FR2941592A1 - Utilisation du molybdene (mo) en nano-dosage en presence de tryptophane (trp) pour la biofertilisation des grandes cultures non legumineuses - Google Patents

Abstract

La solution technique proposée consiste en une combinaison du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) lorsqu'apportés en proximité des racines pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de cultures pailleux au sol ou d'engrais organo-minéraux non-bactéricides. Le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par pulvérisation liquide des résidus de culture pailleux au sol pré-semis d'une grande culture d'hiver. Pareillement, le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide et utilisé comme engrais starter au printemps ou comme fumure de fond à l'automne. Dans tous les cas, la dose-hectare de Mo ne dépasse pas 10 g, et celle du TRP 25 g, tandis que dans la pratique, la dose-hectare de Mo est ainsi minorée de 33 à 25 g, plus particulièrement de 25 à 10 g, et avantageusement de 10 à au moins 1 g. De plus, les lesdits résidus de culture pailleux au sol et EOM sont bactérisés à l'aide d'une dose hectare de biomasses Azotobacteracea rustiques, bien adaptées à la vie dans les sols arables et obtenues expressément à cet effet contenant au moins 5 x 10 cellules viables et correctement formulées et conditionnées. Les grandes cultures non-légumineuses sont choisies parmi un groupe comprenant les céréales d'hivers - y compris le blé, l'avoine, l'orge, le seigle et le triticale, le colza d'hiver, le maïs et le sorgho.

Description

DESCRIPTION DE L'INVENTION

TITRE NANODOSAGE DU MOLYBDÈNE (MO) EN PRÉSENCE DE TRYPTOPHANE (TRP) DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION

Le domaine technique de l'invention concerne la biofertilisation bactérienne, notamment azotobactérienne des grandes cultures agronomiques. Il est aussi question de l'utilisation de coproduits issue de la fabrication industrielle de biomasses microbienne et contenant une certaine quantité d'oligo-élements, co-facteurs enzymatiques et précurseurs d'acides aminés.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE LA BIOFERTILISATION AZOTOBACTÉRIENNE : AZOTE MINÉRAL (NM) ET FERTILISATION RAISONNÉE (FR)

Les BFCP (bactéries favorisant la croissance des plantes) colonisent, outre les racines de certaines cultures, les résidus de cultures (pailleux), les engrais organominéraux et/ou les 20 biomasses racinaires résiduelles. Les mécanismes responsables de l'amélioration de la croissance comprennent : (i) la production de sidérophores extracellulaires (agents microbiens de transport du fer) qui peuvent s'associer de manière efficace avec le fer présent dans l'environnement en le rendant moins disponible pour certaines microflores naturelles nonphytogènes, (ii) l'antibiose contre des bactéries et des champignons pathogènes, (iii) la production 25 de substances favorisant la croissance, et iv) la solubilisation des phosphates organiques et inorganiques. Les BFCP appartiennent à plusieurs genres, y compris Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Cellulomonas, Erwinia, Fiavobacterium, Pseudomonas, (Brady)rhizobium et Xanthomonas.

30 Plus particulièrement, la biofertilisation azotobactérienne consiste en l'utilisation d'inocula BFCP diazotrophes, avantageusement Azotobaceraceae. Les bactéries membres de la famillie Azotobacteraceae sont de bactéries libres, aérobies et capables de fixer l'azote de manière non symbiotique. Leurs populations peuvent varier dans le sol mais ne dépasse que très rarement 102 à 103 par gramme de sol. Ces inocula sont, contrairement aux inocula constitués de rhizobia 35 symbiotiques, généralement appliqués aux résidus de cultures pailleux au sol, aux engrais organominéraux. Le genre Azotobacter est composé d'au moins 6 espèces: Azotobacter armeniacus, Azotobacter beijerinckii, Azotobacter chroococcum, Azotobacter nigricans, Azotobacter paspali et Azotobacter vinelandi.

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Or, en raison de la concurrence entre les racines et les bactéries du sol pour l'azote (Hodge 2004, Hodge et al. 2000, Jingguo et Bakken 1997), la présence de biomasses azotobactériennes réintroduites dans la résidusphère lors de la valorisation microbiologique des résidus de culture au sol (Claude et Fillion 2004, Harper et Lynch 1984, Halsall 1993 et Halsall et Gibson 1991) peut nuire au rendement agronomique. Pourtant, ce simple constat à longtemps été ignoré, ce qui amena les agronomes, notamment sud-est asiatiques, à préconiser la sous-fertilisation azotée en présence de tels inocula (Senapati et al 2004, Kader et al. 2000 et 2002, Mahboob et Asghar 2002, Idris 2003). En procédant ainsi, cette sous-fertilisation N devait éviter de réprimer l'appareil diazotrophique, via l'opéron nifLA (Brewin et al. 1999).

En sus d'être particulièrement sensible à la sous-fertilisation azotée, la valorisation azotobactérienne des résidus de culture pailleux au sol en guise de biofertilisation peut aussi accentuer le rationnement végétatif des grandes cultures céréalières. Bien que ce rationnement végétatif soit globalement souhaitable, sont accentuation est cependant risquée, notamment en absence de fertilisation raisonnée, et peut engendrer des carences en azote de la culture dès la sortie d'hiver. En effet, cette indisponibilité de l'azote crée une concurrence entre les Azotobacteraceae et les racines, nécessairement au dépends des racines vue leurs moindre compétitivités (Jingguo et Bakken 1997 ; Hodge et al. 2000), ce qui globalement réduit IR (indice de récolte).

