CN110760528B - 一种大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转录因子CsWRKY1及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明首次从植物大麻腺毛中分离了转录因子CsWRKY1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明经过功能性试验表明，转录因子CsWRKY1能够与THCA合成酶(THCAS)基因启动子相互作用，从而在大麻素类化合物的合成中发挥抑制作用，能够有效实现对大麻素类化合物合成的调控作用。

Description

一种大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1及其应用
技术领域
本发明属于植物基因技术领域，具体涉及一种大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1及其应用。
背景技术
大麻(Cannabis sativa)是大麻科大麻属一年生草本植物，雌雄异株，是人类最早种植的作物之一，又名汉麻、火麻、线麻、魁麻等，通常为雌雄异株，偶尔有雌雄同株。作为中国传统的经济作物，具有重要的经济价值，涉及纺织、建材、食品及制药等多个方面。例如大麻的花、叶和根，可以提取其中的药用成分用于制药，也可以用作土壤肥料，起到杀虫防病及增加土壤有机质的功效；韧皮纤维可制成高档衣服，秆芯纤维可以用作造纸和建筑材料；子粒可作为食品和饲料，榨出的油可以作生物柴油。随着大麻的价值被深入挖掘，受到越来越多学科的关注，更多的国家也加入到大麻的研发中。中国是全球最大的大麻生产国之一，种植面积已达全球50％。
大麻素(Cannabinoid)是大麻植物中特有的次生代谢产物，其主要成分是THC和CBD，二者互为同分异构体，其中THC具有致幻成瘾性，CBD则无致幻成瘾性。此外大麻植物包括至少120种大麻素，如大麻酚(CBN)，大麻环萜酚(CBC)，四氢大麻酚(THCV)以及大麻萜酚(CBG)等。大麻素用途广泛，医疗健康价值尤其突出。THC和CBD在抗肿瘤、神经系统保护、免疫调节和抗炎抗氧化等方面具有重要的药用价值。此外，研究还发现大麻素具有治疗多种疾病的潜力，包括对炎症、帕金森氏症、糖尿病，肥胖症、自闭症和皮肤病等。2015年：英国GW制药公司研制的Epidiolex(CBD含量高达98％)成为首个获FDA批准大麻药物，用于治疗儿童癫痫症。目前基于大麻素的药物例如Marinol、Syndros、Cesamet、Sativex等已被美国、英国、加拿大等国家批准用于治疗疾病。CBD不仅引发了药品研发，同时它也凭借在营养品、护肤品、普通饮料和功能性饮料等方面的适用性，吸引着多家跨界巨头探索新型合作模式。然而，国内大麻主要应用于纺织纤维领域，大麻素药用研究几乎一片空白。中国的工业大麻主要集中于种植与CBD提纯，且提纯的CBD主要用于出口。目前，我国关于包括CBD在内的大麻素等大麻活性成分合成及调控机制的研究相比于欧美发达国家还相差甚远。
转录因子(transcription factor)是广大生物研究者关注的热点之一。转录因子是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。转录因子可以形成一个动态调控网络，控制次级代谢产物生物合成所需的基因表达的时间、幅度和空间分布。近年来，虽然已经发现了一些调节大麻素类化合物合成的转录因子，但还是有很多重要的转录因子尚未发现，而且转录因子的筛选与鉴定难度较大，研究转录因子参与基因表达调控的生物学过程具有十分重要的意义。
发明内容
本发明首次从植物大麻腺毛中分离了转录因子CsWRKY1，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明经过功能性试验表明，转录因子CsWRKY1能够与THCA合成酶(THCAS)基因启动子相互作用，并抑制THCA合成酶(THCAS)基因的表达。
第一方面，本发明提供了一种大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1编码基因，所述转录因子CsWRKY1编码基因的多核苷酸序列如(a)、(b)、或(c)所示：
(a)、SEQ ID NO：1所示的多核苷酸；或
(b)、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的多核苷酸；或
(c)、与SEQ ID NO：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质具有CsWRKY1转录因子功能。
第二方面，本发明提供了所述转录因子CsWRKY1编码基因编码的氨基酸，序列如SEQ ID NO：2所示。
第三方面，本发明提供了一种含有权利要求1所述的转录因子CsWRKY1编码基因的重组表达载体。进一步地，所述重组表达载体是重组植物表达载体。
同时，本发明还提供了含有本发明所述的重组表达载体的宿主细胞。
第四方面，本发明提供了所述的转录因子CsWRKY1编码基因在调控植物中大麻类化合物合成中的应用。
进一步地，所述植物为大麻，优选为大麻品种：Cannabis sativa。
进一步地，所述转录因子CsWRKY1编码基因能够与顺式作用元件结合而启动植物大麻中的THCA合成酶(THCAS)基因的转录表达。
进一步地，所述转录因子CsWRKY1编码基因能够与顺式作用元件结合而负调控植物大麻中的THCA合成酶(THCAS)基因的转录表达。
本发明首先对实验材料-大麻进行种植，等到其成熟后对雌性大麻的腺毛进行分离，以及进行RNA的提取和实时荧光定量反转录pcr。在显微镜下观察分离的悬液，以确定腺毛与花的分离程度。
转录因子的鉴定和转录活性测定包括构建大麻植株雌花的酵母单杂交cDNA文库方法、共转化诱饵菌株方法、同源重组筛选出THCAS启动子的上游转录因子方法、双荧光素酶报告基因检测方法、体内瞬时表达验证方法、实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法及生物化学检测方法(如高效液相色谱UPLC)，等其他方法进一步鉴定控制大麻素类化合物合成的转录因子。
