FR2941591A1

FR2941591A1 - Utilisation de la chitine pour la biofertilisation des cultures non-legumineuses

Info

Publication number: FR2941591A1
Application number: FR0906106A
Authority: FR
Inventors: Pierre Philippe Claude
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2009-12-16
Publication date: 2010-08-06
Anticipated expiration: 2029-12-16
Also published as: FR2941591B1; FR2941589A1

Abstract

Combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non-légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racines et radicelles des dites cultures. Les supports organiques non-bactéricides sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organo-minéral, voire des semences de grandes cultures ou de cultures fourragères Poaceae et/ou Brassicacea. La dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement 10 g, tandis que celle de CHT est comprise entre 10 et 1 000 g, plus particulièrement entre 250 et 500, préférablement 300 g. Les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent, eux, de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus. Il est aussi loisible d'apporter apportées auxdits supports organiques des Azotobacteraceae (AZB).

Description

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DESCRIPTION DE L'INVENTION

UTILISATION DE LA CHITINE POUR LA BIOFERTILISATION BACTÉRIENNE DES CULTURES NON-LÉGUMINEUSES 5 DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION

Le domaine technique de l'invention concerne la biofertilisation bactérienne, notamment azotobactérienne des grandes cultures agronomiques. II est question de production et d'utilisation inocula bactériens à cet effet et de co-formulants à base de chitine et d'acides aminés. ÉTAT DE LA TECHNIQUE

LA BIOFERTILISATION À L'AIDE DE BFCP AZOTOBACTÉRIENNES

15 Les BFCP (bactéries favorisant la croissance des plantes) colonisent, outre les racines de certaines cultures, les résidus de cultures (pailleux), les engrais organominéraux et/ou les biomasses racinaires résiduelles. Les mécanismes responsables de l'amélioration de la croissance comprennent : (i) la production de sidérophores extracellulaires (agents microbiens de transport du fer) qui peuvent s'associer de manière efficace avec le fer présent dans 20 l'environnement en le rendant moins disponible pour certaines microflores naturelles nonphytogènes, (ii) l'antibiose contre des bactéries et des champignons pathogènes, (iii) la production de substances favorisant la croissance, et iv) la solubilisation des phosphates organiques et inorganiques. Les BFCP appartiennent à plusieurs genres, y compris Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Cellulomonas, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, 25 (Brady)rhizobium et Xanthomonas.

Les bactéries membre de la famille Azotobacteraceae sont de bactéries libres, aérobies et capables de fixer l'azote de manière non symbiotique. Leurs populations peuvent varier dans le sol mais ne dépasse que très rarement 102 à 103 par gramme de sol. Ces inocula, contrairement aux 30 inocula Rhizobiaceae, peuvent être appliqués aux résidus de cultures pailleux au sol, aux engrais organominéraux. Le genre Azotobacter est composé d'au moins 6 espèces, y compris Azotobacter chroococcum et Azotobacter vinelandi.

UTILISATION DE LA CHITINE ET SES DÉRIVÉS SUR GRANDES CULTURES Engrais et produits phytos à base de chitine (CHT)

La chitine (CHT) est surtout utilisée comme agent de lutte biologique pouvant être apporté directement au sol dans l'espoir que la prolifération des microorganismes chitolytiques subséquent 10 -2-

puisse nuire à l'activité des pathogènes fongiques dont les parois sont aussi constituées de chitine (De Boer et al. 1999).

La chitine peut aussi être une source d'azote minéral pour la plante. La dégradation de la chitine est assurée par des chitinases (EC 3.2.1.14). Il en résulte l'apparition relativement rapide d'oligomères chitosaniques (glucosamines), dont plus de la moitié seront eux aussi rapidement minéralisés provoquant une accumulation d'azote minéral (De Boer et al. 1999). La chitine, et les glucosamines qui en découlent, sont somme tout assez peu récalcitrants in situ ; ces derniers ont probablement une durée de vie de quelques jours au plus. Or, cette minéralisation rapide de la chitine et du chitosan ù i.e. de la chitine dé-acétylée, outre leurs coûts, fait qu'ils sont généralement peu/pas utilisés comme fumure de fond à l'automne ; leurs utilisations comme engrais N dès la sortie d'hiver n'est pas plus recommandable étant donnée la disponibilité des engrais N plus conventionnels. L'utilisation agronomique de la chitine comme matière fertilisante est limitée du fait que les doses-hectare prescrites sont importantes. En effet, celles-ci varies de quelques centaines (- 400) de kg à plus d'une tonne par hectare (De Boer et al. 1999). Apporter au sol entant que matières fertilisantes de telles quantités de ces molécules, même obtenues en vrac, ne peut être rentable en agronomie. D'où un certain avantage à utiliser le chitosan soluble en applications foliaires. Entant que matière fertilisante, la chitine ne fait donc pas l'objet d'aucune demande de brevet délivré. Quelques demandes de brevets concernant la chitine et/ou son utilisation sont rapportée au Tableau A ;

Tableau A. EP1908847 - 2008-04-09 Method For Fermentative Production Of N-Acetyl-D-Glucosamine By Microorganism EP1862434 - 2007-12-05 Process For Collecting And Separating Of Water-Insoluble Pollutant From Aqueous Or Soil Environments. EP1741723 - 2007-01-10 Ss-Chitin Complex And Method For Producing The Same EP1917218 - 2008-05-07 Compositions Of Partially Deacetylated Chitin Derivatives EP1669462 - 2006-06-14 Method Of Preparing Alpha-Glycosylisoquercitrin, Intermediate Therefore And By-Product EP1862434 Al û Process for collection and separating water insoluble pollutants form aqueous or soli environments Engrais à base de chitosan (CTS) 25 L'utilisation du chitosan (CTS), un chito-oligosaccharides (COS) soluble dans l'eau dérivé de la chitine et obtenu par dé - acétylation (DA) complète ou partielle de la chitine, comme matière fertilisante n'est pas nouvelle ; la requête chitosan and fertilizer auprès de la base de données esp@cenetTM de l'OEB donne lieu à de nombreuses demandes de brevets, pour la plupart 30 d'origines coréenne, japonaise et chinoise ; quelques une de ces demandes sont rapportées au Tableau B.

Tableau B. KR20040091347 - 2004-10-28. Production Method Of Fertilizer Containing A Large Quantity Of Chitosan, Using King Crabs And Fertilizer Produced Thereby KR20030058804 - 2003-07-07. Production Of Chitosan For Coating Slow Release Chemical Fertilizer And Coating Method KR20010099264 - 2001-11-09. Method For Manufacturing Liquid Composite Fertilizer Using Chitosan RU2255924 - 2005-07-10. Method For Preparing Liquid Organomineral Fertilizer From Chitosan-Containing Raw CN1594229 - 2005-03-16. Composite Amino Acid Chitosan Fertilizer JP2002265292 - 2002-09-18. Organic Fertilizer Containing Chitosan, Fowl Dropping Incineration Ash, Rice Brain And Powdery Charcoal )P4243993 - 1992-09-01. Chitosan-Incorporated Liquid Composite Fertilizer And Production Thereof La plupart de ces demandes proviennent du sud-est asiatique (KR, JP, CN), reflet d'une abondance de sous produits de leurs industries de la pêche. Ces demandes asiatiques (et une russe) proposent l'incorporation d'acides aminés (CN1594229), de mélanges organominéraux (JP 2002 265292) et/ou d'oligoéléments (KR 2003 0058 804) ; l'incorporation d'inocula de microorganismes, et plus particulièrement de bactéries, n'est jamais mentionné. Le chitosan agit tant au niveau de la production d'auxines, à la façon des LCO, et/ou comme agents azotonutritionnel (Osuji et Cuero 1992). En effet, Selon Osuji et Cuero (1992) un dérivé du chitosan, le NCMC, est capable d'accroître la teneur en protéine du maïs et de la pomme de terre. Le chitosan est aussi préconisé pour la stimulation des défenses naturelles chez les plantes (Bell et al. 1998 ; Benhamou 2004), voire dans la composition de produits pharma- et nutraceutique .

Engrais à base de LCO Les lipo-chito-oligosaccharides, ou LCO, sont himiquement plus complexes et pondéralement plus efficaces que de simples oligomères de glucosaminiques (CTS, COS), bien que cela n'est pas démontré clairement sur grandes cultures non-Fabaceae. En effet, les concentrations ambiantes effectives d'LCO que doivent percevoir les semences non - légumineuses (US7250068, W00126465, CA2382614 ; Tableau C) sont comparables à celles pour le simple chitosan rapportées dans CA 2497633, soit de l'ordre de 10-10 à 10-11 M.

Tableau C. US7250068 - 2007-07-31. Method Of Increasing Photosynthesis In Plants Comprising An Exposure Thereof To Lipochitooligosaccharides And Compositions Therefor W00126465 - 2001-04-19. Use Of Lipo-Chitooligosaccharides For Increasing Photosynthesis In Plants And Corresponding Methods And Compositions CA2382614 - 2001-04-19. Use Of Lipo-Chitooligosaccharides For Increasing Photosynthesis ln Plants And Corresponding Methods And Compositions CA2338108 - 2000-02-03. Composition For Accelerating Seed Germination And Plant Growth Composition For Accelerating Seed Germination And Plant Growth Production Of Low-Molecular Chitosan And Chitooligosaccharide Production Of Low-Molecular Chitosan And Chitooligosaccharide Microbicidal Material Composed Of Metallic Ion And Zeolite Compound Plant Function Control Composition Containing Low-Molecular Weight Chitosan 3 JP2000253895 - 2000-09-19. Chitooligosaccharide US6979664 - 2005-12-27. Partially Acetylated Chitosan, Chitooligosaccharide Mixture And Production Of JP9031105 - 1997-02-04. JP9031104 - 1997-02-04. )P6279219 - 1994-10-04. 3P5065368 - 1993-03-19. -4-

Ces concentrations ambiantes de LCO sont aussi comparables à celles rapportées par D'Haeze et Holsters (2002) pour les cultures légumineuses, ou encore à celles apportées via certains produits commerciaux. Or, cette utilisation de LCO Rhizobiaceae sur cultures non-Fabaceae est problématique d'un point de vue industriel et économique. Par exemple, le rendement bioindustriel des ces molécules LCO de l'ordre de quelques mg/L de fermentation Rhizobiaceae (Zhang et al. 2002, Prithivirajae et al. 2003) limite grandement la taille de leurs doses-hectare, soit à environ quelques mg, soit à peine ce qui est requis pour une dose-hectare appliquée aux cultures Fabaceae ciblées par certains produits commerciaux. De plus, la complexité des LCO spécifiques aux Rhizobiaceae les rendent particulièrement sensibles à la dégradation une fois incorporés aux sols. Du coup, l'utilisation des LCO Rhizobiaceae sur cultures non û légumineuses est (surtout) limitée aux applications foliaires, application foliaires pas nécessairement les plus avantageuses pour la biofertilisation bactérienne des grandes cultures. D'une part, elles impliquent la présence de BFCP associatives, voire symbiotiques, dans la rhizosphère, BFCP qui vont donc nécessairement, à terme, ponctionner le flux photosynthétique et devenir du coup potentiellement contreproductives. D'autres parts, du fait de l'efficacité quelque peu aléatoire de biofertilisants bactériens, du moins à ce jour, leurs utilisations ne justifient pas toujours un passage dédié de pulvérisateur.

LA CHITINE COMME SOURCE - IN VITRO ET/OU IN SITU, DE CHITOSAN ET DE COS Bien que moins dispendieux que les LCO, les COS û y compris le chitosan (CTS), sont des molécules néanmoins relativement coûteuses - soit de l'ordre de 100 à 150 { le kg pour des qualités analytiques, et de l'ordre de 15 à 20 { le kg en vrac, pour être librement utilisées comme simples matières fertilisantes. Le prix de revient d'une dose-hectare de l'ordre de 500 g, par exemple, revient à environs 10 { ; pour être économiquement rentable, celle-ci devrait ce situer aux alentours de 2{ voire 3 { au maximum (hors conditionnement).

