FR2941589A1 - Utilisation de la chitine pour la biofertilisation bacterienne des cultures non-legumineuses - Google Patents

Abstract

Une combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS), et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non-légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racine et radicelles des dites cultures. Lesdits supports organiques non-bactéricides permettent de véhiculer CHT, TRP et sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organo-minéral, voire des semences de cultures fourragères Graminae et/ou Brassicacea. De plus, la dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement 10 g, tandis que la dose-hectare de CHT est comprise entre 100 et 1 000 g, préférablement 500 g. A noter que les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus. Il est loisible d'apporter des bactéries biofertilisantes viables de la famille des Azotobacteracea (AZB) - correctement formulées et conditionnées à cet effet selon les règles de l'art, auxdits supports organiques et non-bactéricides ; les apports desdites bactéries de la famille des Azotobacteracea (AZB) auxdits supports organiques et non-bactéricides comportent entre 1 et 10 x 10 cellules Azotobacteracea par hectare, préférablement 5 x 10 cellules par hectare. Il s'agit donc de biofertilisants pour grandes cultures et cultures intermédiaires pièges à nitrates non-légumineuses comprenant le traitement de supports organiques non-bactricides avec un précurseur métabolique d'auxines phytogènes, avantageusement du TRP, d'un co-formulant chitinique tel que la CHT, voire et avantageusement un inoculum azotobactérien (AZB).

Description

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DESCRIPTION DE L'INVENTION

UTILISATION DE LA CHITINE POUR LA BIOFERTILISATION BACTÉRIENNE DES CULTURES NON-LÉGUMINEUSES 5 DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION

Le domaine technique de l'invention concerne la biofertilisation bactérienne, notamment azotobactérienne des grandes cultures agronomiques. Il est question de production et d'utilisation inocula bactériens à cet effet et de co-formulants à base de chitine et d'acides aminés. 10 ÉTAT DE LA TECHNIQUE ÉTAT DE LA TECHNIQUE 15 LA BIOFERTILISATION À L'AIDE DE BFCP AZOTOBACTÉRIENNES

Les BFCP (bactéries favorisant la croissance des plantes) jouent rôle important dans la croissance des plantes. Elles colonisent, outre les racines de certaines cultures, les résidus de cultures (pailleux), les engrais organominéraux et/ou les biomasses racinaires résiduelles. 20 Les mécanismes responsables de l'amélioration de la croissance comprennent : (i) la production de sidérophores extracellulaires (agents microbiens de transport du fer) qui peuvent s'associer de manière efficace avec le fer présent dans l'environnement en le rendant moins disponible pour certaines microflores naturelles non-phytogènes, (ii) l'antibiose contre des bactéries et des champignons pathogènes, (iii) la production de substances favorisant la 25 croissance, et iv) la solubilisation des phosphates organiques et inorganiques. Les BFCP appartiennent à plusieurs genres, y compris Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Cellulomonas, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, (Brady)rhizobium et Xanthomonas. Ces inocula sont, contrairement aux inocula constitués de rhizobia symbiotiques, 30 généralement appliqués aux résidus de cultures pailleux au sol, aux engrais organominéraux. Le genre Azotobacter est composé d'au moins 6 espèces: Azotobacter armeniacus, Azotobacter beijerinckii, Azotobacter chroococcum, Azotobacter nigricans, Azotobacter paspali et Azotobacter vinelandi. Plus particulièrement, la biofertilisation azotobactérienne consiste en l'utilisation d'inocula 35 BFCP diazotrophes, avantageusement du genre Azotobacter de la famille des Azotobaceracea. Les bactéries membre de la famillie Azotobacteracea sont de bactéries libres, aérobies et capables de fixer l'azote de manière non symbiotique. Leurs populations peuvent varier dans le sol mais ne dépasse que très rarement 102 à 103 par gramme de sol. -2 UTILISATION DE LA CHITINE ET SES DÉRIVÉS SUR GRANDES CULTURES Engrais et produits phytos à base de chitine (CHT)

La chitine (CHT) est surtout utilisée comme agent de lutte biologique pouvant être apporté directement au sol dans l'espoir que la prolifération des microorganismes chitolytiques subséquent puisse nuire à l'activité des pathogènes fongiques dont les parois sont aussi constituées de chitine. Cela dit, cette pratique, somme tout trop coûteuse pour être rentable, est entiché de résultats aléatoire (De Boer et al. 1999).

En principe, la chitine peut aussi être une source d'azote minéral pour la plante. In situ, la dégradation de la chitine est assurée par des chitinases (EC 3.2.1.14). II en résulte l'apparition relativement rapide d'oligomères chitosaniques, sont plus de la moitié seront eux aussi rapidement minéralisés provoquant une accumulation d'azote minéral (De Boer et al. 1999). La chitine, et les oligomère chistosaniques qui en découlent, sont somme tout assez peu récalcitrants in situ ; ces derniers ont probablement une durée de vie de quelques jours au plus. Cette minéralisation rapide de la chitine et du chitosan, outre leurs coûts, fait qu'ils sont généralement peulpas utilisés comme fumure de fond à l'automne ; leurs utilisations comme engrais N dès la sortie d'hiver n'est pas plus recommandable étant donnée la disponibilité des engrais N plus conventionnels.

Or, l'utilisation agronomique de la chitine, notamment comme matière organique est limitée du fait que les dose-hectare (dose-hectare) prescrites sont trop importantes. En effet, celles-ci varies de quelques centaines (ù 400) de kg à plus d'une tonne par hectare (cf. France Chitine, De Boer et al. 1999). Apporter au sol entant que matières fertilisantes de telles quantités de ces molécules, même obtenues en vrac, ne peut être rentable en agronomie. D'où dans le passée un certain avantage à utiliser le chitosan soluble en application foliaires par pulvérisation liquide pour les protections végétales.

Entant que matière fertilisante, la chitine ne fait l'objet d'aucune demande de brevet délivré, et cela contrairement à son dérivé oligomérique, le chitosan. En ce sens, quelques demandes de titre de PI concernant la chitine et/ou son utilisation sont rapportée au Tableau A ;

