CN110117322A

CN110117322A - 从紫斑白三叶分离的myb类转录因子及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110117322A
Application number: CN201910503370.XA
Authority: CN
Inventors: 周美亮; 张凯旋; 何铭; 李金博; 丁梦琪; 张春华; 李发良; 谈天斌
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2019-08-13

Abstract

本发明公开了从紫斑白三叶分离的MYB类转录因子及其编码基因和应用。本发明以V型紫斑白三叶为材料通过RNA‑Seq技术筛选出与类黄酮合成相关的转录因子TrMYB308，在此基础上克隆出TrMYB308基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。TrMYB308基因受JA的诱导且在紫斑白三叶各个组织中均有表达。苦荞毛状根中异源表达TrMYB308基因结果发现，转基因根系中的类黄酮代谢途径部分关键酶基因的表达量明显增加，转基因根系总黄酮的含量明显高于对照组，说明TrMYB308基因参与植物体内类黄酮次生代谢生物合成调控。本发明为苦荞类黄酮合成分子机制探索及荞麦品质改良等提供了理论依据和应用基础。

Description

从紫斑白三叶分离的MYB类转录因子及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及转录因子，尤其涉及从紫斑白三叶中分离的与植物类黄酮生物合成相关的MYB类转录因子及其编码基因，本发明进一步涉及它们在调控植物黄酮生物合成方面中的应用，属于MYB类转录因子及其应用领域。

背景技术

茉莉酸类物质(JAs)是一类新型的植物激素，在植物体内普遍存在，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)是JAs的一种活性分子形式。JAs具有多种功能，一方面可以调控特定的初级代谢途径为次级代谢提供必要的底物；另一方面可以调控次生代谢过程，合成次生代谢产物以应对生物和非生物胁迫，如机械损伤昆虫防御抵抗病原菌。已有研究表明，茉莉酸类物质(JAs)通过激活或抑制相应的转录因子活性，进而调控植物次生代谢相关的关键酶基因表达，影响次生代谢产物的合成和积累。

荞麦是一种蓼科(Polygonaceae family)荞麦属(Fagopyrum Mill)药食饲兼用的作物，在全世界范围内均有种植，其营养丰富尤其富含芦丁等生物活性成分，因其具有抗氧化、抗肿瘤等功效，从而被广泛应用食品、医疗和保健等行业，相应的，对荞麦黄酮次生代谢生物合成调控机理的探索具有十分重要理论意义。

MYB类转录因子广泛参与调控植物的生长发育过程，对次生代谢等具有重要调控作用。MYB转录因子基因在植物基因组数量庞大，是植物中最大的转录因子家族之一。目前研究发现，尽管已有很多MYB基因的功能已被证明，如参与次生代谢调控、环境与激素胁迫的应答、器官发育等，但是这些研究进展主要集中在模式植物拟南芥中。植物基因功能一般在拟南芥中研究较为广泛，但是由于其农艺性状差，因此在拟南芥中的研究结果应用价值十分有限。

类黄酮类化合物广泛分布于蓼科和豆科等植物中，具有非常重要的医疗和保健价值。类黄酮是十分重要的植物次级代谢产物，主要包括黄酮醇、花青素和原花色素；该类化合物具有多种生物学功能，不仅广泛参与调控植物生长发育、环境胁迫和次生代谢等，而且发现其是药用植物的主要活性成分之一，具有重要的药理功能并对维持人体健康具有十分重要的作用，如抗癌、抗衰老、软化血管、改善视力等。因此，类黄酮类化合物一直备受关注，被认为是一类极富食品、医疗和保健价值的天然产物，具有广阔的开发与应用前景。

白三叶、苜蓿和大豆等豆科植物是类黄酮物质的重要来源，因此挖掘和研究白三叶中调控类黄酮生物合成的MYB转录因子基因、明确其功能，可以为分子育种提高荞麦类黄酮的含量提供重要的基因资源和理论参考。