Le principal avantage du chitosan (CTS) par rapport à son précurseur qu'est la chitine est sa solubilité aqueuse ; au-delà de 50% de déacétylation la chitine devient soluble dans l'eau et est donc considérée comme étant du chitosan ; la définition du chitosan est donc opérationnel plutôt que chimique. Le degré de déacétylation, et la taille des oligomères ainsi générés influence la bioactivité de ces molécules. En effet, l'inhibition du transport des auxines et l'effet rhizogène qui en découle (voir infra) sont les plus détectables pour les oligomère chito - et lipochito - oligosacchariques (LCO) comportant de 4 à 6 résidus et/ou dé-acétylés à plus de 80-85%.

La dégradation microbienne de la chitine permet l'accumulation de chito-oligosaccharides (COS) tetra- et de pentamériques. Cela est vraisemblablement attribuable au fonctionnement des principales chitinases (Horn et al. 2006). En effet, celles-ci sont constituées de six sous-unités fonctionnelles qui permettent de capter lesdits penta- et hexamères. L'utilisation de la chitine polymérique (brute) comme matière fertilisante impliquerait donc une certaine dégradation in situ -5

de celle-ci. Or, cette dégradation, qui peut atteindre les 60% après 4 semaines d'incubation (De Boer et al. 1999) semble être dans un premier temps surtout le fait de champignons copiotrophes et de bactéries unicellulaires ; ce n'est que dans un deuxième temps que les actinomycètes et les champignons oligotrophes peuvent leur succéder (De Boer et al. 1999). LES LCO : DU CHITOSAN DÉCORÉ

Les LCO (lipo-chito-oligosaccharides) sont essentiellement des oligomères de chitosan (glucosamine) décorés de groupements lipidiques, le squelette glucosaminique û un COS, 10 étant lui-même phytoactif, bien que de façon non-spécifique à l'égard des Fabaceae, ou du moins, moins spécifique que les LCO Rhizobiaceae. Les précurseurs (squelettes) métaboliques des LCO que sont la chitine et le chitosan sont donc impliqués dans les symbioses Fabaceae / Rhizobiaceae. .). En effet, chez les cultures Fabaceae, la présence de LCO Rhizobiaceae permet d'induire les stades initiaux de formation des nodosités où se nichent les symbiotes Rhizobiaceae. 15 Lesdites décorations caractéristiques des LCO sont elles pour l'essentiel responsables que de la spécificité des symbioses (D'Haeze et Holsters 2000). Sans pour autant permettre la nodulation à proprement parler, les COS sont eux actifs chez les non-légumineuses, y compris donc les céréales, le maïs et le colza, incapables de symbioses avec les Rhizobiacea. Rien de surprenant que lesdits LCO aient eux aussi été reconnus, dès 1988, comme régulateurs de croissance végétal 20 au sens plus large, i.e. non seulement sur espèces Fabaceae (Schmidt et al. 1988; De Jong et al. 1993 ; Schmidt et al. 1993 ; Rbhrig et al. 1996).

Cette action des Rhizobiaceae sur la rhizogénie étant le fait, en partie, de leur production de LCO, il eut été normal de rechercher un analogue des LCO chez les Azospirillum. L'action des 25 Azospirillum en ce sens étant moins spécifique (lire : ne donnant pas lieu à une symbiose), il eut été aussi normal de s'attendre à ce que ces homologues des LCO Rhizobiaceae, soient biochimiquement plus simples. II semble donc que la détection par la plante non-légumineuse de signaux moléculaire attribuables à de simples oligomères (n = IV, V et/ou VI) de chitosan est toute aussi prononcée que celles des LCO pourtant beaucoup plus complexe, et spécifique, 30 chimiquement (voir Mathesius et al 1998, Müller et al 2000, et Baureithel et al 1994).

Or, la recherche d'homologues non - Rhizobiaceae de LCO chez les BFCP non - Rhizobiaceae ne fait pas à ce jour l'objet d'efforts concertés. Au contraire, ce sont les LCO Rhizobiaceae qui furent in fine appliqués aux cultures non-Fabaceae dans l'espoir de valoriser sur l'ensemble des grandes 35 cultures ces molécules complexes, maintenant hautement caractérisées et, il est vrai, actives à des concentrations aussi faible de 1012 M, voire moins (D'Haeze et Holsters 2000). Par exemple, les LCO d'origine Rhizobiacea sont aujourd'hui développés entant que biostimulants , et plus spécifiquement comme accélérateurs d'implantation des jeunes plants non-Fabaceae (eg. Bolt , Torque IF , Reveal Foliar - EMD CropBioscience ; voir aussi Prithirajae et al. 2003 et Zhang et 40 a1. 2002).5 -6-

LES INTERACTION DU SQUELETTE CHITOSANIQUE COS ET DES AUXINES

Un des effets les plus marqué et généralisé des auxines est la relative inhibition de l'élongation des racines principales au profit d'une certaine prolifération des racines latérales (Woodward et Bartel 2005). Déjà, en 2000 (Lambrecht et al. 2000) mentionnèrent que la présence active d'Azospirillum dans les rhizosphères provoque une suraccumulation d'auxines dans les racines et un effet rhizogénique. Cette action des Azospirillum mime celle des Rhizobiacea chez les Fabaceae.

Il est reconnu que l'action d'auxines û y compris celles sur ledit développement des racines latérales et/ou radicelles, dépends ou présuppose une accumulation asymétrique û y compris donc la formation de gradients (Paciorek et Friml 2006 ; Benkova et al. 2003 ; Friml et al. 2002 ; Weijers et al. 2005). C'est cette accumulation asymétrique d'auxines au niveau des racines û cause de ladite latéralisation des racines, que la présente invention cherche à provoquer, sans pour autant avoir directement recours à des auxines et/ou des LCO.

Or, cette action des LCO est aujourd'hui attribuée en partie à l'inhibition par les LCO du transport intercellulaire des auxines (Mathesius et al. 1998, Hirsch et al. 1989, Wu et al. 1996). Cette inhibition provoque une augmentation localisée (asymétrique) des teneurs en auxines qui semblerait est responsable de la déformation des radicelles caractéristique des susdites stades initiaux de la nodulation. Cependant, l'activité des oligomères de chitosan plus simples sur l'accumulation localisée des auxines n'est pas expressément documentée bien qu'il soit raisonnable de croire qu'elle existe. En effet, certains gènes et enzymes impliqués dans le métabolisme des LCO, dits aussi facteurs Nod le sont aussi dans celui des simples COS (Staehelin et al. 1994, Bolier 1995, Kafetzopoulos et al. 1993, Tsigos et al. 2000). Il fut donc raisonnable de croire que ces non û Rhizobiacea aussi produisent un certain type d'oligosaccharides glucosaminiques, des COS, voire des analogues de LCO.

Selon Mathesius et al (1998), c'est bel et bien le squelette chitique des LCO qui est biologiquement actif, et plus particulièrement celui des pentamères de chitosan. Selon Mathesius et al (1998), ces oligomères - COS et/ou LCO, peuvent, en interférant avec le transport intercellulaire d'auxines favoriser localement leur accumulation histologique et déclencher ainsi une modification de l'épiderme des radicelles, étape initiatrice de la formation des nodules chez les Fabaceae. Or, il s'avère que cette accumulation peut aussi être opéré par de simples oligomères chitiniques que par des LCO (Müller et al. 2000, Baureithel et al. 1994). Cette interaction COS x auxines est connue depuis au moins 1995 (Rôhrig et al. 1996). En effet, cette interaction implique non seulement des molécules complexes, fragiles et hautement spécifiques comme lesdites LCO, mais aussi de simples oligomères glucosaminiques û et plus généralement COS (Mathesius et al. 1998). Il s'avère aussi que bon nombre de COS les plus actifs sont, comme le leurs confrères, les Iipo- chito-oligosaccharides (LCO), des quadra- ou pentamères, voire des hexamères (Staehelin et al. 1994, Baureithel et al. 1994, Müller et al. 2000 et Schlaman et al. 1997). Vue l'analogie chimique entre LCO et leurs plus simples homologues glucosaminiques, il n'est donc pas surprenant que ceux-ci aussi puissent agir comme inhibiteurs du transport d'auxines. Mieux, selon les données de Muller et al (2000), et Baureithel et al (1994) de simples oligomères de chitosan sont vraisemblablement plus spécifiquement capables d'éliciter des mécanismes moléculaires bénéfiques chez les non - légumineuses que des LCO produites par des Rhizobiacea.

Or, selon Zhao (2008) la plante elle-même peut localiser la production endogène d'auxines, d'une part, et d'autre part une éventuelle surproduction de ces auxines est par la suite très rhizogène ( massive roots , superroots sic) ; voire aussi en ce sens Boergan et al (1995) et Kim et al. (2007). A noter encore une fois que Hirsch et al. (1989) démontrèrent que l'inhibition localisée du transport in planta des auxines précède l'initiation de la nodulation, et que selon Mathesius et al. (1998) cette initiation auxigénique de la nodulation s'apparente à celles des radicelles elles aussi inductibles par de simples oligomères chitosaniques Pour faire simple, c'est bel et bien le squelette ( backbone ) glucosaminé des COS qui est phytoactif, bien que ceux des LCO û du fait de leurs raffinement et leur spécificité, est a priori appréciablement plus efficace sur légumineuse que celui des simples COS, doit de l'ordre d'une efficacité pondérale de 100 fois plus (voir les données de Mathesius et al. 1998 et Schlaman et al. 1997) ; les fioritures et décorations lipidiques des facteurs Nod (LCO) semblent contribuer surtout à leurs spécificités à l'égards de certaines espèces de légumineuses et/ou faciliter leur transport trans-membranaire (Schlaman et al. 1997).

ENGRAIS À BASE D'INHIBITEUR DU TRANSPORT D'AUXINES L'acide indole-acétique, base chimique de la famille de phytohormones dites auxines , est reconnu comme rhizogène et/ou phytogènes (eg. Zahir et al. 2005 ; Ahmed et al. 2008). L'auxine phytoactive peut être soit d'origine microbienne (exogène), soit végétale (endogène). D'origine végétale, l'auxine est surtout produite dans ou près des méristèmes apicaux et favorisera, lors de sa migration vers le base de la plante, l'élongation des cellules y compris donc éventuellement celles des racines. Les teneurs en auxines seront progressivement diluées au cours de ce transport vers le bas de la plante. Or, sans cette dilution, les auxines actives au niveau des racines auraient plutôt un effet rhizogène, et plus particulièrement sur l'initiation et le développement de radicelles latérales. Cette latéralisation des racines peut effectivement être induite par l'apport d'auxines exogènes, y compris donc d'origine exogène.

La principale revendication concernant les auxines est paradoxalement plutôt négative (Tableau D). Rare sont les demandes de brevets qui revendiquent clairement l'effet phytogène et/ou agronomiquement conséquent des auxines ou de leurs précurseurs métaboliques (US5614467).

En effet, les auxines sont plus souvent cibles qu'agents ; l'inhibition de la synthèse, et plus particulièrement du transport intercellulaire et in planta des auxines agit comme herbicide (US6156704 ; JP8283250), ou comme agents capables d'en modifier (+1-) l'ampleur (WO 99/63092 ; EP0646315) (Tableau D) ; Tableau D. W09963092 - 1999-12-09. Root-Specific Protein Involved In Auxin Transport US6156704 - 2000-12-05. Auxin Transport Inhibitor Compounds JP8283250 - 1996-10-29. Inhibitor Of Auxin EP0646315 - 1998-10-30. Synergistic Herbicidal Compositions Comprising An Auxin Transport Inhibitor And At Least One Other Herbicide And Certain Such Novel Auxin Inhibitors US5614467 - 1995-02-06. Use Of Plante Hormones For Plant Improvement En ce sens, W099/63092 et EP0646315 proposent de réduire la sensibilité de plants OGM confrontés à des auxines et/ou leur dérivés et analogues ; il s'agit vraisemblablement de développer des cultures dites auxin-ready . US6156704 lui propose non seulement l'action inhibitrice de certains composés halogénés sur le transport des auxines, mais aussi leur action comme enhancer de l'efficacité de certains herbicides. Idem pour ce qui concerne JP8283250, bien qu'ici les inhibiteurs du transport d'auxines sont extraits de semences de maïs germé.