Cela dit, une simple sur û fertilisation , par exemple l'apport de 60 unités (kg) d'azote par hectare en plus des 120 autrement apportées sera elle aussi incapable de valoriser immanquablement ledit effet phytogène des Azotobacteraceae détectables avant BBCH 41. Par exemple, malgré une efficacité relative des Azotobacteraceae plus appréciable en termes de MSPA (matières sèches des parties aériennes) en présence de 180 Un au lieu des 120, les RDT (rendement en grain à la récolte) et PMG (poids de mille grains à la récolte) ne seront pas pour autant nécessairement améliorés. Pire, cette amélioration de l'état nutritionnel N de la plante et du sol en sortie d'hiver pourrait nuire au rationnement végétatif et provoquer une certaine chute d'EPM (nombre d'épis par m2 ; Debaecke et al. 1996).

La valorisation azotobactérienne des résidus de culture au sol nécessitera donc l'application et l'adaptation de protocoles de fertilisation raisonnée ; cela fut démontré lors des essais agronomiques rapporté dans Claude et Fillion 2004.

SUR-IMMOBILISATION D'NM ET RATIONNEMENT VÉGÉTATIF ; UNE ÉVENTUELLE CONTREPRODUCTIVITÉ ?

L'azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol peut donc nuire au rationnement végétatif de la culture non seulement en provoquant une trop forte carence en N mais aussi, au contraire, en re-larguant trop d'N avant la sortie d'hiver. A noter que le phénomène de rationnement végétatif chez les céréales d'hivers est impliqué dans le passage de la plante de

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l'état végétatif à l'état reproducteur. Parmi les facteurs liés à la plante pouvant influencer ce passage à l'état reproducteur û et donc à la formation des puits, il y a des exigences d'ordre qualitatif ; de façon générale, une alimentation de la plante trop riche en azote favorisera le développement végétatif au détriment de l'appareil reproducteur. Cette observation vaut pour l'alimentation organique interne, mais aussi pour l'alimentation minérale et hydrique.

Selon Debaecke et al 1996, le développement du blé ce fait en quatre temps ; Dl (BBCH 09-30 û levée à tallage), D2 (BBCH 30-40 û élongation de la tige principale), D3 (BBCH 41-73 û gonflement de l'épi au stade laiteux de grains) et D4 (BBCH 74-99 û maturation et récolte des grains). Selon Debeacke et al. 1996, une réduction de P/NGR (poids/nombre de grains par épi) et/ou d'IR (indice de récolte ; harvest index angl.) indique qu'au-delà de D3 (BBCH 41), la disponibilité de l'azote est insuffisante et pénalisera la formation des gains et/ou leurs remplissages ; cette même carence en N dès BBCH 41 pénalisera d'avantage N/PGR que MSPA (matières sèches des parties aériennes) et/ou RDT (rendement en grains à la récolte). En ce sens, P/NGR devraient donc être particulièrement sensibles à une éventuelle sous-fertilisation en présence d'Azotobacteraceae. Une carence en N attribuable à l'activité des Azotobacteraceae en début de développement affecterait la culture différemment qu'une carence en sortie d'hiver (BBCH 31). Par exemple, selon Debaecke et al. 1996, une carence en N avant BBCH 41 favorisera une augmentation de l'indice de récolte, tandis qu'une carence en N imposée après BBCH 41 pénalisera plutôt le nombre de grains par épis. Afin d'optimiser cette fertilisation raisonnée, il faut entrevoir à quels stades de la culture cette éventuelle carence en N intervient.

L'azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol peut donc contribuer doublement à la réduction d'N/PGR ; (i) en évitant un rationnement végétatif en phases Dl et D2, et (ii) en provoquant une carence en N par après en D3 au détriment du nombre et du poids des grains par épi. Elle peu aussi au contraire trop accentuer ce rationnement végétatif et/ou re-larguer trop d'N en sortie d'hiver. Encore une fois, idéalement ce déphasage des fournitures en N pourrait être évité par une fertilisation raisonnée bien menée au sens de Claude et Fillion 2004 ; malheureusement, cette fertilisation raisonnée n'est pas toujours systématiquement appliquée.

LE MOLYBDÈNE (MO) COMME OLIGOÉLÉMENT EN AGRONOMIE ET BIOFERTILISATION MICROBIENNE

Aujourd'hui, le molybdène (Mo) joue un certain rôle en production végétale (Kaiser et al 2005), essentiellement entant que cofacteur enzymatique de plusieurs métabolismes importants, y compris celui des nitrates et de l'azote diatomique. Le Mo joue aussi un rôle dans la rhizosphère du fait de son interaction avec certaines bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP), notamment pour ce qui concerne leurs enzymes nitrate réductase et nitrogenase (El-Samad et al. 2005). Les sols arables sont relativement pauvres en Mo (Goldberg et al. 2002). De plus, et à la vue de son utilité agronomique, le Mo est une matière première coûteuse û soit de l'ordre de 300 euros par kg. Par exemple, la dose-hectare (dose-hectare) habituellement recommandée pour les

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légumineuses à grains est de 40 à 100 g, soit un prix de vente à l'agriculteur de l'ordre de 30{ ; ce prix de vente est généralement prohibitif pour ce qui concerne la production céréalière.

La fertilisation Mo des légumineuses, bien qu'a priori la plus utile à ce jour du fait que leur symbiose avec certaines espèces Rhizobiaceae diazotrophes, est pourtant en principe difficile parce que les Rhizobiaceae sont moins accessibles que des BFCP non - symbiotiques et qu'en plus le Mo in planta est préférablement translocaliser vers les Rhizobiaceae (Brodrick et Giller 1991). Les carences en Mo de ces symbiotes ne seront apparentes que lors de déficits majeurs de Mo peu réconciliables avec une gestion approprié des sols arables. Or, il existe pourtant aujourd'hui des produits biofertilisants à base de Mo (FixaMo , 40 à 100 g / ha, Agronutrition SA, France) destinés ù entre autres, à l'optimisation de cette interaction Rhizobiaceae x Fabaceae.

