecuado de acuerdo con la conveniencia o la personalización. No existen reglas fijas acerca de cómo es necesario que la secuencia 5' en la dirección 5' de una secuencia de codificación impulsa el modelo de expresión génica observado in vivo, y, en vez de esto, se deben ensayar a menudo diversas longitudes más cortas que la máxima para determinar las regiones más mínimas que trabajarán de la manera deseada. Dichos experimentos de delección del promotor son también una primera aproximación para identificar los elementos reguladores clave dentro de un promotor, aunque dicha información no siempre se desvela hasta que los motivos unidos mediante factores de transcripción claves se identifican directamente mediante experimentación adicional. Existen también otras aproximaciones que darán resultados e información similares.
En una forma de realización preferida de la presente invención, el promotor del ADN aislado de la invención está en un constructo de ADN que incluye el promotor del ADN aislado, un segundo ADN que codifica una proteína o polipéptido. El promotor del ADN se une de manera operable a la región 5' del segundo ADN para inducir la transcripción, del segundo ADN. Una región 3' reguladora se une de manera operable al segundo ADN.
Una forma de ADN que codifica una proteína adecuada para el uso en el constructo de ADN de la presente invención es la molécula de ácido nucleico aislado que incluye una secuencia de nucleótidos que hibrida a una molécula de ADN que tiene una secuencia de acuerdo con la SEC DE ID Nº: 1 o la SEC DE ID Nº: 3 en condiciones restrictivas caracterizadas por un tampón de hibridación que comprende 1 x SSC a una temperatura de 61ºC, que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 1 o la SEC DE ID Nº: 3, que codifica una proteína o polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 5 o la SEC DE ID Nº: 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con la SEC DE ID Nº: 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad con la SEC DE ID Nº: 6, o que codifica una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 4.
El ADN que codifica una proteína adecuada para el uso en la presente invención incluye el ADN que se ha amplificado, alterado químicamente, o modificado de otra manera. La modificación de dichos ADN que codifican unas proteínas se puede producir, por ejemplo, tratando el ADN con un enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que sea capaz de unirse de manera operable con el promotor. Se puede producir también la modificación mediante técnicas tales como l mutagénesis dirigida al emplazamiento.
El ADN que codifica una proteína incluye también el ADN que es completamente sintético, semisintético, o biológicamente derivado, tal como el ADN derivado mediante transcripción inversa del ARN. Dicho ADN incluye, pero no se limita a, genes no de plantas tales como los de bacterias, levaduras, animales, o virus; genes modificados, porciones de genes, genes quiméricos, así como el ADN que codifica los aminoácidos que son precursores químicos o biológicos de valor comercial, tales como polímeros o biopolímeros (Pool y col., "In Search of the Plastic Potato", Science, 245: 1187-1189 (1989)). El ADN adecuado es cualquier ADN cuya expresión es beneficiosa en la planta transgénica o que es beneficioso de otra manera por tener el ADN expresado bajo el control de un promotor de ADN que impulsa la expresión preferentemente durante la etapa de la pared secundaria del desarrollo de la fibra.
Una meta general de la industria de la fibra es la de diseñar plantas mediante ingeniería genética con atributos de calidad de la fibra y atributos de calidad manipulables mejorados, de manera que se puedan producir específicamente fibras para diferentes usos finales de productos. Esta meta se refiere tanto a los atributos tradicionales de calidad de la fibra, que se pueden cambiar manipulando las rutas del desarrollo o bioquímicas ya existentes en la fibra, como a calidades más novedosas que se pueden conferir sólo a través de la ingeniería genética. Por ejemplo, la fibra de algodón tiene atributos de calidad tradicionales de longitud, diámetro de la fibra, madurez, resistencia, capacidad de coloreado, y color verde claro y marrón y novedosos atributos potenciales tales como color azul o almacenamiento de enzimas o polímeros novedosos, cada uno con su valor añadido. Varios de los atributos tradicionales de calidad de la fibra de algodón son muy o principalmente dependientes del grosor de la pared secundaria y de su contenido en celulosa, específicamente la madurez, la resistencia, y la capacidad de coloreado. La moderna tecnología de devanado y la producción de telas de elevada calidad prefiere fibras maduras finas (de pequeño diámetro), largas, resistentes (lo que implica una mayor resistencia y capacidad de coloreado). Incluso la longitud y el diámetro de la fibra son dependientes en alguna extensión del tiempo de inicio de la pared secundaria, momento en el cual el alargamiento se ralentiza y el diámetro de la fibra llega a constreñirse más. Debido a que la pared secundaria forma la mayor parte (aproximadamente un 95% del volumen de la fibra madura) y es la fase más larga del desarrollo de la fibra, la ingeniería genética en esta etapa requerirá conferir novedosos colores a las fibras de algodón o almacenar grandes cantidades de moléculas extrañas deseables en la luz de la pared secundaria.
Por tanto, los ejemplos de otras moléculas de ADN que codifican una proteína que podrían expresarse en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, celulosa sintasas homólogas y heterólogas (genes CesA), tanto en forma normal como mutada (Arioli y col., "Molecular Analysis of Cellulose Biosynthesis in Arabidopsis", Science. 279: 717-720 (1998); Holland y col., "A Comparative Analysis of the Plant Cellulose Synthase (CesA) Gene Family", Plant Physiol., 123: 1313-1324 (2000)); genes que pueden modular la repartición de carbono en la celulosa (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers" en: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing The Haworth Press, Nueva York, pp. 85-112 (1999)) tales como sacarosa sintasa (Amor y col., "A Membrane-Associated Form of Sucrose Synthase and Its Potential Role Synthesis of Cellulose and Callose in Plants", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92: 9353-9357 (1995)), sacarosa fosfato sintasa (Haigler y col., "Transgenic Cotton Over-Expressing Sucrose Phosphate Synthase Produces Higher Quality Fibers with Increased Cellulose Content and Has Enhanced Seed Cotton Yield" Resumen 477. En: Proceedings of Plant Biology, 15 - 19 de Julio de 2000, San Diego, CA. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, (2000)), UDPG-pirofosforilasa (Waffler y Meier, "Enzyme Activities in Developing Cotton Fibers", Plant Physiol, Biochem, 32: 697-702 (1994)), pirofosfatasa inorganic (Geigenberger y col., "Overexpression of Pyrophosphatase Leads to Increased Sucrose Degradation and Starch Synthesis, Increased Activities of Enzymes for Sucrose-Starch Interconversions, and Increased Levels of Nucleotides in Growing Potato Tubers", Planta, 205: 428-437 (1998)), hexoquinasas (Smeekens, "Sugar Regulation of Gene Expression", Curr. Op. Plant Biol., 1: 230-234 (1998)), e invertasas (Sturm y Tang, "The Sucrose-Cleaving Enzymes of Plants are Crucial for Development, Growth, and Carbon Partitioning", Trends Plant Sci., 4: 401-407 (1999)); genes que pueden afectar las propiedades moleculares y biofísicas de la celulosa incluyendo el grado de polimerización, el grado cristalino, el tamaño de los cristales, y la orientación de las microfibrillas (es decir, los genes que codifican las proteínas, incluyendo la cristalización conjunta de polímeros de proteínas o las regiones de unión con la celulosa, y que sintetizan polisacáridos y otras enzimas) (Delmer, "Cellulose Biosynthesis: Exciting Times for a Difficult Field of Study", Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 50: 245-276 (1999); Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers. En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology", Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 85-112 (1999); Hsieh, "Structural Development of Cotton Fibers. En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 137-166 (1999)); factores d transcripción tales como los genes MYB que podrían prolongar el alargamiento del crecimiento y/o cambiar el calendario o la extensión de la deposición de la pared secundaria (Wilkins y Jernstedt, "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers. En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 231-270 (1999)); genes que efectúan la síntesis de las hormonas de laa planta y cambian las propiedades de la fibra (John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification. In: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 271 - 289 (1999)); genes de los elementos citoesqueléticos o las proteínas asociadas al citoesqueleto que pueden afectar las propiedades de la fibra (Seagull, "Cytoskeletal Involvement in Cotton Fiber Growth and Development", Micron, 24: 643-660 (1993)); genes para sintetizar lípidos o modificar enzimas que pueden cambiar las propiedades de la membrana y mejorar por tanto la calidad de la fibra incluyendo bajo condiciones ambientales estresantes (Haigler, "The Crystallinity of Cotton Cellulose in Relation to Cotton Improvement", Proc. Cotton Fiber Cellulose: Structure, Function, and Utilization Conference, National Cotton Council of America: Memphis, TN., p. 211-225 (1992)); enzimas tales como xiloglucano endotransferasa, peroxidasa, expansina o ATPasa vacuolar que pueden, a través del aumento o disminución de la actividad, prolongar o aumentar la extensión del crecimiento durante la deposición de la pared secundaria (Wilkins y Jemstedt, "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers. En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 231-270 (1999)); genes de las proteínas o polímeros plásticos que pueden retenerse en la luz de la fibra o se integran en la pared celular para aumentar la resistencia de la fibra o cambiar sus propiedades textiles (John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 271-289 (1999); Guda y col., "Hyperexpression of an Environmentally Friendly Synthetic Polymer Gene", Biotechnology Letters, 17: 745-750 (1995)); genes de las enzimas biosintéticas de la matriz de la pared cellular de la planta o sus proteínas reguladoras de tal manera que se podrían integrar otros carbohidratos en la pared celular y cambiar las propiedades de la fibra (Haigler, "The Relationship Between Polymerization and Crystallization in Cellulose Biogenesis", en C. H. Haigler y P. Weimer, eds., Biosynthesis and Biodegradation of Cellulose, Nueva York: Marcel Dekker, pp. 99-124 (1991); Andrawis y col., "Cotton Fiber Annexins: A Potential Role in the Regulation of Callose Synthase", Plant J., 3: 763-772 (1993)); genes de moléculas tales como taninos, suberinas, o colorantes que pueden conferir colores valiosos a las fibras (Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 1-46 (1999)); genes de moléculas tales como cutina, suberinas, o cera que pueden cambiar la absortividad y la resistencia de las fibras de algodón (May, "Genetic Variation in Fiber Quality", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 183-230 (1999); Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 1-46 (1999)); y los genes de moléculas de transducción de la señal tales como Rac que pueden regular los cambios entre las etapas de desarrollo de la fibra (Delmer y col., "Genes Encoding Small GTP-Binding Proteins Analogous to Mammalian rac are Preferentially Expressed in Developing Cotton Fibers", Mol. Gen. Genet., 248: 43-51 (1995)).
