ES2613396T3

ES2613396T3 - Quitooligosacáridos y métodos para uso en el aumento del crecimiento de soja

Info

Publication number: ES2613396T3
Application number: ES12769291.1T
Authority: ES
Inventors: R. Stewart Smith; Ahsan Habib
Original assignee: Novozymes BioAg AS; Novozymes Biologicals Inc
Current assignee: Novonesis Plant Biosolutions AS; Novozymes Biologicals Inc
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2032-09-24
Also published as: RU2014116239A; CN105746517A; WO2013044212A1; AR088012A1; CN104066328A; US20150099629A1; US20130090236A1; AU2012312007A1; EP2747567B1; AU2012312007B2; CA2849899A1; US8946119B2; BR112014006914A2; CN104066328B; EP2747567A1; RU2016119957A

Abstract

Método de aumento del crecimiento de plantas de soja, que comprende tratar las semillas de soja o la planta de soja que germina desde la semilla con una cantidad eficaz de al menos un CO, donde después de la cosecha la planta muestra al menos uno de rendimiento de planta aumentado medido en cuanto a fanegas/acre, número de raíces aumentado, longitud de raíz aumentada, masa de raíz aumentada, volumen de raíz aumentado y área foliar aumentada, en comparación con plantas de soja no tratadas o plantas de soja cosechadas de semillas de soja no tratadas, donde al menos un CO comprende un CO representado por la fórmula;**Fórmula** donde R1 y R2 cada uno independientemente representa hidrógeno o metilo; R3 representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; R4 representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; R5 representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; R6 representa hidrógeno, arabinosilo, fucosilo, acetilo, éster de sulfato, 3-0-S-2-0-MeFuc, 2-0-MeFuc, y 4-0-AcFuc; R7 representa hidrógeno, manosilo o glicerol; R8 representa hidrógeno, metilo, o -CH2OH; R9 representa hidrógeno, arabinosilo, o fucosilo; R10 representa hidrógeno, acetilo o fucosilo; y n representa 0, 1, 2 o 3.

Description

Quitooligosacaridos y métodos para uso en el aumenlo del crecimiento de soja

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

[0001) La simbiosis entre las bacterias del suelo gram-negativas, rizobios y bradirrizobios, y leguminosas como la soja, está bien documentada. La base bioquímica de estas relaciones incluye un intercambio de la señalización molecular, donde los compuestos señal de plantas a bacterias incluyen navonas, isoflavonas y flavanonas, y los compuestos señal de bacterias a plantas, que incluyen los productos finales de la expresión de los genes nod bradirhizobiales y rizobiales, conocidos como lipoquitooligosacaridos (LCO). La simbiosis entre estas bacterias y las leguminosas permite a la leguminosa fijar el nitrógeno atmosférico para el crecimiento de la planta, así obviando una necesidad de fertilizantes de nitrógeno. Dado que los fertilizantes de nitrógeno pueden aumentar significativamente el coste de las plantas de cultivo y se asocian con un número de efectos contaminantes, la industria agrícola continúa sus esfuerzos para explotar esta relación biológica y desarrollar nuevos agentes y métodos para mejorar el rendimiento de la planta sin aumentar el uso de fertilizantes a base de nitrógeno.

[0002) La Patente estadounidense 6.979.664 enseña un método para aumentar la germinación de semillas o la emergencia de plántulas de un cultivo vegetal, que incluye las etapas de proporcionar una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos un lipoquitooligosacárido y un portador agrícola adecuado y aplicar la composición en la proximidad inmediata de una semilla o plántula en una cantidad eficaz para aumentar la germinación de semillas de la emergencia de plántulas en comparación con una semilla o plántula no tratada.

[0003) Otro desarrollo en este concepto se enseña en WO 2005f062899, dirigido a combinaciones de al menos un inductor vegetal, es decir un LCO, en combinación con un fungicida, insecticida, o combinación de los mismos, para mejorar una característica de la planta tal como soporte de la planta, crecimiento, vigor yfo rendimiento. Las composiciones y métodos se enseñan por ser aplicables para tanto leguminosas como no leguminosas, y se puede usar para tratar una semilla (justo antes de la siembra), plantula, raíz o planta.

[0004) De forma similar, WO 2008/085958 enseña composiciones para aumentar el crecimiento de la planta y rendimiento del cultivo en tanto leguminosas como en no leguminosas, y que contienen LCO en combinación con otro agente activo tal como una quitina o quitosano, un compuesto flavonoide, o un herbicida, y que se pueden aplicar a semillas y/o plantas concomitantemente o consecutivamente. Como en el caso de la publicación '899, la publicación '958 enseña el tratamiento de semillas justo antes de la siembra.

[0005) Más recientemente, Halford, "Smoke Signals," en Chem. Eng. News (abril 12, 2010), en páginas 37-38, informa que las karrikinas o butenolidas que se contienen en el humo actúan como estimulantes del crecimiento y estimulan la germinación de semillas después de un incendio, y pueden estimular semillas tates como maíz, tomates, lechuga y cebollas que han sido almacenadas. Estas moléculas son el sujeto de patente estadounidense 7.576.213.

[0006) WO 89/07395, WO 2008f085958 Y WO 2010/125065 revelan derivados de quitosano y el uso del mismo en la mejora del crecimiento de la planta.

[0007) Hay, sin embargo, todavía una necesidad de sistemas para mejorar o aumentar el crecimiento de la planta.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCiÓN

[0008) Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método de mejora del crecimiento de las plantas de semilla de soja, que comprende a) tratamiento (por ejemplo, aplicación al semilla de semilla de soja o una planta de semilla de soja que germina desde la semilla, con una cantidad eficaz de al menos un quitooligosacárido (Ca) tal y como se define en la reivind icación 1, donde Iras la cosecha la planta de semilla de soja muestra al menos uno de rendimiento de planta aumentado medido en cuanto a fanegas/acre, número de raíces aumentado, longitud de raíz aumentado, masa de raíz aumentada, volumen de raíz aumentado y área foliar aumentada, en comparación con plantas de soja no tratadas o plantas de soja cosechadas de semilla de soja no tratada .

[0009) En algunas formas de realización, se usan al menos dos CO. En algunas formas de realización, el tratamiento de la semilla de soja incluye la aplicación directa del al menos un CO sobre la semilla, que puede luego ser plantado o almacenado durante un periodo de tiempo previo a la siembra. El tratamiento de la semilla de soja también puede incluir tratamiento indirecto tal como por la introducción del al menos un CO en el suelo (conocido en la técnica como aplicación en el surco). En otras formas de realización, al menos un ca se puede aplicar a la planta que germina desde la semilla, por ejemplo, via pulverización foliar.

Los métodos pueden incluir además el uso de otros agentes agronómicamente beneficiosos, tales como micronutrientes; ácidos grasos y derivados de los mismos; moléculas señal de planta «distintas de Ca), tales como lipoquitooligosacaridos, compuestos quitinosos (distintos de Ca), f1avonoides, acido jasmónico y derivados del mismo, ácido linoleico y derivados del mismo, ácido linolénico y derivados del mismo, y karrikinas y derivados de las mismas); herbicidas, fungicidas e insecticidas; microorganismos de solubilización de fosfato, diazótrofos (inoculantes rizobiales), y/o hongos micorrizales.

[0010) Como se ha demostrado por los ejemplos prácticos, que resumen experimentos conducidos en el invernadero y en el campo, los resultados conseguidos por los métodos de la presente invención muestran que la aplicación de al menos un ca a la semilla de soja semilla o a una planta de semilla de soja que germina a partir de una semilla, produce el crecimiento mejorado de la planta. Se cree que estos resultados son inesperados, particularmente desde el punto de vista de que se sabe que los cas intervienen en la resistencia adquirida en el sistema (SAR) pero no están necesariamente implicados en la mejora directa del crecimiento de la planta. Los resultados descritos aquí muestran que en algunos casos, los métodos de la invención han conseguido un efecto sustancialmente igualo en algunos otros casos, superado la mejora del crecimiento de la planta conseguido por un LCa. Los resultados obtenidos de los experimentos en invernadero son significativos particularmente a este respecto, ya que se realizaron en condiciones sustancialmente libres de enfermedad.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

[0011[

Las Figuras 1a y 2a muestran las estructuras quimicas de los compuestos de quitooligosacáridos (CO) útiles en la práctica de la presente invención. Las Figuras 1b y 2b muestran las estructuras químicas de los compuestos de lipoquitooligosacáridos (LCO) que corresponden a los ca en las figuras 1a y 2a, y que son útiles también en la práctica de la presente invención. Las Figuras 3a y 4a muestran las estructuras químicas de otros ca útiles en la práctica de la presente invención. Las Figuras 3b y 4b muestran las estructuras químicas de los factores Myc que corresponden a los ca en las figuras 3a y 3b, Yque son útiles también en la practica de la presente invención. La Fig. 5 es un gráfico de barras que ilustra el efecto del eo ilustrado en la Fig. 2a, en comparación con el LeO ilustrado en la Fig. 2b, una mezcla de ca producidos por quitinasa, un isoflavonoide, y un control, tratado en la semilla de soja, expresado en términos de área de la superficie foliar. La Fig. 6 es un gráfico de barras que ilustra el efecto del ca ilustrado en la Fig. 2a, el LCO ilustrado en la Fig. 1 b, un isoflavonoide, y la mezcla de los compuestos quitinosos no inventivos (obtenidos de quitosano por medio de un proceso enzimático), tratado en las semillas de soja, expresado en términos de peso seco promedio de la planta de soja. La Fig. 7 es un gráfico de barras que ilustra el efecto del ca ilustrado en la Fig. 2a, solo o en combinación con uno de dos ácidos grasos diferentes, en comparación con el LeO ilustrado en la Fig. 1 b, en la semilla de soja, expresado en cuanto a longitud de radícula promedio. La Fig. 8 es un gráfico de barras que ilustra el efecto del ca ilustrado en la Fig. 2a, en comparación con el LCa ilustrado en la Fig. 1 b, Yuna mezcla de CO producida por quitinasa, tratada en las plantas de soja, expresada en términos de biomasa seca promed io de planta .