La fertilisation Mo des céréales est elle moins étoffée. En effet, selon Loué 1993, la déficience Mo à très peu d'importance sur Poaceae (graminées) ; selon lui, la déficience Mo n'a pas été détectée sur céréales en France. Cela dit, et ce fondant sur une éventuelle limitation de l'utilisation de l'azote en raison d'une insuffisance de la nitrate réductase ù enzyme molybdénique impliqué dans l'assimilation de l'azote par la plante, certains auteurs (op cit Loué 1993) ont pu détecter des effets de la fertilisation Mo sur les rendements céréaliers, mais cela seulement dans les cas de sols très pauvres en Mo-extractible. En ce sens ù selon Loué 1993, sur céréales, les déficiences Mo ne devraient ce manifester que sur sols à moins de 10 ng (nanogramme)-Mo par g de sol.

Pourtant, dans la résidusphère, le métabolisme azotobactérien est affecté par la disponibilité du molybdène (Mo), cofacteur du complexe enzymatique nitrogenase responsable de la réduction de l'azote diatomique (Igarashi et Seefeldt 2003). En effet, la plupart des 50 enzymes molybdèniques, soit environ 90% sont exclusivement bactériennes (Mendel 2007). Parmi celles-ci, seule la nitrogenase comporte un facteur Mo qui n'est pas lié à une molécules ptériques (Mendel et Hânsch 2002). Le Mo, comme le fer (Fe), est dans une moindre mesure le vanadium (V) sont des cofacteurs essentiels pour le fonctionnement du complexe nitrogenase (Igarashi et Seefeldt 2003 ; Loveless et al. 1999). Bien que sa présence et ou sa concentration, au delà d'un certain seuil critique, ne sont pas nécessairement directement reliés au taux d'activité dudit complexe (Jacobson et al. 1986), l'apport de compléments de Mo est parfois jugé utile en agronomie, du moins pour ce qui concerne les cultures légumineuses en symbioses avec des Rhizobiacea fixateurs d'azote, eg. ù 40 à 100 g / ha via des produits tels que FIxAMo .

En situations écologiques où le taux de la production de biomasse aérienne (phytomasse, ou MSPA ù matière sèche des parties aérienne) reste somme tout modéré, du moins en régions tempérées, la disponibilité du Mo dans les sols n'est généralement pas limitative. Or, en situations agronomiques, surtout si l'activité azotobactérienne est augmentée suite à l'incorporation au sol de résidus de culture pailleux et/ou racinaire, voire par la bactérisation azotobactérienne de ceux-ci, la disponibilité du Mo peut en principe être insuffisante pour permettre le plein rendement de la -

diazotrophie azotobactérienne. Un éventuel effet favorable des Azotobacter sur les rendements serait donc minoré, voire indétectable. Dans de telles situations, l'apport de Mo est envisageable.

ROLE DU TRYPTOPHANE (TRP) COMME PRECURSEUR D'AUXINES CHEZ LES BACTERIES DU SOL L'utilisation agronomiques de TRP comme précurseur d'auxines est connue (Arshad et Frankenberger 1991, 1998). Par exemple, Zahir et al 2005 démontrèrent que des apports de TRP comme précurseurs d'auxines lors d'inoculations de sols et/ou de semences eurent des effets phytogènes, et cela à des doses équivalentes à quelques g par hectare, voire moins, bien que les auteurs reconnaissent que l'application agronomique de cette approche, dites précurseur û inoculum , fait aujourd'hui défaut (El-Samad et al 2005). La dose-hectare (dose-hectare) de TRP elle, même si on utilise du TRP raffiné quasi pur, n'est que de 1{ pour une dose-hectare d'environ 5 à 10 g (cf. Zahir et al. 2005, Ahmed et al. 2008).

A noter aussi que chez les plantes le TRP n'est plus reconnu comme le véritable û ou du moins l'unique et principal, précurseur immédiat des auxines, comme c'est effectivement le cas chez les bactéries (Baldi et al. 1991) ; l'origine microbienne de cette phytohormone est donc d'autant plus importante pour la plante. Cette origine essentiellement microbienne des auxines dans les sols û voire généralement issues d'un précurseur TRP, explique en bonne partie l'effet fortement phytogène û du moins en termes de MSPA (matières sèches des parties aériennes) indépendamment de MOBN (mobilisation de l'azote (N) par les MSPA), des apports de TRP exogènes, et cela notamment en présence d'inocula BFCP. Cet effet phytogène des BFCP auxinogènes est comme de raison surtout détectable en début de culture, voire au stade plantule lors d'essais en pot, les auxines produites par la plante elles même n'intervenant que plus tard à des stades BBCH plus avancés.

INTERACTION PRIVILIEGIEE DE MO ET TRP AU SEIN DE LA COMPOSANTE I DE LA NITROGENASE (NIF)

La nitrogenase est un complexe oligomérique composé de deux types bien différents de protéines. L'une, dépourvue de tryptophane, la ferro û protéine dite composante 11, est un homodimère (PM du protomère = 34 000) qui enrobe un centre Fe4S4 et possède deux sites de fixation pour I'ATP. L'autre, la ferro û molybdo û protéine dite composante 1, est un tetramère (PM 220 000) de stoechiométrie a2132. Cette protéine, renferme deux atomes de Mo, de 28 à 32 atomes de Fe, et autant de S. Le rapport moléculaire Fe/Mo pour la composante ferro- molybdénique de la nitrogenase (i.e. la dinitrogenase) est donc d'environ 15.