Tableau A

EP1908847 - 2008-04-09 Method For Fermentative Production Of N-Acetyl-D-Glucosamine By Microorganism EP1862434 - 2007-12-05 Process For Collecting And Separating Of Water-Insoluble Pollutant From Aqueous Or Soli Environments. EP1741723 - 2007-01-10 Ss-Chitin Complex And Method For Producing The Same EP1917218 - 2008-05-07 Compositions Of Partially Deacetylated Chitin Derivatives EP1669462 - 2006-06-14 Method Of Preparing Alpha-Glycosylisoquercitrin, Intermediate Therefore And By-Product EP1862434 Al û Process for collection and separating water insoluble pollutants form aqueous or soli environments -3- Engrais à base de chitosan (COS) L'utilisation du chitosan, un chito-oligosaccharides (COS), un dérivé soluble dans l'eau de la chitine obtenu par dé - acétylation complète ou partielle de la chitine, comme matière fertilisante n'est pas nouvelle ; la requête chitosan and fertilizer auprès de la base de données esp@cenetTM de l'OEB donne lieu à 67 demandes de brevets, pour la plupart d'origines coréenne, japonaise et chinoise ; quelques une de ces demandes sont rapportées au Tableau B. Tableau B. KR20040091347 - 2004-10-28. Production Method Of Fertilizer Containing A Large Quantity Of Chitosan, Using King Crabs And Fertilizer Produced Thereby KR20030058804 - 2003-07-07. Production Of Chitosan For Coating Slow Release Chemical Fertilizer And Coating Method KR20010099264 - 2001-11-09. Method For Manufacturing Liquid Composite Fertilizer Using Chitosan RU2255924 - 2005-07-10. Method For Preparing Liquid Organomineral Fertilizer From Chitosan-Containing Raw CN1594229 - 2005-03-16. Composite Amino Acid Chitosan Fertilizer 3P2002265292 - 2002-09-18. Organic Fertilizer Containing Chitosan, Fowl Dropping Incineration Ash, Rice Brain And Powdery Charcoal 3134243993 - 1992-09-01. Chitosan-Incorporated Liquid Composite Fertilizer And Production Thereof 10 Hormis une demande canadienne (CA 2497633), la plupart des demandes récentes, depuis 2001, proviennent du sud-est asiatique (KR, JP, CN), reflet d'une abondance de sous produits de leurs industries de la pêche très importantes. Or, hormis la susdite demande canadienne, plus apparentée ici à l'utilisation de LCO (voir infra), ces demandes SE asiatiques (et 15 une russe) proposent effectivement l'incorporation d'acides aminés (CN1594229), de mélanges organominéraux (JP 2002 265292) et/ou d'oligoéléments (KR 2003 0058 804) ; l'incorporation d'inocula de microorganismes, et plus particulièrement de bactéries, n'est jamais mentionné. Or, le chitosan agit tant au niveau de la production d'auxines, un peu à la façon des LCO, et/ou comme agents azoto-nutritionnel (Osuji et Cuero 1992) un peu à la façon des divers sels 20 d'acide glutamique. En effet, Selon Osuji et Cuero (1992) un certain dérivé du chitosan, le NCMC, est déjà, en 1992, reconnu comme capable d'accroître la teneur en protéine du maïs et de la pomme de terre. Le chitosan est aussi préconisé pour la stimulation des défenses naturelles chez les plantes (Bell et ai. 1998 ; Benhamou 2004), voire dans la composition de produits pharma- et nutraceutique . 25 Engrais à base de LCO Les lipo-chitooligosaccharides, ou LCO, sont en principe chimiquement plus complexes et pondéralement plus efficaces que de simples oligomères de glucosaminiques (chitosan, COS). Or, 30 cela n'est pas démontré clairement sur grandes cultures non-légumineuses. En effet, les concentration ambiantes effectives d'LCO que doivent percevoir les semences non - légumineuses (US7250068, W00126465, CA2382614 ; Tableau C) sont comparables à celles pour le simple chitosan rapportées dans CA 2497633, soit de l'ordre de 1010 à 10-11 M. Ces 5 concentrations ambiantes de LCO sont aussi comparables à celles rapportées par D'Haeze et Holsters (2002) pour les cultures légumineuses, ou encore à celles apportées via les produits commerciaux Torque IF , Reveal Foliar et Optimize proposés par la société EMD CropBioscience. Tableau C. US7250068 - 2007-07-31. Method Of Increasing Photosynthesis ln Plants Comprising An Exposure Thereof To Lipochitooligosaccharides And Compositions Therefor W00126465 - 2001-04-19. Use Of Lipo-Chitooligosaccharides For Increasing Photosynthesis In Plants And Corresponding Methods And Compositions CA2382614 - 2001-04-19. Use Of Lipo-Chitooligosaccharides For Increasing Photosynthesis In Plants And Corresponding Methods And Compositions CA2338108 - 2000-02-03. Composition For Accelerating Seed Germination And Plant Growth 3P2000253895 - 2000-09-19. Partially Acetylated Chitosan, Chitooligosaccharide Mixture And Production Of Chitooligosaccharide US6979664 - 2005-12-27. Composition For Accelerating Seed Germination And Plant Growth JP9031105 - 1997-02-04. Production Of Low-Molecular Chitosan And Chitooligosaccharide JP9031104 - 1997-02-04. Production Of Low-Molecular Chitosan And Chitooligosaccharide JP6279219 - 1994-10-04. Microbicidal Material Composed Of Metallic Ion And Zeolite Compound JP5065368 - 1993-03-19. Plant Function Control Composition Containing Low-Molecular Weight Chitosan Or, cette utilisation de LCO Rhizobiacea sur cultures non-légumineuses est problématique d'un point de vue industriel et économique. Par exemple, le rendement bioindustriel des ces 10 molécules LCO de l'ordre de quelques mg/L de fermentation Rhizobiacea (Zhang et al. 2002, Prithivirajae et al. 2003) limite grandement la taille de la dose hectare, soit à environ quelques mg, soit à peine ce qui est requis pour une dose-hectare appliquée aux cultures légumineuses ciblées par les produits Bolt et/ou Optimize d'EMD CropBioscience. De plus, l'application des LCO spécifiquement produits pour et par les Rhizobiacea sur cultures non-légumineuses ce fera 15 vraisemblablement sans co-inoculation de bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP) non ù symbiotiques, de type Azospirillum par exemple. Enfin, la complexité des LCO spécifiques aux Rhizobiacea les rendent particulièrement sensibles à la dégradation une fois incorporés aux sols arables. Du coup, leur utilisation sur cultures non ù légumineuses est (surtout) limitée aux applications foliaires, application foliaires pas 20 nécessairement les plus avantageuses pour la biofertilisation bactérienne des grandes cultures. En effet, les applications foliaires et les traitements de semences, bien que largement utilisés en agronomie pour l'apport de molécules actives ne sont pas nécessairement les mieux adaptés pour la biofertilisation. D'une part, ils impliquent la présence de BFCP associatives, voire symbiotiques, dans la rhizosphère, BFCP qui vont donc nécessairement, à terme, ponctionner le flux 25 photosynthétique et devenir du coup potentiellement contreproductives. D'autres parts, du fait de l'efficacité quelque peu aléatoire de biofertilisants bactériens, du moins à ce jour, leurs utilisations ne justifient pas toujours un passage dédié de pulvérisateur.

LA CHITINE COMME SOURCE DE CHITOSAN ET DE COS

Le principal avantage du chitosan par rapport à son précurseur qu'est la chitine est sa solubilité aqueuse ; au-delà de 50% de déacétylation (DA) la chitine devient soluble dans l'eau et est donc considérée comme étant du chitosan û la définition du chitosan est donc opérationnel plutôt que chimique. Le degré de DA, et donc de la taille des oligomères générer conjointement à cette déacétylation influence grandement la bioactivité de ces molécules. En effet, l'inhibition du transport des auxines et l'effet rhizogène qui en découle (voir infra) sont les plus détectables pour les oligomère chito û et lipochito û oligo-sacchariques (LCO) comportant de 4 à 6 résidus et/ou déacétylés à plus de 80-85%. Or, bien que moins dispendieux que les LCO, les COS û y compris le chitosan, sont des molécules néanmoins relativement coûteuses - soit de l'ordre de 100 à 150 { le kg pour des qualités analytiques, et de l'ordre de 15 à 20 { le kg en vrac, pour être librement utilisées comme simples matières fertilisantes. Le prix de revient d'une dose-hectare de l'ordre de 500 g, par exemple, revient à environs 10 { ; pour être économiquement rentable, celle-ci devrait ce situer aux alentours de 2{ voire 3 { au maximum (hors conditionnement, mais y compris la formulation). La dégradation microbienne de la chitine û in situ ou in vitro, dans le cas d'une fermentation à l'état solide par exemple, permet l'accumulation de chito-oligosaccharides (COS) tetra- et de pentamériques. Cela est vraisemblablement attribuable au fonctionnement des principales chitinases (Horn et al. 2006). En effet, celles-ci sont constituées de six sous-unités fonctionnelles qui permettent de capter lesdits penta- et hexamères. L'utilisation de la simple chitine polymérique (brute) comme matière fertilisante impliquerait donc une certaine dégradation in situ de celle-ci. Or, cette dégradation, qui peut atteindre les 60% après seulement 4 semaines d'incubation (De Boer et al. 1999) semble être dans un premier temps surtout le fait de champignons copiotrophes et de bactéries unicellulaires ; ce n'est que dans un deuxième temps que les actinomycètes et les champignons oligotrophes peuvent leur succéder (De Boer et al. 1999). A noter ici que cette dynamique communautaire microbienne est semblable à celle impliquée dans la dégradation des résidus de cultures pailleux.

LES LCO : DU CHITOSAN DÉCORÉ ?