DESCRIPCiÓN DETALLADA

Quitooligosacáridos

[0012) CO se conocen en la técnica como estructuras de N-acetil glucosamina enlazadas en 13-1-4 identificadas como oligómeros de quitina, también como N-acetilquitooligosacáridos. CO tienen decoraciones de cadena lateral únicas y diferentes que las hacen diferentes de moléculas de quitina [(CsH,3N05)n, CAS nO 1398-61-4), y moléculas de quitosano [(C5H" N04)n, CAS nO 9012-76-4]. Véase, por ejemplo, Hamel, et al., Planta 232:787-806 (2010)(p. ej., la Fig. 1 que muestra estructuras de quitina, quitosano, factores Nod (LCa), y los CO correspondientes (que carecerían del grupo acilo 18C, 16C, o 20C) . Los ca de la presente invención son hldrosolubles también relativamente en comparación con quitina y quitosano, y en algunas formas de realización, como se describe a continuación, son pentaméricos. Bibliografía representativa que describe la estructura y producción de ca que se puede adecuar para usar en la presente invención es como sigue: Muller, et al., Plant Physiol. 124:733-9 (2000)(p. ej, Fig. 1 de la misma); Van der Holst, et al., Current Opinion in Structural Biology, 11:608-616 (2001) (p. ej., Fig. 1 de la misma); Robina, et al., Tetrahedron 58:521-530 (2002); D'Haeze, el al., Glycobiol. 12(6):79R-105R (2002); Rouge, et al. Capitulo 27, "The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates" en Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan, et al., Plant Cell 21:1053-69 (2009); PCTfF100f00803 (9/21/2000); y Demont-Caulet, et al., Plant Physiol. 120(1 ):83-92 (1999).

[0013) CO difieren del LCO en cuanto a estructura principalmente en que carecen de la cadena de ácido graso pend iente.

35 10.()1-2017

CO derivados de rizobios, y derivados sintéticos que no ocurren de forma natural de los mismos, que pueden ser útiles en la practica de la presente invención se representan por la fórmula siguiente:

R"

Rs \ OH OH \

°°

>,0 HO

°

R,O

""O ....... R,

n

O=(NH °

/ O=<H

R,

O===(

Re

10014) donde R, y R2 cada uno independientemente representa hidrógeno o metilo; R3 representa hidrógeno, acetilo

o carbamoilo; ~ representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; Rs representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; Rs representa hidrógeno, arabinosilo, fucosilo, acetilo, éster de sulfato, 3'()-S-2.()-MeFuc, 2-0-MeFuc, y 4.()-AcFuc; R1 representa hidrógeno, manosilo o glicerol; Ra representa hidrógeno, metilo, o -CH20 H; Rg representa hidrógeno, arabinosilo, o fucosilo; R10 representa hidrógeno, acetilo o fucosilo; y n representa O, 1, 2 o 3. Las estructuras de los LCO rizobiales correspondientes están descritas en o'Haeze, et al., supra.

[0015) Dos CO adecuados para usar en la presente invención se ilustran en las figuras 1 a y 2a. Ellos corresponden a LCO producidos por Bradyrhizobium j aponicum y Rhizobium /eguminosarum biovar viciae respectivamente, que interactúan simbióticamente con la soja y el guisante, respectivamente, pero carecen de las cadenas de ácidos grasos. Los LCO correspondientes producidos por estos rizobios (y que son útiles también en la práctica de la presente invención) se ilustran en las figuras 1b y 2b.

[0016) Las estructuras de otros CO adicionales que pueden ser adecuados para usar en la práctica de la presente invención son derivables fácilmente de LCO obtenidos (es decir, aislados y/o purificados) a partir de unos hongos micorrizales, tales como hongos del grupo Glomerocycota, por ejemplo, G/omus intraradices. Véase, por ejemplo, WO 20101049751 y Maillet, et al., Nature 469:58-63 (2011) (los LCO descritos en la misma también referida como "factores Myc·).

Los CO derivados de hongos micorrizales representativos se representan por la estructura siguiente:

donde n = 1 02; R1 representa hidrógeno o metilo; y R2 representa hidrógeno o S03H. Otros dos CO adecuados para usar en la presente invención, uno de los cuales es sulfatado, y el otro siendo no sulfatado, se ilustran en las figuras 3a y 4a respectivamente. Corresponden a dos l CO diferentes producidos por los hongos micorrizales G/amas intraradices que se ilustran en las figuras 3b y 4b (y que son útiles también en la práctica de la presente invención).

10017) l os CO pueden ser sintéticos o recombinantes. Los métodos para la preparación de CO sintéticos son descritos, por ejemplo, en Robina, supra., Métodos para producir CO recombinantes por ejemplo, usando E. coli como huésped, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, oumon, et al., ChemBioChem 7:359-65 (2006), Samain, et al., Carbohydrate Res. 302:35-42 (1997); Cottaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) y Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999) (por ejemplo, Fig. 1 en esta que muestra estructuras de CO que pueden ser hechas recombinantemente en E. coli que contiene combinaciones diferentes de genes nodBCHL). Para los fines de la presente invención, al menos un CO es diferente estructuralmente de quitinas, quitosanos, y otros quitooligosacáridos hechos enzimáticamente usando quitina como una materia prima.

[0018) Para los fines de la presente invención, en formas de realización donde al menos un ca es recombinante, al menos un ca recombinante es al menos 60% puro, por ejemplo, al menos 60% puro, al menos 65% puro, al menos 70'% puro, al menos 75% puro, al menos 80'% puro, al menos 85% puro, al menos 90'% puro, al menos 91% puro, al menos 92°!o puro, al menos 93% puro, al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% puro, hasta 100% puro.

[0019) l as semillas de soja se pueden tratar con al menos un ca en diferentes vías tal como pulverización o goteo. El tratamiento por pulverización y goteo se puede realizar por la formulación de una cantidad eficaz del al menos un ca en un portador agrícola aceptable, típicamente acuoso en la naturaleza, y por pulverización o goteo de la composición sobre semilla por medio de un sistema de tratamiento continuo (que se calibra para aplicar tratamiento a un índice predefinido en proporción con el flujO continuo de semilla), tal como un tipo tambor de tratamiento. Estos métodos ventajosamente emplean volúmenes relativamente pequeños de portador para permitir un secado relativamente rápido de la semilla tratada. De esta manera, se pueden tratar eficazmente grandes volúmenes de semilla. También se pueden emplear sistemas de lote, donde un tamaño de lote predeterminado de semilla y composiciones de moléculas señal se suministran en un mezclador. Sistemas y aparatos para realizar estos procesos estan disponibles comercialmente de numerosos proveedores, por ejemplo, Bayer CropScience (Gustafson).

[0020) En otra forma de realización, el tratamiento implica el recubrimiento de semillas de soja con al menos un ca. Un tal proceso implica recubrir la pared interna de un contenedor redondo con la composición, añadir semillas, luego girar el contenedor para hacer que las semillas contacten la pared y la composición, un proceso conocido en la técnica como "recubrimiento de contenedor". Las semillas se pueden recubrir por combinaciones de los métodos de recubrimiento. El remojo implica tipicamente el uso de una solución acuosa que contiene el agente potenciador de crecimiento vegetal. Por ejemplo, las semillas se pueden empapar durante aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 24 horas (por ejemplo, durante al menos 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 80 min, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas). Algunos tipos de semillas (por ejemplo, semillas de soja) tienden a ser sensibles a la humedad. Así, puede no ser deseable empapar tales semillas durante un periodo de tiempo prolongado, en cuyo caso el remojo es típicamente realizado durante aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 20 minutos.

[0021) En aquellas formas de realización que implican almacenamiento de semilla de soja después de la aplicación del al menos un ca, la adherencia del ca a la semilla sobre cualquier porción de tiempo del periodo de almacenamiento no es crítica. Sin pretender estar sujetos a ninguna teoría particular de funcionamiento, los solicitantes creen que incluso en la medida en que el tratamiento no puede hacer que la molécula señal de la planta permanezca en contacto con la supelficie de la semilla después del tratamiento y durante cualquier parte del almacenamiento, el ca puede conseguir su efecto destinado por un fenómeno conocido como memoria de semillas o percepción de semillas. Véase, Macchiavelli, et al., J. Exp. Bol. 55(408):1635-40 (2004). Los solicitantes también creen que después del tratamiento el ca se difunde hacia la radícula joven en desarrollo y activa genes simbióticos y desarrollables que resulta en un cambio en la arquitectura de la raíz de la planta. No obstante, a la extensión deseable, las composiciones que contienen el ca pueden contener además un agente de pegado o de recubrimiento. Para fines estéticos, las composiciones pueden contener además un polímero de recubrimiento y/o un colorante.

[0022) l a cantidad del al menos un ca es eficaz para mejorar el crecimiento de manera que la cosecha de la planta de soja muestra al menos uno de rendimiento de planta aumentado medido en términos de fanegas/acre, número de raíces aumentado, longitud de raíz aumentada, masa de raíz aumentada, volumen de raíz aumentada y afea de hoja aumentada, en comparaCión con plantas de semilla de soja no tratadas o plantas de semilla de soja cosechadas de semilla de soja no tratada (con bien activo). La cantidad eficaz del al menos un ca usado para tratar la semilla de soja, expresada en unidades de concentración, generalmente varía de aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10.14 M (concentración molar), y

en algunas formas de realización, de a~roximadamente 10.5 a ~roximadamente 10. M, Y en algunas otras formas de realización de aproximadamente 10-a aproximadamente 10 M. Expresado en unidades de peso, la cantidad eficaz generalmente varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 400 ¡.Jg/centena (cwt) de semilla, yen algunas formas de realización de aproximadamente 2 a aproximadamente 70

~g/cwt, y en algunas otras formas de realización, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 3.0 ~gfcwt de semilla.

[0023) Para fines de tratamiento de semilla de soja indirectamente, es decir, tratamiento en el surco, la cantidad eficaz del al menos un ca generalmente varía de aproximadamente 1 ll.9facre a aproximadamente 70 ~gfacre, y en algunas formas de realización, de aproximadamente 50 ~Ig/acre a aproximadamente 60 ~g/acre.