Existen ya ejemplos de manipulación de diversos tipos de estos genes en plantas transgénicas que afectan al contenido en celulosa y/o a la calidad de la fibra. Cualquiera de estas estrategias o análogas o similares podría aplicarse ventajosamente a la fibra de algodón particularmente a su fase de pared secundaria de desarrollo de una manera preferente. Por ejemplo, se ha manipulado el contenido de celulosa positiva y negativamente y se ha cambiado la cristalinidad de la celulosa en el modelo de planta de Arabidopsis mediante la manipulación del nivel de expresión yo la mutación de una sintasa celulosa (Patente de los Estados Unidos Nº 6.495.740 de Arioli y col.). Este trabajo proporciona también un ejemplo de manipulación de la repartición de carbohidratos como un efecto secundario del cambio en el contenido y/o las características de la celulosa, debido en algunos casos a que se acumula almidón preferentemente. Se ha manipulado también la sacarosa sintasa para mejorar el contenido de celulosa en los tallos de maíz, que tienen un elevado contenido de fibra (Publicación de Solicitud de Patente nº 20030005482 de Dhuuga y col.). Además, se ha manipulado la sacarosa fosfato sintasa bajo l control del promotor 35S de CaMv para mejorar la calidad de la fibra el el algodón transgénico (Patente de los Estados Unidos Nº 6.472.588 de Haigler y col.), y se puede ganar una ventaja adicional restringiendo el cambio genético a la fase de la pared secundaria del desarrollo de la fibra. Se ha cambiado también la calidad de la fibra de algodón manipulando la síntesis de la hormona del crecimiento, la citoquinina (Patente de los Estados Unidos Nº 6.329.570 de Martineau). Además, se han acumulado en la luz de la fibra y en la pared celular enzimas y proteínas de unión a la celulosa (Patente de los Estados Unidos Nº 5.474.925 de John y col.). Además, se ha acumulado en la luz de la fibra de algodón un polímero termoplástico con efectos ventajosos sobre las propiedades textiles del algodón (John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification, "En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, pp. 271-289 (1999)). Además, las regiones de unión con la endo-\beta-1,4-glucanasa (una celulasa) y la celulosa dirigidas a la pared celular han demostrado aumentar la masa de fibra, el contenido de celulosa, y la velocidad de crecimiento de la planta, el rendimiento, y la digestibilidad en otras plantas (Patente de los Estados Unidos Nº 6.323.023 de Shoseyov y col.; Patente de los Estados Unidos Nº 6.184.440 de Obed y col.). Se ha demostrado también que la peroxidasa, capaz de reticular las proteínas de la pared celular, aumenta la resistencia de la fibra de algodón (Patente de los Estados Unidos Nº 5.869.720 de John). Se ha manipulado el color en las plantas transgénicas (Patente de los Estados Unidos Nº 6.222.097 de McBride y col.). De esta manera, aunque alguno puede tener efectos ventajosos en la etapa de la pared primaria del desarrollo, muchos de dichos cambios harían probablemente un uso ventajoso d la presente invención dirigiendo el cambio diseñado mediante ingeniería genética en la fase de la pared secundaria del desarrollo de la fibra que afecta a los usos industriales de las fibras en una gran extensión. La lista anterior es ilustrativa más bien que limitante, estando incluida aquí únicamente para ilustrar la factibilidad de usar la presente invención en muchas estrategias útiles que podrían beneficiarse dirigiendo los cambios genéticos en la fase de la pared secundaria del desarrollo de la fibra.
El constructo de ADN de la presente invención incluye también una región 3' reguladora operable, seleccionada de entre aquellas que son capaces de proporcionar la terminación correcta de la transcripción y la poliadenilación del ARNm para la expresión en células de plantas, unida de manera operable a la molécula de ADN que codifica una proteína de elección. Se conocen numerosas regiones 3' reguladoras que son operables en plantas. Las regiones 3' reguladoras a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, la región 3' reguladora de la nopalina sintasa (Fraley, y col., "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells", Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 80: 4803-4807 (1983)) y la región 3' reguladora del virus del mosaico de la coliflor (Odell, y col., "Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter", Nature, 313 (6005): 810-812 (1985)). Virtualmente, cualquier región 3' reguladora conocida por ser operable en plantas sería suficiente para la expresión apropiada de la secuencia de codificación del constructo de ADN de la presente invención.
La molécula de ADN que codifica una proteína, el promotor de la presente invención, y la región 3' reguladora se pueden unir conjuntamente usando técnicas de clonación bien conocidas tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, NY (1989).
En otra forma de realización, la presente invención es un sistema de expresión que incluye un vector adecuado que contiene el constructo de ADN anterior de la invención. La presente invención incluye también células huéspedes que incluyen el constructo de ADN de la invención descrita anteriormente, y las plantas y semillas transgénicas producidas mediante transformación con el constructo de ADN.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para expresar un gen preferentemente en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria en una planta que implica trasformar una planta con el constructo d ADN que incluye el promotor d ADN aislado de la presente invención. Normalmente, las células de la pared secundaria son fibra. Se puede utilizar el constructo de ADN de la presente invención para expresar un gen durante la deposición de la pared secundaria en una amplia variedad de plantas que producen fibra tales como árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp. (por ejemplo, sisal). El constructo de ADN es particularmente muy adecuado para expresar un gen durante la deposición de la pared secundaria en el algodón. Básicamente, este procedimiento se lleva a cabo transformando una célula de planta con un constructo de ADN de la presente invención, tal como se describe anteriormente, en condiciones efectivas para dar como resultado la transcripción de la molécula de ADN en respuesta al promotor. Los procedimientos de transformación pueden dar como resultado la expresión transitoria o estable del ADN bajo el control del promotor. Preferiblemente, el constructo de ADN de la presente invención se inserta de manera estable en el genoma de la célula recombinante de la planta como resultado de la transformación, aunque la expresión transitoria puede servir a un objetivo importante, particularmente cuando la planta bajo investigación crece lentamente.
El sistema de fusión génica que genera moléculas quiméricas es una herramienta muy poderosa para estudiar la actividad del promotor. Sin embargo, aunque se han desarrollado muchos protocolos de transformación y regeneración para plantas, se sigue tardando al menos 3 meses (en el caso del tabaco) o tanto como 6-12 meses (en el caso del algodón) en obtener plantas transformantes estables que se puedan evaluar. Incluso entonces, se requiere más tiempo para evaluar la expresión en tejidos del tipo flores o frutos. Como alternativa metodológica, la expresión transitoria en tejidos o protoplastos ofrece un medio rápido y a menudo fiable para genera información antes de proceder con la transformación estable. Además, este procedimiento evita posibles "efectos de posición" negativos debidos a la inserción del ADN introducido en regiones que no expresan el cromosoma.
Ejemplos
Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar las formas de realización de la presente invención.
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Ejemplo 1
Identificación de F285, un clon de ADNc expresado preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria
Se usó la muestra diferencial tal como se describe en Liang y col., "Differential Display of Eukaryotic DNA by Means of the Polymerase Chain Reaction", Science, 257: 967-970 (1992), para identificar un gen que se expresó diferencialmente en la etapa de la pared secundaria de las fibras de algodón. La técnica tiene las siguientes etapas: (a) se transcriben de manera inversa dos o más diferentes poblaciones de ARN total en presencia de un oligo dT anclado (por ejemplo dT_{12}-XY, en el que X e Y denotan A, C, G, o T, no permitiéndose TT) para dar como resultado fragmentos de ADN en una subpoblación de ARNm; (b) se amplifican los fragmentos de ADN mediante la PCR en presencia del mismo oligo dT anclado, una secuencia arbitraria de oligonucleótido 10 mer, y ^{35}S o ^{33}P-ATPd + NTPd; y (c) los fragmentos de ADNc amplificados se separan en geles de secuenciación no desnaturalizante por el tamaño y se detectan en película mediante autorradiografía. Se identifican los ADNc que están presentes diferencialmente mediante comparación entre las bandas del gel, se escinden de los geles, se vuelven a amplificar mediante la PCR, se clonan, y se analizan mediante secuenciación y análisis de transferencia Northern.
Para los resultados descritos aquí, se usó d(T)_{12}-GA como el cebador anclado y GTCCTGGGTT (SEC DE ID Nº: 11) como el aleatorio de 10.mer (denominado W 17), que se adquirió en un kit 10 mer de Operon Technologies (Almeda, CA). Se aisló el ARN total de tejidos de Gossypium hirsutum cv. Coker 312, tal como se describe en Wilkins y col., "Isolation of RNA from Plant Tissue. In: Krieg (eds) A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis", p 21-40, Wiley Liss, Nueva York (1996), específicamente fibras de algodón de 12 y 18 DPA, así como óvulos desnudos de fibra y fibra separada en otras diversas edades. Se llevó a cabo la muestra preferencial tal como se describe en Song y col., "Improved Procedures for Differential Display of Transcripts from Cotton Tissues", Plant Mol. Biol. Rep., 13: 174-181 (1995), excepto que se usaron 2,5 \mul de transcriptasa inversa de M-MuLV y se usó ^{35}S como radiomarca los geles de la muestra diferencial se hicieron avanzar también durante tiempos suficiente de tal manera que únicamente se retuvieron los ADNc \geq 30 pb, lo que evitó los ADNc procedentes de las regiones no traducidas.
Se clonó el ADNc específico de 18 DPA (Figura 1), usando el kit de clonación TA (InVitrogen Inc., Carlsbad, CA), el ADNc tuvo homología con dos quitinasas. El trabajo posterior para identificar el ADN de longitud completa (que se nombró F285; véase el Ejemplo 3), mostró que el 10 mer (W17) correspondió a GTCCCGGGGTT_{746} (nucleótidos 736-746 de la SEC DE ID Nº: 1) pero el cebador tuvo un nucleótido no emparejado y una delección de un único nucleótido, ambas cuales se producen en su extremo 5' (Bauer y col., "Identification of Differentially Expressed mRNA Species by an Improved Differential Display Procedure (DDRT-PCR)", Nucleic Acids Res., 21: 4272-4280 (1993); Liang y col., "Differential Display and Cloning of Messenger RNAs from Human Breast Cancer Versus Mammary Epithelial Cells", Cancer Res., 52: 6966-6968 (1992)).