Or, le Mo n'est présent que dans l'une des composantes du complexe NIF, la composante I dont une des caractéristique, contrairement à l'autre composante dite Il, est de comporter un quantité appréciable de TRP, soit 2,5%, i.e. jusqu'à 4 à 5 fois plus que dans l'ensemble de la cellule, la composante Il ne contenant elle que du Fe et pas de Mo (Yates et Planqué 1975). La présence du -6-

TRP et du Mo dans le Composante 1 du complexe NIF, dite Act et Av1, pour ce qui concerne Azotobacter chroococcum et A. vinelandii, respectivement, lui est donc caractéristique. Pourtant, la littérature scientifique et technique ne fait aucune mention explicite de cette caractéristique (eg. Igarashi et Seefeldt 2003, Corbett et la. 2006, Hu et al. 2004 et 2006, Dean et al. 1993, Xie et al. 2004). Cette présence de Mo et du TRP en association exclusive au sein de ladite composante I n'est jamais soulignée ou expliquée dans la littérature scientifique consultée. Par exemple, Deistung et Thorneley 1986 ont omis de déterminer la teneur en TRP de ladite composante I, sans pour autant expliquer le pourquoi de cette omission. L'étude la plus pertinente est celle d'El-Samad et al (2005) qui démontre un certain effet positif du Mo complémentaire sur l'activité diazotrophe d'Azospirillum inoculé aux racines de blé. Pourtant, ces Azospirillum sont apportées par pelliculage des semences et par bactérisation des résidus de culture ou d'amendement organiques, et cela sans un apport complémentaire de TRP. Enfin, selon Davey et Bruijn (2000) et Yeliseev et al. (2000) - les seules mentions à ma connaissance d'une richesse particulière en TRP d'une quelconque protéine bactérienne autre que NIF, un certain homologue d'une protéine riche en tryptophane - la TspO, serait impliquée dans la régulation du niveau de rusticité et d'adaptation à la vie dans les sols en conditions oligotrophiques. Or, comme un nombre de protéines, cet analogue intègre un cofacteur Fe sans pour autant nécessiter du Mo en association à TRP.

COMPETITIVITE DES BFCP A L'EGARDS DES RACINES POUR LE TRP ET LE MO Du fait de leurs métabolismes et de leurs petites tailles û d'où des surfaces unitaires très importantes et des capacités d'absorption d'autant plus grandes, les bactéries du sol, et les BFCP en particulier, sont plus compétitives que les racines pour les nutriments et cofacteurs métaboliques tels que le TRP et le Mo. Cette plus grande compétitivité est généralement désavantageuse en agronomie du fait qu'elle implique une concurrence contreproductive plant / microorganisme, notamment en termes d'alimentation azotée. De plus, selon Kinraide (1981) le transport intercellulaire d'acides aminés est beaucoup plus versatile et spécifique (à chacune des espèces acides aminés) chez la bactérie que chez la plante. Chez la plante, le prélèvement et le transport d'un acide aminé inhibe donc généralement le prélèvement et le transport des autres acides aminés ; les acides aminés sont ainsi en compétition les unes avec les autres pour essentiellement les mêmes mécanismes de transports et canaux moléculaires. Cela explique en partie pourquoi les bactéries du sol concurrencent effectivement avec les racines pour les quelques acides aminés naturellement présentes dans les sols arables (Jones et al 2005a, 2005b), et que les plantes sont plus ou moins condamnées , du moins en situations agronomiques, à prélever essentiellement que de l'azote minéral.

Or, et paradoxalement, toute mesure pouvant doper l'activité des bactéries en proximité des résidus de culture au sol une fois enfouis dans la couche arable, et plus particulièrement ici les Azotobacteraceae, pourra aussi à court terme concurrencer la culture en cours d'implantation. Par exemple, l'apport ciblé de Mo û bénéfique en principe à l'activité de la nitrogenase (NIF)

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azotobactérienne pourrait aussi avoir un effet temporairement délétère sur le développement initial de la culture céréalière d'hiver.

LE MO LIMITE L'ACTIVITE DES POPULATIONS AZOTOBACTERACEAE IN SITU Contrairement aux autres oligoéléments métalliques, la chimie du Mo relève de la chimie des anions, et surtout MoO42-. Dans les sols arables, le Mo peut se trouver, 1) comme faisant partie de certains minéraux, 2) sous forme d'anion échangeable adsorbé par les colloïdes du sol, 3) lié à la matière organique et/ou 4) dans la solution du sol (Loué 1993). La teneur normale des sols en Mo est située entre 0,5 et 5 ug par g de sol (moyenne de 2), bien que celle-ci ne rende pas compte de la phyto-disponibilité du Mo. Or, le pH est le facteur principale qui détermine cette phytodisponibilité, la force d'adsorption du Mo diminuant avec l'élévation du pH entre 4,5 et 7,8, approximativement ; en ce sens, la dynamiques de la phytodisponibilité du Mo resemble en principe à celle des anions phosphate - PO4-.

Au sein de la dinitrogenase, il existe une molécule (atome ; pm 95) de Mo pour environs 25 molécules de tryptophane (pm : 138) ; les besoins en TRP sont donc de 25 fois ceux du Mo û pour ce qui concerne la formation du complexe NIF (nitrogenase) du moins. Cependant, les sols agricoles ne sont pas nécessairement capables de fournir un plein complément de Mo à une flore azotobactérienne en pleine expansion du fait d'un apport massif de substrat carboné, suite à l'enfouissement des résidus de culture au sol par exemple. En effet, l'activité de la nitrogenase azotobactérienne peut être utilisée comme indicateur de la biodisponibilité d'un sol arable (Franco et al. 1978).