发明内容

本发明目的之一是提供从紫斑白三叶分离的与类黄酮合成相关的MYB类转录因子及其编码基因。

本发明目的之二是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于调控植物合成类黄酮或调控紫斑白三叶植株中叶片紫斑的形成或花的形态建成等方面。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

为实现上述目的，本发明一方面从紫斑白三叶分离得到了MYB类转录因子TrMYB308，其氨基酸为(a)或(b)所示:

(a)、SEQ ID No.1所示的氨基酸；或

(b)、将SEQ ID No.1所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有MYB类转录因子功能或活性的蛋白变体。

本发明进一步提供了MYB类转录因子的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有MYB类转录因子功能；或

(d)、与SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列至少有90％或以上同源性的多核苷酸序列；或

(e)、在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有MYB类转录因子功能的功能或活性。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明所述的转录因子TrMYB308包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多核苷酸变体或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明还提供了含有所述转录因子TrMYB308的编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述TrMYB308基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.2所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

发明还涉及将所述的TrMYB308基因引入到植物中以调控类黄酮合成代谢中的应用，其中，所述的调控植物类黄酮合成代谢包括促进类黄酮的生物合成；作为参考，所述的应用包括：(1)构建含有所述TrMYB308基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将TrMYB308基因在植物组织或细胞中进行过表达。

本发明进一步提供了一种促进植物体内类黄酮生物合成的方法，包括：(1)构建含有所述TrMYB308基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将所述TrMYB308基因在植物组织或细胞中进行过表达。

其中，所述的植物优先为荞麦、大豆、白三叶或苜蓿等。

本发明更进一步提供了一种应用所述的编码基因在调控紫斑白三叶植株中叶片紫斑的形成或花的形态建成中的应用，包括：(1)构建含有所述TrMYB308基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到紫斑白三叶组织或细胞中；(3)将所述TrMYB308基因在紫斑白三叶植物组织或细胞中进行过表达。

所述的“引入”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明TrMYB308基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的TrMYB308基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的转录因子的编码基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.PlantCell Reports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括荞麦、大豆、白三叶或苜蓿等。

本发明对前期选育的高类黄酮材料V型紫斑白三叶中克隆到的TrMYB308基因在类黄酮生物合成的调控作用进行了初步研究。本发明以V型紫斑白三叶为材料通过RNA-Seq技术，筛选出与类黄酮合成相关的转录因子TrMYB308。在此基础上从V型紫斑白三叶中克隆出TrMYB308基因，该基因的CDS全长为921bp，编码306个氨基酸。TrMYB308蛋白亚细胞定位于细胞核，且与红三叶TaMYB308、苜蓿MtMYB308和鹰嘴豆CarMYB308的亲缘关系较近，属于典型的R2R3-MYB转录因子。TrMYB308基因受JA的诱导，且在紫斑白三叶各个组织中均有表达。苦荞毛状根中异源表达TrMYB308结果发现，转基因根系中的类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如FtF3H和FtFLS)的表达量明显增加，转基因根系总黄酮的含量明显高于对照组，参与类黄酮次生代谢生物合成调控。本发明为苦荞类黄酮合成分子机制探索及荞麦品质改良提供了理论依据。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“转录因子”是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1 TrMYB308与其它R2R3-MYB类同源蛋白序列多重比对结果；AtMYB4:Arabidopsis thaliana NP_195574.1；AtMYB7:Arabidopsis thaliana NP_179263.1；CarMYB308:Cicer arietinum XP_004505789.1；MdMYB308:OsMYB047：Oryza sativaAFZ78649.1；OsMYB4：Oryza sativa NP_195574.1；PpMYB7:Prunus persica KT159231.1；PtoMYB7:Populus tomentosa；TaMYB7:Trifolium pretense；TrMYB308:Trifolium repensL。