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Ejemplo 2
Expresión de F285 en fibras durante la deposición de la pared secundaria
Se llevó a cabo el análisis de transferencia Northern sobre el ARN total extraído de diversos tejidos de Gossypium hirsutum cv. Coker 312 en crecimiento en invernadero (luznatural y temperatura ca, 32ºC día/22ºC noche). Se cargó el ARN total (15 \mug/banda) sobre un gel de agarosa al 1,2%, se sometió a electroforesis, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, se fijo mediante calor (1,5 h, 80ºC) y se hibridó con una sonda F285 marcada con ^{32}P (65ºC, durante la noche. Se lavó la membrana (0,1 x SSC, SDS al 0,1%, 65ºC, 15 min), y se expuso la película a película de autoradiografía (17 h; -80ºC). La misma mancha se arrastró y se volvió a sondear con una sonda de ARN ribosómico de 18S marcada con ^{32}P como control.
Las transferencias Northern indicaron que el gen F285 se expreso en las fibras en crecimiento en invernadero únicamente en la etapa de la pared secundaria a los 18, 24, y 27 DPA (Figura 2). No hubo evidencia de expresión en las fibras durante la deposición de la pared primaria a los 8 DPA, o en hojas, tallos, raíces, u óvulos desnudos de fibra a los 8, 18, y 24 DPA. (Los datos d los óvulos desnudos a los 18 y 18 DPA no fueron buenos debido al nivel más bajo de carga del ARN). Sin embargo, cualquier expresión fuerte similar a la que se muestra para la fibra a los 18, 24, y 27 DPA podría haber sido evidente incluso con la carga más baja).
Un análisis temporal más detallado indicó que la expresión en fibra en crecimiento en invernadero no comenzó en los 12 DPA, pero fue fuerte en los 15 DPA, que está cerca del comienzo de la deposición de la pared secundaria en la fibra de algodón cuando se hacen crecer las plantas de algodón en condiciones de invernadero (aproximadamente 32ºC día/22ºC noche).
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Ejemplo 3
Secuenciación de F285 y comparación de su secuencia de aminoácidos traducida con otras proteínas
Basándose en la secuencia del ADNc de F285, se sintetizó un cebador de oligonucleótido de 31-mer justo antes de la cola poliT (5' CAATGGCTATATGTGACTCATTCAATCACAC; SEC DE ID Nº: 12) y se usó junto con el cebador SK (CGCTCTAGAACTAGTGGATC: SEC DE ID Nº: 13) en el rastreo mediante la PCR de una biblioteca de ADNc UniZAP-XR de los ARNm de de fibras de algodón Acala-SJ2 de 21 DPA (Stratagene, La Jolla, CA; kindly proporcionado por el Dr. D. P. Delmer). La reacción de la PCR estaba constituida por 5 \mul de un lisado hervido de biblioteca como plantilla, 1 \muM de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, 200 \muM de MgCl_{2} y 0,5 U de polimerasa Taq. Las condiciones de la reacción de la PCR fueron: 34 ciclos de 95ºC (30 min), 55ºC (1 min), y 72ºC (2 min), seguido por la extensión a 72ºC (5 min). Los productos de la PCR se purificaron en gel, se clonaron en el vector de clonación TA (InVitrogen, Carslbad, CA), y se secuenció completamente en ambas cadenas. El análisis del ADNc de 1273 pb de longitud generado desveló un marco de lectura abierto único con 957 pb, que se nombró F285 (SEC DE ID Nº: 1).
La secuencia de aminoácidos deducida de 318 restos (SEC DE ID Nº: 2) tuvo un pI predicho de 7,98 y un peso molecular predicho de 35.246 Da. La proteína traducida tuvo una mezcla diversa de aminoácidos, una secuencia señal N-terminal predicha, y los emplazamientos para la modificación postraduccional mediante: N-glicosilación, fosforilación mediante cuatro tipos diferentes de proteína quinasas; amidación; y N-miristoilación. La proteína F285 tuvo una mezcla de regiones hidrófilas e hidrofóbicas, extensas regiones de hélice alfa, cadena extendida, y cola aleatoria, y hélices alfa transmembrana no predichas. BLASTX busca qué secuencia del nucleótido F285 se traduce en todos los posibles marcos de lectura y se comprueba para la homología con otras secuencias de aminoácidos que mostraron homología con numerosas quitinasas. La búsqueda de BLASTX confirmó que hubo sólo dos homólogos cercanos de F285 que se descubrieron mediante la secuenciación del genoma de Arabidopsis thaliana, uno en el cromosoma 3 (BAA94976.1; 76,28% de identidad de aminoácidos con F285) y uno en el cromosoma 1 (AAF29391.1, nombrado también AAL37737; 67,49% de identidad de aminoácidos con F285. A partir de ahora, éstos se denominan como homólogos de Arabidopsis de F285. La correspondencia más estrechamente próxima fue con una quitinasa de Arabis microphylla (AAF69789.1; 35,22% de identidad de aminoácidos con F285) (Bishop y col., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 97: 5322-5327 (2000)). La búsqueda de BLAST confirma también que F285 fue similar a pero distinto de las quitinasas de algodón d longitud completa o de longitud casi completa (Q39799, Q39785, AAD11255, y S72528, en la que las tres primeras secuencias relacionadas están muy estrechamente relacionadas) en las bases de datos (véase la TABLA 1), Una búsqueda mediante BLASTP con la secuencia de aminoácidos traducida de F285 no desveló ninguna secuencia adicional muy similar, excepto que otra secuencia de Arabis estrechamente relacionada con AAF69789.1 (Bishop y col., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 97: 5322-5327 (2000)) se sitúo como la tercera correspondencia más elevada.
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Ejemplo 4
Ensayo de actividad de la quitinasa
Para comenzar a explorar el papel biológico de la proteína análoga de F285, se evaluó la actividad de la quitinasa en fibras de algodón en crecimiento en invernadero y cultivadas y láminas de las hojas de las plantas del semillero en presencia y ausencia de ácido salicílico (SA) y etefona (ETH), un compuesto que produce etileno. Se usaron SA y ETH para pulverizar hojas u óvulos de algodón más fibra cultivados tal como se ha descrito anteriormente en Haigler y col., "Cultured Cotton Ovules as Models for Cotton Fiber Development Under Low Temperatures", Plant Physiology, 95: 88-96 (1991), debido a que estos compuestos inducen las quitinasas en otros mucho sistemas (Cutt y col., "Pathogenesis-Related Proteins", in Boller eds., Genes Involved in Plant Defense, New York, Nueva York: Springer-Verlag/Wien, pp. 209-243 (1992)). Se pulverizaron las plantas del semillero (al nivel de escorrentía) con SA (2 nM, pH 6,8), ETH (1 mg/ml; ácido 2-cloroetilfosfórico), o agua (como control) 16 días después de la plantación, se cubrieron débilmente con bolsas de plástico, y se cosecharon las hojas y los tallos 2 días después. En la cosecha, las plantas de semillero tratadas con SA y agua tuvieron un aspecto sano, con sólo unas pocas zonas de necrosis en las hojas y los cotiledones. Sin embargo, las plantas de semillero tratadas con ETH tuvieron 1/3 hojas con abscesos. Se retiraron los óvulos cultivados en el 1 DPA de los matraces de cultivo en el 6 DPA, se pulverizaron similarmente, y se sustituyeron en los matraces, seguido por la cosecha de la fibra en el 8 DPA, Se aplicaron gotitas de los extractos de tejido (10 \mug de proteína total; extraídos por los procedimientos de Mauch y col., "Antifungal Hydrolases in Pea Tissue. I. Purification and Characterization of Two Chitinases and Two b-1,3-Glucanases Differentially Regulated During Development and in Response to Fungal Infection", Plant Physiology, 87: 325-333 (1988), o soluciones control a las zonas (indicadas por 1-12 en la Figura 4) en un gel de poliacrilamida que contenía glicol quitina suspendida, y se llevó a cabo laa incubación para permitir la actividad de la enzima durante 1 h a 37ºC. Se aplicó un abrillantador fluorescente, Tinopal LPW, con elevada afinidad por la quitina polimérica, y se excitó el gel con glicol quitina soluble en agua suspendida en el gel de poliacrilamida (Trudel y col., "Detection of Chitinase Activity After Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Anal. Biochem., 178: 362-366 (1989)). Las zonas oscuras indican que la quitina polimérica en esta localización se degrado de tal manera que el colorante fluorescente no se enlazó más a ésta. Por tanto, las zonas oscuras demuestran la actividad de la quitinasa en la solución aplicada.
El control positivo (zona 12) mostró una fuerte actividad de la quitinasa. Los controles negativos (zonas 8 y 11) no mostraron actividad de la quitinasa. Todos los tejidos de algodón ensayados mostraron actividad de la quitinasa, y no se observó inducción por SA de la actividad de la enzima mediante este ensayo cualitativo.
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Ejemplo 5
Inducción de la expresión de F285 en fibras mediante SA
Se llevaron a cabo las transferencias Northern para indicar si el promotor F285 fue responsable o no de las mismas señales inductoras de otras muchas quitinasas de plantas (Figura 5). Se usó el tratamiento con agua como control negativo: Se ensayó la fibra a los 8 y a los 24 DPA tal como se indicó por las marcas de las bandas, y se cosecharon el tallo y el tejido de la hoja a los 18 días después del tratamiento, si acaso, a los 16 días. No se encontró inducción de la expresión de F285 en las hojas tratadas con SA o ETH o en los tallos de las plantas de semillero tratadas con ETH. Sin embargo, se detectó una débil expresión de las fibras tratadas con SA, pero no en las tratadas con ETH o H_{2}O a los 8DPA a partir de los óvulos cultivados (se expuso la mancha a película durante 4 días). Estos datos sugieren que el promotor F285 es sólo débilmente responsable de los inductores de otros genes de defensa, y esto puede argumentar un papel en el desarrollo de F285.
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Ejemplo 6
Identificación de una posible familia del gen F285
La Figura 6 muestra una transferencia Southern del ADN genómico de algodón (preparado a partir de hojas de plantes de semillero de 18 días) digerido con los enzimas de restricción EcoR1 y Hind III y sondeado con el ADNc de longitud completa de F285; el modelo de bandeado sugiere 4-5 miembros de la familia. Con el fin de comenzar a entender la diversidad genómica y funcional de una posible familia del gen F285, se usó un cebador de una región distintiva (6 repeticiones TAG) próximo al extremo 3' no traducido de la secuencia de F285 en el rastreo de la PCR de la biblioteca de ADNc de la fibra, seguido por la clonación de los productos de la PCR amplificados. Se escogieron tres colonias para la secuenciación del extremo del inserto, una de las cuales, se encontró que era diferente de las otras dos. Se usó este clon designado TAG1, para la hibridación Southern (Figura 6) y la Northern (Figura 7). La mancha de ADN genómico usada para la hibridación de F285 se arrastró y se volvió a sondear con TAG1, que se hibridó en un conjunto similar de fragmentos con diferentes intensidades de hibridación. Por tanto, F285 y TAG1 están relacionados a nivel del ADN.