Actuellement l'efficacité pondérale du Mo en situations agronomiques fait que ses doses-hectare sont nécessairement dix fois plus grandes que celles du TRP. Étant donné le coût du Mo û environ 300{ el kg en 2008, soit plus de 4 fois celui du TRP, l'efficacité pondérale du Mo peut être vue comme 40 fois trop faible pour assurer une véritable rentabilité agronomique de ce cofacteur métallique, notamment s'il doit être apporté conjointement avec du TRP.

A noter enfin que le fer (Fe) est tout aussi essentiel au fonctionnement de la dinitrogenase û via la formation d'un cofacteur tandem Fe-Mo. Or les teneurs en fer assimilable des sols arables sont très supérieures à celles du Mo, soit par un facteur de 100, voire 1 000. En effet, dans un sol arable le rapport entre l'extractabilité du Fe par rapport à celui du Mo est d'environ 1 500 ; les teneurs en Fe de la plante entière et, plus particulièrement de sa dinitrogenase sont en moyenne de 150 et 15 fois supérieure à celles du Mo. Cette disproportion remet encore plus en perspective le rôle limitant du Mo en situations agronomiques impliquant l'enfouissement de résidus de culture pailleux au sol.

QUELQUES BREVETS PERTINENTS ?

Une recherche préliminaire révéla quelques demandes de brevets initialement jugées comme pertinentes. II s'agit des demandes US 20081194407 Al, FR 2 910 230 Al et US 4 077 793 A.

Or, US 20081194407 Al décrit la valorisation agronomique de la chélation û phénomène physico-chimique bien connu, de métaux, y compris le fer, le calcium, le magnésium et û surtout en ce qui nous concerne ici, le molybdène. Cette chélation métallique est expressément destinée à l'amélioration de l'efficacité pondérale de ces métaux lorsque appliqués à une plante (revendication (R)50), y compris via les feuilles (R74), les semences et/ou au sol en proximité immédiate de celles-ci (R75, R77), les racines (R76), ou encore les fruits (R78). Il n'est nullement question d'appliquer cette chélation métallique métaboliquement active aux résidus de culture pailleux au sol et/ou à des EOM pondéreux, et cela nonobstant la mention de sels azotés [0034] qui laisse entendre qu'il y de facto la formation de mélanges organo-minéraux à base d'agents chélateur (organo-) et de sels azotée et de métaux (minéral).

Sans mentionner le Mo, US 4 077 793 A, lui, préconise néanmoins l'utilisation de catalyseurs enzymatique (colonne 2, ligne 4), et û sans surprise, d'acides aminés phytogènes (phytohormonales) tel que et comme de raison le TRP, et cela avantageusement en présence d'Azotobacteraceae. Disons que dans ce cas-ci (US 4 077 793 A) le titanium (sic) (Ti, ou titane) et/ou le wolfram (W, ou tungstène) sont effectivement des analogues métaboliques du Mo lorsqu'utilisés comme catalyseurs enzymatique . (Nb. Cette supposition est raisonnable û voire démontrée depuis, en raison de la proximité au sein de tableau périodique des éléments de ces trois éléments de transition.) US 4 077 793 A propose néanmoins en premier (colonne 2, lignes 23 à 25) de traiter les semences, et dans un deuxième temps le sol, directement. II n'est pas question dans US 4 077 793 A de cibler préférentiellement, voire exclusivement, les susdits résidus de culture pailleux au sol et EOM starter ou fumure de fond, matières fertilisantes et amendements par définition pondéreux et donc aux yeux de l'homme de métier a priori pas attrayantes comme cibles privilégiées par rapport aux semences et/ou le sol qui les entours immédiatement.

Enfin, FR 2 910 230 Al concerne effectivement une méthode d'utilisation de biomasses bactériennes via leurs mises en contacte avec des résidus de culture pailleux au sol et/ou des EOM ; l'application conjointe de cofacteurs enzymatiques métalliques et/ou de précurseurs phytohormonaux n'est pas mentionné. L'utilisation de telles micro-doses de molécules somme tout coûteuses pour un usage agronomique, en combinaison à des engrais et amendements aussi pondéreux n'étant pas évident ni pour l'inventeur, ni pour la personne de métier. -8- DÉFINITIONS

Résidusphère : Volume de sol entourant immédiatement les résidus de culture pailleux, engrais organominéraux (EOM) et/ou biomasses racinaires résiduelles, et plus ou moins influencé par ceux- ci. Il est aussi question d'un noyau où se situe la décomposition desdits résidus de culture. Les microorganismes responsables de la décomposition des résidus de culture sol et sont particulièrement actifs dans la résidusphère. Phytogène : Action d'une molécule ou d'un microorganisme permettant d'augmenter la production de phytomasse de façon non - pondérale, c'est-à-dire de façon disproportionnée par rapport aux augmentations de rendements normalement attribuables aux engrais NPK plus conventionnels. Fumure de fond : engrais ou de fumier appliquée avant ou pendant le semis. La plupart des éléments nutritifs secondaires et des oligoéléments incorporés au sol font partie de la fumure de fond avec une partie de N et l'ensemble de P et K pour les cultures annuelles. Engrais starter : Une fumure de fond particulière, granulée et généralement déposée en bandes en proximité des semences au moment du semis. Un engrais starter est généralement riche en P afin d'éviter la fixation ce celui-ci, élément nutritif peu/pas mobile in situ, avant l'arrivé des racines. Rationnement végétatif ; Appauvrissement ù intentionnel généralement, des teneurs en azote des phytomasses aérienne des grandes cultures céréalières d'hiver à l'automne afin de favoriser le développement reproducteur ù i.e. en termes agronomiques de la taille et du nombre des puits (sinks) capable de stocker éventuellement et jusqu'à la récolte les assimilats photosynthétiques.