Para fines de aplicación a las plantas, la cantidad eficaz del ca generalmente varía de aproximadamente 1 ~(g/acre a aproximadamente 30 Ilg/acre, y en algunas formas de realización, de aproximadamente 11 pg/acre a aproximadamente 20 Ilgfacre.

[0024) La semilla de soja se puede tratar con al menos un ca justo antes o en el momento de la siembra. El tratamiento en el momento de la siembra puede incluir aplicación directa a la semilla como se ha descrito anteriormente, o en algunas otras formas de realización, introducir los activos en el suelo, conocido en la técnica como tratamiento en el surco. En aquellas formas de realización que implican el tratamiento de semillas seguido de almacenamiento, la semilla puede ser luego envasada, por ejemplo, en bolsas de 50-lb o 100-lb, o bolsas o envases en masa, conforme a técnicas estándar. La semilla se puede almacenar durante al menos 1, 2, 3,4, S, 6, 7, 8, 9, lO , 11, o 12 meses (hasta la siguiente estación de siembra) bajo condiciones de almacenamiento apropiadas que se conocen en la técnica.

Otros agentes beneficiosos agronómicamente

[0025) La presente invención puede incluir además tratamiento de la semilla de soja o las plantas de soja que germinan desde la semilla con al menos un agente beneficioso agrícolamente/agronómicamente. Como se utiliza en este caso y en la técnica, el término "beneficioso agrícola o agronómicamente" se refiere a agentes que cuando se aplican a semillas o plantas de soja resultan en una mejora (que puede ser significativa estadísticamente) de las características de la planta de semilla de soja tal como soporte de la planta, crecimiento (por ejemplo, tal y como se define en relación con los Ca), o vigor en comparación con semillas o plantas de soja no tratadas. Estos agentes se pueden formular con al menos un ca o aplicarse a la semilla o planta por medio de una formulación separada. Ejemplos representativos de tales agentes que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen micronutrientes (por ejemplo, vitaminas y oligoelementos), ácidos grasos y derivados de los mismos, moléculas señal de la planta (diferentes de los COl, herbicidas, fungicidas e insecticidas, microorganismos de solubilización de fosfato, diazótrofos (inoculantes rizobiales), y/o hongos micortizales.

Micronutrientes

[0026) Vitaminas representativas que pueden ser útiles en la practica de la presente invención incluyen pantotenato de calcio, ácido fólico, biotina, y vitamina C. Ejemplos representativos de oligoelementos que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen boro, cloro, manganeso, hierro, zinc, cobre, molibdeno, níquel, selenio y sodio.

[0027) La cantidad del al menos un micronuttiente usado para tratar la semilla, expresado en unidades de concentración, generalmente varía de 10 ppm a 100 ppm, y en algunas formas de realización, de aproximadamente 2 ppm a aproximadamente 100 ppm. Expresado en unidades de peso, la cantidad eficaz varía generalmente en una forma de realización de aproximadamente 180 ~(g a aproximadamente 9 mg/centena (CWT) de semilla, y en algunas formas de realización de aproximadamente 4 ~(g a aproximadamente 200 ~(g/planta cuando se aplica en el follaje . En otras palabras, para fines de tratamiento de semilla de la cantidad eficaz del al menos un micronutriente generalmente varia de 30 ).lgfacre a aproximadamente 1.5 mgfacre, y en algunas formas de realización, de aproximadamente 120 mgfacre a aproximadamente 6 gfacre cuando se aplica foliarmente.

Ácidos grasos

[0028) Ácidos grasos representativos que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen los ácidos grasos que son sustituyentes en los LCO de origen natural, tales como ácidos esteancos y palmíticos. Otros ácidos grasos que pueden ser útiles incluyen ácidos grasos C12-18 saturados que (aparte de ácidos palmíticos y esteáricos) incluyen ácido láurico, y ácido mirístico, y ácidos grasos C12-18 insaturados tal como ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido sapiénico, ácido oleico, ácido elaidico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido linolénico, y ácido linoelaidico. El ácido linoleico y ácido linolénico se producen en el curso de la biosintesis de ácido jasmónico (que como se describe abajo, es también un agente beneficioso agronómica mente para fines de la presente invención). Ácido linoleico y ácido linoleico (y sus derivados) se proporcionan por ser inductores de expresión de genes nod o producción de LeO por rizobacterias . Véase, por ejemplo, Mabood, Fazli, "Linoleic and linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum," USDA 3, Mayo 17, 2001

[0029) Derivados útiles de ácidos grasos que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen ésteres, amidas, glucósidos y sales.

Los ésteres representativos son compuestos donde el grupo carboxilo del acido ~raso, por ejemplo, ácido linoleico y acido linolénico, se ha sustituido por un grupo --COR, donde R es un grupo --OR ,donde Rl es: un grupo alquilo, tal como un grupo alquilo el-CSno ramificado o ramificado, por ejemplo, un grupo metilo, etílico o propilo; un grupo de alquenilo, tal como un grupo alquenilo C2""CS no ramificado o ramificado; un grupo de alquinilo, tal como un grupo alquinilo CrCs no ramificado o ramificado; un grupo arilo que tiene, por ejemplo, 6 a 10 atamos de carbono; o un grupo heteroarilo que tiene, por ejemplo, 4 a 9 átomos de carbono, donde los heteroátomos en el grupo heteroarilo pueden ser, por ejemplo, N, O, P, o S. Amidas representativas son compuestos donde el grupo carboxilo del ácido graso, por ejemplo, acido linoleico y ácido linolénico, se ha sustituido por un grupo --COR, donde R es un grupo NR2R3, donde R2 y R3 son independientemente: hidrógeno; un grupo alquilo, tal como un grupo alquilo Cl-Cs no ramificado o ramificado, por ejemplo, un grupo metilo, etilo o propilo; un grupo de alquenilo, tal como un grupo alquenilo C2-CS no ramificado o ramificado; un grupo alquinilo, tal como un grupo alquinilo Cr Cs no ramificado o ramificado; un grupo arilo que tiene, por ejemplo, 6 a 10 átomos de carbono; o un grupo heteroarilo que tiene, por ejemplo, 4 a 9 átomos de carbono, donde los heteroátomos en el grupo heteroarilo pueden ser, por ejemplo, N, O, P,

o S. Los ésteres se pueden preparar por métodos conocidos, tal como adición nucleofílica catalizada por acido, donde el acido carboxílico se hace reaccionar con un alcohol en presencia de una cantidad catalítica de un acido mineral. Las amidas también se pueden preparar por métodos conocidos, tales como haciendo reaccionar el acido carboxílico con la amina apropiada en presencia de un agente de acoplamiento tal como carbodiimida de diciclohexilo (DCC), bajo condiciones neutras. Sales adecuadas de acidos grasos, por ejemplo, ácido linoleico yacido linolénico, incluyen por ejemplo, sales de adición de bases. Las bases que se pueden utilizar como reactivos para preparar sales de base aceptables metabólicamente de estos compuestos incluyen aquellas derivadas de cationes tales como cationes de metal alcalino (por ejemplo, potasio y sodio) y cationes de metal alcalinotérreo (por ejemplo, calcio y magnesio). Estas sales se pueden preparar fácilmente mediante la mezcla de una solución del acido graso con una solución de la base. La sal se puede precipitar de la solución y ser recogida por filtración o se puede recuperar por otros medios tal como por evaporación del solvente.

[0030) Las cantidades del ácido graso o derivados del mismo usadas para tratar la semilla de soja o plantas de soja están típicamente entre aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, y en algunas formas de realización aproximadamente 25% de la cantidad del al menos un ca.

Moléculas señal de la planta

[0031) La presente invención también puede incluir además el tratamiento de la semilla de soja o planta de soja con una molécula señal de la planta diferente de un CO. Para fines de la presente invención, el término "molécula señal de la planta", que se puede usar de forma intercambiable con "agente de mejora del crecimiento de la planta" en general se refiere a cualquier agente, ambos de origen natural en plantas o microbios, y sintético (y que puede ser que no ocurra de forma natural) Que activa directa o indirectamente una vía bioquímica de la planta, dando como resultado el crecimiento de la planta de soja aumentado, medible al menos en términos de al menos uno de rendimiento aumentado medido en cuanto a fanegasfacre, número de raíces aumentado, longitud de raíz aumentada, masa de raíz aumentada, volumen de raíz aumentada y área foliar aumentada, en comparación con plantas de semilla de soja no tratadas o plantas de semilla de soja cosechadas de semilla de soja no tratada. Ejemplos representativos de moléculas señal de planta que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen lipoquitooligosacáridos; compuestos quitinosos (diferentes de los Ca); navonoides; ácido jasmónico, acido linoleico y ácido linolénico y sus derivados (supra); y karrikinas y sus derivados.

[0032) Compuestos de lipoQuitooligosacáridos (LCO), también conocidos en la técnica como señales Nod simbióticas o factores Nod, consisten en un esqueleto de oligosacarido de residuos de N-acetil-D-glucosamina enlazada en P-1,4 ("GlcNAc") con una cadena de acilo graso N-enlazada condensada en el extremo no reductor. Los LeO difieren en el número de residuos GlcNAc en el esqueleto, en la longitud y grado de saturación de la cadena de acilo graso, y en las sustituciones de residuos de azúcar reductores y no reductores. Véase, por ejemplo, Denarie, et al., Ann. Rev. Biochem. 65:503-35 (1996), Hamel, et al., supra., Prome, et al., Pure & Appl. Chem. 70(1 ):55-60 (1998). Un ejemplo de un LCO es presentado a continuación como fórmula I

en la cual: G es una hexosamina que puede ser sustituida, por ejemplo, por un grupo acetilo en el nitrógeno, un grupo sulfato, un grupo acetilo yfo un grupo éter en un oxigeno,

5 R" R2, R3, R5, Re y R7, que pueden ser idénticos o diferentes, representan H, CH3 CO--, C. Hy CO--donde x es un numero entero entre O y 17, Y Y es un numero entero entre 1 y 35, o cualquier otro grupo acUo tal como por ejemplo un carbamoilo, ~representa una cadena alifática mono-, di-o triinsaturada que contiene al menos 12 átomos de carbono, y n es un numero entero entre 1 y 4.