Se expresó TAG1 en fibras en crecimiento en invernadero a los 8 DPA (etapa de la pared primaria) y se sobrerreguló en fibras a los 24 DPA (etapa de la pared secundaria). Se detectó también una débil expresión en los óvulos desnudos de las fibras (aunque no se pudieron excluir algunas partes contaminantes de las fibras) y en las raíces y los tallos. No se detectó expresión en las hojas. Por tanto, TAG1 tuvo un modelo de expresión más amplio que F285.
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Ejemplo 7
Identificación de un promotor y un homólogo de F285, denominado F286
Para intentar aislar la región del promotor F285 del algodón, se rastreó una biblioteca de algodón genómico de Gossypium hirsutum cv. Acal SJ-2 en lambda Fix II (Stratagene, La Jolla, CA; amablemente facilitada por el Dr. T. Wilkins) en condiciones normalizadas de hibridación (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989)). Se marcó el clon completo de ADNc de F285 con 32P usando un Prime-a-Gene Labeling System Kit (Promega, Madison, WI) y se hibridó hasta placas ca. 5 x 10^{5} fagos colocadas en membranas de nylon (Hybond-N, Amersham, Uppsala, Suecia) en el rastreo inicial. De las 6 placas de hibridación obtenidas, se aisló el ADN del fago a partir de los cultivos de cinco placas y se sometió a digestión con el enzima de restricción Xba I. El modelo de restricción desveló que hubo al menos cuatro bandas en el ADN de cada placa. La hibridación Southern con la misma sonda de F285 mostró que sólo una banda, ca 4,4 kb de tamaño, se hibridó con la sonda del fragmento de F285. El fragmento ca. 44 kb se cortó del gel de agarosa y se purificó mediante el kit de extracción en gel Jetsorb (PGC Scientific, Gaitthersburg, MD) para
subclonar.
Para subclonar el fragmento de 4,4 kb anterior, se digirió el vector PBS (Stratagene, La Jolla, CA) con Xba I, se desfosforiló usando fosfatasa de intestino de ternero (Promega, Madison, WI), y se unió con el fragmento de 4,4 kb usando la ligasa T4 y procedimientos normalizados (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989)). A continuación se transformó la reacción de ligadura en células DH 5\alpha de E. coli (Promega, Madison, WI), y se seleccionaron los transformantes en placas de agar X-gal/IPTG LB. Se aisló el ADN plásmido designado como 47A con el Kit xiAprep Spin Miniprep de QuiaGen (Quiagen, Almeda, CA) para la manipulación y la secuenciación adicional.
Para identificar la presunta región promotora dentro del clon 47A, se uso la secuencia del promotor T3 (procedente del vector pBS) como cebador directo de inicio y se usó el cebador de oligonucleótidos sintetizado que representa los nucleótidos números 159 - 178 de la secuencia del ADNc de F285 (SEC DE ID Nº: 1) como cebador inverso de inicio para la secuenciación automatizada basada en la PCR en una instalación núcleo. Basándose en la secuencia nuevamente generada, se diseñaron cebadores adicionales y el cromosoma continuó su camino en sucesivas etapas hasta que se secuenció completamente una región de 2,34 kb del ADN genómico en ambas cadenas. Este procedimiento de secuenciación es bien conocido por los expertos en la técnica (Sambrook y col, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, pp 12.10-12.100 (2001)). La secuencia de 2,34 kb incluyó 90 pb de la región de codificación 5', se incluyó toda la región 5' en la dirección 5 de la secuencia de codificación en el clon 47A, y los 145 pb del vector pBS. Se esperaba que la región 5'en la dirección 5' de la secuencia de codificación contuviera el promotor
La secuencia del ADNc de F285 se alineó frente a la secuencia del clon 47A usando de Programa de Secuencias BLAST2. En los 90 pb de la región de codificación solapada, sólo fueron idénticos 70 pb (77% de identidad), indicando que el fragmento del promotor identificado puede comenzar en un gen homólogo de F285. Por tanto, el resto del inserto del clon 47A se secuenció completamente en ambas cadenas mediante el procedimiento del cromosoma que continuó su camino descrito anteriormente que usan un cebador de oligonucleótidos sintetizado (5' GAGTGTGAGTGCCCATCATT 3'; nucleótidos 1916-1935 de la SEC DE ID Nº: 10) como el cebador directo de inicio y la secuencia del promotor T7 (procedente del vector pBS) y un cebador inverso de inicio. La anotación de la secuencia del clon 47A usando un programa de predicción génica (Burge y col., "Finding the Genes in Genomic DNA", Curr. Opin. Struct. Biol., 8: 346-354 (1998)) desveló que este contenía dos exones (de 376 pb y 575 pb) con un entrón de intervención (131 pb). La presunta secuencia de ADNc, designada como F286 (SEC DE ID Nº:3), mostró: (a) un 85,0% de homología a nivel del nucleótido en el ADNc de F285, y (b) un 87,46% de identidad y un 97,18% de similitud a nivel de aminoácidos en el ADNc de F285 (con la secuencia señal de los 30 aminoácidos n terminales más variables excluida, hubo un 89,93% de identidad y un 97,92% de simulitud entre las dos secuencias de codificación). La elevada relación entre las dos secuencias de codificación demostró que F285 y F286 son genes homólogos. Y los aminoácidos no idénticos se dispersaron en todas las proteínas. Por lo tanto, podría esperarse que las transferencias Northern producidas con una sonda de ADNc de F285 que reflejaran la expresión d F285 y F286. Se espera que ambos genes tengan una expresión fuertemente potenciada en la etapa de la pared secundaria de la fibra de algodón, aunque sus regiones 5' no traducidas (UTR) no son idénticas (basadas en la secuencia parcial de la 5' UTR en el ADNc de F285).
El fragmento de 2,1 kb en la dirección 5' de la secuencia de codificación de F286 se denominará de ahora en adelante como promotor F286, y esta región puede contener todos los elementos reguladores requerido para dirigir correctamente la expresión temporal y espacial de F286. Debido a la carencia de información en lo que concierne a la longitud exacta del promotor F286 efectivo, se amplificaron mediante la PCR los fragmentos genómicos de cuatro longitudes - 2,1 kb (SEC DE ID Nº: 10), 1,8 kb (SEC DE ID Nº: 9), 1,4 kb (SEC DE ID Nº: 8), y 1,0 kb (SEC DE ID Nº: 7) - en la dirección 5' del presunto codón de inicio de la traducción en la secuencia del gen F286. Se usó ADN polimerasa de revisión turbo pfu (Stratagene, La Jolla, CA) para aumentar la precisión de la amplificación. Los cuatro cebadores directos fueron:
11 
\newpage
La secuencia de reconocimiento del emplazamiento de restricción SaI I (subrayada) y los 5 nucleótidos en la dirección 5' se introdujeron artificialmente en cada cebador, lo que dio como resultado el emplazamiento SaI I que llegó a ser parte de los fragmentos del promotor amplificados, El cebador inverso de cada longitud diferente del fragmento F285 fue el mismo:
12
Este cebador corresponde a la secuencia del promotor justo antes del codón de inicio con el emplazamiento de restricción Xba I (cursiva) y los 5 nucleótidos en la dirección 5' añadidos artificialmente. Los fragmentos del promotor amplificados de cuatro longitudes se ensayaron funcionalmente mediante la transformación estable del algodón.
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Ejemplo 8
Producción de plantas de algodón transformadas de manera estable
Los fragmentos del promotor F286-2,1 kb, F286-1,8 kb, F286-1,4 kb, y F286-1,0 kb amplificados se digirieron posteriormente con SaI I + Xba I y se subclonaron en los emplazamientos correspondientes del plásmido pB1101 de Ti binario (comercialmente disponible de Clontech, Palo Alto, California; Figura 8). El vector pBI101 binario es uno de los muchos que podrían ser adecuados para la transformación del algodón. El plásmido pBI101 se adquiere contenido en un gen de la PPTII transferasa bajo el control del promotor NOS y con un terminador NOS, lo que proporciona un marcador seleccionable para la transformación de la planta. pBI101 contiene también el gen indicador GUS que codifica la \beta-glucuronidasa (GUS) que incluye los codones de inicio y de detención y el terminador NOS. El gen gusA se introduce normalmente en las plantas transgénicas para actuar como un "gen indicador" para ensayar la función del promotor génico. Se conocen comúnmente los principios y procedimientos relevantes y se describen completamente (Gallagher (ed), "Gus Protocols: Using the GUS Gene As a Reporter of Gene Expression", 221 pp, Academic Press, Nueva York (1992)). Los 4 fragmentos del promotor descritos ahora mismo se clonaron en el 5' del gen GUS para producir 4 constructos de expresión génica separados: pBI101-2,1, pBI101-1,8, pBI101-1,4, y pBI101-1, 0. En cada uno de los nuevos 4 constructos, GUS se expresaría sólo bajo el modelo temporal y espacial dictado por los fragmentos F286-2,1 kb, F286-1,8 kb, F286-1,4 kb, y F286-1,0 kb del promotor.
Cada uno de los 4 nuevos constructos se introdujo por separado en la cepa EHA 105 de Agrobacterium (Hood y col., "New Agrobacterium Helper Plasmids for Gene Transfer to Plants", Transgenic Research, 2: 208-218 (1993)) by triparental mating (Svab y col., "Generation of Transgenic Tobacco Plants by Cocultivation of Leaf Disks with Agrobacterium Binary Vector", En: Maliga y col. (eds) Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, pp. 55-77, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)). La cosecha de plásmidos experimentales de Agrobacteria se hizo crecer antes de la transformación en caldo de Luria que contenía Kanamicina (50 \mug/ml) hasta una DO = 0,5 - 0,6, a continuación se diluyó 1:20 en sales minerales Murashige y de Skoog y vitaminas (M-5519; Sigma Chemical Company, San Luis, MO) con glucosa (0,3 g/ml) pero que carecían de hormonas de plantas. Las bacterias diluidas se usaron para infectar segmentos ca. 0,5 cm de hipocótilos de algodón (Gossypium hirsutum cv. Coker 312).