QUELQUES DEMANDES DE BREVES PERTINENTES ? US-A-4 964 894 A décrit des solutions aqueuses pour le traitement (pelliculage) de semences, voire de traitements au sol à base de chitosan (i.e. de chitine fortement désacétylée) et non de chitine en soi, donc peu ou pas déacétylée et peut soluble. De plus, bien que plusieurs acides non-phytotoxiques soient mentionnés, y compris donc le tryptophane (TRP ; une acide aminée), c'est l'acide glutamique qui est clairement préféré et le seule à faire l'objet d'exemples d'applications. Or, entant qu'agent phytogène ( growth regulator au sens de US-A-4 964 894 A), l'acide glutamique et le tryptophane ont des modes d'action très différents ; l'acide glutamique stimule l'enzyme nitrate réductase, le tryptophane lui sert de précurseur à la formation d'auxines. En ce sens, et sans l'avoir expressément revendiqué ici puisqu'il s'agit de l'état de la technique, les COS dérivés de la dégradation de la chitine interagissent avec le transport de ces auxines, et non pas nécessairement sur la nitrate réductase et/ou l'acide glutamique.

XP 002545450 concerne lui aussi l'utilisation du chitosan et non de la chitine au sens de la présente invention. Encore une fois, et bien que nettement plus coûteux, le chitosan est a priori attractif étant donné sa solubilité dans l'eau. La présente invention fait fi de cette non-solubilité de la chitine et/ou du coût respiratoire au niveau de la microflore du sol qu'implique sa dégradation in situ en présence de résidus de culture pailleux au sol, en favorisant par leur mise en contacte (combinaison) l'interaction directe de la chitine (CHT) et du tryptophane (TRP) auxinogène. Encore une fois, cette utilisation de la chitine à des doses-hectare normalement caractéristiques de celles du chitosan n'est pas évidente pour l'homme de métier, celui-ci étant ù à la lumière de l'état -9-

de la technique, amené à considérer cette simple chitine au mieux comme une matière fertilisante pondérale, et au pire comme un vulgaire amendement de sol. US 2008/221314 Al, lui, implique nécessairement la chélation de métaux afin d'en favoriser la phyto-assimilation. Bien que des effets phytogènes sont revendiqués en présence d'agents auxigéniques û y compris donc le tryptophane, ceux-ci nécessitent la présence d'un oligosaccharide soluble (eg. chitosan) û la chitine me semble-t-il étant ici expressément omise. De plus, la présente invention est aussi plus simplement mise en oeuvre ne faisant aucunement référence à la présence nécessaire de cations à chélater et/ou la sulfonisation de complexes humiques. Donc, XP 002545450 et US 20081221314 Al ne nous oriente aucunement vers l'utilisation de la simple chitine grossière et non-soluble en combinaison avec du tryptophane. Au contraire, ces éléments présupposent la formation de solutions de chitosan (XP 002545450) dans lesquelles pourraient éventuellement agir un certain pouvoir chélateur de hétéro-molécules humiques (cf. US 20081221314 Al).

XP-002545451 décrit l'utilisation de chitosan et non de chitine ou de tryptophane ; l'interaction du chitosan et du tryptophane n'étant pas explicité, les deux molécules ayant été apportées séparément via deux modalités différentes. De plus, il s'agit ici de cultures hydrophoniques (sans sol) et non de grandes cultures non-légumineuses aux champs, et notamment en présence de résidus de culture pailleux. Pire, le tryptophane (cf. modalité T1+E2) ou le chitosan (cf. modalité T1+E3 ; Tableau 2 op. cit.) ne semblent pas particulièrement efficaces en termes de teneurs en vitamine C, de DHAA, etc. Pour faire simple ; ce document ne fait aucune mention de l'utilisation conjointe de la chitine et du tryptophane afin d'inhiber localement le transport d'auxines ; il s'agit plutôt d'élicitation au sens habituel à l'aide de telles molécules solubles et bien connues.

DEFINITIONS Chitine (CHT) : sucre aminé, polysaccharide d'acétylglucosamine (Poly N-acétyl-D-glucosamine, (3-(1,4)-2-Acétamido-2-désoxy-D-glucose) reliés entre eux par une liaison du type 13-1,4. Associé à de carbonate de calcium, la chitine est un des constituants de la cuticule des insectes et des araignées, des crustacés, des animaux à coquille et de la paroi des champignons. Le nom chimique de la molécule est Poly N-acétyl-D-glucosamine, 8-(1,4)-2-Acétamido-2-désoxy-D-glucose Chitosan (CTS) : polysaccharide composé de la distribution aléatoire de D-glucosamine liée en I3-(1-4) (unité désacétylée) et de N-acétyl-D-glucosamine (unité acétylée) produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine. Chito-oligosaccharides (COS) : Fait ici référence aux Squelettes composés de polysaccharide et dérivé de la chitine comportant donc des résidus faits de groupes d'acétylglucosamine (N-acétyl-glucosamine) reliés entre eux par une liaison du type 13-1,4. Le chitosan est donc un COS. Lipo-chito-oligosaccharide (LCO) : idem au COS, mais comportant une décoration lipidique lui permettant de spécifier la relation plante / Rhizobiacea ; aussi facteurs Nod, principaux déterminants de la spécificité d'interaction entre les deux partenaires menant à la création de nodosités effectives.

Résidosphère (ou résidusphère) : Volume ou zone du sol entourant immédiatement les résidus de culture pailleux, engrais organominéraux et/ou biomasses racinaires, et plus ou moins influencé par ceux-ci. Il est aussi question d'un noyau où se situe la décomposition desdits résidus de culture. A noter

- 10 - que les microorganismes responsables de la décomposition occupent généralement moins de 5% de l'ensemble de l'espace disponible dans le sol et sont particulièrement présents dans la résidusphère. DIVULGATION DE L'INVENTION Problème technique

L'utilisation actuelle des LCO comme biostimulant, avantageusement lors de la biofertilisation de grandes cultures non-légumineuses ; celle-ci est vraisemblablement trop coûteuse du fait des 10 faibles rendements bioindustriels nécessaires à leur production. L'utilisation d'un simple analogue, non décoré de LCO û des oligomères de chitosan, ou plus simplement de chito-oligosaccharide (COS), est en principe moins coûteuse du fait de la relative abondance naturelle de la chitine, leur précurseur. Cependant, du moins entant que matière fertilisantes, ces COS ne sont pas aujourd'hui véritablement efficaces en agronomie, ou pondéralement rentables. De plus, les LCO 15 généralement préconisés le sont entant que traitement de semence et/ou en application foliaire ; ces pratiques culturales sont généralement inadéquates pour la biofertilisation û azotobactérienne plus particulièrement, des grandes cultures non û légumineuses.

Le problème consiste donc à trouver une façon de rendre des simples oligomères COS, des 20 pentamères par exemple, pondéralement plus efficace de façon à rentabiliser leurs utilisations comme matières fertilisantes en agronomie, et plus particulièrement pour la (bio)fertilisation des grandes cultures non-légumineuses. En d'autres mots, il s'agit de trouver une alternative biofertilisante aux applications foliaires et semencières actuels des LCO d'origine Rhizobiacea, l'application de ces molécules fragiles et coûteuse aux grandes cultures non-légumineuses étant 25 particulièrement inadéquate. Le problème technique consiste aussi à trouver comment rendre de simples COS dérivés de la dégradation microbienne de la chitine, avantageusement in situ, pondéralement et molairement presque aussi efficace que les LCO pourtant beaucoup plus raffinés, complexes et coûteuses à produire.

30 Solution technique

Le lien qui existe entre la présence immédiate de COS et l'action des auxines est probablement plus facilement (économiquement) valorisable sur grandes cultures non-Fabaceae que l'utilisation directe de LCO Rhizobiacea plus complexes, fragiles et foncièrement spécifiques. L'utilisation de 35 doses par hectare relativement massives de simples COS par rapport à celles préconisée pour les LCO est probablement plus avantageuse. Encore faut-il savoir comment valoriser cette action plus générale û i.e. moins spécifique à l'égard des Fabaceae, des oligomères COS.

Il est maintenant proposé que l'apparition in situ d'oligomères IV, V ou VI de chito-oligosaccharides 40 (COS) peut être simplement induite par un apport de chitine (CHT) peu ou pas raffinée au lieu du5 -11-

chitosan dont la durée de vie, du fait même de l'activité des chitinases du sol, est probablement très limitée. En effet, il est reconnu que la chitine incorporée au sol, ou mise en présence de microorganismes du sol û y compris donc ceux de la résidosphère, subit rapidement une dégradation et/ou du coup une certaine déacétylation ; de ce métabolisme in situ de la chitine (CHT) provient des oligomères chito-oligosaccharides (COS). A noter que les pentamères élémentaires des peptidoglycans bactériens sont structurellement analogues aux pentamères chitosaniques issue de l'hydrolyse de la chitine, et donc structurellement similaires aux LCO penta-/ hexamèriques les plus actif et spécifiques au Fabaceae, du moins pour ce qui concerne la structure de leurs squellet glucosamine. Or, si nous ne recherchons pas nécessairement une action spécifique aux Fabaceae, et/ou si la solubilité desdits squelettes glucosaminés peut être assuré par l'ajout de simples adjuvants ou en modifiant que légèrement sa structure.

Or, nous avons observé qu'en présence de BFCP particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols û au sens de FR 01/15542 par exemple, productrices d'auxines in situ et disposées dans la résidusphère en proximité des racines de cultures non-Fabaceae, l'utilisation d'un certain coformulant à base de CHT provoque bel et bien un accroissement de la biomasse racine et aérienne de plantules tests. Cet accroissement est vraisemblablement attribuable à une accumulation extraordinaire d'auxine dans les racines approximativement aux endroits où les résidusphères - i.e. les résidus de culture pailleux au sol une incorporés à la couche arable du sol, sont les plus riches en biomasses azotobactériennes. Nous avons aussi remarqué que l'apport conjoint de précurseurs métaboliques d'auxines, le tryptophane (TRP) notamment, permet d'amplifier cet effet rhizogénique des chito-oligosaccharide, ou COS.

La présente invention stipule donc que la séquestration des auxines exogènes prélevées par la plante au niveau racinaire favorisera une certaine rhizogénie, voire parfois une germination plus rapide, qui se traduira par une augmentation de la matière sèche des parties aériennes (MSPA) produites par la plante, vraisemblablement du fait 'un meilleur prélèvement du P en début de culture, avantageusement lors de son démarrage post-semis. II s'avérera que cette séquestration est en partie attribuable à l'action combinée des oligomères chitosaniques (COS) issus de la dégradation de la chitine in situ et de l'action d'auxines exogènes produites par les biomasses (azoto)bactériennes dans la résidusphère et/ou la rhizosphère.

En principe, l'invention consiste donc en la mise en présence de biomasses azotobactériennes biofertilisantes et productrices d'auxines, d'une combinaison de précurseurs métaboliques d'auxines, notamment le tryptophane TRP, et - fait nouveau, de certains COS dérivés de CHT et expressément destinés à inhiber le transport des auxines ainsi produites par les biomasses azotobactériennes ; c'est cette accumulation qui provoquerait la densification racinaire et l'augmentation de la biomasses aérienne produite conséquemment. - 12 -

Ces oligosaccharides (COS) sont en principe capables d'amplifier l'action rhizogénique des auxines en les séquestrant au niveau des racines. Or, si cette séquestration est très localisée, comme c'est le cas avec les LCO Rhizobiacea, l'effet rhizogénique sera d'atant plus prononcé et spécifique, notamment au membre de la famille Fabaceae. Si la séquestration des auxines, par voie d'inhibition de leur transports intercellulaire, est moins localisée, qu'au niveau de l'ensemble des racines par exemple, l'effet rhizogénique sera plus diffus, moins prononcé et, fait notable ici, moins spécifique, un peu comme le sont les effets de la plupart des hormones végétales. C'est cet effet pseudo-hormonal des oligosaccharides COS, qui nous intéresse ici, et cela précisément du fait de sa non - spécificité.