图2 TrMYB308和其他植物R2R3-MYB蛋白的系统进化树；AtMYB4:Arabidopsisthaliana NP_195574.1；AtMYB7:Arabidopsis thaliana NP_179263.1；CarMYB308:Cicerarietinum XP_004505789.1；MdMYB308:OsMYB047:Oryza sativa AFZ78649.1；OsMYB4:Oryza sativa NP_195574.1；PpMYB7:Prunus persica KT159231.1；PtoMYB7:Populustomentosa；TaMYB7:Trifolium pretense；TrMYB308:Trifolium repens L。

图3 TrMYB308的亚细胞定位和酵母转录转录激活结果；A.TrMYB308的亚细胞定位；空载35S-GFP和35S-TrMYB308-GFP在拟南芥原生质体中表达；B.酵母转录转录激活结果。

图4 TrMYB308基因的表达特性；A.V型紫斑白三叶不同组织中TrMYB308的相对表达量；B.普通白三叶中TrMYB308受MeJA诱导的表达谱；C.V型紫斑白三叶中TrMYB308受MeJA诱导的表达谱。

图5毛状根的诱导及鉴定和转基因根系的鉴定；A.苦荞毛状根的诱导过程；B.A4毛状根的分子鉴定；C.转基因毛状根的分子鉴定。

图6过表达TrMYB308毛状根的生长指数测定和总黄酮含量测定；A.A4、A4-1302和A4-1302-TrMYB308根系的生长指数的测定；B.相应根系的总黄酮含量检测；*表示与对照相比在P<0.05水平差异显著。

图7基因毛状根的类黄酮代谢途径酶基因的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 TrMYB308基因的分离、鉴定、分析以及遗传转化

1试验材料和试验方法

1.1试验材料

白三叶、V型紫斑白三叶和川荞1号(苦荞)；大肠杆菌菌株DH5α、酵母pJ94A、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)A4；植物原生质体表达载体pAN580、酵母转录激活载体pAS2-1、入门载体pPOTO-Blunt、过表达载体pCAMBIA-1302，上述材料均由本发明人实验室保存提供。限制性内切酶、T₄连接酶、胶回收试剂盒以及cDNA合成试剂盒，购自ThermoFisher Scientific公司。PCR扩增的酶和试剂、实时荧光定量PCR的试剂、质粒提取，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。DNA标准分子量购自北京博迈德生物技术有限公司。Trizol和RNA提取试剂盒购自北京天根科技公司。原生质体转化所用纤维素酶和离析酶均购自美国Sigma公司。PCR引物合成及DNA测序由北京博迈德生物技术有限公司完成。白三叶和V型紫斑白三叶材料种植于中国农业科学院实验田及组培室。培养条件：温度为18℃，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度40％-60％。

1.2试验方法

1.2.1 TrMYB308基因的克隆

V型紫斑白三叶总RNA提取：选取4周龄幼苗叶片，利用Trizol法抽提V型紫斑白三叶总RNA。用RNase free DNase(天根生化科技公司)消除残存的DNA，然后用Revert AidFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)进行反转录获得V型紫斑白三叶的cDNA。反转录反应体系为：DNase消化的RNA(500ng/μL)11μL，Oligo(dT)18 primer 1μL，5×Reaction Buffer 4μL，Revert Aid M-MuLV RT(200U/μL)1μL，RiboLock RNase Inhibitor 1μL，再用RNase-free水补至20μL。反应体系混匀后，65℃退火5min后冰浴2min，然后再42℃孵育1h，最后70℃反应5min终止反应，反转录产物稀释5～10倍，－20℃保存备用。

TrMYB308基因克隆：

通过普通白三叶与紫斑白三叶叶片的RNA转录组测序技术，分析并筛选获得该基因CDS序列。结合生物信息学分析，由NCBI blast序列比对可知，目的基因编码的蛋白与蒺藜苜蓿中的MYB-related 308蛋白同源性性最高84％；鹰嘴豆的MYB-related 308蛋白同源性为78％。

根据TrMYB308基因的ORF设计特异PCR扩增引物：

F：5’-ATGGGAAGATCACCTTG-3’