10033) LCO pueden ser obtenidos (aislados y/o purificados) de bacterias tales como rizobios, por ejemplo, Rhizobium sp., Bradyrhizobium sp., Sinorhizobium $p. y Azorhizobium sp. La estructura de LCO es caracterfstica para cada una de estas especies bacterianas, y cada cepa puede producir LCO multiples con estructuras diferentes.

15 Por ejemplo, LCO espedficos de S. meliloti han sido también descritos en la Patente estadounidense 5.549.718 como teniendo la fórmula 11:

/ OR

C H 20H

H,c

-: o

-: "\

HO HO

o

HO

o

HO

NH

'-H

o

°

H,c~ o

CH,

HH

n

(CH~

\

HC

\\

HC

--: (CH~

\

CH,

donde R representa H o CH3 CO-y n es igual al 2 o 3.

20 [0034) LCO aun más especificos incluyen NodRM, NodRM-1; NodRM-3. Cuando se acetilan (el R=CH3 CO-), se vuelven AcNodRM-1, y AcNodRM-3, respectivamente (Patente estadounidense 5.545.718). 10035) LCO de Bradyrhizobium japonicum son descritos en las patentes estadounidenses 5.175.149 y 5.321.011. En términos generales, ellos son fitohormonas pentasacáridas que comprenden metilfucosa.

25 Un numero de estos LCO derivados de B. japonicum son descritos: BjNod-V (C'8:'); BjNod-V (Ac; C'8:'), BjNod-V (C,e:,); y BjNod-V (CA; C,e:o), con "\¡-indicando la presencia de cinco N-acetilglucosaminas; "Ac" una acetilación; el numero después de ·C" Indicando el número de carbonos en la cadena lateral de ácldo graso; y el número después de ":" el número de enlaces dobles.

45 10.()1·2017

10036) LCO usados en formas de realización de la invención se pueden obtener (es decir, aislar '110 purificar) de cepas bacterianas Que producen LCO, tales como cepas de Azorhizobium, Bradyrhizobium (incluyendo B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (incluyendo R. leguminosarum), Sinorhizobium (incluyendo S. meliloll), '1 cepas bacterianas genéticamente modificadas para producir LCO.

[0037) Los LCO son los determinantes primarios de especificidad de huésped en la simbiosis de legumbre (Oiaz, et al., Mol. Plant-Microbe Interactions 13:268-276 (2000». Así, en la familia de legumbres, géneros específicos '1 especies de rizobios desarrollan una relación de fijación de nitrógeno simbiótica con un huésped de legumbre especifico. Estas combinaciones de planta-huésped/bacterias son descritas en Hungría, et al., Soil BioL Biochem. 29:819-830 (1997), ejemplos de estas sociedades simbióticas de bacterias/legumbre incluyen S. melilolilalfalfa '1 trébol oloroso;

R. leguminosarum biovar viciaefguisantes '1 lentejas; R. leguminosarum biovar phaseolilalubias; Bradyrhizobium japonicum/soja ; '1 R. leguminosarum biovar trifoliiltrébol rojo. Hungria también enumera los inductores de genes Nod flavonoides eficaces de las especies rizobiales, '1 las estructuras LCO específicas Que se producen por las especies rizobiales diferentes. Sin embargo, la especificidad de LCO solo se requiere para establecer nodulación en leguminosas. En la práctica de la presente invención, el uso de un LCO dado no está limitado al tratamiento de semillas de su legumbre asociada simbiótica, para conseguir un rendimiento de planta aumentado medido en términos de fanegas/acre, número de ralces aumentado, longitud de ralz aumentada, masa de ralz aumentada, volumen de ralz aumentado '1 área foliar aumentada, en comparación con plantas cosechadas de semilla no tratada, o en comparación con plantas cosechadas de semilla tratada con la molécula señal justo antes de o dentro de una semana o menos de la siembra.

[0038) Así, por medio de otros ejemplos, derivados de LCO '1 que no ocurren de forma natural de los mismos que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención se representan por la fórmula siguiente:

OH O" O

'\ R' \

O

n

",O 0=("

"'

en donde Rl representa C14:0,30H-C14:0, iso-C15:0, C16:0,3-0H-C16:0, iso-C15:0, C16:1, C16:2, C16:3, Iso C17:0, iso-C17:1, C18:0,30H-C18:0, C18:0/3-0H, C18:l, OH-C18:1, C18:2, C18:3, C18:4, C19:l carbamoilo, C20:0, C20:1 ,3-OH-C20:1, C20:1/3-OH, C20:2, C20:3, C22:1, '1 C18-26(ro-1)-OH (Que según O'Haeze. el al., supra, incluye C18; C20; C22; C24 '1 C26 especies hidroxiladas '1 C16:169, C16:2 (1.\2,9) '1 C16:3 (1.\2,4,9» ; R2 representa hidrógeno o metilo; R;, representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; R. representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; Rs representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; R6 representa hidrógeno, arabinosilo, fucosilo, acetilo, éster de sulfato, 3-0-S-2-0-MeFuc, 2.()-MeFuc, '1 4-0-AcFuc; Rr representa hidrógeno, manosilo o glicerol; R8 representa hidrógeno, metilo, o -CH2ÜH; Rg representa hidrógeno, arabinosilo, o fucosilo; R10 representa hidrógeno, acetilo o fucosito; y n representa O, 1, 2 o 3. Las estructuras de los LCO rizobiales de origen natural comprendidas por esta estructura son descritas en O'Haeze,

el al. , supra.

10039) La presente invención también comprende el uso de LCO obtenidos (es decir, aislados '110 purificados) a partir de unos hongos micorrizales, tales como hongos del grupo Glomerocycota, por ejemplo, Glomus intraradices. Las estructuras de LCO representativos obtenidos de estos hongos se describen en WO 2010/049751 '1 WO 2010/049751 (los LCO descritos en estos documentos también se refieren como ~factores Myc"). ca derivados de hongos micorrizales representativos y derivados Que no se originan de forma natural de los mismos se representan por la estructura siguiente:

O~

/ ;': OH I l NH

~: §"

HO: ' HO--r-_t-''-

_~~~1°

HO

NH

R, I OH " OR,

en donde n = 1 02; Rl representa C16, C16:0, C16:1, C16:2, C18:0; C18:1A9Z o C18:1t.11Z; y R2 representa hidrógeno o SO:)H. En algunas formas de realización, los LCO se producen por los hongos micorrizales que se ilustran en las figuras 3b Y4b.

[0040) La presente invención abarca además el uso de compuestos sintéticos de LCO, tales como los descritos en WO 20051063784, y los LCO recombinantes producidos por ingenierfa genética. La estructura básica de LCO de origen natural puede contener modificaciones o sustituciones encontradas en LCO de origen natural, tales como los descritos en Spaink, Crit. Rev. Plan! Sci. 54:257-288 (2000) y D'Haeze, et al., Glycobiology 12:79R-105R (2002). Las moléculas de oligosacáridos precursores (Ca, que como se describe abajo, son útiles también como moléculas señal de planta en la presente invención) para la construcción de LCO también se pueden sintetizar por organismos genéticamente modificados, por ejemplo, como se describe en Samain, et al., Carbohydrate Res. 302:35-42 (1997); Coltaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) y Samain, el al., J. Siotechnol. 72:33-47 (1999Xpor ejemplo, Fig. 1 en la misma muestra estructuras de los LCO que pueden ser hechas recombinantemente en E. coli que comprende combinaciones diferentes de genes nodBCHL).

[0041 ) LCO se pueden utilizar en varias formas de pureza y se pueden usar solos o en forma de un cultivo de bacterias productoras de LCO u hongos. Por ejemplo, OPTIMIZE® (disponible comercialmente de Novozymes SioAg Limited) contiene un cultivo de B. ja(XJnicum que produce un LCO (LCON(C18: 1 MeFuc), MOR 116) que se ilustra en la Fig. 1 b. Los métodos para proporcionar lCO sustancialmente puros incluyen sencillamente eliminar las células microbianas a partir de una mezcla de LCO y el microbio, o seguir aislando y purificando las moléculas de LCO a través de separación de fase de solvente de LCO seguido de cromatografía de HPLC como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.549.718. La purificación se puede mejOl"ar pOI" HPLC repetida, y las moléculas de LCO purificadas se pueden liofilizar para almacenamiento a largo plazo. Los quilooligosacáridos (CO) como se ha descrito anteriormente, se pueden utilizar como materias primas para la producción de l CO sintéticos. Para los fines de la presenle invención, LCO recombinantes son al menos 60% puro, por ejemplo, al menos 60% puro, al menos 65% puro, al menos 70% puro, al menos 75% puro, al menos 80% puro, al menos 85% puro, al menos 90% puro, al menos 91% puro, al menos 92% puro, al menos 93% puro, al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% puro, hasta 100% puro.

[0042) Quitinas y quitosanos. que son componentes mayores de las paredes celulares de hongos y los exoesqueletos de insectos y crustáceos, son también compuestos por residuos de GlcNAc. Compuestos quitinosos incluyen quitina, (IUPAC: N-[5-113-acelilamino-4,5-dihidroxi-6-(hidroximelil)oxan2il]metoximetil]-2-115-acetilamin0-4,6-dihidroxi-2-(hidroxi metil)oxan-3-il]metoximetil]-4-hidroxi-6-(hidroximetil)oxan-3is]etanamida). y quitosano, (IUPAC: 5-amino-6-[5-amino-6-[5-amino-4,6-dihidroxi-2(hidroximetil)oxan-3-il}oxi-4hidroxi-2-(hidroximetil)oxan-3-il]oxi-2(hidroximelil)oxano-3,4-d iol). Estos compuestos se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich, u obtener a partir de insectos, conchas de crustáceo, o paredes celulares de hongos. Los métodos para la preparación de quitina y quitosano se conocen en la técnica, y se han descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense 4.536.207 (preparación a partir de conchas de crustáceo), Pochanavanich. et al., Lel!. Appl. Microbio!. 35:17-21 (2002) (preparación a partir de paredes celulares de hongos), y patente estadounidense

5.965.545 (preparación a partir de cáscaras de cangrejo e hidrólisis de quitosano comercial). Véase, lambién, Jung, el al., Carbohydrate Polymers 67:256-59 (2007); Khan, et al., Photosynthetica 40(4):621-4 (2002). Quitinas y quitosanos desacetilados se pueden obtener que varfan de menos del 35% a más del 90% de desacetilación, y cubren un amplio espectro de pesos moleculares, por ejemplo, oligómeros de quitosano de bajo

peso molecular inferior a 15kD y oligómeros de quitina de 0.5 a 2kD; quitosano de "grado práctico" con un peso molecular de aproximadamente 150kO; y quitosano de peso molecular alto de hasta 700kD. Las composiciones de quitina y de quitosano formuladas para el tratamiento de semillas están disponibles también comercialmente. Productos comerciales incluyen, por ejemplo, ELEXA® (Plant Oefense Boosters, Inc.) y BEYONO ..... (Agrihouse, Inc.).