La solution technique proposée consiste donc en une combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS), et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non-légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racine et radicelles des dites cultures. Lesdits supports organiques non-bactéricides permettent de véhiculer CHT, TRP et sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organo-minéral, voire des semences de grandes cultures et/ou de cultures fourragères Poaceae et/ou Brassicaceae. Le traitement des résidus de culture pailleux au sol, avantageusement via l'apport de bactéries de la famille des Azotobacteracea biofertilisants est avantageusement effectué selon l'approche de Claude et Fillion (2004), tandis que lesdits engrais starter organo-minéraux peuvent être fabriqués selon FR06/00014 et utilisés selon l'approche décrite dans Claude et Giroux (2006). Dans le cas du traitement des résidus de culture pailleux au sol selon - par exemple, Claude et Fillon (2004), le CHT est avantageusement préalablement combiné à une fermentation à l'état solide û avantageusement selon FR 06/00014 et conditionnée selon FR 05/05753, permettant la production desdites bactéries de la famille des Azotobacteracea et la libération des COS avant la pulvérisation de ce mélange COS - Azotobacteracea ; le TRP peut lui être appliqué conventionnellement par simple pulvérisation liquide d'une bouillie. Dans le cas du traitement d'engrais starter organo- minéraux non-bactéricide selon Claude et Giroux (2006), l'incorporation de la CHT et du TRP ce fait directement dans pré-mélange en prévision de la formation des granules, avantageusement selon le protocole décrit dans FR 06/00014. Enfin, le pelliculage des semences de grandes cultures ou de cultures fourragères Poaceae et/ou Brassicaceae ce fait de façon conventionnelle selon les règles de l'art.

Plus précisément, il s'agit d'une combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chitooligosaccharides (COS) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non-légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racines et radicelles des dites cultures. Lesdits supports organiques non-bactéricides permettent de - 13 -

véhiculer CHT et TRP et sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organo-minéral, voire des semences de grandes cultures ou de cultures fourragères Poaceae et/ou Brassicacea. La dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement entre 1 et 10 g, tandis que celle de CHT est comprise entre 10 et 1 000 g, plus particulièrement entre 250 et 500, préférablement 300 g. Les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent, eux, de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus. Il est aussi loisible d'apporter apportées auxdits supports organiques et non-bactéricides des bactéries biofertilisantes viables de la famille des Azotobacteraceae (AZB), celles-ci étant correctement formulées et conditionnées à cet effet selon les règles de l'art, et apportées à hauteur de 1 et 10 x 1012 cellules Azotobacteraceae par hectare, préférablement 5 x 1012 cellules Azotobacteraceae par hectare. L'invention permet donc de procédé à la biofertilisation des grandes cultures et cultures intermédiaires pièges à nitrates non-légumineuses via le traitement de supports organiques non-bactéricides avec un précurseur métabolique d'auxines phytogènes, avantageusement du TRP, d'un co-formulant chitinique tel que la CHT, voire et avantageusement un inoculum azotobactérien.

La dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement 10 g, tandis que la dose-hectare de CHT est comprise entre 10 et 1 000 g, plus particulièrement entre 250 et et 500 g, et préférablement 300 g. A noter que les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus. Il est loisible d'apporter auxdits supports organiques et non-bactéricides des bactéries biofertilisantes viables de la famille des Azotobacteraceae (AZB) û correctement formulées et conditionnées à cet effet selon les règles de l'art et avantageusement obtenues selon le protocole décrit dans FR01/15542 ; ces apports desdites bactéries Azotobacteraceae (AZB) auxdits supports organiques comportent entre 1 et 10 x 1012 cellules Azotobacteracea par hectare, préférablement 5 x 1012 cellules par hectare. Il s'agit donc de biofertilisants pour grandes cultures et cultures intermédiaires pièges à nitrates non-légumineuses comprenant le traitement de supports organiques non-bactéricides avec un précurseur métabolique d'auxines phytogènes, avantageusement du TRP, d'un co-formulant chitinique tel que la CHT, voire et avantageusement un inoculum azotobactérien.

Avantages apportés, nouveauté et activité inventive

En supprimant l'étape de déacétylation de la CHT au profit d'une dégradation microbienne in situ de celle-ci en proximité des résidu- et/ou rhizosphères l'invention permet de réduire la dose-hectare effective de la CHT de quelques centaine de kg à moins d'un kg, voire quelques centaines de g, rendant ainsi cette matière fertilisante a priori pondéreuse aussi efficace à faibles doses que des LCO et/ou des CTS beaucoup plus complexes, raffinés et û surtout, coûteux. En effet, l'homme de métier cherche depuis un bon moment à améliorer la solubilité de tels oligosaccharides en transformant la CHT en CTS, et/ou leurs spécificités en synthétisant des -14-

LCO ; la CHT, aux yeux d de l'homme de métier, ne peut être efficace à ces doses-hectare normalement réservés à des biostimulants et/ou des agents azoto-nutritionnels. Pourtant, la présente invention permet d'utiliser de la sorte, à de telles doses-hectare, cette simple CHT.

L'invention concerne donc une nouvelle utilisation de la chitine (CHT) pour la biofertilisation bactérienne des (grandes) cultures non-Fabaceae, et cela par une combinaison ingénieuse de cette CHT nécessairement capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS) et de tryptophane (TRP). En ce sens, et avant tout une remarque générale ; la présente invention concerne bien une combinaison de chitine et non de chitosan tel que proposée dans la plupart des documents cités ci- dessus, voire aussi dans l'état de la technique telle que présenté par le demandeur. Cette distinction entre chitine et chitosan est notable et primordial ici, la chitine étant une matière première nettement moins coûteuse que le chitosan si souvent cité dans la base de connaissance et l'état de la technique. De plus, si et quand la chitine est mentionnée comme utilisable entant que matière fertilisante, cette mention implique des apports pondéreux, voire un usage comme amendement de sol plutôt que matière fertilisante. Voir en ce sens US-4 964 894 A. En ce sens, la chitine est donc nécessairement utilisée en quantités bien plus grandes que le chitosan, et cela essentiellement en raison d'une solubilité dans l'eau nettement plus faible de la chitine. La présente invention concerne donc û encore une fois, l'utilisation (combinaison) de la chitine et non du chitosan, d'où un net avantage en termes de coût par rapport à l'état de la technique essentiellement basée sur l'utilisation du chitosan beaucoup plus soluble, ou voire de la chitine mais cette fois-ci comme matière fertilisante pondérale et/ou comme amendement de sol. Pour faire simple, disons que la chitine est généralement perçue par l'homme de métier, soit comme un précurseur bio-industriel du chitosan, soit comme un engrais N pondéreux, soit comme un amendement de sol ; la chitine en soi n'a jamais été considérée comme un régulateur de croissance pouvant être apportée à des doses û hectare de l'ordre de 500 g à quelques kg.

Ces préparation TRP-CHT sont faciles à utilisés ne nécessitant ni application foliaire, ni traitement de semence, pratiques culturales parfois préjudiciables au développement de la biofertilisation bactérienne pour grande cultures non-légumineuses du fait de leurs coûts et contraintes particulières (compatibilité avec les microorganismes, justification des passages pulvérisateur dédiés). Au contraire, les co-formulations CHT-TRP û avantageusement en présence de bactéries biofertilisantes de la famille des Azotobacteracea, sont préconisées pour le traitement des résidus de culture au sol, des engrais organominéraux (EOM) û engrais starter et fumure de fond compris, voire éventuellement des biomasses racinaires résiduelles lors de la rénovation des prairies anciennes. Cette valorisation de tels substrats carbonés résiduels et non-bactéricides permet d'affranchir lesdites biomasses azotobactériennes du flux photosynthétique de la plante, la ponction de ce flux par d'éventuelles BFCP rhizosphériques s'avérant à terme contreproductive en terme de rendements agronomiques.

-15- C'est l'amplification de l'effet des auxines par les oligomères COS qui permet d'améliorer l'efficacité pondérale de ces derniers. Sans cette plus grande efficacité pondérale de la simple chitine et de ses dérivés in situ, les quantités et les coûts associés à sont utilisation pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses deviendraient rapidement prohibitifs. En ce sens, le simple mélange CHT-TRP permet d'améliorer l'efficacité pondérale et molaire de CHT à un niveau comparable à celui des LCO - pourtant beaucoup plus complexes, raffinés, spécifiques et coûteux, soit d'environs 10-6'-7 M à moins de 10 $~-9 M. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS ET FIGURES Figure 1. Matières sèches des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum produites lors deuxième coupe c2 (56 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise de traitement de semence. Faute de différences véritablement significatives (Anova), les écarts-types sont affichés à titre d'illustration. En ce sens, seules les semences avec TRP et CHT sont appréciablement plus performantes en ce sens que les semences non û traitées. Figure 2. Matières sèche des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum produites lors première coupe cl (28 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux. Faute de différences véritablement significatives (Anova) entre les modalités avec RC, les écarts-types sont affichés à titre d'illustration.

En ce sens, à noter une certaine supériorité des RC avec TRP et CHT, notamment par rapport au RC qu'avec CHT. Figure 3. Matières sèches des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum et leurs prélèvement en azote (mg-N par pot) au moment de la première coupe cl (28 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitements avec de tels résidus sont indiqués ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués. Les moyennes associées aux mêmes lettrages ne sont pas significativement différentes (Anova/Duncan ; a = 5%). Figure 4. Matières sèches des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum et leurs prélèvement en azote (mg-N par pot) au moment de la deuxième coupe c2 (56 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués. Les moyennes associées aux mêmes lettrages ne sont pas significativement différentes (Anova/Duncan ; a = 5%). Figure 5. Matières sèches des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum et leurs prélèvement en azote (mg-N par pot) au moment de la troisième coupe c3 (84 jps) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitements avec de tels résidus sont indiqués. Les moyennes associées aux mêmes lettrages ne sont pas significativement différentes (Anova/Duncan ; a = 5%).

Figure 6. Matières sèches des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) du Lolium multiflorum et leurs prélèvement en azote (mg-N par pot) produites par l'ensemble des coupes cl, c2 et c3 (c123) selon la présence du TRP et/ou CHT au sens de l'invention en guise d'azotobactérisation des résidus de culture (RC) pailleux ; pour fin de clarté, seuls les traitement avec de tels résidus sont indiqués. Les

-16- moyennes associées aux mêmes lettrages ne sont pas significativement différentes (Anova/Duncan ,a=5%). Figure 7 Représentation graphique des variations des l'efficacités relatives de l'azotobactérisation par dopage au molybdène (erAZB) attribuables à la présence de la chitine (CHT) en proximité de la résidusphère au sens de la présente invention. Les erAZB sont calculées en termes de mg-MSPA par plant et de leurs mobilisations (MOB, de l'azote, du phosphore, du calcium, du magnésium et du zinc (MOBN, MOBP, MOBCa, MOBMg et MOBZn, respectivement) ; il s'agit ici des valeurs moyennes obtenus lors de la première coupe (cl) 28 jours post-semis. Figure 8. Représentation graphique des variations des efficacités relatives de l'azotobactérisation par dopage au molybdène (erAZB) attribuables à la présence de la chitine (CHT) en proximité de la résidusphère au sens de la présente invention. Les erAZB sont calculées en termes de mg-MSPA par plant et de leurs mobilisations (MOBr1) de l'azote, du phosphore, du calcium, du magnésium et du zinc (MOBN, MOBP, MOBCa, MOBMg et MOBZn, respectivement) ; il s'agit ici des valeurs moyennes obtenus lors de la deuxième coupe (c2) 56 jours post-semis.