Les LCO (lipo-chito-oligosaccharides) sont essentiellement des oligomères de chitosan (glucosamine) décorés de groupements lipidiques, le squelette glucosaminique û un COS, étant lui-même phytoactif, bien que de façon non-spécifique à l'égard des Leguminosea, ou du moins spécifique que les LCO Rhizobiacea. Les précurseurs (squelette) métaboliques de la chitine et du chitosan que sont les LCO sont donc impliqués dans les symbioses Leguminosea I Rhizobiacea. Sans pour autant permettre la nodulation à proprement parler, les LCO sont aussi actifs chez les non-légumineuses, y compris donc les céréales, le maïs et le colza, incapables de symbioses avec les Rhizobiacea. Rien de surprenant donc que lesdits LCO aient eux aussi été reconnus, dès 1988, comme régulateurs de croissance végétal au sens plus large, i.e. non seulement sur espèces Leguminosea (Schmidt et al. 1988; De Jong et al. 1993 ; Schmidt et al. 1993 ; Rdhrig et al. 1996, etc.). En effet, chez les cultures légumineuses, la présence de LCO Rhizobiacea permet d'induire les stades initiaux de formation des nodosités où se nichent les symbiotes Rhizobiacea. Lesdites décorations caractéristiques des LCO sont pour l'essentiel responsables de la spécificité des symbioses (D'Haeze et Holsters 2000). Or, cette action des LCO est aujourd'hui attribuée en partie à l'inhibition par les LCO du transport intercellulaire des auxines (Mathesius et al. 1998, Hirsch et al. 1989, Wu et al. 1996). Cette inhibition provoque une augmentation localisée des teneurs en auxines qui semblerait est responsable de la déformation des radicelles caractéristique des susdites stades initiaux de la nodulation. Cependant, l'activité des oligomères de chitosan plus simples sur l'accumulation localisée des auxines n'est pas expressément documentée bien qu'il soit raisonnable de croire qu'elle existe. De plus, et tel que déjà mentionné, Lambrecht et al. 2000 rapportent qu'Azospirillum, une espèce bactérienne non û Rhizobiacea et non û symbiotique avec les Leguminosea peut elle aussi provoquer une suraccumulation d'auxines racinaires. II fut donc raisonnable de croire que ces non û Rhizobiacea aussi produisent un certain type d'oligosaccharides glucosaminiques, des COS, voire des analogues de LCO. Déjà, en 2000 (Lambrecht et al. 2000) mentionnèrent que la présence active d'Azospirillum dans les rhizosphères provoque une suraccumulation d'IAA (auxines) dans les racines et un certian effet rhizogénique. Cette action des Azospirillum mime en sorte celle des Rhizobiacea symbiotiques chez les Leguminosea. Cette action des Rhizobiacea sur la rhizogénie étant le fait, en partie, de leur production de LCO, il eut été normal de rechercher un analogue des LCO chez les Azospirillum. L'action des Azospirillum en ce sens étant moins spécifique (lire : ne donnant pas lieu à une symbiose), il eut été aussi normal de s'attendre à ce que ces homologues des LCO Rhizobiacea, soient biochimiquement plus simples. Il semble donc que la détection par la plante non-légumineuse de signaux moléculaire attribuables à de simples oligomères (n = IV, V et/ou VI) de chitosans est toute aussi prononcée que celles des LCO pourtant beaucoup plus complexe, et spécifique, chimiquement (voir Mathesius et al 1998, Müller et al 2000, et Baureithel et al 1994). Or, la recherche d'homologues non - Rhizobiacea de LCO chez les BFCP non - Rhizobiacea ne fait pas à ce jour l'objet d'efforts concertés. Au contraire, ce sont les LCO Rhizobiacea qui furent in fine appliqués aux cultures non-Leguminosea dépourvues de symbioses Rhizobiacea dans l'espoir de valoriser sur l'ensemble des grandes cultures ces molécules complexes, maintenant hautement caractérisées et, il est vrai, actives à des concentrations aussi faible de 10-12 M, voire moins (D'Haeze et Holsters 2000). Par exemple, les LCO d'origine Rhizobiacea sont aujourd'hui développés entant que biostimulants , et plus spécifiquement comme accélérateurs d'implantation des jeunes plants non-Leguminosea (eg. Bolt , Torque IF , Reveal Foliar - EMD CropBioscience ; voir aussi Prithirajae et al. 2003 et Zhang et al. 2002). -7

ENGRAIS À BASE D'INHIBITEUR DU TRANSPORT D'AUXINES

L'acide indole-acétique, base chimique de la famille de phytohormones dites auxines , est reconnu comme rhizogène et/ou phytogènes (eg. Zahir et al. 2005 ; Ahmed et al. 2008).

Pourtant, la principale revendication concernant les auxines est paradoxalement plutôt négative (Tableau D). Rare sont les demandes de brevets qui revendiquent clairement l'effet phytogène et/ou agronomiquement conséquent des auxines ou de leurs précurseurs métaboliques (US5614467). En effet, les auxines sont plus souvent cibles qu'agents ; l'inhibition de la synthèse, et plus particulièrement du transport intercellulaire et in planta des auxines agit comme herbicide (US6156704 ; JP8283250), ou comme agents capables d'en modifier (+1-) l'ampleur (WO 99/63092 ; EP0646315) (Tableau D) ; Tableau D. W09963092 - 1999-12-09. Root-Specific Protein Involved ln Auxin Transport US6156704 - 2000-12-05. Auxin Transport Inhibitor Compounds JP8283250 - 1996-10-29. Inhibitor Of Auxin EP0646315 - 1998-10-30. Synergistic Herbicidal Compositions Comprising An Auxin Transport Inhibitor And At Least One Other Herbicide And Certain Such Novel Auxin Inhibitors US5614467 - 1995-02-06. Use Of Plante Hormones For Plant Improvement 15 En ce sens, W099/63092 et EP0646315 proposent de réduire la sensibilité de plants OGM confrontés à des auxines et/ou leur dérivés et analogues ; il s'agit vraisemblablement de développer des cultures dites auxin-ready un peu à la façon des cultures RoundUp ReadyTM . US6156704 lui propose non seulement l'action inhibitrice de certains composés 20 halogénés sur le transport des auxines, mais aussi leur action comme enhancer de l'efficacité de certains herbicides. Idem pour ce qui concerne JP8283250, bien qu'ici les inhibiteurs du transport d'auxines sont extraits de semences de maïs germé.

LES INTERACTION DU SQUELETTE CHITOSANIQUE COS ET DES AUXINES 25 L'analogie chimique des LCO avec de simples COS explique probablement pourquoi ces derniers peuvent eux aussi agir sur le métabolisme des non-légumineuses. Selon Mathesius et al (1998), c'est bel et bien le squelette chitique des LCO qui est biologiquement actif, et plus particulièrement celui des pentamères de chitosan. Selon Mathesius et al (1998), ces oligomères - 30 COS et/ou LCO, peuvent, en interférant avec le transport intercellulaire d'auxines favoriser localement leur accumulation histologique et déclencher ainsi une modification de l'épiderme des radicelles, étape initiatrice de la formation des nodules chez les légumineuses. II semble qu'un des effet des LCO ù et donc en principe aussi des COS, est d'inhiber le transport des auxines, -8 provoquant ainsi une déformation très localisée des radicelles, initiant ainsi û chez les légumineuse la formation des nodules (Hirsch et al. 1989). En effet, les Rhizobiacea, ainsi que certains Azospirillum spp. (Bashan 1991), peuvent dépolariser les membranes cellulaires des racines, favorisant ainsi le rapprochement et l'adhésion des cellules BFCP (Müller et al. 2000). Or, il s'avère que cette dépolarisation est effectuée autant par de simples oligomères chitiniques que par des LCO (Müller et al. 2000, Baureithel et al. 1994). Cette interaction COS x auxines est connue depuis au moins 1995 (Rdhrig et al. 1996). Cette interaction implique non seulement des molécules complexes, fragiles et hautement spécifiques comme lesdites LCO, mais aussi de simples oligomères glucosaminiques û et plus généralement COS (Mathesius et al. 1998). En effet, et tel que déjà mentionné, Vue l'analogie chimique entre LCO et leurs plus simples homologues glucosaminiques, il n'est donc pas surprenant que ceux-ci aussi puissent agir comme inhibiteurs du transport d'auxines. Or, selon Zhao (2008) la plante elle-même peut localiser la production endogène d'auxines, d'une part, et d'autre part une éventuelle surproduction de ces auxines est par la suite très rhizogène ( massive roots , superroots sic) ; voire aussi en ce sens Boergan et al (1995) et Kim et al. (2007). Il semble donc que la localisation et le caractère rhizogène des auxines ne soit pas étranger l'un à l'autre. A noter encore une fois que Hirsch et al. (1989) démontrèrent que l'inhibition localisée du transport in planta des auxines précède l'initiation de la nodulation, et que selon Mathesius et al. (1998) cette initiation auxigénique de la nodulation s'apparente à celles des radicelles elles aussi inductibles par de simples oligomères chitosaniques II s'avère aussi que bon nombre de COS les plus actifs sont, comme le leurs confrères lipooligosacchariques (LCO), de quadra- ou pentamères, voire des hexamères (Staehelin et al. 1994, Baureithel et al. 1994, Müller et al. 2000 et Schlaman et al. 1997).

Enfin, outre leur similitude chimique, certains gènes et enzymes impliqués dans le métabolisme des LCO, dits aussi facteurs Nod le sont aussi dans celui des simples COS (Staehelin et al. 1994, Bolier 1995, Kafetzopoulos et al. 1993, Tsigos et al. 2000). Mieux, selon les données de Muller et al (2000), et Baureithel et al (1994) de simples oligomères de chitosan sont vraisemblablement plus spécifiquement capables d'éliciter des mécanismes moléculaires bénéfiques chez les non - légumineuses qu des LCO produites par des Rhizobiacea. Pour faire simple, c'est bel et bien le squelette ( backbone ) glucosaminé des COS qui est phytoactif, bien que ceux des LCO û du fait de leurs raffinement et leur spécificité, est a priori appréciablement plus efficace sur légumineuse que celui des simples COS, doit de l'ordre d'une efficacité pondérale de 100 fois plus (voir les données de Mathesius et al. 1998 et Schlaman et al. 1997) ; les fioritures et décorations lipidiques des facteurs Nod (LCO) semblent contribuer surtout à leurs spécificités à l'égards de certaines espèces de légumineuses etlou faciliter leur transport trans-membranaire (Schlaman et al. 1997).