Se llevaron a cabo la transformación de las secciones de hipocótilos de algodón (Gossypium hirsutum cv. Coker 312-17 o 5a, exclusivo) y la regeneración de las plantas mediante embriogénesis somática generalmente tal como se describe en Bayley y col., "Engineering 2,4-D Resistance in Cotton", Theoretical and Applied Genetics, 83: 645-649 (1992); Trolinder y col., "Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration in Cotton (Gossypium hirsutum L.)", Plant Cell Reports, 6: 231-234 (1987); Umbeck y col., "Genetically Transformed Cotton (Gossypium hirsutum L.) Plants", Bio/Technology, 5: 263-266 (1987); Patente de los Estados Unidos Nº. 5.159.135 de Umbeck; Dang, "Expression of a Cotton Fiber `Specific' Gene Promoter in Tobacco and Cotton", 96 pp, Ph.D. tesis doctoral, Texas Tech University, Lubbock, TX (1996). Se prepararon selecciones exclusivas, muy embriogénicas del cv Coker 312 y las semillas fueron contribución del Dr. N. Trolinder (USDA-ARS, Lubbock, TX). El procedimiento de transformación y regeneración incluyó las etapas principales de cultivo simultáneo de las secciones de hipocótilos con Agrobacterium, el crecimiento de callos transformados axénicos, la proliferación de callos embriogénicos en el cultivo en suspensión, y la maduración y la germinación embriónica durante un periodo de aproximadamente 8 meses para cada línea independiente. Se evitaron tiempos más largos en el cultivo del tejido para minimizar la variación somaclonal perjudicial, incluyendo la infertilidad.
Los detalles metodológicos fueron como sigue. Se hicieron germinar plantas de semillero a partir de semillas deshiladas con ácido, esterilizadas, incluidas (EtOH al 70% 2 min, enjuagadas vigorosamente con agua, remojadas en agua estéril, 7-8 h o durante la noche) en medio de Stewart solidificado (2 g/l Gelrite; Kelco Co, San Diego, CA) (pH 6.8; Stewart y col., "En Ovulo Embryo Culture and Seedling Development of Cotton (Gossypium hirsutum L.)", Planta, 137: 113-117 (1977)) en tubos de 25 x 150 mm, 30ºC, 7-12 días, 16 h de luz fluorescente/8 h de oscuridad. Se inocularon (30 s-5 min) segmentos de hipocótilos (ca. 0,5 cm) con Agrobacterium preparados tal como se describe al principio. Tras la eliminación del exceso de bacterias por mechado, se incubaron los hipocótilos 3-4 días (21-25ºC) en medio MS solidificado (2 g/l Gelrite) (Sigma Chemical Company, M-5519; pH 5,8) con 30 g/l de glucosa, 2 mg/l de NAA, y 0,1 mg/l de kinetina para permitir que se produzca la infección. Se transfirieron los segmentos de los hipocótilos en el mismo medio más 50 \mug/ml de kanamicina (para seleccionar el crecimiento de únicamente el tejido transformado) y 500 \mug/ml de Claforan (denominado también cefotaxima, para matar el Agrobacterium) y se incubaron (30ºC; luz), transfiriendo los segmentos de hipocótilos cada 2-4 semanas sobre un nuevo medio (evitando el colorante en el medio). Al final de al menos 6 semanas (normalmente 9-12 semanas; se puede separar el callo con al menos 0,5 cm de diámetro a partir de las piezas de hipocótilos en la transferencia, el callo friable con moderada velocidad de crecimiento preferiblemente de un color ligeramente gris/verde y 0,5-1 cm de diámetro) se transfirió a un cultivo en suspensión en un matraz de 50 ml con 15 ml de medio MS más 30 g/l de glucosa, 1,0 g/l de KNO_{3}, y 25 \mug/ml de kanamicina para la proliferación embriónica (2-4 semanas de crecimiento hasta que las células alcanzaron aproximadamente ½ del volumen del medio, en agitación, 30ºC, luz). Las células/embriones (en cultivos que estuvieron en medio transparente sólido blanco, marrón, o verde) se recogieron mediante sedimentación, las piezas grandes de callos se quebraron mecánicamente, y se retiraron las piezas de callo marrones. Se lavó 3 veces el tejido en medio de suspensión, se volvió a suspender el volumen del tejido 10 x en medio en suspensión, y se plaquearon de manera repetitiva alícuotas de 2 ml en medio en suspensión solidificado (2 g/l Gelright) en placas Petri de 100 x 20 mm, excepto que se usó la kanamicina a 50 \mug/ml. Se cultivaron las placas (30ºC; luz; 2-4 semanas) hasta que los embriones desarrollaron alargamiento (\geq 3 mm), que se transfirieron a medio de Stewart que incluía 5 g/l de sacarosa, 1,5 g/l de Gelrite, y 5 d/l de agar de maduración embriónica (30ºC, luz, 10-14 días). Cuando se desarrollaron las hojas verdaderas, se transfirieron las plántulas al mismo medio en jarras de lata de 1 pinta (0,57 l) con tapas de cultivo de tejido plástico (Frank Moses, Rhyno Manufacturing, Riverside, CA) para crecimiento (30ºC, 16 h de luz fluorescente/8 h de oscuridad). Cuando las plantas de semillero tuvieron 5-8 cm de altura y 5 hojas verdaderas, se realizó un corte del tallo por encima del segundo nódulo y se volvió a enraizar (7-14 días) en el mismo medio. Se transfirió este clon al suelo cuando tuvo 3-5 raíces blancas ca. 4 cm de longitud y se templó gradualmente mediante una bolsa de plástico sujeta con flojedad antes de la transferencia al invernadero.
Se inició el ensayo de 2,1 kb a una escala mayor (2500 piezas de hipocótilo inoculadas) que los otros (1040, 1710, y 1040 piezas de hipocótilo inoculadas para los ensayos de 1,8, 1,4, y 1,0 kb, respectivamente), lo que explica diferentes números de líneas disponibles finalmente para cada ensayo. Una "línea" transgénica se refiere a las plantas que se originan a partir de una pieza original de callo debido a que éstas está garantizado que representan uno o más (en diferentes embriones) episodios de transformación.
A partir de las plantas T0 y T1 de los ensayos de 2,1, 1,8, y 1,4 kb que crecían en el invernadero y que formaban cápsulas, se llevaron a cabo los análisis histológicos de los modelos de expresión de GUS en las fibras en desarrollo, tejidos vegetativos juveniles y maduros, y tejidos reproductores de la planta. Los modelos de expresión específicos de tejido fueron los mismos entre las plantas T0 y T1. Para el ensayo de 1,0 kb, se seleccionaron tejidos vegetativos juveniles y maduros en T0. Se llevó a cabo el ensayo sistemático en T1 sobre plantas de semillero juveniles de 21, 6, y 8 líneas de los ensayos de 2,1, 1,8 y 1,4 kb, respectivamente, todos los cuales mostraron resistencia a la kanamicina. La resistencia a la kanamicina mediante el gen NPTII bajo el control del promotor 25S de CaMV, el marcador de selección al antibiótico en el casete de expresión del gen extraño, indicó la inserción y la expresión del gen extraño. Las plantas de semillero de algodón resistentes a la kanamicina forman raíces laterales dentro del medio de kanamicina, mientras que las plantas de semillero no transformadas o con transformación nula producen sólo una raíz central sin raíces laterales.
Adaptando los procedimientos descritos en Umbeck y col, "Inheritance and Expression of Genes for Kanamycin and Chloramphenicol Resistance in Transgenic Cotton Plants", Crop Science, 29: 196-201 (1989), se determinó la capacidad de germinación de las semillas para formar raíces laterales dentro del medio solidificado que contenía kanamicina (sales minerales de Stewart y vitaminas, pH 6,8, 2 g/l de Gelright®, 50 \mug/l de kanamicina). De cada planta T0, se hicieron germinar 24 semillas T1 esterilizadas y deshiladas con ácido en medio de kanamicina (10-12 ml/tubo de ensayo) en una cámara de crecimiento (luz baja; 30ºC), puntuadas tras 5-7 días, y las plantas que formaban raíces laterales dentro del medio se transfirieron al suelo tras eliminar suavemente el medio de kanamicina de las raíces. Dos-cuatro plantas resistentes por embrión (según disponibilidad) se transfirieron al suelo. Las semillas de tres líneas transformadas con el gen GUS bajo el control del promotor 35S de CaMV (amablemente facilitado por R.D. Allen; Song y col., "Expression of Two Tissue-Specific Promoters in Transgenic Cotton Plants", The Journal of Cotton Science, 4: 217-223 (2000)) se trataron similarmente, y las plantas de semillero resistentes de éstos más las C312-17 parentales no transformadas se plantaron en el invernadero.
De las semillas que germinaron normalmente (raíces abajo y retoños arriba), se realizaron los recuentos para la segregación de la resistencia a la kanamicina; sensibilidad a la kanamicina, lo que permitió evaluar preliminarmente numerosos emplazamientos de inserción génica en algunos casos. Los datos de la relación de segregación son preliminares, debido a que se necesitan 72 semillas germinadas para evaluar una relación 15:1 que surge de los dos emplazamientos de inserción independientes a p \leq 0,01. Para los rasgos bajo herencia normal mendeliana, las semillas T1 resistentes a la kanamicina (con nulas eliminadas y no consideradas) segregarán una población con las siguientes características: (a) si hay un emplazamiento de inserción génica, 1/3++ y 2/3+0 de semillas; y (b) si hay dos emplazamientos de inserción génica en cromosomas no homólogos, 1/8+++, 1,4+++0, 3/8++00, y ¼+000 de semillas. Estos cuatro grupos (++++, +++0. ++00, y +000) no son genética o necesariamente funcionalmente equivalentes en ellos mismos debido a los emplazamientos dobles de inserción génica y a posibles efectos posicionales de inserción génica sobre la expresión génica. El número de emplazamientos de inserción génica no se tiene en cuenta para posibles repeticiones en tándem del gen extraño en un emplazamiento cromosómico. Son posibles otras relaciones de segregación más complejas si los múltiples emplazamientos de inserción génica se producen en los mismos cromosomas homólogos.