Figure 9. Représentation graphique des variations des efficacités relatives de l'azotobactérisation par dopage au molybdène (erAZB) attribuables à la présence de la chitine (CHT) en proximité de la résidusphère au sens de la présente invention. Les erAZB sont calculées en termes de mg-MSPA par plant et de leurs mobilisations (MOB) de l'azote, du phosphore, du calcium, du magnésium et du zinc (MOBN, MOBP, MOBCa, MOBMg et MOBZn, respectivement) ; il s'agit ici des valeurs moyennes obtenus pour les sommes des premières et deuxième coupes (c12). Figure 10. Représentation graphique du degré de corrélation (régression linéaire) entre la mobilisation du P (MOBP) et celles du calcium (MOBCa) et du magnésium (MOBMg) sans (-P ; demi-dose PI/2,) et avec (+P ; double-dose P2x) un certaine surabondance de phosphore apporté ; à noter une pente beaucoup plus abrupte de la régression MOBP x MOBCa sans surabondance de P. Il s'agit ici des valeurs obtenues 28 jours post-semis (première coupe, cl). Figure 11 Représentation graphique du degré de corrélation (régression linéaire) entre la mobilisation du P (MOBP) et celles du calcium (MOBCa) et du magnésium (MOBMg) sans (-P ; demi-dose Pv2x) et avec (+P ; double-dose P2x) un certaine surabondance de phosphore apporté ; à noter une pente beaucoup plus abrupte de la régression MOBP x MOBCa sans surabondance de P. Il s'agit ici des valeurs obtenues 56 jours post-semis (deuxième coupe, c2). Figure 12 Représentation graphique du degré de corrélation (régression linéaire) entre la mobilisation du P (MOBP) et celles du calcium (MOBCa) et du magnésium (MOBMg) sans (-P ; demi-dose PI/2x) et avec (+P ; double-dose P2x) un certaine surabondance de phosphore apporté ; à noter une pente beaucoup plus abrupte de la régression MOBP x MOBCa sans surabondance de P. Il s'agit ici des valeurs pour les sommes des premières et deuxièmes coupes (cl + c2 : c12). MODE DE RÉALISATION PRÉFÉRÉ DE L'INVENTION Du fait de la relative abondance naturelle de la chitine, précurseur habituel du chitosan et de COS, le prix de revient des préparations chitiniques au sens de la présente invention est nécessairement plus faible que celui de préparations à base de LCO Rhizobiacea. Du coup, les dose-hectare d'oligomères COS physiologiquement actifs peuvent être plus importantes et, notamment en présence de précurseurs d'auxines, plus conséquentes. En effet, faute d'assurer une production massive et continuelle d'LCO par des BFCP Rhizobiaceae, des apports appréciables d'oligomères -17-

glucosaminiques (COS) correctement déacétylés et somme tout beaucoup moins coûteux que des LCO, peuvent être effectués économiquement. Les préparations TRP-CHT au sens de la présente invention sont non spécifiques, du fait de leur simplicité moléculaire par rapport aux LCO Rhizobiacea, et peuvent donc en principe être appliqués plus librement à l'ensemble des grandes cultures non-légumineuses.

Un mode préféré de réalisation de l'invention consistera à introduire dans un réceptacle de fermentation modulaire, par exemple tel que décrit dans FR05/05753, un mélange pour la fermentation à l'état solide comprenant 750 g de résidus cellulosiques hachés finement broyé (1 mm), avantageusement provenant de résidus de culture au sol non-stériles de façon à assurer la présence de champignons cellulosiques, et de 100 g de chitine pure pulvérisée. Si lesdits résidus cellulosique ne sont pas des résidus de culture au sol, il faudra non seulement les inoculer avec un champignon cellulosique mais aussi leurs apporter un complément oligoélémentaire nutritif, avantageusement une solution Hogland sans N, voire sans ou avec peu de P (voir infra).

L'humidité des susdits mélange fermentatifs est portée à environs 50%. Afin d'accélérer le processus de fermentation, des sucres simples à 1% p/p peuvent aussi être apportés aux dits mélanges. Cette fermentation à l'état solide, en plus de permette une multiplication cellulaires des biomasses azotobactériennes ù du fait d'un rapport C/N très élevé des résidus cellulosiques, permettra aussi la transformation enzymatique de la chitine en COS de 4 à 6 résidus, avantageusement 5, en principe les les plus phytogènes. Vu le nombre de cellules azotobactériennes produites, soit environs 1010 par g de mélange fermentatif, ce mélange contiendra à terme suffisamment de cellules bacatériennes viables pour bactériser (inoculer) un hectare de résidus de culture pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver, et cela ù par exemple, au sens de Claude et Fillion 2004.

La production de COS partiellement désacétylés et donc plus ou moins solubles et pouvant donc être appliqués aux résidus pailleux au sol par pulvérisation liquide est cependant aléatoire, voire capricieuse, et nécessite un pilotage et un suivi bioindustriel. Un mode de réalisation alternatif consiste simplement à nanomériser la CHT afin de rendre celle-ci suspendable , et cela faute de pouvoir la rendre soluble comme l'est le CTS.

Dans le cas d'une grande culture non-légumineuse de printemps pouvant bénéficier d'un engrais de démarrage (starter), une dose de chitine de l'ordre de 500 g peut être intégrée directement à un engrais organo-minéral (EOM) granulé pouvant maintenant servir à biofertilisation, et cela avantageusement tel que décrit dans Claude et Giroux 2006 et FR06/00014. Cette surdose de chitine - i.e. par rapport aux 100 g préconisés pour les susdits mélanges fermentatifs, est loisible du fait d'une transformation de celle-ci en COS plus lente et moins contrôlée.

Il est aussi possible d'apporter une dose de CHT au sens de la pa présente invention à un EOM 40 servant de fumure de fond à l'automne ù contrairement aux susdits EOM starter . Cette fumure -18-

de fond peut-être répandue à la volée sur des résidus de culture pailleux au sol, avantageusement en pré-semis d'une Cipan (culture intermédiaire piège à nitrate). En ce sens, ce mélange organominéral est un alternative à la pulvérisation liquide du susdit mélange fermentatif ; à terme cette option pourrait être la plus favorable. Enfin, dans le cas de semences de grandes cultures et/ou de cultures fourragères Poaceae et/ou Brassicacea le pelliculage desdites semences ce fait conventionnellement selon les règles de l'art.

Pour faire simple ; le mode préféré de réalisation de l'invention doit pouvoir assurer une 10 concentration immédiate et minimale de 1 nano-molaire (nM, ou 10-9 M) de COS en proximité des résidus de culture pailleux au sol au sens de Claude et Fillion 2004, et/ou desdits EOM au sens de Claude et Giroux 2006. A noter que cette concentration minimale est plus faible que celle rapporté par Mathesius et al 1998 pour de tels COS. Concrètement, en supposant un poids moléculaire de 750 pour un pentamère de COS, il faudra 7,5 g de COS pour traiter 10' g de résidus de culture au 15 sol. Économiquement et techniquement, il est loisible d'apporter environs 100 g de chitine par kg du susdit mélange fermentatif ; produire ainsi lesdits 7,5 g de COS à partir de ces 100 g de chitine implique un taux de transformation de l'ordre de 12 à 15%.

Ce taux de transformation de la chitine en COS est vraisemblable. Par exemple, De Boer et al. 20 1999 mentionnèrent des taux de disparition in situ (sol et sables) de la chitine ù et donc logiquement d'apparition de COS, de l'ordre de 60 à 75% sur quelque semaines. À cette concentration (nM) de simples COS sont normalement pas, ou à peine, phytogènes (voir Mathesius et al. 1998), et c'est donc l'interaction entre l'action restrictive des COS ainsi produits localement in situ avec une dose de tryptophane de l'ordre de 25 à 50 g par hectare, et par ù 10' g 25 de résidus de culture au sol, sur le transport des auxines qui permet la réalisation de l'effet phytogène, voire agronomque, recherché. A comparer donc avec les quelques centaines de kg de chitine préconisés par France Chitine.

La pulvérisation liquide des résidus de culture au sol et/ou des granules organo-minérales peut 30 donc avantageusement comporter une dose-hectare (dose-hectare) de bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP) azotobactériennes bien adaptées à la vie dans les sols arables au sens de FR 01/15542. En principe, ces bactéries sont déjà présentes dans les sols arables mais leurs concentrations à la surface des susdits substrats carbonés (i.e. résidus de culture au sol ou engrais organo-minéraux, cf. Claude et Fillion 2004 et Claude et Giroux 2006)) peut contribuer à 35 améliorer l'efficacité de l'invention.

Enfin, la préparation peut aussi être appliquée à semences Poaceae fourragères en présence des susdites matières organiques résiduelles et/ou de biomasses racinaires résiduelles. De plus, étant donné que le chitosan au sens de la présente invention permet d'amplifier l'effet des auxines 40 produites par les BFCP à partir de tryptophan (TRP), il est loisible d'apporter comme co-formulant 5 20 25 30 -19-

une certaine dose de TRP, avantageusement d'environs 10 g par hectare. Encore une, a noter que bien que en principe les BFCP azotobactériennes productrices d'auxines peuvent obtenir ce TRP précurseur à même les réserves du sol, il est néanmoins avantageux d'inclure du TRP dans la formule. APPLICATIONS BIOINDUSTRIELLES ET AGRONOMIQUES

L'invention est susceptible d'être appliquée au secteur agronomique, soit via (i) un traitement de semences, (ii) une azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol (Claude et Fillion 10 2004) et/ou (iii) un engrais organo-minéral (EOM) intégrant avantageusement une biomasse azotobactérienne (Claude et Giroux 2006). En ce sens, j'ai donc mené trois (3) expérimentation ù A, B et C, afin d'illustrer comment l'invention est susceptible d'être appliquée à ces trois types de vecteurs ù semences, résidus de culture pailleux et EOM.

15 (i) l'Invention comme traitement de semence Poaceae : Expérimentation A

A 100 g de semences de Lolium multiflorum Lam. nous avons ajouté 8 g de charbon activé enrichis, 0.08 g de TRP le cas échéant, et/ou 8 g de CHT, soit l'équivalent pour une dose-hectare de semence Poaceae de 25 kg d'envions 2 kg de charbons enrichis (Tableau E) et/ou de CHT et 20 g de TRP, soit des quantités abordables et mécaniquement opérables.

Tableau E : Caractéristiques physico-chimiques des charbons enrichis Paramètres analysés Unités Sec brut Matières Sèches (MS) g/kg 1000 418 Carbone Organique total (COT) g/kg 447,0 186,8 Azote total (NtK) g/kg 28,0 11,7 Azote ammoniacal (N-NH4) g/kg 1,10 0,5 Rapport C/N na 16,0 pH eau na 6,8 Calcium total(CaO) g/kg 0,9 0,4 Magnesium total (MgO) g/kg 0,2 0,1 Phosphore total (P205) g/kg 0,4 0,2 Potassium total (K20) g/kg 1,6 0,7 Bore total (B) mg/kg 1,60 0,7 Cobalt (Co) mg/kg <8,5 <3,5 Cuivre (Cu) mg/kg 12,00 5,0 Fer (Fe) g/kg 0,51 0,2 Manganèse (Mn) mg/kg 22,00 9,2 Molybdene (Mo) mg/kg 0,50 0,2 Zinc (Zn) mg/kg 18,00 7,5 Nous avons disposé les quatre modalités au sein d'un dispositif expérimental en carré latin 4 x 4 constitué de pots de 1 L contenant chacun 500 g de sol reconstitué et tamisés à 5 mm ; l'analyse physico-chimique du sol utilisé est au Tableau F. A la surface de chaque pot 2,5 de semence ù plus les susdits co-formulants est matières actives, sont saupoudrés et recouverts de 5 g de sables siliceux. Lors de l'irrigation des pots, aucune fertilisation n'est apportée au semis question de bien - 20 -

assurer le prélèvement complet des éventuels reliquats d'azote minéral (Nm). À c1 cependant, soit 28 jours post-semis 35 mg N-NO3NH4 / kg sol sont apportés à même une solution nutritive dont la composition et le mode de préparation est rapportée au Tableau G.