DIVULGATION DE L'INVENTION

Problème technique 25 La biofertilisation azotobactérienne est particulièrement sensible à la sous- ET la sur-fertilisation azotée. La sous-fertilisation N ù en saison d'une concurrence des bactéries du sol pour l'Nm devenu rare, provoquera une carence en N malencontreuse au-delà de ce qui est nécessaire pour assurer un simple rationnement végétatif. La sur-fertilisation N elle provoquera une production trop 30 importante de MSPA et/ou une répression de NIF chez les Azotobacteraceae. Bien que la fertilisation raisonnée avec pilotage des apports d'engrais azotés puisse en principe éviter ce déphasage des fournitures en N, elle n'est pas/plus systématiquement mise en oeuvre en raison ù semblait-il, d'une technicité trop contraignante.

35 Dans une logique de d'immobilisation / mobilisation de l'azote au profit de la culture d'hiver en place propre à la biofertilisation par azotobactérisation des résidus de culture pailleux au sol ù et cela sans nécessairement recourir à la fertilisation raisonnée, il est important de chercher à maximiser l'immobilisation des reliquats d'Nm à l'automne, maximisant ainsi la mobilisation éventuel de cet azote - en plus de celui provenant de Nif maintenant d'autant plus précoce, dès 40 son re-largage en sortie d'hiver. Cela dit, cette sur-immobilisation automnale provoquera une telle réduction de la MSPA qu'elle pourrait à terme être contreproductive en accentuant trop le rationnement végétatif de la culture, rationnement pourtant recherché en soi. II s'agit donc de -9- - 10 -

trouver comment atténuer de tels éventuels effets contreproductifs d'une telle sur-immobilisation des reliquats d'azotes pouvant malencontreusement sur-dimensionner le rationnement végétatif.

Normalement, i.e. sans l'inoculation azotobactérienne des résidus de culture au sol et des engrais organo-minéraux, voire d'une certaine suractivité du complexe nitrogenase dans la résidosphère, le Mo n'est pas limitatif et l'apport de TRP peu recommandable économiquement. En effet, et faute de méthodes de biofertilisation innovantes en ce sens, l'utilisation simple de ces matières engendraient des coûts des doses - hectare (dose-hectare) de l'ordre de 35-40{ ; a noter que le prix de revient d'une dose-hectare de biofertilisants devrait avantageusement être aux alentours de 7,5{. Or, en présence d'une telle suractivité, induite soit par l'incorporation desdits résidus de culture inoculés par exemple, la disponibilité du Mo peut être limitative du fait de la prolifération du complexe nitrogenase. Pire, cette suractivité azotobactériennes peut même à court terme compromettre la production de phytomasse par la culture en cours d'implantation du fait d'une concurrence pour les éléments nutritifs autrement facilement prélevés par les racines. L'apport ciblé de Mo û bénéfique en principe à l'activité de la nitrogenase (NIF) azotobactérienne pourrait aussi avoir un effet temporairement délétère sur le développement initial de la culture céréalière d'hiver. Il serait utile de trouver une approche simple susceptible d'atténuer cette apparente contreperformance d'un telle biofertilisation azotobactérienne.

Le problème technique provient aussi du fait que l'efficacité pondéral du Mo est trop faible pour permettre l'utilisation d'une dose-hectare économiquement rentable sur grandes cultures non-légumineuses. Étant donnée le coût du Mo, la dose-hectare généralement applicable aux cultures légumineuses à grains telles que le soja est trop importante pour être économiquement rentable en production céréalière. Donc, et bien qu'en principe le Mo peut complémenter l'activité du complexe NIF (nitrogenase) azotobactérien, la dose-hectare de Mo habituellement apportée aux cultures légumineuses devra être réduite d'environ 90%, soit avantageusement de l'ordre de 1 à 10 g au lieu de 40 à100, pour être économiquement rentable en production céréalière. De plus, des apports ciblés de Mo à la flore azotobactérienne du sol pourraient s'avérer contreproductives à court terme du fait d'une importante concurrence ponctuelle des Azotobacteracea pour divers éléments nutritifs autrement facilement prélevés par les racines de la culture en place.

Le problème technique consiste donc à trouver un moyen de compléter l'alimentation en Mo et en TRP de la flore azotobactériennes du sol capable de favoriser la croissance des plantes, notamment en présence de résidus de culture pailleux enfouis et/ou sans avoir à nécessairement recourir à la fertilisation raisonnée. Cela devra aussi ce faire à l'aide de substances somme tout relativement coûteuses, et cela tout en atténuant une éventuelle contre-productivité de cette stimulation des Azotobacteraceae sur la production de phytomasse par la culture en cours d'implantation. En d'autres mots, il faut impérativement trouver une approche simple susceptible d'atténuer cette apparente contreperformance d'un telle biofertilisation azotobactérienne via l'apport de simples compléments de Mo. Alimenter en Mo une population Azotobacteraceae -11-

grandissante du fait de l'incorporation de résidus de culture pailleux au sol est donc (pré)jugée comme contraire au but premier de l'agronomie qui est de nourrir les plantes, et non la microflore bactérienne du sol.

Solution technique

L'auxèse provoquée par l'application d'auxines et/ou de leurs précurseurs ù le TRP notamment, seront ici mise à contribution afin de réduire l'éventuelle contreproductivité d'une certaine sur-immobilisation des reliquats automnaux d'Nm par des populations Azotobacteraceae, sur- immobilisation pourtant en principe utile en termes de rationnement végétatif.