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Ejemplo 9
Procedimientos y resultados histológicos
Tal como se describe en Gallagher (ed) ``Gus Protocols: Using the GUS Gene As a Reporter of Gene Expression, 221 pp, Academic Press, Nueva York (1992), GUS rompe un sustrato histoquímico (por ejemplo, X-GlcA: sal de ciclohexil amonio del ácido 5-Bromo-4-cloro.3.indolil-\beta-D-glucurónico) en la unión \beta1 glucurónica entre el ácido glucurónico y el resto 5-Bromo-4-cloro-3-indolilo. El dicloro-dibromo-indigo azul, insoluble en agua precipita en el emplazamiento de la rotura enzimática, proporcionando un marcador cualitativo para la expresión de gusA en algunas células y tejidos. Las partes de la planta completa o las secciones, si son pequeñas, se procesan para la reactividad de GUS mediante protocolos normalizados. Se pueden preparar las secciones manipulando con el filo de una navaja o con un micrótomo tras la inclusión, por ejemplo, inclusión en parafina mediante un protocolo ayudado por microondas para preservar los tejidos delicados tales como el cambium (Ruzin, Plant Microtechnique and Microscopy, 322 pp, Oxford Univ. Press, Oxford (1999)). El color azul (o el color rojo si se usa óptica de campo oscuro) se evalúa en la disección y/o el microscopio óptico compuesto. La óptica de campo claro, de contraste por interferencia diferencial (DIC), y la de campo oscuro son útiles para desvelar la localización y la estructura de la planta, y el examen en paralelo con óptica de polarización puede desvelar el grosor de las paredes de las células de la planta y las microfibrillas organizadas de celulosa en el interior de las paredes de las células de la planta para ayudar en la evaluación de los tipos de células en los que se encuentra GUS.
El análisis de múltiples líneas de plantas T1 juveniles demostró que los promotores más largos (2,1 y 1,8 kb) produjeron el silenciamiento de la expresión de GUS, mientras que no se observó este efecto con el promotor de 1,4 kb (TABLA 1).
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TABLA 1
13 
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Por tanto, se prefiere el promotor de 1,4 kb por la ausencia del silenciamiento del gen extraño, de tal manera que se maximizará el número de líneas útiles que surgen del procedimiento de transformación. Para los ensayos de 2,1 y 1,8 kb, se observó el silenciamiento de la expresión de GUS en todos los tejidos de la planta en los que se esperaba la expresión positiva. Se esperaba que loss tejidos seleccionados para el análisis fueran tejidos en crecimiento, y los resultados negativos en una línea se confirmaron en un segundo ensayo. Debido a que se observó el silenciamiento de la expresión de GUS en las plantas que eran resistentes a la kanamicina, el promotor 35S de CaMv y el promotor F286 deben estar afectados diferentemente por el factor que produce el silenciamiento del gen GUS. Posiblemente funciona un elemento regulador negativo adicional en la dirección 5' en el promotor F286 para reprimir la expresión génica cuando se produce la inserción promotor/gen en un microentorno genómico concreto. Se usó la base de datos PLACE de presuntos motivos reguladores que se encuentran qn elementos reguladores del ADN cis actuantes en la planta (Higo y col., "Plant cis-Acting Regulatory DNA Elements (PLACE) Database", Nucleic Acids Research, 27: 297-300 (1999)) para observar loss motivos que pueden encontrarse únicamente en las regiones de los fragmentos promotores de 2,1 y 1,8 kb que están en la dirección 5' del fragmento de 1,4 kb. La TABLA 2 muestra que al menos 8 motivos cumplen este criterio, y estos establecen una posible base para la regulación diferencial de la expresión génica, incluyendo un silenciamiento más frecuente por los fragmentos más largos. Además, otros motivos no identificados mediante PLACE pueden ser responsables del silenciamiento génico observado. Los diversos motivos reguladores en el interior de los fragmentos de 2,1 kb o más cortos ilustran adicionalmente que los elementos reguladores clave, los que se muestran en la TABLA 2 y otros que no se conocen aún, se pueden fusionar artificialmente en un promotor útil sin que sea necesaria o útil la delección de otros motivos para el objetivo pretendido tal como se ha descrito anteriormente.
Combinando los resultados histológicos de las plantas T0 maduras y la plantas T1 juveniles, se pueden hacer las siguientes observaciones del modelo de desarrollo de la expresión de GUS. Estos resultados fueron los mismos para los ensayos de 2,1 kb, 1,8 kb, y 1,4 kb. Se pueden resumir los resultados diciendo que la tres longitudes del promotor impulsan la expresión génica preferentemente en diversas células de la pared secundaria dentro de la planta de algodón, todas las cuales contienen celulosa como componente principal. Se obtuvieron similares resultados en las plantas T0 del ensayo de 1,0 kb. Existen numerosas aplicaciones comerciales para la modificación del contenido de celulosa en tallos de plantas, y el promotor F286 podría ser útil en dichas estrategias biotecnológicas, La utilidad del promotor se enfatiza adicionalmente por su exclusión de la expresión génica en: (a) células vasculares y oclusivas de la pared secundaria de hojas, cotiledones, brácteas, pétalos, y semillas; (b) fibras de hila blanqueadas cortas que se desarrollan al lado de fibras largas de hila de algodón; y (c) células típicas del parénquima tales como las mesófilas fotosintéticas y las voluminosas del tejido profundo de tallos y raíces.
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TABLA 2 Motivos reguladores posibles presentes en el promotor F286
14
TABLA 2 (continuación)
15
TABLA 2 (continuación)
16
TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
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TABLA 2 (continuación)
26 
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En las fibras de hila del algodón, el promotor impulsa la expresión de GUS comenzando a los 14 DPA, con una expresión muy fuerte en los 17 DPA (figura 9). Se sugirió la fuerza de la expresión de GUS en la fibra por la masa azul brillante de fibra \geq 17 DPA observada tras \leq 30 min de incubación en el sustrato. Las células no de fibra de la epidermis externa de la semilla no expresan GUS (Figura 9; semilla a los 27 DPA). El examen de las fibras individuales mediante microscopía de contraste por interferencia diferencial (DIC) mostró que el comienzo de la expresión de GUS corresponde al desarrollo de las paredes engrosadas de las fibras que contienen microfibrillas helicoidales, lo cual indica el comienzo de la deposición de la pared secundaria. La expresión fuerte de GUS a los 17 DPA (Figura 9) indica probablemente que todas las fibras tuvieron interrumpida entonces la deposición de la pared secundaria, en contraste con unas pocas fibras que entran en esta etapa de desarrollo a los 14-16 DPA. Las fibras de hila en motas se tiñeron también intensamente de azul en los 17 DPA, y el examen microscópico confirmó que habían iniciado la deposición de la pared secundaria.
El color azul brillante persistió en las fibras vivas hasta al menos los 40 DPA (Figura 9). La expresión de GUS continuó durante este periodo en función de lo que se esperaba basándose en el modelo de expresión que se muestra en las transferencias Northern de los genes F285/F286. Estos genes homólogos se expresaron entre los 15-31 DPA (el último día ensayado), y el análisis histológico de GUS fue consistente con este hallazgo. También, los resultados cuantitativos demostraron que la cantidad de GUS aumentó entre los 18 y los 24 DPA para las tres longitudes del promotor.
GUS no se expresó en las borras (denominadas también fibras de borra) a los 27 DPA (figura 10). Las borras iniciaron el alargamiento unos pocos días después que las fibras de hila. Las borras fabrican paredes celulósicas gruesas y representan una disminución de carbono significativa (Berlin, "The Outer Epidermis of the Cotton Seed", En: Mauney y col. (eds) Cotton Physiology, pp. 375-414, The Cotton Foundation, Memphis (1986)). Los cambios en la calidad de la fibra, especialmente los que requieren más asignación de carbono, se dirigen preferentemente a la fibras de hila más valiosas y el(los) promotor(es) tiene(n) una utilidad adicional proporcionando una herramienta para cumplir esta meta.
En las plantas T0 maduras y/o en las plantas T1 juveniles, GUS se expresó en diferentes células de la pared secundaria que incluían: (a) las del integumento interno del recubrimiento de la semilla; (b) los tricomas en hojas, tallos, y sépalos en desarrollo dentro de brotes jóvenes; (c) células vasculares de la pared gruesa (en xilema y floema) de los tallos, hipocótilos, raíces, y la columna estaminal; (d) el endotecio fibroso de las anteras; y (e) la intina celulósica gruesa de las paredes del polen. El tejido del xilema separado de una sección manualmente en el cambium y observado de frente mostró claramente la tinción HUS positiva selectiva en las filas alargadas de las fibras. La expresión fue transitoria en algunos casos: tricomas de más edad/maduros y células vasculares no se tiñen positivamente y algunas veces, un órgano fue completamente negativo, presumiblemente debido a que no estaba en crecimiento. La intensidad de la expresión en las ramas laterales aumentó con la distancia al talo principal en aumento, lo que es consistente con el aumento de la expresión en regiones en rápido crecimiento, en las que se forman paredes más secundarias. Fue consistente una conexión entre la tinción positiva en la fibra de algodón y la tinción positiva en unos tejidos vegetativos que no se observó sin los otros.
No se observó la expresión de GUS en células de hoja diferentes de tricomas a pesar del examen de hojas de muchas edades (comenzando por los brotes en crecimiento) y el clarificado de la clorofila en EtOH de tal manera que no desapareciera la débil tinción azul. No se observó la expresión de GUS en células de pétalos o vasculares de hojas o en célula oclusivas (amas en las paredes secundarias). Se obtuvieron los mismos resultados negativos para cotiledones y brácteas. Permanecieron también sin teñir las células oclusivas en la superficie de la semilla.
La inclusión y la sección del tejido procesado para la actividad de GUS confirmó la asociación específica de la actividad del promotor con las células que producían las paredes celulares secundarias gruesas (Figura 11).
La intensidad de la expresión cualitativa de GUS estuvo en el rango de 2,1 kb > 1,4 kb > 1,8 kb, lo que fue consistente con los resultados cuantitativos. Los resultados preliminares del ensayo de 1,0 kb mostraron que la expresión de GUS en tejidos vegetativos y reproductores puede ser de intensidad similar a los tres fragmentos del promotor más largos. Combinando los resultados de las plantas maduras (m) y juveniles (j), la intensidad de la expresión cualitativa de GUS en los diferentes tejidos fue. Raíces (j) > peciolos (m) > hipocótilos (j) > ramas laterales (m) > talos principales (m y j). Sin embargo, estos resultados pueden tener poca relación con los niveles de expresión en el interior de las células y más relación con la densidad de células que forman la pared secundaria en el interior de un tejido. Los datos sugirieron que la función del promotor fue más fuerte en la fibra de algodón que en estas otras fibras debido a que se observo una fuerte tinción en la fibra de algodón a \geq 17 DPA en < 1 h, mientras que se determinó empíricamente que eran normalmente necesarias \geq 4 h para obtener color azul visible en tejidos vegetativos (Figura 12ª; un resultado típico en una línea que expresa un nivel moderado). Se produjo una excepción en la línea 2.2-47 que se expresaba fuertemente (véase a continuación para los resultados cuantitativos) en la que se observó color azul en otros tejidos después de 1 hora (Figura 12B), pero el comportamiento de los expresores de nivel moderado es más útil para comparar la fuerza de la expresión histológicamente entre tejidos. Por tanto, el(los) promotor(es) F286 tuvieron la expresión mucho más potenciada en la fibra de hila de algodón.