Tableau F : Analyse physico-chimique des sols alsaciens (se13, gewn) utilisés Se13 (Expérimentations A, B) Gewn (Expérimentation C) CEC (cmol) 121 101 PH 6,7 5,7 MO (%) 1,84 5,55 P205 (Dyer) 0,19 0,037 P205 (Joret-Hebert) 0.069 nd Texture A-L-S (g/kg-sol) 218-673-84 270-380-350 K20 (g/kg-sol) 0,12 0,19 MgO (g/kg-sol) 0,16 0,1 CaO (g/kg-sol) 3,2 2,82 Na2O (g/kg-sol) 0,025 0,03 Fe (mg/kg-sol) 73,3 86,6 Mn (mg/kg-sol) 28,7 6,6 Zn (mg/kg-sol) 2,8 0,7 Cu (mg/kg-sol) 2,5 0,4 B (mg/kg-sol) 0,44 0,36 TABLEAU G : PREPARATION DES SOLUTIONS NUTRITIVES 1. Ca(NO3)2.4H20 236.1 g/I 2. KNO3 101.1 g/I 3. KH2PO4 136.1 g/I 4. MgSO4.7H2O 246.5 g/I H3BO3 2.8 g MnCl2.4H20 1.8 g ZnSO4.7H20 0.2 g CuSO4.5H20 0.1 g, et, le cas échéant, NaMoO4 0.025 g FeSO4.7H20 0.0078 g Comme nous pouvons le voir à la Figure 1, la combinaison desdites doses de CHT ù sommes toutes très petites par rapport à celles préconisées selon l'état de la technique, en combinaison au TRP au sens de la présente invention semble favoriser la production de MSPA au-delà de celle obtenu chez le témoin, ce qui n'est pas le cas avec la CHT ou le TRP utilisés simplement. 35 Sur semence, les substrats carbonés étant moins abondants, notamment jusqu'à cl 28 jps et/ou avant l'implantation de la rhizosphère et de son exsudation de C, cette suractivité n'est pas véritablement détectable. A noter aussi que les charbons activés (enrichis) d'AFE sont probablement une certaine valeur fertilisante du fait qu'ils contiennent des résidus organiques et 40 aminés issus de la production d'acide glutamique par Corynebacterium. Or, contrairement à une Quatre solutions molaires (1M) pour les apports de N/P/K/S/Mg ; 10 Deux solutions oligo-élémentaire, soit pour 1 L ; 15 20 Pour prépare 1 L de solution nutritive, dite de Hoagland ; 7 ml Ca(NO3)2 5 ml KNO3 2 ml KH2PO4 (Expérimentation A et B) 25 1 ml KH2PO4 (sous - abondance ; Expérimentation C) 4 ml KH2PO4 (sur ù abondance P2. ; Expérimentation C 2 ml MgSO4 1 ml oligo-éléments (avec ou sans Mo) 30 -21 -

application aux résidus de culture au sol, le tryptophane appliqué sur semences n'est pas facteur de sur - compétitivité des bactéries du sol û faute de substrat carboné suffisant ; la chitine avec le tryptophane permet même à ce dernier d'avoir un effet détectable par rapport aux témoins, ce qui n'est pas le cas avec les applications simples de chitine ou de tryptophane. Sur semences, la présence de chitine ou de tryptophane ne provoque pas une telle sur - immobilisation apparente d'Nm, vraisemblablement du fait d'une moins grande abondance de substrat carboné immédiatement assimilable par les bactéries du sol en proximité desdites semences ; l'interaction de ces substances provoque néanmoins un effet phytogène détectable. En ce sens, l'invention est aussi applicable entant que traitement de semences de grandes cultures non-Fabaceae bien qu'elle risque du coup d'être moins valorisée.

(ii) l'Invention lors de l'azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol

Expérimentation B Pour cette deuxième illustration j'ai considérée le mode de réalisation par épandage d'un mélange organo-minéral comme fumure de fond automnale sur résidus de culture pailleux au sol. En principe, je cherche ici à simuler l'effet de ce mélange CHT-TRP sur l'implantation d'une Cipan û ici un Lolium multiflorum, bien que de l'implantation d'une céréale d'hiver est aussi loisible. Pour ce faire, j'ai simplement enduit de TRP des résidus de culture pailleux à hauteur de 10 g pour 10' g (modalité TRP).au de 100 g de CHT sur 10' g de résidus pailleux (modalité CHT), voire la combinaison des deux (modalité CHT + TRP). Il y a comme de raison des témoins avec résidus de culture pailleux (RC) et sans RC.

Dans des pots de 1 L, 500 g du susdit de sol reconstitué est mélangé à 1% p/p de résidus pailleux traités selon chacune des susdites modalités. 2,5 g de semences non - traitées de Lolium multiflorum sont déposées à la surface du sol reconstitué, puis recouvertes de 5 g de sable siliceux. Lors de l'irrigation des pots, aucune fertilisation n'est apportée au semis question de bien assurer le prélèvement complet des éventuels reliquats d'azote minéral (Nm). À c1 cependant, soit 28 jours post-semis (jps) 35 mg N-NO3NH4 / kg sol sont apportés à même un solution nutritive dont la composition est rapportée en annexe. L'irrigation des plants ce fait avantageusement par le bas en apportant uniformément une certaine quantité d'eau aux soucoupes sur lesquelles reposent les pots.

Une première coupe (cl) peut intervenir dès 28 jours post-semis (jps), et avantageusement une deuxième coupe (c2) peut être pratiquée 56 jps, voire une troisième (c3) à 84 jps. Les matières sèches des parties aériennes (MSPA ; g x 100 / pot) ainsi que leurs prélèvement (mobilisation) en azote (mg-N / pot) peuvent alors servir d'indice phytogène ; ces valeurs sont rapportées graphiquement aux Figures 3, 4, 5 et 6. Malgré une certaine contre-productivité de la CHT ou du TRP utilisé simplement û notamment en terme de prélèvement (mobilisation) de l'azote on observe -22-

néanmoins une certaine supériorité de CHT et de TRP utilisés en combinaison. Cette supériorité est au début ù toujours en termes de prélèvement d'azote (l'effet sur MSPA étant moins probant), relative par rapport à l'une ou l'autre des autres modalités. A terme ù i.e. 84 jps, elle est cependant absolue par rapport à l'ensemble des modalités (Figure 6).

Sur résidus de culture pailleux au sol, cette contre-productivité initiale des applications simples de CHT et de TRP est vraisemblablement attribuable à une suractivité ponctuelle de la microflore résidusphérique du fait de la présence de ces deux molécules pouvant agir comme substrat carboné pour ladite microflore. Cela dit, dès c2, l'azote diatomique réduit provenant de la susdite suractivité de la microflore résidusphériques (et azotobactérienne nécessairement) peut maintenant être re-largué contribuant d'autant plus à l'interaction positive entre CHT et TRP.

Sur résidus de culture au sol, la présence de chitine (CHT) ou de tryptophane (TRP) provoque vraisemblablement une sur - immobilisation d'N minéral (Nm) au dépends de la MSPA produite.

La simple chitine (CHT), une fois partiellement dégradée in situ ou in vitro, en amplifiant l'effet phytogène du tryptophane (TRP) permet d'atténuer la sur - compétitivité des bactériens en proximité des résidusphères induite par l'application de tels substrats lors de la valorisation microbiologique des résidus de culture au sol. L'action auxinogène de la chitine au sens de la présente invention permet visiblement de compenser pour cette sur - immobilisation et de rétablir ainsi au niveau témoins la production de MSPA. Cette double application de la chitine et du tryptophane aux résidus de culture pailleux au sol permettra d'atténuer l'effet dépressif d'une valorisation azotobactérienne desdits résidus de culture (pailleux) au sol, tout en permettant un captage effectif des reliquats d'Nm à l'automne et donc un certain rationnement végétatif des plantules au profit de leurs potentiels de rendements (Debaecke et la. 1996).

Expérimentation C

Afin de mieux illustrer comment l'invention est susceptible d'être appliquée à l'agriculture, nous avons mise en place un essai en serre avec deux niveaux de fertilisation P d'un sol a priori relativement pauvre en P (Tableau F). La prolifération transitoire des racines latérales devrait ù un peu à la façon d'une symbiose mycorhizienne mais sans le coût respiratoire, favorise le démarrage des plantules et/ou leur mobilisation du P.

Pour ce faire, nous avons préparé deux mélanges à base d'un substrat relativement inerte ù ici des charbons activés (CA ; Tableau E), un sous-produit issu de la fabrication d'acide glutamique (Ajinomoto Foods Europe, Nesle, France), et de chitine (CHT). A noter qu'à ce stade la CHT est non - miscible à l'eau et/ou soluble du fait de sont très faible degré de déacétylation. Pour faciliter à terme le développement technique et agronomique de l'invention il sera avantageux de nanomeriser la CHT ù sans pour autant la rendre soluble, et d'utiliser un substrat inerte soluble, voire simplement de l'eau permettant une pulvérisation liquide de la CHT à la grandeur d'une -23-

parcelle agronomique. En ce sens, et à titre expérimental, le susdit substrat inerte se substitue ici à cet eau faute d'une nanomérisation effective de la CHT.

Cinquante (50) g de CA sans et avec 0,5 g de CHT sont imprégnés de 5 ml d'eau afi de permettre leurs adhésion aux résidus de culture pailleux û ici des pailles de blé hachées à 2 mm. En ce sens, à 50 g de tels résidus pailleux, 0,5 g desdits mélanges CA +1- CHT sont combinés ; cette intégration implique donc une teneur en CHT desdits résidus pailleux d'un kg de CHT par 10' g (10 tonnes) et par hectare, soit des proportions loisibles en agronomie. Ces quelques 50 g de résidus pailleux, sans et avec CHT sont maintenant intégrés par malaxage à huit (8) lots de 350 g de sol (Tableau F) reconstitué (4 mm) à un taux de 3,5 g par 350 g de sol ; cela équivaut effectivement à 1% de résidus pailleux, soit 10' g pour l'ensemble des 109 g de sol en surface (10 cm).

Quatre (4) séries de lots û 4 x 8 = 32 pots, de 350 g-sol (Tableau F) sont ainsi préparés, la moitié (16) avec et l'autre moitié (16) sans CHT. Chacune de ces modalité CHT û sans et avec, seront à leur tour déclinées sans et avec l'application d'une pleine fertilisation P (i.e. 2 x , Tableau xxx) ; la contrepartie de cette pleine fertilisation P étant ici une demi dose (i.e. 1/2 x , Tableau xxx) de P via une certaine solution nutritive décrite au Tableau G. A noter donc que cette variable P implique ici une différence par un facteur de 4 (2 /'/2 = 4) du taux de fertilisation P ; cette différence permettra de mettre en évidence l'effet de ladite latéralisation des racines au sens de la présente invention sur la mobilisation du P (MOBP ; voir infra).

Enfin, et afin de simuler l'effet d'une éventuelle azotobactérisation desdits résidus pailleux, ceux-ci sont imprégnés û avant leur intégration aux sols par malaxage mais après qu'ils aient été enduits des mélanges CA +/- CHT, de l'équivalent d'une dose-hectare de 10 g-Mo, et cela via 3,5 ml d'une solution convenable. Donc, et pour faire simple, les proportions suivantes ont été respectées afin de reproduire en pots approximativement les proportions et taux d'apports par hectare opérables en agronomie, soit par hectare (ha) ; 109g-sol 10' g-résidus pailleux 105 g-CA 103 g-CHT 101 g-TRP 101 g-Mo Ces quantités de résidus de culture pailleux au sol sont généreuses mais respectables si on inclue les biomasses racinaires et les chaumes, tandis que les quanttés de TRP et Mo ainsi proposées sont économiquement justifiables. Les quelques 105 g de CA sont pondéralement équivalents aux quelques 100 L d'eau normalement utilisés pour la pulvérisation liquide de matières actives sur un hectare (voir supra à propos de la nanomérisation de la CHT). - 24 -

En guise de dispositif expérimental, les modalités avec et sans Mo sont appariées afin de former une seule unité expérimentale permettant le calcul de l'efficacité relative du mo ù dans les faits ici une azotobactérisation par stimulation de la flore azotobactérienne indigène aux résidus de culture pailleux. II y a donc quatre (4) modalités avec imbrication des traitements avec et sans Mo ; A ù P1/2x (sous - abondance) sans CHT, sans (a) et avec (b) 10 g-Mo / ha B ù P112, (sous - abondance) avec CHT, sans (a) et avec (b) 10 g-Mo / ha C ù P2x (sur - abondance) sans CHT, sans (a) et avec (b) 10 g-Mo / ha D ù P2x (sur - abondance) avec CHT, sans (a) et avec (b) 10 g-Mo / ha 10 II s'agit donc d'un dispositif en carré-latin des modalités avec et sans Mo imbriqués ( split-plot ) au sein de chacune des 16 (4 modalités principales x 4 répétitions), soit un total de 32 pots d'un demi L comprenant chacun 350 g de sol + 3,5 g de résidus de culture pailleux plus 0,5 g de mélange organo-minéral à base de charbon activé (CA) +/- CHT. Une fois les 32 pots (4 modalités 15 A, B, C et D avec est sans Mo x 4 répétitions) disposés par paires (unité expérimentale) en carré latin, 0,20 g de semences de Lolium multiflormum Lam. ù environ 30 plantules par pot et dont le nombre exacte est déterminé dès la première coupe (cl) 28 jps afin de permettre le calcules de la MSPA par plantule, sont placés à la surface, tassées et recouvertes d'une certaine quantité donnée de sables siliceux inerte. Les pots sont alors irrigués avec une solution nutritive (Tableau 20 G) selon les deux modalités P décrites ci-haut, la molarité de ladite solution étant simplement ajustement conséquemment en ajoutant soit 1, soit 4 ml de la solution mère (molaire) de P à la solution nutritive. A noter que malgré l'inclusion d'une modalité avec et sans Mo (i.e. équivalente à 10 g-Mo par hectare), la solution nutritive en soit n'est pas dépourvue de Mo, question d'éviter des carence végétales en Mo sur les sous-parcelles imbriquées sans Mo ajoutés directement aux 25 résidus de culture pailleux. Les matières sèches des parties aériennes (MSPA) produites par pot à 28 (cl) et 56 (c2) jps sont déterminées et dosées en termes de N, P, K, Ca, Mg et des oligoéléments (hors Mo). J'ai aussi déterminé la mobilisation du P par la MSPA ainsi que celles du Ca, du Mg, du Zn et de l'azote pour chacune des 4 x 2 = 8 modalités.