Or, nous avons constaté que cette atténuation de la contre-productivité de la sur-immobilisation des reliquats automnaux d'Nm est efficace surtout si les précurseurs ù le TRP notamment, soit appliqués en combinaison avec une dose minime ù une nanodose dans les faits (voir infra), de molybdène (Mo), soit de l'ordre d'un ou quelques g pour 109 g de sol et par hectare. Cette minimalisation (minoration) améliore de facto l'efficacité pondérale de cet oligoélément cofacteur de nombreux complexes enzymatiques, y compris celui de NIF. Plus exactement, nous avons remarqué que minorer ces nanodoses de Mo ù en présence de nano-doses de tryptophane (TRP), permet d'atténuer la contre-productivité transitoire immanquablement associée à la valorisation azotobactériennes des résidus de culture pailleux au sol. Ce constat n'est pas évident puisque ù à la vue de l'état de la technique, l'homme de métier aurait été amené à prévoir que les Azotobacteraceae ù du fait de leurs métabolismes diazotrophique et molybdénique exigeraient une majoration et non pas une minoration des susdites doses-hectare de Mo.

La solution technique proposée consiste donc aussi à rendre plus efficace sur grandes cultures non ù légumineuses (Fabaceae) une nanodose-hectare réduite (minorée) de Mo, soit de l'ordre de quelques g ù avantageusement 1 g, au lieu des habituels 40 à 100 g actuellement recommandées pour les grandes cultures légumineuses. Cette amélioration de l'efficacité du Mo entant que cofacteur de NIF Azotobacteraceae est vraisemblablement rendu possible par le double rôle (cf.

Figure 1) que joue maintenant le TRP, a savoir ; 1) entant que précurseur d'auxines phytogènes, et 2) entant que constituants caractéristiques de la Composante I du complexe NIF azotobactérien dit soit Av1 ou Act selon qu'il provient d'Azotobacter vinelandii ou Azotobacter chroorococum, respectivement (Yates et Planqué 1975). Or, ce second rôle, et bien qu'il est depuis longtemps démontré que TRP est absent des Composantes Il (eg. Av2, Ac2) du complexe, n'as jamais été valorisé en agronomie. Cette omission, bien qu'étonnante en soi, est probablement attribuable au fait que l'azotobactérisation de mélanges organo-minéraux et/ou de résidus de culture au sol à jusqu'à récemment fait défaut (voir Claude et Fillion 2004 et Claude et Giroux 2006). L'activité azotobactérienne des résidusphères n'ayant pas été dans le passé très importante, l'apport de Mo et/ou TRP ne fit jamais l'objet de telles mises au point. En ce sens, il est maintenant proposé d'alimenter la diazotrophie résidosphérique à l'aide d'un mélange Mo-TRP dans un rapport

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d'environ 1:10, complémentant ainsi la composante I de NIF malgré une faible disponibilité du Mo édaphique.

Schématiquement, nous pouvons illustrer cette plus grande aptitude à valoriser des apports (conjoints) de Mo et de TRP (Figure 1). Chez la bactérie le Mo est cofacteur de la composante I de la dinitrogenase et de l'enzyme AO (aldehyde oxidase ; Mendel et Hansch 2002) responsable de la synthèse des auxines (IAA), tandis que le TRP est lui aussi un constituant caractéristique de ladite composante I de Nif ; ce jeux croisé permet une certaine interaction plus ou moins directe entre TRP et Mo (Figure 1 b). La possibilité d'une telle interaction Mo x TRP est beaucoup plus réduite chez la plante du fait notamment le Nif n'intervient plus que le TRP n'est plus le principal précurseur d'IAA (Figure la). Mieux, nous pouvons aussi valoriser la présence de TRP exogène, étant donné l'existence d'une protéine régulatrice d'ndi û Tsp, particulièrement riche en tryptophane ; cette régulation est d'autant plus effective si les stresses oxidatifs contraires au bon fonctionnement de la dinitrogenase sont importants. Encore une fois, ce jeu croisé entre la diazotrophie et l'adaptation à la vie dans les sols de certaines bactéries nous permet maintenant d'entrevoir une interaction Mo x TRP susceptible d'être appliquée en agronomie.

La solution technique proposée consiste donc en une combinaison du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) lorsqu'apportés en proximité des racines pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de cultures pailleux au sol ou d'engrais organominéraux non-bactéricides. Le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par pulvérisation liquide des résidus de culture pailleux au sol pré-semis d'une grande culture d'hiver, avantageusement selon le mode opératoire décrit dans Claude et Fillion 2004. Pareillement, le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide et utilisé comme engrais starter au printemps ou comme fumure de fond à l'automne, avantageusement selon le mode opératoire décrit dans Claude et Giroux 2006.

La dose-hectare de Mo se situe entre 1 et 33 g, plus particulièrement entre 5 et 25, et avantageusement entre 8 et 12 g, tandis que celle du TRP se situe entre 5 et 50 g, plus particulièrement entre 12 et 36, et avantageusement entre 24 et 26 g. Or, dans la pratique l'invention permet aussi et surtout de réduire cette dose-hectare de Mo. En effet, cette dose-hectare de Mo est elle minorée de 33 à 25 g, plus particulièrement de 25 à 10 g, et avantageusement de 10 à au moins 1 g. De plus, lesdits résidus de culture pailleux au sol et EOM peuvent être avantageusement bactérisés à l'aide d'une dose hectare de biomasses Azotobacteraceae obtenues expressément à cet effet contenant entre 1 x 1012 et 1 x 1013, voire plus avantageusement 5 x 1072 cellules viables et correctement formulées et conditionnées ; à noter que ces biomasses sont avantageusement obtenues selon le protocole d'obtention décrit dans FR01/15542. Enfin, les grandes cultures non-légumineuses sont choisies parmi un groupe comprenant les céréales d'hivers û y compris le blé, l'avoine, l'orge, le seigle et le triticale, le colza - 13 -

d'hiver, le maïs et le sorgho. II s'agit donc en principe de biofertilisants pour grandes culture non-légumineuses combinant le Mo et le TRP, et cela avantageusement en présence d'au moins 5 x 1012 cellules Azotobacteracea réintroduites expressément à cet effet sur lesdits résidus de culture pailleux au sol ou au sein desdits EOM. Avantages apportés, nouveauté et activité inventive

L'invention concerne donc l'utilisation nouvelle du molybdène (Mo) en combinaison avec le tryptophane (TRP) lorsque apportés en proximité des racines de grandes cultures non-Fabaceae 10 (non-légumineuses) par pulvérisation des résidus de culture pailleux au sol (en pré-semis d'une grandes culture d'hiver) ou par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide (au semis d'une culture de printemps) ou à une fumure de fond.