[0043) Los flavonoides son compuestos fenólicos que tienen la estructura general de dos anillos aromáticos conectados por un puente de tres carbonos. Los flavonoides se producen por las plantas y tienen muchas funciones, por ejemplo, como moléculas de señalización beneficiosas, y como protección contra los insectos, animales, hongos y bacterias. Las clases de flavonoides incluyen chalconas, antocianidinas, cumarinas, f1avonas, flavanoles, f1avonoles, flavanonas, e isoflavonas. Véase, Jain, et al., J. Plant Biochem. & Biotechnol. 11 :1-10 (2002); Shaw, et al., Environmental Microbiol. 11 :1867-80 (2006).

[0044) Flavonoides representativos que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen genisteina, daidzeína, formononetina, naringenina, hesperetina, luteolina, yapigenina. Compuestos f1avonoides están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Natland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, Irvine, CA; LC Laboratories, Woburn MA. Lo compuestos f1avonoides se pueden aislar de plantas o semillas, por ejemplo, como se describe en las patentes estadounidenses 5,702,752,5,990,291; Y 6,146,668. Los compuestos flavonoides también se pueden producir por organismos genéticamente modificados, tales como levadura, como se describe en Ralston, et al., Plant Physiology 137:1375-88 (2005).

[0045) El ácido jasmónico (JA, ácido [1R-[1 Cl.2B(Z»))-3-oxo-2-(pentenil)ciclopentanoacético) y sus derivados (que incluyen ácido linoleico y ácido linolénico (que se describen anteriormente en relación con ácidos grasos y sus derivados), se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. El ácido jasmónico y su éster metílico, metil jasmonato (MeJA), conocido colectivamente como jasmonatos, son compuestos a base de octadecanoides que se originan naturalmente en las plantas. El ácido jasmónico se produce por las raíces de semillas de trigo, y por microorganismos fúngicos como Botryodiplodia theobromae y Gibbrella fujikuroi, levadura (Saceharomyces cerevisiae), y cepas patógenas y no patógenas de Eseherichia eoli. Acido linoleico y ácido linolénico se producen en el curso de la biosintesis de ácido jasmónico. Al igual que el ácido linoleico y ácido linolénico, los jasmonatos (y sus derivados) se proporcionan por ser inductores de expresión de genes nod o producción de LCO por rizo bacterias. Véase, por ejemplo, Mabood, Fazli, Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum, 17 Mayo, 2001 .

[0046) Derivados útiles de ácido jasmónico que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen ésteres, amidas, glucósidos y sales. ¡;:steres representativos son compuestos donde el grupo carboxilo de ácido jasmónico ha sido sustituido con un grupo --COR, donde R es un grupo __OR1, donde Rl es: un grupo alquilo, tal como un grupo alquilo Cl-CS no ramificado o ramificado, por ejemplo, un grupo metilo, etilo o propilo; un grupo alquenilo, tal como un grupo alquenilo C2""CS no ramificado o ramificado; un grupo de alquinilo, tal como un grupo alquinilo C2-CS no ramificado o ramificado; un grupo arilo que tiene, por ejemplo, 6 a 10 átomos de carbono; o un grupo heteroarilo que tiene, por ejemplo, 4 a 9 átomos de carbono, donde los heteroátomos en el grupo heteroarilo pueden ser, por ejemplo, N, 0 , P,

o S. Am idas representativas son compuestos donde el grupo carboxilo de ácido jasmónico ha sido sustituido con un grupo --COR, donde R es un grupo NR2R3 , donde R2 y R son independientemente: hidrógeno; un grupo alquilo, tal como un grupo alquilo Cl-CS no ramificado o ramificado, por ejemplo, un grupo metilo, etilo o propilo; un grupo alquenilo, tal como un grupo alquenilo C2-C8 no ramificado o ramificado; un grupo alquinilo, tal como un grupo alquinilo C2""CSno ramificado o ramificado; un grupo arilo que tiene, por ejemplo, 6 a 10 átomos de carbono; o un grupo heteroarilo que tiene, por ejemplo, 4 a 9 átomos de carbono, donde los heteroátomos en el grupo heteroarilo pueden ser, por ejemplo, N, 0, P, o S. Los ésteres se pueden preparar por métodos conocidos, como la adición nucleofllica catalizada por ácido, donde el ácido carboxllico se reacciona con un alcohol en presencia de una cantidad catalítica de un ácido mineral. Las amidas también se pueden preparar por métodos conocidos, tal como reaccionando el ácido carboxílico con la amina apropiada en presencia de un agente de acoplamiento tal como diciclohexil carbodiimida (DCC), bajo cond iciones neutras. Las sales adecuadas de ácido jasmónico incluyen por ejemplo, sales de adición básicas. Las bases que se pueden utilizar como reactivos para preparar sales de base aceptables metabólicamente de estos compuestos incluyen aquellas derivadas de cationes tales como cationes de metal alcalino (por ejemplo, potasio y sodio) y cationes de metal alcalinotérreo (por ejemplo, calcio y magnesio). Estas sales se pueden preparar fácilmente mezclando una solución de ácido linoleico, ácido linolénico, o ácido jasmónico con una solución de la base.

La sal se puede precipitar de la solución y ser recogida por filtración o se puede recuperar por otros medios tales como por evaporación del disolvente,

[0047) Karrikinas son 4H-pironas vinflogas por ejemplo, 2H-furo[2,3-c]piran-2-onas incluyendo derivados y sus análogos. Ejemplos de estos compuestos se representan por la estructura siguiente:

z

donde; Z es O, S o NRs R" R2, R3, Y Ro¡ son cada uno independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, fenilo, bencilo, hidroxilo, hidroxialquilo, alcoxi, feniloxi, benciloxi, CN, CORs, COOR=, halógeno, NRt;R7, o N02 Y Rs, Rs, Y R7 son cada uno independientemente H, alquilo o alquenilo, o una sal aceptable biológicamente del mismo. Ejemplos de sales biológicamente aceptables de estos compuestos pueden incluir sales de adición de ácido formadas con ácidos aceptables biológicamente, ejemplos de los cuales incluyen hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato

o bisulfato, fosfato o fosfato de hidrógeno, acetato, benzoato, succinato, fumarato, maleato, lactato, citrato, tartrato, gluconato; metanosulfonato, bencenosulfonato y ácido P-toluenosulfÓflico. Otras sales metálicas aceptables biológicamente pueden incluir sales de metal alcalino, con bases, ejemplos de las cuales incluyen sales de sodio y de potasio. Ejemplos de compuestos abarcados por la estructura y que pueden ser adecuados para usar en la presente invención incluyen los siguientes: 3-metil-2H-furo(2,3-cjpiran-2-ona (donde R,=CH3, R2, R3, Ro¡=H), 2H-furo[2,3c]piran-2-ona (donde R" R2, R3, Ro¡=H), 7-metil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (donde R" R2, R.=H, R3=CH3), 5-metil-2Hfuro[2 ,3-c]piran-2-ona (donde R" R2, ~=H, ~=CH3), 3,7-dimelil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (donde R" ~=CH3, R2, ~=H), 3,5-dimetil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (donde R" ~=CH3, R2, R3=H), 3,5,7-trimetil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (donde R" R3, Ro¡=CH3, R2=H), 5-metoximetil-3-metil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (donde R,=CH3, R2, R3=H, Ro¡=CH20CH3), 4-bromo-3,7-dimetil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (donde R" R3=CH3, ~=Br, Ro¡=H), 3-metilfuro[2,3c]piridin-2(3H)-ona (donde Z=NH, R,=CH3, R2, R3, ~=H), 3,6-dimetilfuro(2,3-c)piridin-2(6H)-ona (donde Z=N--CH3, R,=CH3, R2, R3, ~=H). Véase la patente estadounidense 7.576.213. Estas moléculas son conocidas también como karrikinas. Véase, Halford, supra.

[0048) La cantidad de la al menos una molécula señal de planta usada para tratar la semilla de soja, expresada en unidades de concentración, generalmente varfa de aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10-'· M (concentración molar), y en algunas formas de realización, de aproximadamente 10-5 a a~roximadamente lO'" M, Y en algunas otras formas de realización de aproximadamente 10-7 a aproximadamente 10' M. Expresado en unidades de peso, la cantidad eficaz generalmente varIa de aproximadamente 1 a aproximadamente 400 IJg/centena (cwt) de semilla, y en algunas formas de realización de aproximadamente 2 a aproximadamente 70 1J9/cwt, Y en algunas otras formas de realización, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 3.0 IJg/cwt de semilla.

10049) Para fines de tratamiento de semilla de soja indirectamente, es decir, tratamiento en el surco, la cantidad eficaz de la al menos una molécula señal de la planta generalmente varía de 1 IJg/acre a aproximadamente 70 IJg/acre, y en algunas formas de realización, de aproximadamente 50 IJg/acre a aproximadamente 60 IJg/acre. Para los fines de aplicación a las plantas de soja, la cantidad eficaz de la al menos una molécula de señal de planta generalmente varia de 1 IJg/acre a aproximadamente 30 IJg/acre, y en algunas formas de realización, de aproximadamente 11 IJg/acre a aproximadamente 20 IJg/acre.