DEFINITIONS

Agents azoto-nutritionnel (ANN) : molécule facilitant l'entrée de l'azote dans le cycle de la synthèse des protéines via la stimulation de la nitrate réductase et/ou de la glutamine synthétase. Les ANN peuvent être de simples acides aminés, eg. acide glutamique, ou glucidiques, eg. divers polysaccharides extraits d'algue, notamment. Biofertilsants : il s'agit de matières fertilisantes comportant des microorganismes pouvant favoriser la croissance des plantes, et/ou de simples molécules û chimiquement assez simple par définition (eg. oligoéléments, acides aminées, sucres simples ou osides, capable de stimuler l'activité et l'efficacité agronomique relative de tels microorganismes par rapport à des parcelles témoins non-traitées. Plus particulièrement, les biofertilisants dits azotobactériens comprennent une certaine quantité de bactéries de la famille des Azotobacteracea. Chitine (CHT) : sucre aminé, polysaccharide d'acétylglucosamine (Poly N-acétyl-D-glucosamine, (3-(1,4)-2-Acétamido-2-désoxy-D-glucose) reliés entre eux par une liaison du type [3-1,4. Associé à de carbonate de calcium, la chitine est un des constituants de la cuticule des insectes et des araignées, des crustacés, des animaux à coquille et de la paroi des champignons. Le nom chimique de la molécule est Poly N-acétyl-D-glucosamine, R-(1,4)-2-Acétamido-2-désoxy-D-glucose Chitosan : polysaccharide composé de la distribution aléatoire de D-glucosamine liée en R-(1-4) (unité désacétylée) et de N-acétyl-D-glucosamine (unité acétylée) produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine. Chito-oligosaccharides (COS) : Fait ici référence aux Squelettes composés de polysaccharide et dérivé de la chitine comportant donc des résidus faits de groupes d'acétylglucosamine (N-acétyl-glucosamine) reliés entre eux par une liaison du type (3-1,4. Le chitosan est donc un COS.

Lipo-chito-oligosaccharide (LCO) : idem au COS, mais comportant une décoration lipidique lui permettant de spécifier la relation plante / Rhizobiacea ; aussi facteurs Nod, principaux déterminants de la spécificité d'interaction entre les deux partenaires menant à la création de nodosités effectives. Auxines : L' auxine naturelle ou acide indole acétique est une hormone végétale qui stimule la croissance de la plante. Elle est fabriquée dans l'extrémité supérieure des végétaux, dite Apex, par un acide aminé, le Tryptophane. Résidosphère (ou résidusphère) : Volume ou zone du sol entourant immédiatement les résidus de culture pailleux, engrais organominéraux et/ou biomasses racinaires résiduelles, et plus ou moins influencé par ceux-ci. Il est aussi question d'un noyau où se situe la décomposition desdits résidus de culture. A noter que les microorganismes responsables de la décomposition occupent généralement moins de 5% de l'ensemble de l'espace disponible dans le sol et sont particulièrement présents dans la résidusphère. Support organique non-bactéricide : Comprend ici toute les matières ou mélanges organiques non-bactéricide pouvant véhiculer des biomasses microbienne, azotobactériennes en particulier, vers la rhizosphère, ou du moins en proximité des racines et radicelles. Plus spécifiquement, il s'agit de résidus de culture pailleux au sol, de certaines engrais organo-minéraux, de semences (azoto)bactérisées par pelliculage, voire même certaines forme de biomasses racinaires résiduelles. -9- DIVULGATION DE L'INVENTION

Problème technique Le problème technique provient de l'utilisation actuelle des LCO comme biostimulant, avantageusement lors de la biofertilisation de grandes cultures non-légumineuses ; celle-ci est vraisemblablement trop coûteuse du fait des faibles rendements bioindustriels nécessaires à leur production. L'utilisation d'un simple analogue, non décoré de LCO û des oligomères de chitosan, ou plus simplement de chito-oligosaccharide (COS), est en principe moins coûteuse du fait de la relative abondance naturelle de la chitine, leur précurseur. Cependant, du moins entant que matière fertilisantes, ces COS ne sont pas aujourd'hui véritablement efficaces en agronomie, ou du moins pondéralement rentables. De plus, les LCO généralement préconisés le sont entant que traitement de semence et/ou en application foliaire ; ces pratiques culturales sont généralement inadéquates pour la biofertilisation û azotobactérienne plus particulièrement, des grandes cultures non û légumineuses. Le problème consiste donc à trouver une façon de rendre des simples oligomères COS, des pentamères par exemple, plus pondéralement efficace de façon à rentabiliser leurs utilisations comme matières fertilisantes en agronomie, et plus particulièrement pour la (bio)fertilisation des grandes cultures non-légumineuses. En d'autres mots, il s'agit de trouver une alternative biofertilisante aux applications foliaires et semencières actuels des LCO d'origine Rhizobiacea, l'application de ces molécules fragiles et coûteuse aux grandes cultures non-légumineuses étant particulièrement inadéquate. Accessoirement, le lien qui existe entre la présence immédiate de simples oligomères chitosanique (COS) et/ou des glycolipides, y compris donc lesdits LCO Rhizobiacea, d'une part, et d'autre part l'action des auxines est probablement plus facilement (lire : économiquement) valorisable sur grandes cultures non-Leguminosea que l'utilisation directe de LCO Rhizobiacea plus complexes, fragiles et foncièrement spécifiques. L'utilisation de doses par hectare relativement massives de simples COS par rapport à celles préconisée pour les LCO est probablement plus avantageuse. Encore faut-il savoir comment valoriser cette action plus générale û i.e. moins spécifique à l'égard des Leguminosea, des oligomères COS. En d'autre mots ; le problème technique consiste aussi à trouver comment rendre de simples COS dérivés de la dégradation microbienne de la chitine, avantageusement in situ, pondéralement et molairement aussi efficace que les LCO pourtant beaucoup plus raffinés, complexes et coûteuses à produire.

Solution technique La présente invention stipule que la séquestration des auxines exogènes prélevées par la plante au niveau racinaire favorisera une certaine rhizogénie, voire parfois une germination plus rapide, qui ce traduira par une augmentation de la matière sèche des parties aériennes (MSPA) produites par la plante. II s'avérera que cette séquestration est en partie attribuable à l'action combinée des oligomères chitosaniques (COS) issus de la dégradation de la chitine in situ et de -10- -11-

l'action d'auxines exogènes produites par les biomasses (azoto)bactériennes dans la résidusphère et/ou la rhizosphère. A noter que les pentamères élémentaires des peptidoglycans bactériens sont structurellement analogues aux pentamères chitosaniques issue de l'hydrolyse de la chitine, et donc structurellement similaires aux LCO penta- / hexamèriques les plus actif et spécifiques au Leguminosea, du moins pour ce qui concerne la structure de leurs squellet glucosamine. Or, si nous ne recherchons pas nécessairement une action spécifique aux Leguminosea, et/ou si la solubilité desdits squelettes glucosaminiques peut être assuré par l'ajout de simples adjuvants ou en modifiant que légèrement sa structure, l'utilisation agro-industrielle de LCO sur culture non - légumineuses est probablement surfaite et non-rentable entant que matière fertilisante pour grandes cultures non-légumineuses. Il est maintenant proposé que l'apparition in situ d'oligomères IV, V ou VI de chitooligosaccharides (COS) peut être simplement induite par un apport de chitine (CHT) peu ou pas raffinée au lieu du chitosan dont la durée de vie, du fait même de l'activité des chitinases du sol est probablement très limitée. Or, il est reconnu que la chitine incorporée au sol, ou mise en présence de microorganismes du sol û y compris donc ceux de la résidosphère, subit rapidement une dégradation et/ou du coup une certaine déacétylation ; de ce métabolisme in situ de la chitine (CHT) provient des oligomères chito-oligosaccharides (COS). Or, nous avons observé qu'en présence de BFCP particulièrement bien adaptées à la vie dans les sol û au sens de FR 01/15542, productrices d'auxines in situ et disposées dans la résidusphère en proximité des racines de cultures non - léguminoseuses, l'utilisation d'un certain co-formulant à base de CHT provoque bel et bien un accroissement de la biomasse racine et aérienne de plantules tests. Cet accroissement est vraisemblablement attribuable à une accumulation extraordinaire d'auxine dans les racines approximativement aux endroits où les résidusphères - i.e. les résidus de culture pailleux au sol une incorporés à la couche arable du sol, sont les plus riches en biomasses azotobactériennes. Nous avons aussi remarqué que l'apport conjoint de précurseurs métaboliques d'auxines, le tryptophane (TRP) notamment, permet d'amplifier cet effet rhizogénique des chito-oligosaccharide, ou COS. En principe, l'invention consiste donc en la mise en présence de biomasses azotobactériennes biofertilisantes et productrices d'auxines, d'une combinaison de précurseurs métaboliques d'auxines, notamment le tryptophane TRP, et - fait nouveau, de certains COS dérivés de CHT et expressément destinés à inhiber le transport des auxines ainsi produites par les biomasses azotobactériennes ; c'est cette accumulation qui provoquerait la densification racinaire et l'augmentation de la biomasses aérienne produite conséquemment.