R：5’-TCATTTCATTTCTAAGCC-3’。

再以V型紫斑白三叶cDNA为模板，TrMYB308-F和TrMYB308-R为引物进行PCR扩增获得基因的CDS序列。PCR反应体系为：cDNA模板2μL(250ng/μL)，2×phanta Mix Master Mix25μL，上下游引物各加2μL(10pmol/μL)，加ddH₂O补至50μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，34个循环，72℃延伸8min。

1.2.2目的基因序列分析

用NCBI blast分析目的序列，使用CLUSTALW对TrMYB308的同源蛋白序列进行比对，并用MEGA7软件绘制邻近树(neighbor-joining tree)，树的每个节点的bootstrap值为1000。

1.2.3实时定量荧光PCR分析

组织表达样品：取种植与中国农业科学院实验基地的V型紫斑白三叶的根、茎、叶、花和叶柄经液氮速冻并储存于-80℃保存。然后提取样品总RNA(见1.2.1)，接着反转录成cDNA，-20℃保存备用。

MeJA诱导表达样品：白三叶和紫斑白三叶材料在组培室光照培养三周，培养过程中需避免染菌和其他的胁迫。待其长出真叶后用50μM MeJA室温120rpm/min，分别震荡处理0、1、4、8和12h时后取样。处理其他条件和培养均保持一致，对照组添加同体积的二甲基亚砜(DMSO)。取样之后用滤纸快速吸干后置液氮速冻，保存于–80℃冰箱备用。

转基因毛状根样品：将农杆菌A4介导的转基因毛状根，待其长至28d时取样(此时毛状根的生长状态最好)，取样之后用滤纸快速吸干后液氮速冻，保存于–80℃冰箱备用。

实时荧光定量PCR：分别以白三叶组成型表达的TrActin基因和荞麦组成型表达的FtH3基因为内参；设计基因特异引物，以制备好的cDNA为模板，qPCR反应体系：ChamQ^TM qPCR Master Mix 10.0μL，PCR Forward Primer(10mol/L)0.4μL，PCR ReversePrimer(10mol/L)0.4μL，cDNA模板1.0μL，补水至20μL。qRT-PCR程序：95℃2min，95℃15s，60℃30s，72℃20s，40个循环。每个样品重复测定3次，在BAI 7500Real-time PCR仪上进行qRT-PCR检测。本实验中用RQ(相对表达量)＝2-^ΔΔCT的算法，计算目标基因的相对表达量；设置诱导表达0h 2-^ΔΔCT值为1，计算出1、4、8和12h的表达倍数。实时荧光定量PCR的引物详见表1。

表1引物序列

1.2.4亚细胞定位分析

根据TrMYB308基因的ORF设计亚细胞定位的特异性引物：

PAN580-F:

5’-TCCGGAGCTAGCTCTAGAA TGGGAAGATCACCTTGTTGT-3’

pAN580-R:

5’-CTTGCTCACCATGGATCCTTTCATTTCTAAGCCTTTGTA-3’。

以TrMYB308-T载体为模板，pAN580-F/R为引物进行PCR扩增，获得含酶切位TrMYB308基因的PCR产物。接着对骨架载体进行酶切后纯化回收。将目的基因采用同源重组的方法构建至pAN580表达载体上，从而获得融合蛋白重组质粒pAN580-MYB308-GFP。重组质粒pAN580-MYB308-GFP测序正确后，通过PEG介导法分别将重组质粒与对照(pAN580-GFP)质粒转入拟南芥原生质体中。

1.2.5转录激活特性分析

根据TrMYB308的ORF设计酵母转录激活的特异性引物：

pAS2-1-F:

5’-GGAGGCCCCGGGGATCCATGGGAAGATCACCTTGT-3’

pAS2-1-R:

5’-TTCATAGATCTCTCGAGTCATTTCATTTCTAAGCCTTT-3’。

采用同源重组的方法，将目的基因序列构建到pAS2-1载体上。制备pJ94A酵母感受态细胞，并将构建好的质粒载体转化酵母感受态细胞，转化成功后涂布在SD/－Trp缺陷固体培养基上，28℃倒置培养2～3d。挑取单克隆后经PCR阳性鉴定后，将酵母菌落接种于SD/－Trp液体缺陷培养基中，28℃振荡过夜培养，将所得菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1，分别点样在SD/－Trp和SD/－Trp/－His缺陷固体培养基上，28℃倒置培养2～3d。阳性对照为pAS2-1-Active，阴性对照为空载pAS2-1。

1.2.6农杆菌介导的苦荞毛状根转化系统的构建及遗传转化

过表达载体的构建，根据TrMYB308的ORF序列设计含NcoI和BamHI酶切位点的上下游引物，PCR扩增TrMYB308的全长序列。

上游引物OE-MYB7-F:5’-CCATGGGAAGATCACCTTGTT-3’

下游引物OE-MYB7-R:5’-GGATCCTCATTTCATTTCTAAGCC-3’。

随后经酶切、回收、和连接转化后，将TrMYB308全长序列正向插入pCAMBIA-1302载体的CaMV35S启动子后，构建成过表达载体pBA1302-TrMYB308。

农杆菌介导的苦荞毛状根转化，挑选成熟饱满的苦荞种子(川荞1号)用10％次氯酸钠溶液消毒7-10min，接着用75％酒精灭菌5-8min，然后再用无菌水清洗3-5次；4℃春化3-4天后选取萌发状态一致的种子种植在无激素MS培养基上，将其置于组培室25℃(光周期为16h/8h)培养，待其萌发生长2周龄后用于农杆菌侵染。用热激法将过表达载体质粒pCAMBIA1302-TrMYB308以及空载体质粒分别转化发根农杆菌A4。接着挑取阳性单克隆至YEB液体培养基中(含有Kan 50mg/L)28℃振荡培养48h，2500rpm/min离心8min后集菌，并用液体MS溶液重悬菌体至终浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8。在超净台剪下培2周龄的苦荞幼苗的下胚轴或叶片，并用尖镊子扎破创造尽可能多的伤口,然后将外植体浸入提前制备好的侵染液中边摇晃边侵染约8-15min。

将处理后的苦荞下胚轴放在无激素的MS培养基上，放置在组培室中黑暗条件下25℃共培养3-7天。挑选长势良好的毛状，剪取根系约3min转至含200mg/L Cef(头孢)的MS液体培养基中，置于转速为120rpm/min的摇床上28℃暗培养。培养28天后取样并进行后续实验，设置三组重复。

1.2.7转基因毛状根总黄酮含量分析

采用三氯化铝法(Z.Hui-Fen,F.Karen,K.Abha,R.G.Kranz,％J MolecularPlant,CPC,a single-repeat R3 MYB,is a negative regulator of anthocyaninbiosynthesis in Arabidopsis,2(4)(2009)790-802；L.Shutian,Z.J.P.J.Sabine,TCP3interacts with R2R3-MYB proteins,promotes flavonoid biosynthesis andnegatively regulates the auxin response in Arabidopsis thaliana,76(6)(2013)901-913.)测定转基因苦荞毛状根的总黄酮含量。用已确定的超声提取率，超声30min。总黄酮标准曲线的绘制：称取芦丁标准品3.6mg，于容量瓶中加入80％甲醇20mL定容即得芦丁标准溶液。分别吸取芦丁标准溶液4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031mL置于10mL容量瓶中，加入0.1mol/L的三氯化铝溶液2mL、1mol/L的乙酸钾溶液3mL，用80％甲醇溶液定容，摇匀后室温下放置30min，同时以80％甲醇溶液作为空白对照，在波长为420nm处测定吸光度。以吸光度值A为纵坐标，芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。