Herbicidas, funglcldas e Insecticidas

[0050) Herbicidas adecuados incluyen bentazona, acifluorfen, clorimurón, lactofeno, clomazona, fluazifop, glufosinato, glif05alo, seloxidim, imazetapir, imazamox, fomesafen, flumiclorac, imazaquin, y clelodim. Los productos comerciales que contienen cada uno de estos compuestos están disponibles fácilmente. La concentración de herbicida en la composición generalmente corresponderá al Indice de uso marcado para un herbicida particular.

[0051 ) Un ~fungicida" como se utiliza en este caso y en la técnica, es un agente que mata o inhibe el crecimiento fúngico.

Como se utiliza en este caso, un fungicida "exhibe actividad contra" una especie particular de hongos si el tratamiento con el fungicida produce la muerte o la inhibición del crecimiento de una población fúngica (por ejemplo, en el suelo) con respecto a una población no tratada. Los fungicidas eficaces conforme a la invención exhibirán adecuadamente actividad contra una gama amplia de patógenos, incluyendo pero no limitandose a Phytophthora, Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Phomopsis o Selerotinia y Phakopsora y combinaciones de los mismos.

[0052) Los fungicidas comerciales pueden ser adecuados para usar en la presente invención. Los fungicidas adecuados disponibles comercialmente incluyen PROTÉGÉ, RIVAL o ALLEGIANCE FL o LS (Gustafson, Plano, TX), WARDEN RTA (Agrilance, St. Paul, MN), APRON XL, APRON MAXX RTA o RFC, MAXIM 4FS o XL (Syngenta, Wilmington, DE), CAPTAN (Arvesta, Guelph, Onta rio) y PROTREAT (Nitragin Argentina, Buenos Aires, Argentina). Los ingredientes activos en estos y otros fungicidas comerciales incluyen, pero de forma no limitativa, f1udioxonil, mefenoxam, azoxistrobin y metalaxil. Los fungicidas comerciales son mas adecuadamente usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante en las concentraciones recomendadas.

[0053) Como se utiliza en este caso, un insecticida "exhibe actividad contra" unas especies particulares de insecto si el tratamiento con el insecticida produce la muerte o la inhibición de una población de insectos con respecto a una población no tratada. Los insecticidas eficaces conforme a la invención exhibiran adecuadamente actividad contra una gama amplia de insectos incluyendo, pero no limitándose a, gusanos alambre, gusano cortador, larvas, gusano de la raíz de maiz, larvas de semilla de maíz, escarabajos pulga, chinches, pulgones, escarabajos de hoja, y chinches apestosos.

[0054) Insecticidas comerciales pueden ser adecuados para usar en la presente invención. Los insecticidas disponibles comercialmente adecuados incluyen CRUISER (Syngenta, Wilmington, DE), GAUCHO y PONCHO (Gustafson, Plano, TX). Ingredientes activos en estos y otros insecticidas comerciales incluyen tiametoxam, clotianidina, e imidacloprid. Los insecticidas comerciales son mas adecuadamente usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante en las concentraciones recomendadas.

Microorganismos solubiJizantes de fosfato, diazótrofos (inoculantes rizobiales), y/o hongos micorrizales.

[0055) La presente invención puede incluir ademas el tratamiento de la semilla con un microorganismo solubilizante de fosfato. Como se utiliza en la presente, "microorgan ismo solubi lizante de fosfato" es un microorganismo que es capaz de aumentar la cantidad de fósforo disponible para una planta. Los microorganismos solubilizantes de fosfato incluyen cepas bacterianas y fúngicas. En la forma de realización, el microorganismo solubilizante de fosfato es un microorganismo formador de esporas.

[0056) Ejemplos no limitativos de microorganismos solubilizantes de fosfato incluyen especies de un género seleccionado del grupo consistente en Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, AspergiJ/us, Azospirillum, Baeillus, Burkholderia, Gandida Ghryseomonas, Enterobaeter, Eupenicillium, Exiguobaeterium, Klebsiella, K/uyvera, Mierobaeterium, Mueor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Se"atia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobaeillus, Toru/ospora, Vibrio, Xanthobaeter, y Xanthomonas.

[0057) Ejemplos no limitativos de microorganismos de solubilización de fosfato son seleccionados del grupo que consiste en Aeinetobacter calcoacetieus, Aeinetobaeter sp, Arthrobacter sp., Arthrobotrys o/igospora, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Azospirillum ha/opraeferans, Bacillus amy/o/iquefaciens, Bacillus atrophaeus, Baeillus eirculans,Bacillus licheniformis, Bacillus subti/is, Burkholderia eepacia, Burkho/deria vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteo/a, Enterobaeter aerogenes, Enterobaeter asburiae, Enterobaeter sp., Enterobaeter tay/orae, Eupenieillium parvum, Exiguobaeterium sp., K/ebsiella sp. , Kluyvera cryocreseens, Microbaeterium sp., Mueor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus maeerans, Paenibaeillus muci/aginosus, Pantoea ag/omerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomooas lu/ea, Pseudomooas peae, Pseudomooas pulida, Pseudomooas s/u/zari, Pseudomooas /rivialis, Serratia marceseens, Stenotrophomonas ma/tophilia, Streptomyces sp. , Streptosporangium sp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agi/is, y Xanthomonas campestris

[0058) En una forma de realización particular, el microorganismo solubilizante de fosfato es una cepa del hongo

Penicilfium.

Las cepas del hongo Penicillium que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen P. bi/aiae (anteriormente conocido como P. bila;¡) , P. albidum, P. aurantiogriseum, P. chrysogenum, P. citreonigrum, P. eitrinum, P. digitatum, P. frequentas, P. fuseum, P. gaestrivorus, P. g/abrum, P. griseofu/vum, P. implicatum, P. janthinellum, P. Ii/aeinum, P. minioluteum, P. montanense, P. nigricans, P. oxalicum, P. pinetorum, P. pinophilum, P.

purpurogenum, P. radicans, P. radicum, P. raistrickii, P. rugulosum, P. simplicissimum, P. solitum, P. variabile, P. velutinum, P. viridicatum, P. g/aueum, P. fussiporus, y P. expansum.

[0059) En una forma de realización particular, la especie de Penicillium es P. bilaiae. En otra forma de realización particular las cepas de P. bilaiae son seleccionadas del grupo consistente en ATCC 20851 , NRRL 50169, ATCC 22348, ATCC 18309, NRRL 50162 (Wakelin, et al. , 2004. Biol Fertil Soils 40:36-43). En otra forma de realización particular la especie de Penicillium es P. gaestrivorus, por ejemplo, NRRL 50170 (véase. Wakelin, supra.).

[0060) En algunas formas de realización , se usa mas de un microorganismo de solubilización de fosfato, tal como, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, incluyendo cualquier combinación de

Acinetobacter, Al1hrobacter, Al1hrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Baci/Jus, Burkho/deria, Gandida Ghryseomonas, Enterobacter, Eupenieillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mueor, Paecilomyees, Paenibaeillus, Penicillium, Pseudomonas, Seffatia, Stenotrophomonas, Streptomyees, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Toru/ospora, Vibrio, Xanthobacter, y Xanthomonas, incluyendo una especie del siguiente grupo: Acinelobacler ca/coaceticus, Acinelobacler sp, Al1hrobacler sp., Al1hrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus sp. , Azospirillum ha/opraeferans, Bacillus amy/oliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus eireu/anS,Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkho/deria eepacia, Burkholderia vietnamiensis, Gandida krissii, Ghryseomonas luleo/a, Enlerobacler aerogenes, Enlerobacler asburiae, Enlerobacler sp., Enlerobacler laylorae, Eupenieillium parvum, Exiguobaeterium sp., Klebsiella sp., K/uyvera cryocreseens, Microbaeterium sp., Mueor ramosissimus, Paeci/omyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus maeerans, Paenibacillus mucilaginosus, Panloea ag/omerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugale, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas Jutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas pulida, Pseudomonas stulzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marceseens, Stenotrophomonas ma/tophilia, Streptomyees sp., Streptosporangium sp. , Swaminathania salilolerans, Thiobacillus feffooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proleolyticus, Xanlhobacler agilis, y Xanlhomonas eampestris

[0061) En algunas formas de realización, dos cepas diferentes de la misma especie también pueden ser combinadas, por ejemplo, se usan al menos dos cepas diferentes de Penieillium. El uso de una combinación de al menos dos cepas de Penicillium diferentes tiene las ventajas siguientes. Cuando se aplica a un suelo que ya contiene fosfatos insolubles (o difícilmente solubles), el uso de las cepas fúngicas combinadas dará lugar a un aumento en la cantidad de fósforo disponible para la absorción de plantas en comparación con el uso de solo una cepa de Penieillium. Esto a su vez puede suponer un aumento en la absorción de fosfato y/o un aumento en el rendimiento de plantas crecidas en el suelo en comparación con el uso de cepas individuales solas. La combinación de cepas también permite que los fosfatos de roca insolubles sean usados como un fertilizante eficaz para suelos que tienen cantidades inadecuadas de fósforo disponibles. Asi, en algunas formas de realización, se usa una cepa de P. bilaiae y una cepa de P. gaestrivorus. En otras formas de realización, las dos cepas son NRRL 50169 Y NRRL 50162. En otras formas de realización, al menos dos cepas son NRRL 50169 Y NRRL 50170. En otras formas de realización adicionales, al menos dos cepas son NRRL 50162 Y NRRL 50170.

[0062) Los microorganismos solubilizantes de fosfato se pueden preparar utilizando cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica, lal como, fermentación en estado sólido o liquido utilizando una fuente de carbono adecuada. El microorganismo solubilizante de fosfalo es preferiblemente preparado en forma de una espora estable.