Ces oligosaccharides û COS et/ou LCO le cas échéant, sont en principe capables d'amplifier l'action rhizogénique des auxines en les séquestrant au niveau des racines. Or, si cette séquestration est très localisée, comme c'est le cas avec les LCO Rhizobiacea, l'effet rhizogénique sera d'atant plus prononcé et spécifique, notamment au membre de la famille Leguminosea. Si la séquestration des auxines, par voie d'inhibition de leur transports intercellulaire, est moins localisée, qu'au niveau de l'ensemble des racines par exemple (Figure 1), l'effet rhizogénique sera - 12 -

plus diffus, moins prononcé et, fait notable ici, moins spécifique, un peu comme le sont les effets de la plupart des hormones végétales. C'est cet effet, pseudo-hormonal des oligosaccharides COS, qui nous intéresse ici, et cela précisément du fait de sa non - spécificité. La solution technique proposée consiste donc en une combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS), et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non-légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racine et radicelles des dites cultures. Lesdits supports organiques non-bactéricides permettent de véhiculer CHT, TRP et sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organo-minéral, voire des semences de grandes cultures et/ou de cultures fourragères Graminae et/ou Brassicacea. Le traitement des résidus de culture pailleux au sol, avantageusement via l'apport de bactéries de la famille des Azotobacteracea biofertilisants est avantageusement effectué selon l'approche de Claude et Fillion (2004), tandis que lesdits engrais starter organo-minéraux peuvent être fabriqués selon FR06/00014 et utilisés selon l'approche décrite dans Claude et Giroux (2006). Dans le cas du traitement des résidus de culture pailleux au sol selon - par exemple, Claude et Fillon (2004), le CHT est impérativement préalablement combiné à une fermentation à l'état solide û avantageusement selon FR 06/00014 et conditionnée selon FR 05/05753, permettant la production desdites bactéries de la famille des Azotobacteracea et la libération des COS avant la pulvérisation de ce mélange COS - Azotobacteracea ; le TRP peut lui être appliqué conventionnellement par simple pulvérisation liquide d'une bouillie. Dans le cas du traitement d'engrais starter organominéraux non-bactéricide selon Claude et Giroux (2006), l'incorporation de la CHT et du TRP ce fait directement dans pré-mélange en prévision de la formation des granules, avantageusement selon le protocole décrit dans FR 06/00014. Enfin, le pelliculage des semences de grandes cultures ou de cultures fourragères Graminae et/ou Brassicacea ce fait de façon conventionnelle selon les règles de l'art. La dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement 10 g, tandis que la dose-hectare de CHT est comprise entre 10 et 1 000 g, plus particulièrement entre 250 et et 500 g, et préférablement 300 g. A noter que les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus. Il est loisible d'apporter auxdits supports organiques et non-bactéricides des bactéries biofertilisantes viables de la famille des Azotobacteracea (AZB) û correctement formulées et conditionnées à cet effet selon les règles de l'art et avantageusement obtenues selon le protocole décrit dans FR01/15542 ; ces apports desdites bactéries Azotobacteracea (AZB) auxdits supports organiques comportent entre 1 et 10 x 1012 cellules Azotobacteracea par hectare, préférablement 5 x 1012 cellules par hectare. II s'agit donc de biofertilisants pour grandes cultures et cultures intermédiaires pièges à nitrates non-légumineuses comprenant le traitement de supports organiques non-bactéricides avec un précurseur métabolique d'auxines phytogènes, - 13 -

avantageusement du TRP, d'un co-formulant chitinique tel que la CHT, voire et avantageusement un inoculum azotobactérien (AZB).

Avantages apportés 5 Du fait de la relative abondance naturelle de la chitine, précurseur habituel du chitosan et de COS, le prix de revient des préparations chitiniques au sens de la présente invention est nécessairement plus faible que celui de préparations à base de LCO Rhizobiacea. Du coup, les dose-hectare d'oligomères COS physiologiquement actifs peuvent être plus importantes et, 10 notamment en présence de précurseurs d'auxines, plus conséquentes. En effet, faute d'assurer une production massive et continuelle d'LCO par des BFCP Rhizobiacea, des apports appréciables d'oligomères glucosaminiques (COS) correctement déacétylés et somme tout beaucoup moins coûteux que des LCO, peuvent être effectués économiquement. Les préparations TRP-CHT au sens de la présente invention sont non spécifiques, du fait 15 de leur simplicité moléculaire par rapport aux LCO Rhizobiacea, et peuvent donc en principe être appliqués plus librement à l'ensemble des grandes cultures non-légumineuses. Lesdits oligomère COS dérivés de CHT sont aussi, du fait de leurs relatives simplicités moléculaires, plus robustes et donc dégradés moins rapidement in situ ; leurs délais de conservation seront vraisemblablement plus important aussi. 20 Enfin, ces préparation TRP-CHT amino-chitiniques sont facile à utilisés ne nécessitant ni application foliaire, ni traitement de semence, pratiques culturales parfois préjudiciables au développement de la biofertilisation bactérienne pour grande cultures non-légumineuses du fait de leurs coûts et contraintes particulières (compatibilité avec les microorganismes, justification des passages pulvérisateur dédiés, etc.). Au contraire, les co-formulations CHT-TRP û 25 avantageusement en présence de bactéries biofertilisantes de la famille des Azotobacteracea, sont préconisées pour le traitement des résidus de culture au sol, des engrais organominéraux (EOM) û engrais starter et fumure de fond compris, voire éventuellement des biomasses racinaires résiduelles lors de la rénovation des prairies anciennes. Cette valorisation de tels substrats carbonés résiduels et non-bactéricides permet d'affranchir lesdites biomasses azotobactériennes 30 du flux photosynthétique de la plante, la ponction de ce flux par d'éventuelles BFCP rhizosphériques s'avérant à terme contreproductive en terme de rendements agronomiques. C'est l'amplification de l'effet des auxines par les oligomères COS qui permet d'améliorer l'efficacité pondérale de ces derniers. Sans cette plus grande efficacité pondérale de la simple chitine et de ses dérivés in situ, les quantités et les coûts associés à sont utilisation pour la 35 biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses deviendraient rapidement prohibitifs. En ce sens, le simple mélange CHT-TRP permet d'améliorer l'efficacité pondérale et molaire de CHT à un niveau comparable à celui des LCO - pourtant beaucoup plus complexes, raffinés, spécifiques et coûteux, soit d'environs 10-6f-7 M à moins de 10-8f-9 M. -14-BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS ET FIGURES

Figure 1 a) En absence d'oligomère COS provenant de CHT au sens de l'invention, les auxines, produites par les BFCP à partir de TRP sont prélevées et métabolisées par l'ensemble de la plante ; leurs actions sont ainsi dilués et localement moins appréciables. Figure 1 b) La présence de CHT dans la formulation permet d'inhiber ce transport hors des racines ; l'effet rhizogène est ainsi amplifié au profit de l'implantation des jeunes plants. Figure 2. Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum Lam. produite lors deuxième coupe c2 (56 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise de traitement de semence. Figure 3. Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 I pot) du Lolium multiflorum Lam. produite lors première coupe cl (28 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux. Figure 4. Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum Lam. produite lors première coupe cl (28 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitements avec de tels résidus sont indiqués ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués. Figure 5. Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum Lam. produite lors deuxième coupe c2 (56 jps) selon la présence du TRP etlou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués. Figure 6. Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum Lam. produite lors troisième coupe c3 (84 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués. Figure 7. Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum Lam. produite par l'ensemble des coupes cl, c2 et c3 (c123) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués.