2试验结果

2.1 TrMYB308基因的克隆

以V型紫斑白三叶的cDNA为模板，使用设计的特异扩增引物TrMYB308-F和TrMYB308-R进行PCR扩增，得到包含部分5'-UTR和部分3'-UTR在内的TrMYB308全长CDS(coding sequence)序列(结果未显示)，与RNA-Seq筛选所获得的片段大小(897bp)基本一致。生物信息学分析发现，该基因的ORF(Open Reading Frame)长度为921bp(SEQ IDNo.2)，编码蛋白分子量为3.39kDa的306个氨基酸(SEQ ID No.1)，且所编码蛋白的等电点(pI)为8.49。在NCBI数据库中用Blast比对发现，该蛋白与红三叶MYB-related protein308-like protein同源性最高(91.0％)，将其命名为TrMYB308。用SMART软件分析可知，TrMYB308包含2个保守的DNA结合结构域是典型的R2R3MYB转录因子，C端的氨基酸变化较大(图1)。将TrMYB308与其他物种中同源的R2R3转录因子蛋白序列进行比对，例如红三叶、蒺藜采用MEGA7软件对这些蛋白构建进化树(邻接法)，进行分子发育分析发现，TrMYB308与红三叶、蒺藜苜蓿和鹰嘴豆等双子叶植物亲缘关系较近，但是相关基因功能报道很少；而该蛋白与水稻等单子叶植物亲缘关系较远(图2)。

2.2 TrMYB308的亚细胞定位及转录激活验证

转录因子功能的发挥与其在细胞中的定位密切相关，为探究TrMYB308的具体定位情况，构建pAN580-TrMYB308-GFP重组质粒，通过PEG介导法转入拟南芥原生质体。25℃培养16-20h后，用激光共聚焦显微镜观察细胞中发出GFP绿色荧光的位置。结果发现，转35S-GFP的荧光信号分布于整个细胞内，而pAN580-TrMYB308-GFP融合蛋白的信号都集中在细胞核内(图3A)。结果表明，TrMYB308属于典型的转录因子并在细胞核中发挥转录调控功能。

构建具有GAL4 DNA结合结构域的pAS2-1-TrMYB308酵母表达重组质粒，分别将pAS2-1-TrMYB308、pAS2-1(阴性对照)、pAS2-1-Active(阳性对照)转入酵母pJ94A中。结果显示，三者在酵母单缺培养基SD(-Trp)中均能正常生长。转入pAS2-1-Active可在二缺培养基SD(-Trp，His)上正常生长，阴性对照和pAS2-1-TrMYB308均无法在二缺培养基上生长(图3B)，说明TrMYB308蛋白无转录自激活活性，该转录因子可能需要与其他转录调控蛋白互作才能发挥其转录调控功能。

2.3 TrMYB308基因的表达特性

2.3.1 TrMYB308的组织表达特性

qRT-PCR分析结果发现，TrMYB308在V型紫斑白三叶的各个组织中均有表达，其中在叶片的表达量最高比根的表达量高7倍(图4A)；在叶柄和花中的表达量也较高，在根和茎中的表达量则相对较低，上述结果表明，TrMYB308参与类黄酮的合成调控并对叶片的紫斑形成起重要调控作用。

1.2.3.2 TrMYB308受MeJA诱导的表达情况

用茉莉酸甲酯(MeJA)处理普通白三叶和紫斑白三叶幼苗，并在不同时间段提取幼苗的总RNA，用Real-time PCR监测TrMYB308的转录水平。结果如图4所示，目的基因的表达量随着MeJA处理时间的增加而逐渐增高，在8h达到峰值，此后又逐渐降低。在处理1h时，2种材料中的TrMYB308的表达量均开始上调，普通白三叶在处理4h、8h和12h时其表达量无显著变化。而紫斑白三叶组，目的基因的表达量呈现显著的先增加后下降的趋势。此外，V型紫斑组比普通组受MeJA诱导的程度更大(图4B；图4C)。