[0063) En una forma de realización, el microorganismo solubilizante de fosfato es un hongo Penicillium. El hongo Penicillium según la invención se puede cultivar usando fermentación en estado sólido o liquido y una fuente de carbono adecuada. Los aislados de Peniciflium se pueden cultivar usando cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, el hongo se puede cultivar en un medio de crecimiento sólido tal como agar de dextrosa y patata o agar de extracto de malta, o en matraces que contienen medios líquidos adecuados tal como medio Czapek-Dox o caldo de dextrosa y patata. Estos métodos de cultivo se pueden utilizar en la preparación de un inóculo de Peoicillium spp. Para tratar semillas (por ejemplo; recubrimiento) y/o aplicación a un portador aceptable agronómica mente para aplicar al suelo. El término "in6culo" como se usa en esta especificación se destina a significar cualquier forma de microorganismo solubilizante de fosfato, células de hongos, micelio o esporas, células bacterianas o esporas bacterianas, que es capaz de propagarse sobre o en el suelo cuando las condiciones de temperatura, humedad, etc., son favorables para el crecimiento fúngico.

[0064) La producción en estado sólido de esporas de Penicillium se puede conseguir por la inoculación de un medio sólido tal como un sustrato de turba o a base de vermiculita, o granos incluyendo, pero no limitados a, avena, trigo, cebada, o arroz. El medio esterilizado (conseguidO a través de autoclave o irradiación) se inocula con una suspenSión de esporas (1x102_1x107 UFC/mL) del Penicillium spp. apropiado y la humedad ajustada a 20 a 50%, dependiendo del sustrato.

El material se incuba durante 2 a 8 semanas a temperatura ambiente. Las esporas también se pueden producir por fermentación líquida (Cunningham et al., 1990. Can J Bol. 68:22702274). La producción liquida se puede conseguir por el cultivo del hongo en cualquier medio adecuado, tal como caldo de dextrosa y patata o medios de extracto de levadura de sacarosa, baja condiciones apropiadas de pH y de temperatura que se pueden determinar conforme a procedimientos estándar en la técnica.

[0065) El material resulta nte se puede utilizar directamente, o las esporas, se pueden cosechar, concentrar por centrifugación, formular, y luego secar usando secado de aire, liofilización, o técnicas de secado en lecho fluidizado (Friesen, et al., 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:397-404) para producir un pOlvo humedecible. El pOlvo humedecible es luego suspendido en agua, aplicado a la superticie de las semillas, y dejado secar antes de la siembra. El pOlvo humedecible se puede utilizar conjuntamente con otros tratamientos de semillas, tales como, pero sin limitarse a, tratamientos quimicos de semilla, portadores (por ejemplo, talco, arcilla, caolin, gel de sílice, caolinita) o polimeros (por ejemplo, metilcelulosa, polivinilpirrolidona). Alternativamente, una suspensión de esporas del Penicillium spp. apropiado se puede aplicar a un portador compatible con el suelo adecuado (por ejemplo, polvo o gránulo a base de turba) hasta un contenido de humedad final apropiado. El material se puede incubar a temperatura ambiente, lipicamente durante aproximadamente 1 dia hasta aproximadamente 8 semanas, antes del uso.

[0066) Aparte de los ingredientes usados para cultivar el microorganismo solubilizante de fosfato, incluyendo, por ejemplo, los ingredientes referenciados arriba en el cultivo de Penicillium, el microorganismo solubilizante de fosfato se puede formular utilizando otros portadores aceptables agronómica mente. Como se utiliza en la presente en relación con el término "portador", el término "aceptable agronómica mente" se refiere a cualquier material que se puede usar para entregar los activos a una semilla de saja, suelo o planta de soja, y preferiblemente qué portador se puede adicionar (a la semilla, suelo o planta) sin que tenga un efecto adverso en el crecimiento de la planta, estructura del suelo, drenaje del suelo o similar. Portadores adecuados comprenden, pero de forma no limitativa, paja de trigo, salvado, paja de trigo molida, pOlvos o gránulos a base de turba , gránulos a base de yeso , y arcillas (por ejemplo, caolin, bentonita, montmorillonita). Cuando las esporas se añaden al suelo, será preferible una formulaci6n granulosa. Las formulaciones como liquido, turba , o polvo humedecible serán adecuadas para revestimiento de las semillas de saja. Cuando se usa para revestir semillas de soja, el material puede mezclarse con agua, aplicarse a las semillas y dejarse secar. Ejemplo de otros portadores incluyen salvado humedecido, secado, tamizado y aplicado a semillas de soja antes de recubrir con un adhesivo, por ejemplo, goma arábiga. En formas de realización que implican formulación de los activos en una composición única, el portador aceptable agron6micamente puede ser acuoso.

[0067) La cantidad del al menos un microorganismo solubilizante de fosfato varia dependiendo del tipo de suelo, las cantidades de la fuente de fósforo y/o micronutrientes presentes en el suelo o adicionados al mismo, etc. Una cantidad adecuada puede ser encontrada por experimentos de tanteo simples para cada caso particular. Normalmente, para Penicillium, por ejemplo, la cantidad de aplicación cae en la gama de 0.001-1.0 Kg de esporas fú ngicas y micelio (peso fresco) por hectárea, o 102.106 unidades formadoras de colonias {CFU) por semilla (cuando se usan semillas recubiertas), o sobre un portador granuloso aplicando entre 1x106 y 1x10 1 unidades formadoras de colonias por hectárea. Las células fúngicas en forma de por ejemplo, esporas y el portador se pueden añadir a una fila de semillas del suelo a nivel de la raiz o pueden usarse para revestir semillas antes de la siembra.

[0068) En formas de realización, por ejemplo, que implican el uso de al menos dos cepas de un microorganismo solubilizante de fosfato, tal como, dos cepas de Penicillium, fertilizantes comerciales se pueden adicionar a la tierra en vez de (o incluso también como) fosfato de roca natural. La fuente de fósforo puede contener una fuente de fósforo nativa del suelo. En airas formas de realización, la fuente de fósforo se puede adicionar al suelo. En una forma de realización la fuente es fosfato de roca. En otra forma de realización la fuente es un fertilizante fabricado. Fertilizantes de fosfato fabricados disponibles comercialmente son de muchos tipos. Algunos comunes son aquellos que contienen fosfato de monoamonio (MAP), fosfato super triple (TSP), fosfato de diamonio, supertosfato ordinario y polifosfato de amonio. Todos estos fertilizantes se producen por el procesamiento químico de fosfatos de roca natural insoluble en las instalaciones de fabricación de abono a gran escala y el producto es caro. Mediante la presente invención es posible reducir la cantidad de estos fertilizantes aplicadOS al suelo mientras se sigue manteniendo la misma cantidad de absorción de fósforo desde el suelo.

[0069) En otra forma de realización, la fuente o fósforo es orgánica.

Un fertilizante organico se refiere a una enmienda del suelo derivada de fuentes naturales que garantiza, al menos, los porcentajes minimos de nitrógeno, fosfato, y potasa. Ejemplos incluyen subproductos vegetales y animales, polvos de roca, algas marinas, inoculantes, y acondicionadores. Ejemplos representativos especificos incluyen harina de hueso, harina de carne, estiércol animal, compost, lodo de depuradora, o guano.

[0070) Otros fertilizantes, tales como fuentes de nitrógeno, u otras enmiendas del suelo pueden por supuesto también ser añadidas al suelo a aproximadamente el mismo tiempo que el microorganismo solubilizante de fosfato o en otros momentos, dado que los otros materiales no son tóxicos para el hongo.

[0071) Los diazótrofos son bacterias y arqueas que fijan el gas nitrógeno atmosférico en una forma mas utilizable tal como amoniaco. Ejemplos de diazótrofos incluyen bacterias de los géneros Rhizobium spp. (por ejemplo, R. cellu/osi/yticum, R. daejeonense, R. etli, R. ga/egae, R. gallicum, R. giardínií, R. haínanense, R. huautlense, R. índígoferae, R. /eguminosarum, R. /oessense, R. /upíni, R. /usitanum, R. me/í/otí, R. mongo/ense, R. mi/uonense, R. sullae, R. tropici,

R. undico/a, ylo R. yanglingense), Bradyrhizobium spp. (por ejemplo, B. bete, B. canariense, B. e/kanii, B. iriomotense, B. japonicum, B. jicamae, B. liaoningense, B. pachyrhizi, y/o B. yuanmingense), Azorhizobium spp. (por ejemplo, A caulinodans y/o A doebereinerae), Sínorhizobium spp. (por ejemplo, S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. aboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meli/oti, S. mexicanus,

S. more/ense, S. saheli, S. terangae, ylo S. xinjiangense), Mesorhizobium spp., (M. a/biziae, M. amarphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuií, M. /otí, M. medíterraneum, M. p/uifaríum, M. septentríona/e, M. temperatum, y/o M. tianshanense), y combinaciones de los mismos. En una forma de realización particular, el diazotrof es seleccionado del grupo consistente en B. Japonicum, R /eguminosarum, R meliloti, S. me/í/otí, y combinaciones de los mismos. En otra forma de realización, el diazótrofo es B. Japonicum. En otra forma de realización, el diazótrofo es R /eguminosarum. En otra forma de realización, el diazótrofo es R meliloti. En otra forma de realización, el diazótrofo es S. melilati.

[0072) Los hongos micorrizales forman asociaciones simbióticas con las ralces de una planta vascular, y proporcionan, por ejemplo, capacidad de absorción de agua y nutrientes minerales debido al area de superficie comparativamente grande del micelio. Los hongos micorrizales incluyen hongos endomicorrizales (también llamados micorrizas vesiculares arbusculares, VAMs, micorrizas arbusculares, o AMs), un hongo ectomicorrizal, o una combinación de los mismos. En una forma de realización, los hongos micorrizales son endomicorrizas del tipo Glomeromycota y los géneros Glomus y Gigaspora. En otra forma de realización adicional, las endomicorrizas son una cepa de Glomus aggregatum, G/amus brasi/íanum, G/omus c/arum, G/omus deserlíco/a it, G/omus etunicatum, G/omus fascicu/atum, G/omus íntraradíces, G/amus monosporum, o G/omus mosseae, Gigaspora margarita, o una combinación de los mismos.

[0073) Ejemplos de hongos micorrizales incluyen ectomicorrizas del filo Basidiomycota, Ascomycota, y Zygomycota. Otros ejemplos incluyen una cepa de Lacearia bicolor, Laccaria laccata, Pisolithus tinctorius, Rhizopogon amylopogon, Rhizopogon fulvigleba, Rhizopogon luteolus, Rhizopogon villosuli, Scleroderma cepa, Scleroderma citrinum, o una combinación de los mismos.