MODE DE RÉALISATION PRÉFÉRÉ DE L'INVENTION

Un mode préféré de réalisation de l'invention consistera à introduire dans un réceptacle de fermentation modulaire, par exemple tel que décrit dans FR05/05753, un mélange pour la fermentation à l'état solide comprenant 750 g de résidus cellulosiques hachés finement broyé (1 mm), avantageusement provenant de résidus de culture au sol non-stériles de façon à assurer la présence de champignons cellulosiques, et de 100 g de chitine pure pulvérisée. Si lesdits résidus cellulosique ne sont pas des résidus de culture au sol, il faudra non seulement les inoculer avec un champignon cellulosique mais aussi leurs apporter un complément oligoélémentaire nutritif, - 15 -

avantageusement une solution Hogland sans N. L'humidité des susdits mélange fermentatifs est portée à environs 50%. Afin d'accélérer le processus de fermentation, des suces simples à 1% p/p peuvent aussi être apportés aux dits mélanges. Cette fermentation à l'état solide, en plus de permette une multiplication cellulaires des biomasses azotobactériennes û du fait d'un rapport C/N très élevé des résidus cellulosiques, permettra aussi la transformation enzymatique de la chitine en COS de 4 à 6 résidus, avantageusement 5, en principe les les plus phytogènes. Vu le nombre de cellules azotobactériennes produites, soit environs 1010 par g de mélange fermentatif, ce mélange contiendra à terme suffisamment de cellules bacatériennes viables pour bactériser (inoculer) un hectare de résidus de culture pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver, et cela û par exemple, au sens de Claude et Fillion 2004. Dans le cas d'une grande culture non-légumineuse de printemps pouvant bénéficier d'un engrais de démarrage (starter), une dose de chitine de l'ordre de 500 g peut être intégrée directement à un engrais organo-minéral (EOM) granulé pouvant maintenant servir à biofertilisation, et cela avantageusement tel que décrit dans Claude et Giroux 2006 et FR06/00014.

Cette surdose de chitine - i.e. par rapport aux 100 g préconisés pour les susdits mélanges fermentatifs, est loisible du fait d'une transformation de celle-ci en COS plus lente et moins contrôlée. Enfin, dans le cas de semences de grandes cultures et/ou de cultures fourragères Graminae et/ou Brassicacea le pelliculage desdites semences ce fait conventionnellement selon 20 les règles de l'art. Pour faire simple ; le mode préféré de réalisation de l'invention doit pouvoir assurer une concentration immédiate et minimale de 1 nano-mole (nM, ou 10-9 M) de COS en proximité des résidus de culture pailleux au sol au sens de Claude et Fillion 2004, et/ou desdits EOM au sens de Claude et Giroux 2006. A noter que cette concentration minimale est plus faible que celle rapporté 25 par Mathesius et al 1998 pour de tels COS. Concrètement, en supposant un poids moléculaire de 750 pour un pentamère de COS, il faudra 7,5 g de COS pour traiter 10' g de résidus de culture au sol. Économiquement et techniquement, il est loisible d'apporter environs 100 g de chitine par kg du susdit mélange fermentatif ; produire ainsi lesdits 7,5 g de COS à partir de ces 100 g de chitine implique un taux de transformation de l'ordre de 12 à 15%. 30 Ce taux de transformation de la chitine en COS est vraisemblable. Par exemple, De Boer et al. 1999 mentionnèrent des taux de disparition in situ (sol et sables) de la chitine û et donc logiquement d'apparition de COS, de l'ordre de 60 à 75% sur quelque semaines. À cette concentration (nM) de simples COS sont normalement pas, ou à peine, phytogènes (voir Mathesius et al. 1998), et c'est donc l'interaction entre l'action restrictive des COS ainsi produits 35 localement in situ avec une dose de tryptophane de l'ordre de 25 à 50 g par hectare, et par û 10' g de résidus de culture au sol, sur le transport des auxines qui permet la réalisation de l'effet phytogène, voire agronomque, recherché. A comparer donc avec les quelques centaines de kg de chitine préconisés par France Chitine. La pulvérisation liquide des résidus de culture au sol et/ou des granules organo-minérales 40 peut donc avantageusement comporter une dose-hectare (dose-hectare) de bactéries favorisant la - 16 -

croissance des plantes (BFCP) azotobactériennes bien adaptées à la vie dans les sols arables au sens de FR 01/15542. En principe, ces bactéries sont déjà présentes dans les sols arables mais leurs concentrations à la surface des susdits substrats carbonés (i.e. résidus de culture au sol ou engrais organo-minéraux, cf. Claude et Fillion 2004 et Claude et Giroux 2006)) peut contribuer à améliorer l'efficacité de l'invention. Enfin, la préparation peut aussi être appliquée à semences Graminae fourragères en présence des susdites matières organiques résiduelles et/ou de biomasses racinaires résiduelles. De plus, étant donné que le chitosan au sens de la présente invention permet d'amplifier l'effet des auxines produites par les BFCP à partir de tryptophan (TRP), il est loisible d'apporter comme co- formulant une certaine dose de TRP, avantageusement d'environs 10 g par hectare. Encore une, a noter que bien que en principe les BFCP azotobactériennes productrices d'auxines peuvent obtenir ce TRP précurseur à même les réserves du sol, il est néanmoins avantageux d'inclure du TRP dans la formule.

APPLICATIONS BIOINDUSTRIELLES ET AGRONOMIQUES L'invention est susceptible d'être appliquée au secteur agronomique, soit via (i) un traitement de semences, (ii) une azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol (Claude et Fillion 2004) et/ou (iii) un engrais organo-minéral (EOM) intégrant avantageusement une biomasse azotobactérienne (Claude et Giroux 2006). Nous avons donc trois supports (vecteurs) selon les modalités suivantes ; - Témoins sans support (hormis le cas des semences comme de raison) - Support seul - Support avec l'équivalent de 10 g TRP / ha - Support avec l'équivalent de 100 g CHT / ha - Support avec TRP et CHT

(i) l'invention comme traitement de semence Graminae : A 100 g de semences de Lolium multiflorum Lam. nous avons ajouté 8 g de charbon activé enrichis, 0.08 g de TRP le cas échéant, et/ou 8 g de CHT, soit l'équivalent pour une dose-hectare de semence Graminae de 25 kg d'envions 2 kg de charbons et/ou de CHT et 20 g de TRP, soit des quantités abordables et mécaniquement opérables. La composition du charbon activé enrichis obtenu d'Ajinomoto Foods Europe (AFE), Nesle, France est rapportée au Tableau E. Nous avons disposé les quatre modalités au sein d'un dispositif expérimental en carré latin 4 x 4 constitué de pots de 1 L contenant chacun 500 g de sol reconstitué et tamisés à 5 mm ; l'analyse physico-chimique du sol utilisé est au Tableau F. A la surface de chaque pot 2,5 de semence ù plus les susdits coformulants est matières actives, sont saupoudrés et recouverts de 5 g de sables siliceux. Lors de l'irrigation des pots, aucune fertilisation n'est apportée au semis question de bien assurer le prélèvement complet des éventuels reliquats d'azote minéral (Nm). À et cependant, soit 28 jours post-semis 35 mg N-NO3NH4 / kg sol sont apportés à même une solution nutritive dont la composition et le mode de préparation est rapportée au Tableau G. - 17 - Tableau E : Quelques caractéristiques physico-chimiques des charbons enrichis d'AFE Unités g/kg g/kg g/kg g/kg

g/kg g/kg g/kg g/kg mg/kg mg/kg mg/kg g/kg mg/kg mg/kg sec 1000 447,0 28,0 1,10 16,0 6,8 0,9 0,2 0,4 1,6 1,60 <8,5 12,00 0,51 22,00 0,50 1800 Paramètres analysés Matières Sèches (MS) Carbone Organique total (COT) Azote total (NtK) Azote ammoniacal (N-NH4) Rapport C/N pH eau Calcium total(CaO) Magnesium total (MgO) Phosphore total (P205) Potassium total (K20) Bore total (B) Cobalt (Co) Cuivre (Cu) Fer (Fe) Manganèse (Mn) Molybdene (Mo) Zinc (Zn) brut 418 186,8 11,7 0,5