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
cDNA文库(cDNA library):是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的CDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。CDNA文库与基因组文库的最主要的区别是，基因组文库含有而CDNA文库不含非转录的基因组序列(重复序列等)。CDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，并用于表达。不论是由细胞总DNA建立的基因组文库，还是由mRNA逆转录而成的CDNA建立的CDNA文库，都是混合物，还要对文库进行筛选，直到获得目的基因。以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
验证实施例：荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。(2)将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。(3)加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
进一步地，本发明公开了一种通过体内瞬时表达验证的方法技术鉴定该转录因子CsWRKY1的的表达情况。
体内瞬时表达验证(Transient expression)：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。体内瞬时表达验证是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具有简单、快速、周期短、准确等优点。瞬时表达不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效率较稳定，转化率高。同时，瞬时表达不产生可遗传的子代，生物安全性高。进一步地，本发明公开了一种通过实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法检测该转录因子CsWRKY1的的表达情况。
实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法是对mRNA进行定量的方法。该方法可用于对内源性基因表达的mrna进行定量检测，并可用于基因表达的定量研究，该方法是目前最灵敏的mRNA定量分析方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
进一步，实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法的步骤是：(1)提取大麻腺毛中的总RNA；(2)通过“一步法”对特异性表达基因进行定量表达分析；(3)分析数据，得出结论。
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用
与现有技术相比，本发明提供的转录因子CsWRKY1编码基因与大麻中大麻素类化合物的合成具有很密切的关系，可用于调节大麻中大麻素的合成。
附图说明
图1实施例1中不同的植物器官对GUS报告基因的表达分析图，其中图a：6天大的幼苗的子叶；图c：成熟叶；图e：茎；图g：花；图b、d、f、h分别为毛状体在图a、图c、图e、和图g上的特写视图。a，c，e，g＝1000μm；b，d，f，h＝500μm。
图2实施例2中酵母杂交图，其中Pro53和ProTHCAS-P53分别为阳性对照及阴性对照。.
图3实施例3中Pro35S:WRKY1-EYFP以及Pro35S:EYFP的细胞定位图。
图4实施例4中CsWRKY1转录激活活性验证，其中4a为载体构建结构示意图，图b为基因表达量检测柱状图。
图5实施例5中CsWRKY1与植物中的THCAS启动子相互作用验证结果图，其中图5a为载体构建结构示意图，图5b为基因表达量检测柱状图。
图6实施例6中大麻植物7周龄雌花不同生长发育时期检测图。
图7实施例7中不同阶段发育中的花中THCAS，CsWRKY1表达量柱状图，以及不同阶段发育中的花中THCA，大麻二酸(CBDA)，大麻二酚(CBGA)的含量。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。其中，所使用的化学试剂除非有特别说明，其均为本领域的技术人员所理解常规使用试剂。
实施例1
用基因特异性引物对548bp的THCAS启动子进行克隆，利用Gateway技术构建双元载体pMDC163:ProTHCAS：GUS。接着利用农杆菌转化拟南芥，对10个独立的ProTHCAS：GUS转基因株系进行分析。用不同的植物器官对GUS报告基因的表达进行了组织化学分析，结果如图1所示，其中图a：6天大的幼苗的子叶；图c：成熟叶；图e：茎；图g：花；图b、d、f、h分别为毛状体在图a、图c、图e、图g上的特写视图。a，c，e，g＝1000μm；b，d，f，h＝500μm。从图中可以看出，GUS活性仅在多叶器官(图1a-h)和茎(图1e，f)的毛状体中观察到。在花朵中，仅在萼片的毛状体中检测到GUS活性(图1g，h)。
实施例2
利用酵母单杂交技术对靶向结合序列进行筛选，在酵母载体pAbAi中AUR1-C基因上游的MCS(KpnI(5')和XhoI(3'))中克隆了用于GUS表达测定的相同THCAS启动子片段。AUR1-C基因是一种抗真菌抗生素耐药性基因。构建的载体结构为ProTHCAS-AbA，通过BstBI酶进行消化切割，并根据说明书使用PEG介导的转化方法转化为Y1HGold酵母菌株。以pAbAi的URA3基因为选择标记，将其整合到Y1HGold酵母菌株的无功能的ura3位点中。在缺乏合成葡萄糖培养基上选择转化体，并在菌落PCR中进行验证。以Y1HGold-ProTHCAS-ABA为材料，利用大麻(Purple Kush)雌花的mRNA构建了Y1H cDNA文库。经过筛选，结果如图2显示，从图中可以看出CsWRKY1可以与THCAS启动子相互作用。