30 A première vue, seule la surabondance du P (P2x) est véritablement et simplement phytogène ; l'azotobactérisation par dopage molybdénique ne semble l'être que transitoirement, tandis que CHT apparaît comme franchement contreproductif ; cf. MSPA et MOBn au Tableaux 1, 2 et 3.

Tableau 1 : Matière sèches des parties aériennes (MSPA ; mg par plant) et leurs mobilisation 35 élémentaire (MOB- ; ug et ng par plant) de N, P, Ca, Mg et Zn au moment de la première coupe (cl) 28 jours post-semis. Modalité (mgMSPA) (ugMOBN) (ugMOBP) (ugMOBCa) (ugMOBMg) (ngMOBZn) P1/2x, sans CHT, sans AZB-Mo 68,15 825 74,97 266 102 1677 P1/2x, sans CHT, avec AZB-Mo 70,74 905 70,74 283 106 1549 P112x, avec CHT, sans AZB-Mo 59,24 776 71,09 255 107 1505 P1,2x, avec CHT, avec AZB-Mo 63,45 831 69,80 286 108 1510 P2x, sans CHT, sans AZB-Mo 66,25 828 112,63 272 113 1544 P2x, sans CHT, avec AZB-Mo 74,10 867 125,96 282 119 1712 P2x, avec CHT, sans AZB-Mo 67,19 820 114,22 242 108 1445 P2x, avec CHT, avec AZB-Mo 73,27 835 109,91 264 110 14225 - 25 - Tableau 2: Matière sèches des parties aériennes (MSPA ; mg par plant) et leurs mobilisation élémentaire (MOB- ; ug et ng par plant) de N, P, Ca, Mg et Zn au moment de la deuxième coupe (c2) 56 jours post-semis. Modalité (mgMSPA) (ugMOBN) (ugMOBP) (ugMOBCa) (ugMOBMg) (ngMOBZn) P112,,, sans CHT, sans AZB-Mo 26,50 344 63,60 262 135 1330 P1,yx, sans CHT, avec AZB-Mo 29,28 392 61,48 225 117 1206 P112,, avec CHT, sans AZB-Mo 25,55 332 53,65 207 118 1106 P1,2,, avec CHT, avec AZB-Mo 30,71 387 61,43 236 126 1109 Pz,,, sans CHT, sans AZB-Mo 29,62 373 74,05 225 124 1179 P2,, sans CHT, avec AZB-Mo 30,12 383 81,34 223 124 1223 Pa,, avec CHT, sans AZB-Mo 29,74 354 71,37 205 116 1068 Pz,,, avec CHT, avec AZB-Mo 30,58 367 76,46 220 116 1061 Tableau 3: Matière sèches des parties aériennes (MSPA ; mg par plant) et leurs mobilisation élémentaire (MOB- ; ug et ng par plant) de N, P, Ca, Mg et Zn pour la somme des première deuxième coupe (c12). Modalité (mgMSPA) (ugMOBN) (ugMOBP) (ugMOBCa) (ugMOBMg) (ngMOBZn) P1,2,, sans CHT, sans AZB-Mo 94,6 1169 139 528 237 3007 P112,,, sans CHT, avec AZB-Mo 100,0 1298 132 508 223 2755 P112,,, avec CHT, sans AZB-Mo 84,8 1108 125 462 224 2611 P112,,, avec CHT, avec AZB-Mo 94,2 1218 131 522 234 2619 Pb, sans CHT, sans AZB-Mo 95,9 1201 187 497 237 2723 P2x, sans CHT, avec AZB-Mo 104,2 1250 207 504 242 2935 P2,,, avec CHT, sans AZB-Mo 96,9 1174 186 447 223 2512 Pa,, avec CHT, avec AZB-Mo 103,9 1202 186 484 226 2483 Or, ce qui est le plus révélateur et précisément mesuré ici est l'efficacité relative de l'azotobactérisation des résidusphère par dopage molybdénique (erAZB) par rapport à un témoin apparié non - dopé. C'est cette erAZB qui devrait ici le plus augmenter, du moins pour ce qui concerne MOBP, MOBCa, MOBMg, voire MOBZn ; MOBN et MSPA ne devraient pas être impactés négativement par une éventuelle latéralisation transitoire des racines. Cette augmentation d'erAZB devrait aussi être la plus prononcée en absence d'une surabondance de P, une certaine carence en P (P112x) étant plus propice à la mise en évidence d'une plus grande capacité à mobilisé le P - et donc accessoirement le Ca et le Mg. Or, c'est précisément ce qu'illustrent les données rapportées au Tableaux 4, 5 et 6. Tableau 4 : Efficacité relative de l'azotobactérisation des résidusphères par dopage molybdénique (erAZB) en terme de MSPA produite et de mobilisation élémentaire (MOB-) selon la sous- (P1/2x) ou sur- (P2x) abondance de P apporté et/ou la présence de chitine (CHT) au moment de la première coupe (cl) 28 jours post-semis. Modalité mgMSPA ugMOBN ugMOBP ugMOBCa u.MOBMg ngMOBZn P1/ 2x, sans CHT 1,05 1,11 0,95 1,07 1,05 0,93 P11,,, avec CHT 1,08 1,08 0,99 1,13 1,02 1,01 P2,, sans CHT 1,13 1,06 1,13 1,05 1,06 1,12 P2,, avec CHT 1,10 1,03 0,97 1,10 1,03 0,99 Tableau 5 : Efficacité relative de l'azotobactérisation des résidusphères par dopage molybdénique (erAZB) en terme de MSPA produite et de mobilisation élémentaire (MOB-) selon la sous- (PI/2x) ou sur- (P2x) abondance de P apporté et/ou la présence de chitine (CHT) au moment de la deuxième coupe (c2) 56 jours post-semis. Modalité mgMSPA ugMOBN ugMOBP ugMOBCa . ugMOBMg ngMOBZn P1/2,,, sans CHT 1,10 1,13 0,96 0,85 0,86 0,90 P1,Z,,, avec CHT 1,21 1,17 1,15 1,15 1,08 1,01 P2,, sans CHT 1,04 1,05 1,12 1,01 1,01 1,06 P2,,, avec CHT 1,03 1,04 1,07 1,07 1,00 0,99 25 -26-

Tableau 6 : Efficacité relative de l'azotobactérisation des résidusphères par dopage molybdénique (erAZB) en terme de MSPA produite et de mobilisation élémentaire (MOB-) selon la sous- (P12x) ou sur- (P2x) abondance de P apporté et/ou la présence de chitine (CHT) pour la somme des première et deuxième coupes (c12). Modalité mgMSPA ugMOBN ugMOBP ugMOBCa ugMOBMg ngMOBZn P1zx, sans CHT 1,06 1,12 0,96 0,97 0,94 0,92 P1/2x, avec CHT 1,12 1,11 1,06 1,14 1,05 1,01 Pte, sans CHT 1,10 1,05 1,13 1,03 1,04 1,09 P2x, avec CHT 1,08 1,03 1,01 1,09 1,01 0,99 L'erAZB est quasi-systématiquement en présence de CHT au sens de la présente invention, du moins en sous - abondance de P (P1,2x) ; si le P est surabondant (P2x), cette effet positif de CHT sur erAZB n'et plus appréciable, notamment et surtout pour ce qui concerne MOBP. Malgré une Anova peu ou pas conclusive - nb. seule l'effet de CHT en termes de MOBCa est véritablement significative en ce sens, j'ai néanmoins rapporté ces variations d'erAZB attribuable à CHT, somme toutes quasi-systématiquement positives, aux Figures 7, 8 et 9.

Cela dit, cette plus grande mobilisation du Ca attribuable à erAZB en présence du CHT présuppose une action des racines sur les réserves calco-magnésiques du P (apatite). En effet, à faibles concentration de P apporté (P1/2x) la mobilisation du P devrait en ce sens être mieux corrélé à celle de MOBCa, voire dans une moindre mesure MOBMg, du fait d'une dégradation concomitante de l'apatite du sol ; à plus fortes concentration de P apporté (P2x), cette attaque de l'apatite devient moins impérative et la susdite corrélation MOBP / MOBCa(Mg) moins prononcée. II devrait donc exister deux groupes d'observations - avec et sans surabondance de P apporté ; une seule corrélation tentant de cerner ces deux phénomènes sera du coup d'autant plus faibles.

A priori, j'ai repéré cette affaiblissement des corrélations MOBP / MOBCa(Mg) pourtant en principe (voir supra) nécessairement importantes. Voir en ce sens la petitesse des coefficients de corrélation Pearson (XLStatTM 2009) MOBP / MOBCa(Mg) aux Tableaux 7, 8 et 9. Tableau 7 : Coefficients de corrélation Pearsons pour la matière sèche des parties aériennes (MSPA) et l'ensemble de leurs mobilisations élémentaires (MOB-) obtenus au moment de la première coupe (cl) 28 jours post-semis ; Nb. Le faible degré de corrélation MOBP x MOBCa. mgMSPA ugMOBN ugMOBP ugMOBK ugMOBCa ugMOBMg mgMSPA 1 0,917 0,607 0,718 0,800 0,851 ugMOBN 0,917 1 0,377 0,591 0,930 0,881 ugMOBP 0,607 0,377 1 0,922 0,238 0,626 ugMOBK 0,718 0,591 0,922 1 0,534 0,838 ugMOBCa 0,800 0,930 0,238 0,534 1 0,865 ugMOBMg 0,851 0,881 0,626 0,838 0,865 1 30 Tableau 8 : Coefficients de corrélation Pearsons pour la matière sèche des parties aériennes (MSPA) et l'ensemble de leurs mobilisations élémentaires (MOB-) obtenus au moment de la deuxième coupe (c2) 56 jours post-semis ; Nb. Le faible degré de corrélation entre MOBP et MOBCa. mgMSPA ugMOBN ugMOBP ugMOBK ugMOBCa ugMOBMg mgMSPA 1 0,969 0,852 0,784 0,781 0,826 ugMOBN 0,969 1 0,774 0,805 0,841 0,868 ugMOBP 0,852 0,774 1 0,823 0,619 0,681 ugMOBK 0,784 0,805 0,823 1 0,906 0,925 ugMOBCa 0,781 0,841 0,619 0,906 1 0,975 ugMOBMg 0,826 0,868 0,681 0,925 0,975 1 -27-