研究证明目的基因参与了植物对JA信号的应答反应，且V型紫斑白三叶对JA信号胁迫诱导更敏感。研究发现，茉莉酸(JA)是一种重要的植物激素并具有多种生物功能，其中JA是次生代谢产物合成中有效诱导子，例如类黄酮、生物碱、萜类等，上述结果表明TrMYB308基因可能参与调控类黄酮类物质的合成调控。

2.4毛状根的诱导及转基因根系的鉴定

构建pCAMBIA1302-TrMYB308过表达载体，然后用A4农杆菌介导的方法将过表达质粒和对照均转入苦荞毛状根中(图5A)。接着，对A4毛状根和转基因根系进行分子鉴定，对各根系所提的DNA与阳性对照质粒进行PCR分析发现，A4农杆杆菌的毒性区和转移区相关的RolAB、Ags、VirC和VirD基因的片段大小于阳性对照完全一致，表明所诱导的毛状根为阳性；其次，转pCAI1302-TrMYB308根系的扩增片段与阳性对照组(TrMYB308质粒)大小完全一样(A1、A1、A3)(图5B)；上述结果表明，本发明成功地诱导了苦荞毛状根且筛选获得了转基因阳性根系A1、A2和A3(图5)。

2.5在苦荞毛状根中过表达TrMYB308对总黄酮积累的影响

2.5.1转基因毛状根系的生长指数和总黄酮含量检测

结果如图6A所示，分别在3天、7天、14天、21天、28天和35天检测毛状根的鲜重，统计其生长指数。结果发现，A4、A4-1302和A4-1302-TrMYB308均在前7天生长速度较为缓慢；7-28天的范围内生长最快；28-35范围内其生长速度又开始下降。其次，A4、A4-1302和A4-1302-TrMYB308三个根系中，A4根系生长状态最好，A4-1302根系生长状态次之；

最后，A4-1302-TrMYB308根系生长最为缓慢(图6A)。对TrMYB308基因毛状根和对照(A4、A4-1302)进行总黄酮含量的测定。每个株系测定3个植株，株重复测3次。方差分析结果表明处理间差异显著。结果分析表明A4-1302-TrMYB308株系与对照组总黄酮含量差异显著(图6)；说明转基因植株的总黄酮含量均有显著提高，进一步证明目的基因TrMYB308参与调控苦荞毛状根中类黄酮的生物合成。

2.5.2转基因毛状根类黄酮合成途径关键酶基因的表达量分析

提取转基因毛状根阳性根系的总RNA，反转录合成第1链cDNA，分别对类黄酮代谢途径关键酶基因(FtPAL、FtF3H、FtFLS、FtFLS1)的表达量进行qRT-PCR检测分析(方法见1.2.3)。结果如图7所示，TrMYB308基因的导入明显提高了转基因苦荞毛状根中类黄酮生物合成途径FtF3H(对照组的2.5倍)和FtFLS(对照组的1.5倍)酶基因的表达量。相反，FtPAL的表达量有一定程度的下调；FtFLS的表达量没有明显的变化。说明目的基因TrMYB308的导入提高了毛状根中类黄酮代谢途径酶基因的表达量，进而促进类黄酮化合物的生物合成。

SEQUENCE LISTING

<110> 从紫斑白三叶分离的MYB类转录因子及其编码基因和应用

<120> 中国农业科学院作物科学研究所

<130> BJ-2011-190402A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 306

<212> PRT

<213> Trifolium repens L

<400> 1

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Leu Ile Ser Tyr Ile Arg Ala His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Glu Glu Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Arg Arg Lys Leu Leu Asn Arg Gly Ile Asp Pro Ala Thr His Arg Pro