0,4 0,1 0,2 0,7 0,7 <3,5 5,0 0,2 9,2 0,2 75 10 15 Tableau F : Analyse physico-chimique du sol alsacien utilisé CEC (cmol) 121 pH 6,7 MO (%) 1,84 P205 (Dyer) 0,190 P205 (Joret-Hebert) 0.069 Texture A-L-S (g/kg-sol) 218-673-84 K20 (g/kg-sol) 0,12 MgO (glkg-sol) 0,16 CaO (g/kg-sol) 3,2 Na2O (g/kg-sol) 0,025 Fe (mg/kg-sol) 73,3 Mn (mg/kg-sol) 28,7 Zn (mg/kg-sol) 2,8 Cu (mg/kg-sol) 2,5 B (mg/kg-sol) 0,44 20 TABLEAU G : PREPARATION DES SOLUTIONS NUTRITIVES AVEC ET SANS N Quatre solutions molaires (1M) pour les apports de N1P/K1S/Mg ; 1. Ca(NO3)2.4H2O 236.1 g/1 2. KNO3 101.1 g/I 3. KH2PO4 136.1 g/1 25 4. MgSO4.7H2O 246.5 g/I Deux solutions oligo-élémentaire, soit pour 1 L ; H3BO3 2.8 g MnCl2.4H20 1.8 g ZnSO4.7H20 0.2 g 30 CuSO4.5H2O 0.1 g, et, le cas échéant, NaMoO4 0.025 g (Nb. Il est nécessaire de préparer deux solutions oligo-élémentaires, l'une avec et l'autre sans Mo.) Une solution de Fe-EDTA ; 10.4 g EDTA.2Na 35 7.8 g FeSO4.7H2O 56.1 g KOH ... pour I L de KOH, ajuster à pH 5,5 avec de l'acide sulfurique, et ajouter l'EDTA.2Na et le FeSO4.7H20 Pour prépare 1 L de solution nutritive, dite de Hoagland , à l'aide de ces solutions de base, les 40 combiner dans les proportions suivantes ; 7 ml Ca(NO3)2 5 ml KNO3 2 ml KH2PO4 2 ml MgSO4 45 1 ml oligo-éléments (avec ou sans Mo) 1 ml FeEDTA, ,.. QSP 1 L eau demineralisée Les quantités (ml) de solution nutritive à apporte par pot dépendra comme de raison de la dose N-P recherchée, ainsi que de la quantité de sol par pot. -18-

(ii) l'invention lors de l'azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol : Dans des pots de 1 L, 500 g du susdit de sol reconstitué est mélangé à 1% p/p de résidus pailleux traités selon chacune des susdites modalités. 2,5 g de semences non-traitées de Lolium multiflorum Lam. sont déposées à la surface du sol reconstitué, puis recouvertes de 5 g de sable siliceux. Lors de l'irrigation des pots, aucune fertilisation n'est apportée au semis question de bien assurer le prélèvement complet des éventuels reliquats d'azote minéral (Nm). À et cependant, soit 28 jours post-semis (jps) 35 mg N-NO3NH4 / kg sol sont apportés à même un solution nutritive dont la composition est rapportée en annexe. L'irrigation des plants ce fait avantageusement par le bas en apportant uniformément une certaine quantité d'eau aux soucoupes sur lesquelles reposent les pots. Une première coupe (cl) peut intervenir dès 28 jours post-semis (jps), et avantageusement une deuxième coupe (c2) peut être pratiquée 56 jps. Les matières sèches des parties aériennes (MSPA) peuvent alors servir d'indice phytogène Comme nous pouvons le voir aux Figures 3, 4, 5 et 6, et cela contrairement à l'application de l'invention sur semences, les apports simples de TRP et d CHT sont contreproductifs en terme de MSPA produites à 28 (Figures 3 et 4), voire à 56 (Figures 5 et 6) jps. Sur résidus de culture pailleux au sol, cette contreproductivité est vraisemblablement attribuable à une suractivité ponctuelle de la microflore résidosphérique du fait de la présence de ces deux molécules pouvant agir comme substrat carboné pour ladite microflore. Cela dit, dès c2, l'azote diatomique réduit provenant de la susdite suractivité de la microflore résidosphériques (et azotobactérienne nécessairement) peut maintenant être re-largué contribuant d'autant plus à l'interaction positive entre CHT et TRP. Cette contribution expliquerait pourquoi û et cela au lieu de l'habituelle ponction du flux photosynthétique par les BFCP rhizosphériques, la MSPA est relativement û par rapport aux témoins sans résidus de culture pailleux et aux témoins avec apports simples de CHT ou TRP, plus élevés en présence de TRP et CHT. Sur semence, les substrats carbonés étant moins abondants, notamment jusqu'à cl 28 jps et/ou avant l'implantation de la rhizosphère et de son exsudation de C, cette suractivité n'est pas véritablement détectable. A noter aussi que les charbons activés (enrichis) d'AFE sont probablement une certaine valeur fertilisante du fait qu'ils contiennent des résidus organiques et aminés issus de la production d'acide glutamique par Corynebacterium. La simple chitine (CHT), une fois partiellement dégradée in situ ou in vitro, en amplifiant l'effet phytogène du tryptophane (TRP) permet d'atténuer la sur-compétitivité des bactériens en proximité des résidosphères induite par l'application de tels substrats lors de la valorisation microbiologique des résidus de culture au sol. Sur résidus de culture au sol, la présence de chitine (CHT) ou de tryptophane (TRP) provoque vraisemblablement une sur-immobilisation d'N minéral (Nm) au dépends de la MSPA produite. Cela dit, l'action auxinogène de la chitine au sens de la présente invention permet visiblement de compenser pour cette sur-immobilisation et de rétablir ainsi au niveau témoins la production de MSPA. Cette double application de la chitine et du tryptophane aux résidus de culture pailleux au sol permettra d'atténuer l'effet dépressif d'une -19- valorisation azotobactérienne desdits résidus de culture (pailleux) au sol, tout en permettant un captage effectif des reliquats d'Nm à l'automne et donc un certain rationnement végétatif des plantules au profit de leurs potentiels de rendements (Debaecke et la. 1996).

Or, contrairement à une application aux résidus de culture au sol, le tryptophane appliqué sur semences n'est pas facteur de sur-compétitivité des bactéries du sol ù faute de substrat carboné suffisant ; la chitine avec le tryptophane permet même à ce dernier d'avoir un effet détectable par rapport aux témoins, ce qui n'est pas le cas avec les applications simples de chitine ou de tryptophane. Sur semences, la présence de chitine ou de tryptophane ne provoque pas une telle sur-immobilisation apparente d'Nm, vraisemblablement du fait d'une moins grande abondance de substrat carboné immédiatement assimilable par les bactéries du sol en proximité desdites semences ; l'interaction de ces substances provoque néanmoins un effet phytogène détectable. En ce sens, l'invention est aussi applicable entant que traitement de semences de grandes cultures non-légumineuses bien qu'elle risque du coup d'être moins valorisée.

Références, bibliographie et brevets pertinents Ahmad, Rizwan, Azeem Khalid, Muhammad Arshad, Zahir A. Zahir And Tariq Mahmood. 2008. Effect Of Compost Enriched With N And L-Tryptophan On Soil And Maize Agronomy For Sustainable Development 28 (2) 299-305 (2008) Bashan, Y. 1991. Changes in membrane potential of intact soybean root elongation zone cells induced by Azospirillum brasilense. Cari. J. Microbiol. 37 : 958-963. Baureithel, Karl, Georg Felix, And Thomas Boll. 1994. Specific High Affinity Binding Of Chitin Fragments To Tomato Cells. THE Journal Of Biological Chemistry. Vol. 269, No. 27, Pp, 17931-17938, 1994 Bell, A. A., Hubbard, J. C., Liu, L., Davis, R. M., And Subbarao, K. V. 1998. Effects Of Chitin And Chitosan On The Incidence And Severity Of Fusarium Yellows ln Celery. Plant Dis. 82:322-328. Benhamou, N. 2004. Potential Of The Mycoparasite, Verticillium Lecanii, To Protect Citrus Fruit Against Penicillium Digitatum, The Causal Agent Of Green Mold: A Comparison With The Effect Of Chitosan. Phytopathology 94:693-705. Boerjan, Wout, Maria-Teresa Cervera, Marianne Delarue, Tom Beeckman, Walter Dewitte, Catherine Bellini, Michel Caboche, Harry Van Onckelen, Marc Van Montagu, And Dirk Lnzé. 1995. Superroot, A Recessive Mutation ln Arabidopsis, Confers Auxin Overproduction. The Plant Cell, Vol. 7, 1405-1419, September 1995 0 1995 American Society Of Plant Physiologists Baller, Th. Chemoperception Of Microbial Signais ln Plant Cells. 1995. Ann. Rev.Plant Physiol..46.'189-214 Claude, P-P. Et L. Fillion. 2004. Effet De L'apport D'un Inoculum Bactérien Aux Résidus De Culture De Maïs-Grain Au Sol Sur Le Rendement Et La Qualité De Blés D'hiver Panifiables En France. Agrosol (Depuis Agrosolutions ) 15(1) :23-29. Claude, P-P. Et M. Giroux. 2006. Effet Des Engrais Organo ù Minéraux Inoculés (EOMI) Sur La Croissance Des Plants De Maïs - Grain, Les Rendements, Les Prélèvements Des Éléments Nutritifs Et La Qualité Des Grains. Agrosolutions 17(1) : 51-64.