实施例3
为了确定CsWRKY1的亚细胞定位，将全长CsWRKY1编码区与全长增强型黄色荧光蛋白(EYFP)融合在一起。CsWRKY1-EYFP融合构建体以及EYFP都在35S启动子的控制下，在从拟南芥叶中分离的原生质体中瞬时表达。仅在细胞核中观察到了CsWRKY1-EYFP(图3)，这与其作为转录因子的作用是一致的。
实施例4
为了测试植物中CsWRKY1的转录激活活性，采用了双重荧光素酶测定法。将含有萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因(LUC)的报告质粒在带有GAL4结合位点的启动子(ProGAL4：LUC)的控制下与效应质粒共转化，Pro35S：GAL4结合域(GD，阴性对照)或GD与单纯疱疹病毒VP16激活域的融合(GD-VP16，阳性对照)或7个全长CsWRKY1(GD-CsWRKY1)从拟南芥叶中共转化为原生质体(图4a)。报告质粒ProGAL4：LUC与效应质粒GD-VP16的共转染引起强烈的LUC活性，而与仅含GD的效应子的共转染则导致LUC报告基因表达水平降低。ProGAL4：LUC与GD-CsWRKY1的共转染显示出比单独的GD更强的LUC活性(图4b)。这表明当被GD募集到启动子区域时，CsWRKY1可以抑制LUC报告基因的表达。
实施例5
为了确定CsWRKY1是否影响植物中的THCAS启动子，我们将原生质体与ProTHCAS：LUC报告质粒和Pro35S：GFP-CsWRKY1或Pro35S；GFP效应质粒和瞬时荧光素酶活性。相对于阴性对照，Pro35S：GFP，GFP-CsWRKY1的表达引起了ProTHCAS定向的荧光素酶活性的增加(图5)。这些结果表明，CsWRKY1与THCAS启动子片段结合并抑制THCAS启动子活性。
实施例6
在大麻营养生长过程中，在24±2℃光照下生长18h，然后转移到24±2℃光光周期中诱导开花。在大麻植株生长的不同阶段中，腺毛的种类和其中大麻素类化合物的含量也会有所不同。腺毛种类的观察和腺毛中大麻素类化合物含量的检测，对于研究调控大麻素类化合物的转录因子以及定向调节大麻素的合成具有重大的意义。因此，根据大麻腺毛数量，对大麻植株的不同生长阶段做出了区别，并用尼康SMZ18型立体显微镜对7周龄雌花进行了检测，检测结果如图6所示。其中，a、b、c、d、e、f分别为花萼发育的2mm花萼(阶段1)、3mm花萼(阶段2)、4mm花萼(阶段3)、5mm花萼(阶段4)、6mm花萼(阶段5)、7mm花萼(阶段6)条形，A-F＝1mm,花萼大小的增加说明了新出现的花蕾向完全成熟的花的发育。
通过定量RT-PCR测量在六个阶段的每个阶段中发育中的花中THCAS，CsWRKY1的表达(图7a、7b)。当毛状体发育时，THCAS转录在第一阶段的花中最高，并随着花的发育而逐渐降低。CsWRKY1转录在发育的早期阶段(1-2期)最低，而在发育的中期至晚期(3-6期)最高。用乙腈提取6个阶段花的主要大麻素含量，并用超高效液相色谱(UPLC)分析。随着雌花的成熟，检测到THCA和大麻二酸(CBDA)的增加(图7c、7d)，而在此过程中大麻二酚(CBGA)的含量降低(图7e)。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门梓蔓生物科技有限公司
<120> 一种大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1及其应用
<130> 2019
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1689
<212> DNA
<213> 大麻（Cannabis sativa）
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<213> 大麻（Cannabis sativa）
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Ala Cys Leu Thr Ile Pro Pro Gly Leu Ser Pro Ser Ser Phe Leu Glu
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Asn Ser Ser Ser Gly Val Gln Thr Ala Gln Phe Asp His Lys Gly Asn
195 200 205
Gly Pro Ser Val Ile Ser Ser Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr
210 215 220
Gly Gln Lys His Val Lys Gly Ser Glu Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Thr His Pro Asn Cys Glu Val Lys Lys Leu Phe Glu Arg Ala His
245 250 255
Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Val Tyr Lys Gly Thr His Asp His Pro
260 265 270
Lys Pro Gln Pro Ser Arg Arg Tyr Asn Thr Gly Ser Ile Met Ser Asn
275 280 285
Gln Glu Glu Arg Ser Asp Lys Phe Ser Ser Ile Ile Gly Arg Asp Asp
290 295 300
Lys Ser Ser Ile Tyr Gly Gln Gly Ser Asn Thr Asn Glu Pro Asn Gly
305 310 315 320