115 120 125

Leu Asn Glu Pro Pro His Ser Ser His Ser Gln Ser Gln Ser Gln Ser

130 135 140

Leu His Leu Gln Asn His Asn His Asn Gln Asn Gln Asn Gln Glu Val

145 150 155 160

Val Thr Ile Ala Val Ala Ala Ser Ala Thr Thr Thr Thr Thr Ile Pro

165 170 175

Ala Val Thr Val Pro Thr Thr Thr Ile Ser Phe Ala Ser Ser Val Lys

180 185 190

Gln Glu Gln Tyr His His His His His His His Gln Tyr Asn His His

195 200 205

His His His Gln Glu Ile Asn Thr Ser Met Ile Lys Gly Ser Ser Val

210 215 220

Leu Glu Arg Cys Pro Asp Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Ser Pro Pro

225 230 235 240

Arg Gln Gln Glu Ser Asp Glu Gln Phe Lys Asn Arg Asn Leu Cys Phe

245 250 255

Val Cys Ser Leu Gly Leu Gln Asn Ser Lys Asp Cys Ser Cys Asp Glu

260 265 270

Ile Val Gly Asn Ser Ser Thr Gly Asn Ala Ser Thr Ala Pro Ala Tyr

275 280 285

Asp Phe Leu Gly Leu Lys Ala Gly Val Trp Asp Tyr Lys Gly Leu Glu

290 295 300

Met Lys

305

<210> 2

<211> 921

<212> DNA

<213> Trifolium repens L

<400> 2

atgggaagat caccttgttg tgaaaaagct catacaaaca aaggagcatg gactaaagaa 60

gaagatgata gactcatatc ttatattaga gctcatggtg aaggttgttg gagatctctt 120

cctaaagctg ctggtttact acgttgcggt aaaagttgtc gtctccgttg gattaattat 180

ctccgaccag accttaaacg tggtaacttt actgaagaag aagatgaact catcatcaaa 240

cttcatagtc ttcttggtaa caaatggtct ttgattgctg gaagattacc tggtagaact 300

gataatgaga ttaagaatta ttggaatact catattagaa gaaagcttct taacagagga 360

attgaccctg caactcatag acctctaaat gaacctcctc attcttctca ttctcaatct 420

caatctcaat cacttcatct tcagaatcat aatcataatc agaatcagaa tcaagaagtt 480

gttactatag ctgtagcagc atctgcaaca actactacta ctattcctgc agtaacagta 540

ccaacaacaa ctatatcatt tgcttcatct gttaaacaag aacaatatca tcatcatcat 600

catcatcatc aatataatca tcatcatcat catcaagaga ttaacacaag tatgattaaa 660

gggtcatcag tgttagaaag atgtcctgat ttgaatcttg agttaacaat tagtccacca 720

agacaacaag aatcagatga acaattcaaa aacagaaacc tctgttttgt ttgtagtttg 780

ggtttacaaa atagtaaaga ttgtagctgt gatgaaattg ttggaaattc tagcactgga 840

aatgcttcta ctgctcctgc ttatgatttc ttaggtttga aagctggtgt ttgggattac 900

aaaggcttag aaatgaaatg a 921

Claims

1.从紫斑白三叶中分离的MYB类转录因子，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示:

(a)、SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(b)、将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有MYB类转录因子功能或活性的蛋白变体。

2.权利要求1所述的MYB类转录因子的编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQ ID No.1所示氨基酸的多核苷酸；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有MYB类转录因子功能；或

(d)、与SEQ ID No.2所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(e)、在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有MYB类转录因子功能的功能或活性。

3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体。

4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是重组植物表达载体。

5.权利要求1所述的转录因子或权利要求2所述的编码基因在调控植物类黄酮合成代谢中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调控植物类黄酮合成代谢包括促进类黄酮的生物合成。

7.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求2所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将权利要求2所述编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

8.权利要求1所述的转录因子或权利要求2所述的编码基因在调控紫斑白三叶植株中叶片紫斑的形成或花的形态建成中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：，包括：(1)构建含有权利要求2所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到紫斑白三叶组织或细胞中；(3)将权利要求2所述编码基因在紫斑白三叶植物组织或细胞中进行过表达。

10.一种促进植物类黄酮生物合成的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求2所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将权利要求2所述编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。