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Ejemplo 10
Procedimientos y resultados cuantitativos
Se hicieron crecer las plantas de semillero T1 resistentes a la kanamicina, tal como se describe anteriormente en un invernadero hasta la floración. Se etiquetaron las flores blancas en el día de la antesis, y se cosecharon las cápsulas de tamaño normal a los 18-24 DPA. Se demostró que las cápsulas podrían congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -80ºC sin minimizar visiblemente la reacción GUS histológica. Los ensayos cuantitativos demostraron que los valores de las cápsulas congeladas fueron mayores, debido probablemente a la actividad proteolítica que se produjo mientras las fibras frescas se cortaban con tijeras para facilitar la extracción de GUS. Por tanto, los ensayos histológicos y cuantitativos se llevaron a cabo en lotes de las cápsulas congeladas anteriormente recogidas.
Las cápsulas congeladas se abrieron mediante quebrado, se separaron las semillas del tejido de la cápsula, y se separó la fibra de todas las semillas mediante molienda suave antes de que se pulverizaran solo las fibras mediante molienda dura en nitrógeno líquido. Todas las semillas usadas en el ensayo fueron de tamaño normal con fibra normal para su edad. La extracción y el ensayo de GUS fue como se describe en Gallagher, (ed) "Gus Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression", 221 pp., Academic Press, Nueva York (1992), que se incorpora por tanto por referencia en su totalidad. Se midió la actividad de GUS con el sustrato fluorométrico 4-metilumbeliferil-(3-D-glucurónido (MUG). Se hidrolizó MUG mediante GUS, y se finalizó la reacción con Na_{2}CO_{3} básico 0,2 M. El carbonato produce también la liberación del resto, 7-hidroxi-4-metilcumarina (4-metilumbeliferona; MU) para llegar a ser completamente fluorescente. Se midió la fluorescencia de MU en un fluorómetro (excitación a 355 nm/emisión a 460 nm). Se preparó una curva normalizada con GUS purificado [tipo VII-A de E. coli; Sigma Chem; 0,2 - 2,0 ng/\mul), y se determinó el contenido de proteína en los extracto de la fibra de algodón mediante el ensayo de Bradford para permitir la expresión de los datos como % de GUS en la Proteína Total. Usando GUS purificado, se determinó que la detención no rápida de la reacción se produjo por los componentes endógenos de los extractos de la fibra de algodón. Como control, se llevó a cabo el ensayo en las fibras del algodón no transformado, y el valor de fondo que correspondía a un 0,112% de GUS en la proteína total se sustrajo de todos los valores
informados.
En el 18 DPA, un día después de que se observara un azul uniforme en las fibras, los ensayos de 1,4, 1,8, y 2,1 kb mostraron promedios similares para el % de Avg en GUS/planta (TABLA 3). Los conjuntos de datos individuales contenían valores que se solapaban en gran medida. Como excepción, se observaron valores más altos (1,256 y 1,357% de GUS) en dos plantas individuales en el ensayo 2.1, 2.1-2-2a-1 y 2.1-47-1a-1. Estas líneas mostraron recuentos de segregación T1 a T1 de 14:0 y 19:0, respectivamente, lo que indica múltiples emplazamientos de inserción génica. Otras plantas ensayadas dentro de cada una de esta líneas tuvieron valores de GUS inferiores, consistente con tener pocas copias del casete de expresión del gen extraño. Por tanto, el promotor de 2,1 kb puede impulsar una expresión de la proteína más elevada cuando presenta en el interior múltiples copias de un casete de expresión. El promotor de 2,1 kb puede tener una longitud preferida para impulsar una expresión génica más elevada. Los ensayos de 1,4 y 1,8 kb incluyeron líneas con recuentos de segregación T1 que mostraban múltiples emplazamientos de inserción génica (por ejemplo, 1,4-32-2a, 1,4-41-6a, y 1,8-16-11a), y el número de líneas de 1,4 kb ensayadas proporcionó la misma oportunidad que para el ensayo de 2,1 kb para la expresión elevada que se puso de manifiesto. Sin embargo, es posible que las plantas con el número más alto de copias de los casetes de 1,4 y 1,8 kb no se ensayaran debido a la manera aleatoria en la que se colocaron las plantas de semillero en los ensayos basándose sólo en la resistencia a la kanamicina de la formación de raíces laterales). Las líneas con recuentos de segregación generalmente consistentes con un emplazamiento de inserción génica (por ejemplo, 1,4-11-3b, 5b; 1,4-32-1a; 1,4-43-5ª; 1,4-44-1ª, 1,8-16-12ª, 2,1-2-3a, 2,2-55-8a) tuvieron un intervalo de % de GUS en la planta individual de 0,187-0,756, sin diferencias obvias entre los ensayos de 1,4, 1,8 y 2,1 kb. Estos valores surgen presumiblemente de una o dos copias del casete de expresión del gen extraño en las poblaciones T1 segregantes.
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TABLA 3
27
28
29
30
31
En el 18 DPA, el ensayo del promotor 35S de CaMV se mostró 3,70-5,29 veces un % mayor de GUS que cualquier longitud del promotor F286 ensayado (TABLA 4). Sin embargo, este resultado no es indicativo de la fuerza relativa del promotor, debido a que el promotor 35S de CaMV impulsa la expresión génica del principio del desarrollo de la fibra de algodón, tal como se demostró por su uso como promotor control en los experimentos anteriores (Dang, "Expression of a Cotton Fiber ``Specific'' Gene Promoter in Tobacco and Cotton", 96 pp., Ph.D. Tesis doctoral, Texas Tech University, Lubbock, TX (1996)). Consiguientemente, el gen gusA ha estado activado durante 18 días en la fibra procedente del ensayo de 35S de CaMV, pero uniformemente durante un único día en los ensayos del promotor F286. Tal como se ha descrito anteriormente, la proteína GUS es muy estable y se acumula en el tiempo, haciendo difícil distinguir entre el comienzo temprano de la transcripción y la actividad más fuerte del promotor. Sin embargo, los ensayos del promotor F286 de 1,4, 1,8 y 2,1 kb mostraron un aumento del % de GUS (promedio = 0,283% de aumento) entre los 18 DPA y los 24 DPA, mientras que el ensayo del promotor 35S de CaMV mostró una disminución durante el mismo periodo (-0,728%). Por tanto, además de restringir la expresión génica en la etapa de la pared secundaria del desarrollo de la fibra, se prefieren los promotores F286 para mantener niveles más consistentes durante un periodo más largo de deposición de la pared secundaria.
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TABLA 4
32
<110> Universidad Tecnológica de Texas
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<120> MOLÉCULAS DE ADN QUE CODIFICAN QUITINASAS DE ALGODÓN EXPRESADAS PREFERENTEMENTE EN CÉLULAS CON PAREDES SECUNDARIAS DURANTE LA DEPOSICIÓN DE LA PARED SECUNDARIA Y UN PROMOTOR CORRESPONDIENTE
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<130> 201304/1053
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<140> PCT/US2004/001816
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<141> 23-01-2004
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<150> 10/350.696
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<151> 23-01-2003
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<160> 32
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 957
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<212> ADN
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 1
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33 
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<210> 2
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<211> 318
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<212> PRT
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 2
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34 
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<210> 3
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<211> 951
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<212> ADN
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 3
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36 
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<210> 4
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<211> 316
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<212> PRT
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 4
37
38 
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<210> 5
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<400> 5
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39 
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<210> 6
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<400> 6
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40 
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<210> 7
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<211> 1029
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<212> ADN
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 7
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41 
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<210> 8
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<211> 1403
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<212> ADN
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 8
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42 
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<210> 9
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<211> 1815
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<212> ADN
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 9
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43 
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<210> 10
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<211> 2105
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<212> ADN
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<213> Gossypium hirsutum 
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<400> 10
44 
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<210> 11
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<211> 10
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Aleatorización de 10-mer (W17) procedente de un kit de 10mer de Operon Technologies (Almeda, CA)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcctgggtt 
\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
caatggctat atgtgactca ttcaatcaca c 
\hfill
31 
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<210> 13
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgctctagaa ctagtggatc 
\hfill
20 
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<210> 14
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<211> 59
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 18 es un aminoácido que es poco o muy similar a I
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
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<222> (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 26 es un aminoácido que es poco o muy similar a E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 29 es un aminoácido que es poco o muy similar a D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 37 es un aminoácido que es poco o muy similar a N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 42 es un aminoácido que es poco o muy similar a I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 54 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
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<400> 14
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 59
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabis microphylla 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
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<223> X en la posición 2 es un aminoácido que es poco o muy similar a Y
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
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<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 5 es un aminoácido que es poco o muy similar a T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 11 es un aminoácido que es poco o muy similar a H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 15 es un aminoácido que es poco o muy similar a A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 16 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 18 es un aminoácido que es poco o muy similar a I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 38 es un aminoácido que es poco o muy similar a H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 40 es un aminoácido que es poco o muy similar a E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 42 es un aminoácido que es poco o muy similar a I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 45 es un aminoácido que es poco o muy similar a N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 47 es un aminoácido que es poco o muy similar a T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 48 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 51 es un aminoácido que es poco o muy similar a Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 54 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gossypium hirsutum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 1 es un aminoácido que es poco o muy similar a T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 5 es un aminoácido que es poco o muy similar a T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 9 es un aminoácido que es poco o muy similar a S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 11 es un aminoácido que es poco o muy similar a H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 15 es un aminoácido que es poco o muy similar a A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 16 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 18 es un aminoácido que es poco o muy similar a I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 26 es un aminoácido que es poco o muy similar a E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 32 es un aminoácido que es poco o muy similar a K
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 38 es un aminoácido que es poco o muy similar a H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 40 es un aminoácido que es poco o muy similar a E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 42 es un aminoácido que es poco o muy similar a I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (43)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 43 es un aminoácido que es poco o muy similar a E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en las posiciones 44 y 45 es un aminoácido que es poco o muy similar a N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 46 es un aminoácido que es poco o muy similar a A '
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 48 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 49 es un aminoácido que es poco o muy similar a A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 51 es un aminoácido que es poco o muy similar a Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (52)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 52 es un aminoácido que es poco o muy similar a A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 54 es un aminoácido que es poco o muy similar a L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia distintiva de aminoácidos presuntamente sin cambios
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabis microphylla 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
50 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
51 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgagtcga cgatatcgaa ttcctgcagc c 
\hfill
31 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctgagtcga ccttcaatct ctgccaatga tc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctgagtcga caacctctcg agctgccata t 
\hfill
31 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctgagtcga cctgagacca gcgttcaaca t 
\hfill
31 
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<210> 25
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 25
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctagtctag atatcaaaga tacgaagcaa aatg 
\hfill
34 
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<210> 26
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 26
52 
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<210> 27
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<211> 35
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<400> 27
53 
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<210> 28
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 28
54 
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<210> 29
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<400> 29
55 
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<210> 30
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<220>
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<221> inseguro
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<222> (4)..(7)
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<223> N en las posiciones 4-7 es A o G o C o T (inseguro de secuencia exacta)
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<400> 30
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\hskip-.1em\dddseqskip
caannnnatc 
\hfill
10 
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<210> 31
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<400> 31
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ttwtwttwtt 
\hfill
10 
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<210> 32
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
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<400> 32
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\hskip-.1em\dddseqskip
wtttatrttt w 
\hfill
11

Claims (25)

1. Un promotor de ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo de la SEC DE ID Nº: 7, la SEC DE ID Nº: 8, la SEC DE ID Nº: 9, y la SEC DE ID Nº: 10.