Debaeke, Ph., M Cabelguenne ML Casals et J Puech 1996. Élaboration du rendement du blé d'hiver en conditions de déficit hydrique. II. Mise au point et test d'un modèle de simulation de la culture de blé d'hiver en conditions d'alimentation hydrique et azotée variées : Epiephase-Blé. Agronomie 16:25-46 De Boer, W., S. Gerards, P.J.A. Klein Gunnewiek Et R. Modderman. 1999. Response Of The Chitinolytic Microbial Community To Chitin Amendments Of Dune Soils Biol Fertil Soils (1999) 29 :170ù177 De Jong, Anke J., Renze Heidstra,' Herman P. Spaink,B Marijke V. Hartog,' Ellen A. Meijer,' Theo Hendriks,' Fiorella Lo Schiavo,C Mario Ab Van Kammen,' And Sacco C. De Vries. 1993. Rhizobium Lipooligosaccharides Rescue A Carrot Somatic Embryo Mutant. The Plant Cell, Vol. 5, 615-620, June 1993 0 1993 American Society Of Plant Physiologists D'Haeze, W. Et N. Hoisters. 2002. Nod Factor Structures, Responses, And Perception During Initation Of Nodule Development. Glycobiology 12 : 79R-105R. HIRSCH, A. M., T, T. V. Bhuvaneswarit, J. G. TORREY, AND T. BISSELING. Early Nodulin Genes Are induced In Aifalfa Root Outgrowths Elicited By Auxin Transport Inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 86, Pp. 1244-1248, February 1989 Kafetzopoulos, Dimitris T, George Thireos*, John N. Vournakist, And Vassilis Bouriotis. 1993. The Primary Structure Of A Fungal Chitin Deacetylase Reveals The Function For Two Bacterial Gene Products (Mucor RouxulChltosan/NodblPeptidoglycan Deacetylase). Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90, Pp. 8005-8008, September 1993 Kim, Jeong lm, Altanbadralt Sharkhuu, Jing Bo Jin, Pinghua Li, Jae Cheol Jeong, Dongwon Baek, Sang Yeol Lee, Joshua J. Blakeslee, Angus S. Murphy, Hans J. Bohnert, Paul M. Hasegawa, Dae-Jin Yun, And Ray A. Bressan. 2007.

Yucca6, A Dominant Mutation In Arabidopsis, Affects Auxin Accumulation And Auxin-Related Phenotypes. Plant Physiology, November 2007, Vol. 145, Pp. 722ù735 -20- Lambrecht, M., Yaacov Okon, Ann Vande Broek And Jos Vanderleyden. 2000. Indole-3-Acetic Acid: A Reciprocal Signalling Molecule ln BacteriaùPlant Interactions. TRENDS IN MICROBIOLOGY 298 VOL. 8 NO. 7 JULY 2000 Mathhesius, U., H.R.M. Schlaman, H.P. Spaink, C. Sautter, B.G. Rolfe Et M.A. Dkordjevic. 1998. Auxine Transport Inhibition Precedes Rott Nodule Formation ln Whte Clover Roots And Is Regulated By Flavonoids And Derivatives Of Chitin Oligosaccharides. The Plant Journal 14 : 23-34. Müller, Joachim, Christian Staehelin, Zhi-Ping Xie, Gabriele Neuhaus-Uri, And Thomas Bolier.. Nod Factors And Chitooligomers Elicit An Increase ln Cytosolic Calcium ln Aequorin-Expressing Soybean Cellsl. Plant Physiology, October 2000, Vol. 124, Pp. 733ù739, Osuji, Godson 0. Et Raul G. Cuero. 1992. Regulation Of Ammonium Ion Salvage And Enhancement Of The Storage Protein Contents Of Corn, Sweet Potato, And Yam Tuber By N-(Carboxymethyl)Chitosan Application. J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 724-734. Prithivirajæ, B., X. Zhou /E A. Souleimanov W.M. Kahn et D.L. Smith. 2003. A Host-Specific Bacteria-To-Plant Signal Molecule (Nod Factor) Enhances Germination And Early Growth Of Diverse Crop Plants. Planta 216: 437ù445 Rdhrig, Horst , Jürgen Schmidt, Richard Walden, Inge Czaja, Neige Lubenow, Ursula Wieneke, Jeff Schell, And Michael John. 1996. Convergent Pathways For Lipochitooligosaccharide And Auxin Signaling In Tobacco Celis. PNAS 1996;93;13389-13392 Schmidt, Jurgen, Ruth Wingender, Michael John, Ursula Wieneke, And Jeff Schell. 1988. Rhizobium Meliloti Noda And Nodb Genes Are Involved ln Generating Compounds That Stimulate Mitosis Of Plant Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa Vol. 85, Pp. 8578-8582, November 1988 Schmidt, Jurgen, Ruth Wingender, Michael John, Ursula Wieneke, And Jeff Schell. 1993. Alteration Of Plant Growth And Development By Rhizobium Noda And Nodb Genes Involved ln The Synthesis Of Oligosaccharide Signal Molecules. The Plant Jornal 4 : 651-656. Schlaman, Helmi R. M., Andreas A. Gisel, Nicolette E. M. Quaedvlieg, Guido V. Bloemberg, Ben J. J. Lugtenberg, Jan W. Kijne, Ingo Potrykus, Herman P. Spaink, And Christof Sautter. 1997. Chitin Oligosaccharides Can Induce Cortical Cell Division ln Roots Of Vicia Sativa When Delivered By Baliistic Microtargeting. Development 124, 4887-4895 (1997) Staehelin, Christian, T, Michael Schultze2,T, Eva Kondoroni', Robert B. Mellor', Thomas Bolier' And Adam Kondoroni. Structural Modifications ln Rhizobiurn Rne/I/Oti Nod Factors Influence Their Stability Against Hydrolysis By Root Chitinases. The Plant Journal (1994) 5(3), 31 9-330 Tsigos, J., Aggeliki Martinou, Dimitris Kafetzopoulos And Vassilis Bouriotis. 2000. Chitin Deacetylases: New, Versatile Toois In Biotechnology. TIBTECH JULY 2000 (Vol. 18) : 305-3111. Wu, Chunfa, Rebecca Dickstein, Andrew J. Cary, And Joanna Hanks Norris. 1996. The Auxin Transport Lnhibitor N-(l - Naphthyl)Phthalamic Acid Elicits Pseudonodules On Nonnodulating Mutants Of White Sweetclover. Plant Physiol. (1996) 110: 501-510 Zahir, A.Z., H.N. Asghar, M.J. Akhtar Et M. Arshad. 2005. Precursor (L-Tryptophan)-Inoculum (Azotobacter) Interaction For Improving Yields And Nitrogen Uptake Of Maize. J. Plant Nutr. 28:805-817. Zhang, H., B. Prithiviraj, A. Souleimanov, F. D'Aoust, T.C. Charles, B.T. Driscoll Et D.L. Smith. 2002. The Effect Of Temperature an Genistein Concentration on Lipo-Chitooligosaccharide (LCO) Production By Wild-Type And Mutant Strains of Bradyrhizobium Japonicum. Soi! Biot. Biochem. 34 : 1175-1180.

Zhao, Yunde. 2008. The Rote of Local Biosynthesis of Auxin and Cytokinin in Plant Development. Current Opinion ln Plant Biology 2008, 11:16ù22

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1. Combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non- légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racine et radicelles des dites cultures.
2. 2. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les supports organiques non-bactéricides permettent de véhiculer CHT, TRP et sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organominéral, voire des semences de grandes cultures ou de cultures fourragères Graminae et/ou Brassicacea.
3. 3. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que la dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement 10 g.
4. 4. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon les revendications 1, 2 et 3 caractérisée en ce que la dose-hectare (dose-hectare) de CHT est comprise entre 10 et 1 000 g, plus particulièrement entre 250 et 500, préférablement 300 g.
5. 5. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus.
6. 6. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon les revendications 1, 2, 3, 4 et 5 caractérisée en ce que des bactéries biofertilisantes viables de la famille des Azotobacteracea (AZB) û correctement formulées et conditionnées à cet effet selon les règles de l'art, sont apportées auxdits supports organiques et non- bactéricides.
7. 7. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon la revendication 6 caractérisée en ce que les apports desdites bactéries de la famille des Azotobacteracea (AZB) auxdits supports organiques et non-bactéricides comportent entre 1 et 10 x 1012 cellules Azotobacteracea par hectare, préférablement 5 x 1012 cellules Azotobacteracea par hectare.
8. 8. Biofertilisants pour grandes cultures et cultures intermédiaires pièges à nitrates non-légumineuses comprenant le traitement de supports organiques non-bactricides avec un précurseur métabolique d'auxines phytogènes, avantageusement du TRP, d'un co-formulant chitinique tel que la CHT, voire et avantageusement un inoculum azotobactérien (AZB). -21 -