Thr Pro Asp Gln Ser Pro Ile Ala Thr Ile Asp Asp Ile Val Glu Ala
325 330 335
Thr Gly Asn Arg Ile Ser Asp Asp Ala Asp Asp Asp Asp Pro Phe Ser
340 345 350
Lys Arg Arg Lys Met Glu Ile Gly Cys Ile Asp Val Thr Pro Val Val
355 360 365
Lys Pro Ile Arg Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr Leu Ser Glu Val
370 375 380
Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val
385 390 395 400
Val Arg Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Ala
405 410 415
Gly Cys Pro Val Arg Lys His Val Glu Arg Ala Ser His Asp Pro Lys
420 425 430
Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Ala
435 440 445
Ala Arg Asn Ser Ser His Glu Leu Val Gly Ser Met Ala Ala Ser Ile
450 455 460
Pro Ala Arg Ile Arg Pro Glu Glu Thr Asp Thr Ile Ser Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gly Val Gly Ile Ser Ser Ala Thr Asp Asn Arg Ser Asn Glu Gln His
485 490 495
Pro Thr Ala Gln Ser Glu Gln Met Glu Ser Arg Ser His Asn Ser Asn
500 505 510
Val Asn Val Ala Gln Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gly Ile Leu Gly Asn
515 520 525
Gly Leu Asn Gln Phe Gly Ser Arg Glu Asn Ile Glu Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Asn His Ser Ser Tyr Pro Tyr Pro Gln Asn Met Gly Arg Ile Leu Thr
545 550 555 560
Gly Pro

Claims (1)

1.大麻腺毛中分离的转录因子CsWRKY1编码基因在调控大麻THCA合成中的应用，其特征在于，所述转录因子CsWRKY1能够与编码THCA合成酶基因的启动子结合负调控大麻中的THCA合成酶基因的转录表达，其中，所述转录因子CsWRKY1编码基因的多核苷酸序列如（a）或（b）所示：
（a）、SEQ ID NO：1所示的多核苷酸；或
（b）、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的多核苷酸。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1761751A (zh) * 2003-01-23 2006-04-19 得克萨斯科技大学 在次生壁沉积期间优先在次生有壁细胞中表达的来自棉花的编码几丁质酶的dna分子和相应的启动子
WO2019147873A2 (en) * 2018-01-24 2019-08-01 Trait Biosciences, Inc. Systems and methods for enhancing trichome formation and density in cannabis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1761751A (zh) * 2003-01-23 2006-04-19 得克萨斯科技大学 在次生壁沉积期间优先在次生有壁细胞中表达的来自棉花的编码几丁质酶的dna分子和相应的启动子
WO2019147873A2 (en) * 2018-01-24 2019-08-01 Trait Biosciences, Inc. Systems and methods for enhancing trichome formation and density in cannabis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PREDICTED: Cannabis sativa probable WRKY transcription factor 20 (LOC115724926), transcript variant X1, mRNA;无;《NCBI Reference Sequence: XM_030654298.1》;20190828;参见序列及相关信息 *
Tetrahydrocannabinolic Acid Synthase, the Enzyme Controlling Marijuana Psychoactivity, is Secreted into the Storage Cavity of the Glandular Trichomes;Supaart Sirikantaramas等;《Plant Cell Physiol.》;20050715;第46卷(第9期);第1578–1582页 *
大麻ＴＨＣＡ合成酶基因的克隆及生物信息学分析;姜颖等;《山西农业大学学报（自然科学版）》;20170530;第37卷(第5期);第326-329页 *

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