2. Un constructo de ADN que comprende: un promotor de ADN de acuerdo con la reivindicación 1; un segundo ADN que codifica un proteína o un polipéptido heterólogo, en el que el promotor de ADN se une de manera operable a 5' en el segundo ADN para inducir la transcripción del segundo ADN; y una región reguladora 3' unida de manera operable al segundo ADN.
3. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la molécula del segundo ADN se expresa durante la deposición de la pared secundaria.
4. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las células de la pared secundaria son fibra de algodón.
5. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la molécula del segundo ADN se expresa en las fibras de algodón comenzando a los 14 a 17 DPA (días después de la antesis).
6. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula del segundo ADN se expresa en las fibras de algodón a través de la finalización de la deposición de la pared secundaria.
7. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula del segundo ADN se expresa en las fibras de algodón hasta el 40 DPA.
8. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el segundo ADN se selecciona entre el grupo constituido por celulosa sintasas heterólogas, en forma tanto normal como mutada, genes que modulan el reparto del carbono en la celulosa, genes de polímeros de proteínas o regiones de unión con la celulosa que cristalizan simultáneamente y que sintetizan polisacáridos y otros enzimas que pueden afectar las propiedades moleculares y biofísicas de la celulosa, factores de transcripción que prolongan el alargamiento del crecimiento y/o cambian el momento exacto o la extensión de la deposición de la pared secundaria; genes que afectan la síntesis de las hormonas de las plantas y cambian las propiedades de la fibra; genes de los elementos citoesqueléticos o proteínas asociadas al citoesqueleto que afectan las propiedades de la fibra; genes de las enzimas que sintetizan o modifican lípidos que cambian las propiedades de la membrana y mejoran la calidad de la fibra; genes para enzimas que, a través del aumento o la disminución de la actividad, prolongan o aumentan la extensión del crecimiento durante la deposición de la pared secundaria; genes de las proteínas o polímeros plásticos que están retenidos en la luz de la fibra o se integran en la pared celular para aumentar la resistencia de la fibra o cambiar sus propiedades textiles; genes de los enzimas biosintéticos de la matriz de la pared celular de la planta o sus proteínas reguladoras de tal manera que se podrían integrar otros carbohidratos en la pared celular y cambiar las propiedades de la fibra; genes de moléculas que confieren color a las fibras; genes de moléculas que cambian la absortividad y la resistencia de las fibras de algodón; y los genes de las moléculas de transducción de la señal que regulan los cambios entre las etapas de desarrollo de la fibra
9. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el segundo ADN es un gen que modula el reparto del carbono en la celulosa y codifica la celulosa sintasa, la sacarosa sintasa, la sacarosa fosfato sintasa, la UDPG-pirofosforilasa, la pirofosfatasa inorgánica, las hexoquinasas, y las invertasas.
10. Un sistema de expresión que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.
11. Una célula huésped transformada con el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.
12. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula huésped es una célula bacteriana o una célula de planta.
13. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula huésped es una célula de Agrobacterium.
14. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula huésped es una célula de planta de una planta seleccionada entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.
15. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la planta es algodón.
16. Una planta que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.
17. Una planta de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la planta se selecciona entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.
18. Una planta de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la planta es algodón.
19. Una semilla de planta que comprende un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.
20. Una semilla de planta de acuerdo con la reivindicación 19, en la que la planta se selecciona entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.
21. Una semilla de planta de acuerdo con la reivindicación 20, en la que la planta es algodón.
22. Un procedimiento para expresar un gen preferentemente en las células de la pared secundaria durante la deposición de la pared secundaria en una planta que comprende, transformar una planta con el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 2.
23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que las células de la pared secundaria son fibra de algodón.
24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la planta se selecciona entre el grupo constituido por árboles, cultivos forrajeros, algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, yute de Siam, miraguano, coco, bambú, crin vegetal, cáñamo de Manila y Agave spp.
25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la planta es algodón
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Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7098324B2 (en) * 2001-07-30 2006-08-29 Texas Tech University Chitinase encoding DNA molecules from cotton expressed preferentially in secondary walled cells during secondary wall deposition and a corresponding promoter
US7632654B2 (en) * 2002-04-29 2009-12-15 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for detecting endoglycosidase activity
WO2005011366A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Fonterra Co-Operative Group Limited Polynucleotides, polypeptides and their use in the production of plants with altered condensed tannins
US20060107589A1 (en) 2004-11-19 2006-05-25 Rubin Patti D Compressed growing medium
US9756798B2 (en) 2004-11-19 2017-09-12 Patti D. Rubin Burrow filling compressed growing medium
US20100293664A1 (en) * 2007-04-03 2010-11-18 Sathish Puthigae Control of plant gene expression
US20090113791A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Oms Investments, Inc. Compressed Coconut Coir Pith Granules and Methods for the Production and use Thereof
CN101230348B (zh) * 2007-11-19 2010-06-23 安徽省农业科学院水稻研究所 水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSPⅠ)及其应用
BRPI0909285B1 (pt) 2008-03-31 2020-01-28 Ceres Inc ácido nucleico, construção de vetor, método de condução de transcrição, método de expressão de uma região de codificação exógena em uma planta, método de alteração da expressão de um gene em uma planta, método de produção de uma planta transgênica
DE112010003162T5 (de) 2009-04-22 2012-08-16 Basf Plant Science Company Gmbh Gesamtsamen-spezifischer Promotor
CA2765034A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Early endosperm promoter and methods of use
WO2012177418A1 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 Bangladesh Jute Research Institute Nucleic acid molecules encoding enzymes that confer disease resistance in jute
IN2014CN02468A (es) 2011-09-08 2015-06-19 Novozymes Bioag As
US8946119B2 (en) 2011-09-23 2015-02-03 Novozymes Bioag A/S Chitooligosaccharides and methods for use in enhancing soybean growth
WO2013044214A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Novozymes Biologicals Holdings A/S Combinations of lipo-chitooligosaccharides and methods for use in enhancing plant growth
AU2012312006B2 (en) 2011-09-23 2015-10-29 Novozymes Bioag A/S Chitooligosaccharides and methods for use in enhancing corn growth
US9055746B2 (en) 2011-09-23 2015-06-16 Novozymes Bioag A/S Chitooligosaccharides and methods for use in enhancing plant growth
CN102787105B (zh) * 2012-07-16 2013-11-27 河北农业大学 棉花尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因ugd6、其编码蛋白及应用
WO2014198885A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Bayer Cropscience Nv Plant fibers with improved dyeing properties
CN105543229B (zh) * 2016-02-26 2018-06-19 武汉大学 水稻几丁质激发子结合基因启动子及其应用
CN106399358A (zh) * 2016-06-03 2017-02-15 华南农业大学 莲纤维素合酶基因NnuCESA4的应用
CN109554379B (zh) * 2018-12-30 2022-02-22 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因及其克隆方法和应用
US20220220495A1 (en) 2019-05-10 2022-07-14 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
WO2021048316A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
AU2020396138A1 (en) 2019-12-03 2022-06-16 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CN110760528B (zh) * 2019-12-14 2022-02-01 厦门梓蔓生物科技有限公司 一种大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1及其应用
CN111041030B (zh) * 2019-12-31 2021-09-10 海南波莲水稻基因科技有限公司 一种在水稻花粉中特异表达的启动子pchf4及其应用
CN111876429B (zh) * 2020-04-10 2022-05-17 中国科学技术大学 一种水稻蛋白OsYAF9a在调控水稻株型中的用途
EP4232559A1 (en) * 2020-10-26 2023-08-30 Galy Co. Cell lines, varieties, and methods for in vitro cotton fiber production
CN114350675B (zh) * 2022-01-11 2024-01-26 黑龙江省农业科学院经济作物研究所 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用
CN115725549A (zh) * 2022-08-10 2023-03-03 中国海洋大学 几丁质酶突变体
WO2024083579A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5495070A (en) 1988-10-04 1996-02-27 Agracetus, Inc. Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US6329570B1 (en) 1989-07-19 2001-12-11 Calgene, Llc Cotton modification using ovary-tissue transcriptional factors
US5474925A (en) 1991-12-19 1995-12-12 Agracetus, Inc. Immobilized proteins in cotton fiber
US6211430B1 (en) 1995-06-06 2001-04-03 Monsanto Company FbLate promoter
US6096950A (en) 1992-05-18 2000-08-01 Monsanto Company Cotton fiber-specific promoters
US5530187A (en) 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5880110A (en) 1995-02-21 1999-03-09 Toyobo Co., Ltd. Production of cotton fibers with improved fiber characteristics by treatment with brassinosteroids
JPH1094392A (ja) 1996-09-20 1998-04-14 Nisshinbo Ind Inc ワタ遺伝子
US6259003B1 (en) 1997-01-21 2001-07-10 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Cotton plant promoters
US20020170088A1 (en) * 2000-11-03 2002-11-14 The Regents Of The University Of California Novel auxin binding proteins and uses thereof
US7098324B2 (en) * 2001-07-30 2006-08-29 Texas Tech University Chitinase encoding DNA molecules from cotton expressed preferentially in secondary walled cells during secondary wall deposition and a corresponding promoter
US20030106097A1 (en) * 2001-07-30 2003-06-05 Haigler Candace H. Chitinase encoding DNA molecule from cotton expressed preferentially in fibers during secondary cell wall deposition and the corresponding promoter

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