Tableau 9 : Coefficients de corrélation Pearsons pour la matière sèche des parties aériennes (MSPA) et l'ensemble de leurs mobilisations élémentaires (MOB-) obtenus en additionnant les première et deuxièmes coupes (c12) ; Nb. Le faible degré de corrélation MOBP x MOBCa. mgMSPA mgMSPA ugMOBN ugMOBP ugMOBK ugMOBCa ugMOBMg 1 0,939 0,713 0,825 0,815 0,846 ugMOBN 0,939 1 0,503 0,696 0,903 0,887 ugMOBP 0,713 0,503 1 0,936 0,328 0,542 ugMOBK 0,825 0,696 0,936 1 0,565 0,740 ugMOBCa 0,815 0,903 0,328 0,565 1 0,936 ugMOBMg 0,846 0,887 0,542 0,740 0,936 1 J'ai illustré aux Figures 10, 11 et 12 cette plus grande dépendance de MOBP et de MOBCa(Mg) sans (-P) plutôt qu'avec (+P) surabondance de P apporté ; les pentes de ces régressions linéaires sont systématiquement plus faibles avec (+P) que sans (-P) phosphore apporté. Cette distinction est surtout évident pour MOBCa, ce qui laisse effectivement croire qu'il s'agit donc effectivement d'attaques racinaires des composés calco-magnésiques du sol, vraisemblablement d'autant plus importante en présence de CHT du fait d'une erAZB majorée (cf. Tableau 4, 5 et 6). Références, bibliographie et brevets pertinents Ahmad, Rizwan, Azeem Khalid, Muhammad Arshad, Zahir A. Zahir And Tariq Mahmood. 2008. Effect of compost 15 enriched with n and 1-tryptophan on soit and maize. Agron. Sust. Devel. 28 : 299-305 Bashan, Y. 1991. Changes in membrane potential of intact soybean root elongation zone cells induced by Azospirillum brasilense. Can. J. Microbiol. 37 : 958-963. Baureithel, Karl, Georg Felix, And Thomas Boll. 1994. Specific High Affinity Binding Of Chitin Fragments To Tomato Cells. THE Journal Of Biological Chemistry. Vol. 269, No. 27, Pp, 17931-17938, 1994 20 Bell, A. A., Hubbard, J. C., Liu, L., Davis, R. M., And Subbarao, K. V. 1998. Effects Of Chitin And Chitosan On The Incidence And Severity Of Fusarium Yellows ln Celery. Plant Dis. 82:322-328. Benhamou, N. 2004. Potential of the mycoparasite, Verticillium lecanii, to protect citrus fruit against Penicillium digitatum, the causal agent of green mold: a comparison with the effect of chitosan. Phytopathology 94:693-705. Boerjan, Wout, Maria-Teresa Cervera, Marianne Delarue, Tom Beeckman, Walter Dewitte, Catherine Bellini, Michel 25 Caboche, Harry Van Onckelen, Marc Van Montagu, And Dirk Lnzé. 1995. Superroot, A Recessive Mutation ln Arabidopsis, Confers Auxin Overproduction. The Plant Cell, Vol. 7, 1405-1419, September 1995 O 1995 American Society Of Plant Physiologists Bolier, Th. Chemoperception Of Microbial Signais ln Plant Cells. 1995. Ann. Rev.Plant Physiol..46.'189-214 Claude, P-P. Et L. Fillion. 2004. Effet De L'apport D'un Inoculum Bactérien Aux Résidus De Culture De Maïs-Grain Au Soi 30 Sur Le Rendement Et La Qualité De Blés D'hiver Panifiables En France. Agrosolutions 15(1) :23-29. Claude, P-P. Et M. Giroux. 2006. Effet Des Engrais Organo ù Minéraux Inoculés (EOMI) Sur La Croissance Des Plants De Maïs - Grain, Les Rendements, Les Prélèvements Des Éléments Nutritifs Et La Qualité Des Grains. Agrosolutions 17(1) : 51-64. Debaeke, Ph., M Cabelguenne ML Casals et J Puech 1996. Élaboration du rendement du blé d'hiver en 35 conditions de déficit hydrique. II. Mise au point et test d'un modèle de simulation de la culture de blé d'hiver en conditions d'alimentation hydrique et azotée variées : Epiephase-Blé. Agronomie 16:25-46 De Boer, W., S. Gerards, P.J.A. Klein Gunnewiek Et R. Modderman. 1999. Response Of The Chitinolytic Microbial Community To Chitin Amendments Of Dune Soils Biot Fertil Soils (1999) 29 :170ù177 De Jong, A.J., R. Heidstra, H.P. Spaink, B Marijke, V. Hartog, E.A. Meijer, T. Hendriks,' F. Lo Schiavo, CM. Van Kammen et 40 C. De Vries. 1993. Rhizobium lipooligosaccharides rescue a carrot somatic embryo mutant. Plant Cell 5 : 615. D'Haeze, W. Et N. Holsters. 2002. Nod factor structures, responses, and perception during initation of nodule development. Glycobiology 12 : 79R-105R. HIRSCH, A. M., T, T. V. Bhuvaneswarit, J. G. TORREY, AND T. BISSELING. Early Nodulin Genes Are Induced In Alfalfa Root Outgrowths Elicited By Auxin Transport Inhibitors. PNAS USA. 86 : 1244-1248 45 Kafetzopoulos, Dimitris T, George Thireos*, John N. Vournakist, And Vassilis Bouriotis. 1993. The Primary Structure Of A Fungal Chitin Deacetylase Reveals The Function For Two Bacterial Gene Products (Mucor Rouxu/Chltosan/Nodb/Peptidoglycan Deacetylase). PNAS USA 90 : 8005-8008. Kim, Jeong lm, Altanbadralt Sharkhuu, Jing Bo Jin, Pinghua Li, Jae Cheol Jeong, Dongwon Baek, Sang Yeol Lee, Joshua J. Blakeslee, Angus S. Murphy, Hans J. Bohnert, Paul M. Hasegawa, Dae-Jin Yun, And Ray A. Bressan. 2007. 50 Yucca6, A Dominant Mutation ln Arabidopsis, Affects Auxin Accumulation And Auxin-Related Phenotypes. Plant Physiology, November 2007, Vol. 145, Pp. 722ù735 Lambrecht, M., Yaacov Okon, Ann Vande Broek And Jos Vanderleyden. 2000. Indole-3-Acetic Acid: A Reciprocal Signalling Molecule ln BacteriaùPlant Interactions. TRENDS IN MICROBIOLOGY 298 VOL. 8 NO. 7 JULY 2000 Mathhesius, U., H.R.M. Schlaman, H.P. Spaink, C. Sautter, B.G. Rolfe Et M.A. Dkordjevic. 1998. Auxine Transport 55 Inhibition Precedes Rott Nodule Formation ln Whte Clover Roots And Is Regulated By Flavonoids And Derivatives Of Chitin Oligosaccharides. The Plant Journal 14 : 23-34. Müller, J., C. Staehelin, Zhi-Ping Xie, G. Neuhaus-Uri, et T. Bolier.. Nod factors and chitooligomers elicit an increase in cytosolic calcium in aequorin-expressing soybean cells. Plant Physiol. 124: 733ù739, 2941591 -28- Osuji, Godson 0. Et Raul G. Cuero. 1992. Regulation Of Ammonium Ion Salvage And Enhancement Of The Storage Protein Contents Of Corn, Sweet Potato, And Yam Tuber By N-(Carboxymethyl)Chitosan Application. J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 724-734. Prithivirajæ, B., X. Zhou Æ A. Souleimanov W.M. Kahn et D.L. Smith. 2003. A Host-Specific Bacteria-To-Plant Signal 5 Molecule (Nod Factor) Enhances Germination And Early Growth Of Diverse Crop Plants. Planta 216: 437û445 Rôhrig, H., J. Schmidt, R. Walden, I. Czaja, H. Lubenow, U. Wieneke, J. Schell et M. John. 1996. Convergent Pathways For Lipochitooligosaccharide And Auxin Signaling ln Tobacco Cells. PNAS 93 ;13389-13392 Schmidt, Jurgen, Ruth Wingender, Michael John, Ursula Wieneke, And Jeff Schell. 1988. Rhizobium Meliloti Noda And Nodb Genes Are Involved In Generating Compounds That Stimulate Mitosis Of Plant Cells. PNAS 85 : 8578-82 10 Schmidt, Jurgen, Ruth Wingender, Michael John, Ursula Wieneke, And Jeff Schell. 1993. Alteration of plant growth and development by Rhizobium noda and nodb genes involved in the synthesis of oligosaccharide signal molecules. Plant J. 4 : 651-656. Schlaman, Helmi R. M., Andreas A. Gisel, Nicolette E. M. Quaedvlieg, Guido V. Bloemberg, Ben J. J. Lugtenberg, Jan W. Kijne, Ingo Potrykus, Herman P. Spaink, And Christof Sautter. 1997. Chitin Oligosaccharides Can Induce Cortical Cell Division ln Roots Of Vicia Sativa When Delivered By Ballistic Microtargeting. Development 124, 4887-4895 Staehelin, Christian, T, Michael Schultze2,T, Eva Kondorosi', Robert B. Mellor', Thomas Bolier' And Adam Kondoroni. Structural Modifications ln Rhizobiurn Rne/I/Oti Nod Factors Influence Their Stability Against Hydrolysis By Root Chitinases. The Plant Journal (1994) 5(3), 31 9-330 Tsigos, J., Aggeliki Martinou, Dimitris Kafetzopoulos And Vassilis Bouriotis. 2000. Chitin Deacetylases: New, Versatile Tools ln Biotechnology. TIBTECH JULY 2000 (Vol. 18) : 305-3111. Wu, Chunfa, Rebecca Dickstein, Andrew J. Cary, And Joanna Hanks Norris. 1996. The auxin transport Inhibitor n-(i - naphthyl)phthalamic acid elicits pseudonodules on nonnodulating mutants of white sweetclover. Plant Physiol. 110: 501-510 Zahir, A.Z., H.N. Asghar, M.J. Akhtar Et M. Arshad. 2005. Precursor (L-Tryptophan)-Inoculum (Azotobacter) Interaction For Improving Yields And Nitrogen Uptake Of Maize. J. Plant Nutr. 28:805-817. Zhang, H., B. Prithiviraj, A. Souleimanov, F. D'Aoust, T.C. Charles, B.T. Driscoll Et D.L. Smith. 2002. The Effect Of Temperature an Genistein Concentration on Lipo-Chitooligosaccharide (LCO) Production By Wild-Type And Mutant Strains of Bradyrhizobium Japonicum. Soit Biol. Biochem. 34 : 1175-1180.

Zhao, Yunde. 2008. The Rote of Local Biosynthesis of Auxin and Cytokinin in Plant Development. Curr. Op Plant Biol. 2008, 11:16û22

Claims

REVENDICATIONS1. Combinaison de chitine (CHT) capable de libérer des chito-oligosaccharides (COS) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation destinée aux cultures non- légumineuses et appliquée par pulvérisation et/ou pelliculage à divers supports organiques non-bactéricides capables de véhiculer CHT et TRP en proximité des racines et radicelles des dites cultures caractérisée en ce que les supports organiques non-bactéricides permettent de véhiculer CHT, TRP et sont choisis parmi un groupe comprenant les résidus de cultures pailleux au sol en pré-semis d'une grande culture d'hiver ou d'une culture intermédiaire piège à nitrate, une fumure de fond organo-minérale, un engrais starter organo-minéral, voire des semences de grandes cultures ou de cultures fourragères Poaceae et/ou Brassicaceae.
2. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la dose-hectare de TRP et comprises entre 1 et 100 g, préférablement entre 1 et10 g.
3. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon une quelconques des revendications précédentes caractérisée en ce que la dose-hectare (dose-hectare) de CHT est comprise entre 10 et 1 000 g, plus particulièrement entre 250 et 500, préférablement 300 g.
4. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que les chito-oligosaccharides (COS) provenant de la dégradation de CHT comportent de 4 à 6 résidus glucosamines, et préférablement que 5 résidus.
5. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que des bactéries biofertilisantes viables de la famille des Azotobacteraceae (AZB) û correctement formulées et conditionnées à cet effet selon les règles de l'art, sont apportées auxdits supports organiques et non-bactéricides.
6. Combinaison de chitine (CHT) et de tryptophane (TRP) entant que méthode de biofertilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que les apports desdites bactéries de la famille des Azotobacteraceae (AZB) auxdits supports organiques et non-bactéricides comportent entre 1 et 10 x 1012 cellules Azotobacteraceae par hectare, préférablement 5 x 1012 cellules Azotobacteracea par hectare.
7. Procédé de biofertilisation pour grandes cultures et cultures intermédiaires pièges à nitrates non-légumineuses selon un une quelconque des revendications précédentes comprenant le traitement de supports organiques non-bactéricides avec un précurseur métabolique d'auxines phytogènes, avantageusement du TRP, d'un co-formulant chitinique tel que la CHT, voire et avantageusement un inoculum azotobactérien (AZB). - 29 -