[0074) Los hongos micorrizales incluyen micorrizas ecroides, micorrizas arbutoides, o micorrizas monotropoides. Arbusculares y ectomicorrizas forman micorrizas ericoides con muchas plantas pertenecientes al orden de las Ericales, mientras algunas Ericales forman micorrizas arbutoides y monotropoides. En una forma de realización, la micorriza puede ser una micorriza ericoide, preferiblemente del filo Ascomycota, tal como Hymenoscyphous ericae u Oidiodendron sp. En otra forma de realización, la micorriza también puede ser una micorriza arbutoide, preferiblemente del filo Basidiomycota. En otra forma de realización, la micorriza puede ser una micorriza monotripoide, preferiblemente del filo Basidiornycota. En todavía otra forma de realización, la micorriza puede ser una micorriza de orquídea, preferiblemente del género Rh izoctonia.

[0075) La invención será ahora descrita en cuanto a los siguientes ejemplos no limitativos. A menos que se indique lo contrario, se usó agua como control (indicado como "control" o "CHK").

EJEMPLOS

Experimentos de invernadero

Ejemplo 1: tratamiento de soja con varios activos

[0076) Semillas de soja (semilla Jung, varo 8168NRR) fueron tratadas con varias moléculas activas. Las semillas fueron traladas con un índice de dosis líquida de 3 ti oz 1100 lbs de semilla. Las semillas se dejaron secar durante 2 horas y se sembraron en el invernadero en macetas de plástico que contenían una mezcla de arena:perlita 1 :1. Las semillas fueron cultivadas durante 4 semanas con aplicaciones ocasionales de fertilizante líquido y luego las plantas fueron cosechadas. El folio lo central desde el 2° trifoliado (de abajo hacia arriba) fue aislado y se midió el area de la superficie en un escaner WinRhizo. El resto de las plantas se utilizaron para el peso seco de la planta (DW).

[0077] Los resultados obtenidos desde el experimento dilucidaron que Lea de guisante no inventivo, ca de guisante inventivo y ca chino mostraron un aumento significativo en el área de la superficie foliar. Pero entre estos tres principios activos, el guisante ca prOdujO la superficie foliar mas alta (significativamente mas alta que el control (agua» y relativamente más alta que el ca chino (Fig. 5). En otro experimento, ca produjo los pesos secos de la planta mas altos en cuanto a brote, o raíz o biomasa vegetal total. Asi, era evidente que el aumento de biomasa por ca fue mejor que Lea de soja o cualquiera de los otros tratamientos incluyendo agua como un control e isoflavonoides como una molécula señal de la planta separada (F ig. 6).

Ejemplo 2: tratamiento de semilla de soja

[0078) Semillas de soja (Pioneer 90M80) fueron colocadas en placas Petri en papel de germinación húmedo empapado con 5 mi de la solución de tratamiento que contenia bien agua o LCa de soja, ca de guisante y ca más ácidos grasos. Las radículas de las plántulas fueron aisladas después de 48 horas y se midió su longitud.

[0079) LCa mostró mejor mejora del crecimiento de radiculas de semilla que el control y ca pero fue el ca mas el ácido esteárico o ácido palmítico el que mostró un aumento significativo en la longitud de la radicula. El ca mismo es menos eficaz que el LCa en la soja pero la adición de ácido graso o ácido palmílico o esleárico con ca podría además mejorar el crecimiento radical de las plántulas (Fig. 7).

Ejemplo 3: tratamiento foliar de soja con varios activos

[0080) Plantas de soja (semilla Jung, var. 8168NRR) fueron tratadas con varias moléculas activas en la fase de crecimiento V4. Las plantas fueron cultivadas a partir de las semillas en el invernadero en macetas de plastico que contenían una mezcla de arena:per1ita 1:1. Plántulas fueron cultivadas durante 4 semanas con aplicaciones ocasionales de fertilizante líquido y luego las plantas fueron cosechadas.

[0081) La aplicación foliar de LCa de soja, ca de guisante o ca chino no tuvo ningún efecto significativo en el aumento de la biomasa seca de planta (Fig. 8). La biomasa pata cada Lca, ca y ca chino fue relativamente superior a las plantas de control, con los activos igualmente eficaces.

18-20: Pruebas de campo

Ejemplo 4: soja

[0082) Diecinueve pruebas de campo fueron realizadas para evaluar formas de realización de la presente invención en el rendimiento granular cuando se aplican al follaje de soja. Los ensayos de campo fueron realizados en ocho estados con distintas características de suelo y condiciones ambientales.

[0083) Los tratamientos usados en las pruebas fueron control (agua), ca puro (quitooligosacárido) -ca-v (ilustrado en la Fig. 2a) y LCa puro (Iipoquitooligosacárido) -SP104 (ilustrado en la Fig. 2b). Tratamientos de ca y LCa fueron 8 x 10-8 concentración molar dando como resultado 12 ~g I acre aplicado. Variedades de sOJa comerciales diferentes fueron empleadas. Los tratamientos fueron añadidos al herbicida glifosato y pulverizados en el follaje en la fase vegetativa de la planta V4 a V5. Cuatro onzas por acre del tratamiento fueron combinadas con el herbicida yagua fue a plicada a razón de 5 a 10 galones por acre. La soja fue cultivada hasta su madurez, cosechada y se determió el rendimiento granular. Los resultados se exponen en la tabla 1.

RENDIMIENTO: BU { A

CONTROL: Leo $P104 ce (CO-V

Media (N -19): 56,5 58,3 58,2

Res uesta bu ( A: 1 8 17

Aumento de res uesta % de control: 3% 3%

Respuesta de rendimiento positivo %: 68,4 68,4

[0084) Como se refleja por comparación entre el control y CO, el rendimiento fue mejorado por tratamiento de CO foliar por 1.7 bu ( A, dando como resultado un 3% de aumento sobre el control, y una mejora de rendimiento positivo ocurrió en el 68,4'>fo de los ensayos.

[0085) En comparación con la respuesta LCO foliar, el rendimiento medio de CO fue 0.1 bu { A, menor, pero el mismo porcentaje de aumento del rendimiento sobre el control y el mismo porcentaje de aumento de rendimiento pOSitivo. Por lo tanto, tanto el CO como el LCO proporcionaron mejoras de rendimiento sustancialmente iguales que un

10 tratamiento foliar.

10-01·2017

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de aumento del crecimiento de plantas de soja, que comprende tratar las semillas de soja o la planta de soja que germina desde la semilla con una cantidad eficaz de al menos un ca, donde después de la cosecha la

5 planta muestra al menos uno de rendimiento de planta aumentado medido en cuanto a fanegas/acre, número de rafees aumentado, longitud de rarz aumentada, masa de ralz aumentada, volumen de rarz aumentado y area foliar aumentada, en comparación con plantas de sOja no tratadas o plantas de soja cosechadas de semillas de soja no tratadas, donde al menos un CO comprende un CO representado por la fórmula;

R'

R, \\ OH OH

°°

",O

NH

HO

R,O R°joO

N--R, O==<H

/ O=(

R,

O=(

Ro

10 donde Rj y Rz cada uno independientemente representa hidrógeno o metilo; RJ representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; ~ representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; R5 representa hidrógeno, acetilo o carbamoilo; RE; representa hidrógeno, arabinosilo, fucosilo, acetilo, éster de sulfato, 3-O-S-2-O-MeFuc, 2-0-MeFuc, y 4-O-AcFuc; R1 representa hidrógeno, manosilo o glicerol; Ra representa hidrógeno, metilo, o -CH2aH; Rg representa hidrógeno, arabinosilo, o fucosilo; R10 representa hidrógeno, acetilo o fucosilo; y n representa 0, 1, 2 o 3.
2. Método uegún la reivindicación 1, donde al menos un ca comprende un CO representado por la fórmula;

,O~

_OHH

\ H

H

NH 1( H OH

á O

un ca representado por la fórmula;

~OOH H NHAc ~O

NHAc H HO O H~O O OHO--r::::!:T'o O OH HO O O Ha ~~o~O HO NH OH NHAc OH NHAc

H

20 un ca representado por la fórmula:

10-01·2017

0Yl 0y

/OH

NH

""'" OH

~~g l"

°

NH

OR,

R,

OA

donde n = 1 02; R, representa hidrógeno o metilo; y R2 representa hidrógeno o S03H, un ca representado por la fórmula;

o un ca representado por la fórmula;

/OH

~

HO~O HO

HO~

NH

I

H
3.

Método segun la reivindicación 1, donde al menos un ca es sintético.
4.

Método segun la reivindicación 1, donde al menos un ca es recombinante.
5.

Método segun la reivindicación 1, donde al menos un CO se aplica a la semilla de soja antes de la siembra o en el momento de la siembra.
6.

Método segun la reivindicación 1, donde al menos un ca se aplica a la semilla de soja en el surco.
7.

Método segun la reivindicación 1, donde al menos un ca se aplica a la planta de soja por medio de tratamiento foliar.
8.

Método según la reivindicación 1, que comprende además la aplicación a la planta de soja o semilla de la misma de al menos un agente beneficioso agronómicamente.
9.

Método según la reivindicación 8, donde al menos un agente beneficioso agronómica mente es un micronutriente.
10.

Método según la reivindicación 7, donde el agente beneficioso agronómica mente es un ácido graso o un derivado del mismo.
11.

Método según la reivindicación 7, donde al menos un agente beneficioso agronómicamente es una molécula señal de la planta.
12.

Método según la reivindicación 11, donde la molécula señal de la planta es un lipoquitooligosacárido (LeO).
13.

Método según la reivindicación 11, donde la molécula señal de la planta es seleccionada del grupo consistente en f1avonoides, ácido jasmónico y derivados del mismo, ácido linoleico y derivados del mismo, ácido linolénico y derivados del mismo, y karrikinas y derivados de las mismas.

15 14. Método según la reivindicación 7, donde el agente beneficioso agronómica mente es un microorganismo de solubilización de fosfato, diazótrofo, y{u hongos micorrizales.
15. Método según la reivindicación 14, donde al menos un microorganismo solubilizante de fosfato comprende una cepa del hongo Penicillium .