Or, ce ciblage des résidus de culture pailleux et/ou des EOM pondéreux est nouveau et non- 15 évident pour la personne du métier. En effet, ces matières û biostimulantes plutôt que pondéreuses, sont généralement destinées à des applications foliaires et/ou des aspersions racinaires ; voir en ce sens US 2008/194407 Al. La présente invention (FR0900426) elle concerne l'amélioration de l'efficacité pondérale û ou plutôt micro-molaire, du Mo du fait de la présence du TRP appliqué conjointement sur résidus de culture pailleux au sol et/ou EOM, cibles 20 non-conventionnelles pour ce type de matières biostimulantes relativement coûteuses. Du coup, la (re)valorisation agronomique des résidus de culture pailleux au sol est EOM û enfants pauvres du secteur des matières fertilisantes et des amendements de sol, (re)devient possible ; tel qu'indiqué dans le texte, ce revalorisation comporte nécessairement de nombreux avantages inattendus susceptibles d'être appliqués en agronomie et en agro-écologie. 25 Vue la proximité des Azotobacteraceae (AZB) ainsi réintroduites et de la résidusphère, les molécules de TRP éventuellement placées au sein de cette résidusphère pourront elles aussi être métabolisées et servir de précurseurs d'IAA (auxines) phytogènes. Mieux, et c'est ce qu'il y a d'étonnant, la présence d'autres acides aminées, notamment la sérine précurseur de TRP, 30 permettra aussi de compléter la constitution d'Acl dont une des caractéristique, jusqu'à ce jour peu ou pas valorisée agronomiquement, est de contenir du Mo ET de la TRP, et cela contrairement à Ac2, par exemple. L'apport conjoint donc de Mo et de TRP non raffiné, contenant notamment de la sérine, permet d'obtenir un triple effet (Figure 1), et du coup une synergie Mo x TRP d'autant plus importante. Soit la complémentation ; (i) du cofacteur Mo-Fe de la composante I de NIE 35 Azotobacteraceae (i.e. Mo), (ii) du précurseur de la biosynthèse bactérienne de la composante I de NIE Azotobacteraceae (i.e. TRP), et (iii) des constituants caractéristiques de la composante I de NIE Azotobacteraceae (i.e. Mo et TRP).

Cette triple action des apports de Mo-TRP via une certaine interaction au niveau d'Acl (i.e. la 40 composante 1 du complexe Nif) n'avait jamais fait l'objet d'une valorisation agronomique avant5 - 14 - aujourd'hui. A noter aussi que cette triple action, du fait du double rôle du TRP (i.e. précurseur d'auxine ET constituant de la composante I de NIF Azotobacteraceae) n'est véritablement possible qu'en présence d'Azotobacterace réintroduite au sens de Claude et Fillion 2004. Cette utilité relative du TRP qu'en présence d'Azotobacteraceae est d'autant plus défendable qu'il est reconnu que le prélèvement du TRP par les plantes n'est pas une des principales voies de biosynthèse d'auxines. L'invention permet aussi une certaine flexibilité lors de la biofertilisation des grandes cultures non - légumineuses. Par exemple, les résidus de culture pailleux au sol peuvent maintenant être bactérisés directement par pulvérisation liquide. On peut aussi ensemencer via un épandage d'une fumure de fond intégrant une dose-hectare dudit inoculum azotobactérien. On peut aussi placer en bandes près des semences, en guise d'engrais starter un granulé, essentiellement comparables à la susdite fumure de fond mais avantageusement enrichi de phosphate d'ammonium (MAP, DAP).

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS ET FIGURES Figure 1 : Représentation des liens métaboliques entre le Mo, la synthèse des auxines, le complexe NIF et le tryptophane (TRP), ainsi que les mécanismes Tsp et ndi, chez la plante (a) et chez Azotobacteraceae (b). Du fait d'un plus grand maillage de ces liens chez Azotobacteraceae, une interaction plus ou moins directe entre TRP et Mo est beaucoup plus grande que chez la plante. Chez Azotobacteraceae le Mo est cofacteur de la composante I de NIF et de l'enzyme aldehyde oxidase impliquée dans la synthèse des auxines, tandis que le TRP est lui aussi un constituant caractéristique de ladite composante I de NIF ; ce jeu croisé permet une interaction plus ou moins directe entre TRP et Mo (b), beaucoup plus que chez la plante (a). De plus, la présence de TRP exogène, étant donné l'existence d'une protéine régulatrice d'ndi û Tsp, riche en TRP. Figure 2 : Représentation graphiques des matières sèches des parties aériennes (MSPA, en g par pot x 100) et mobilisation de l'azote par celles-ci (MOBN, en mg-N par pot) 28 jours post-semis (jps, ou cl) sans (TRP-1) et avec (TRP-2) 10 g de TRP selon la dose de Mo (i.e. en g-Mo par hectare, soit équivalente à des ng-Mo par g-sol (109 g-sol par ha)) apportée aux résidus de culture pailleux au sol (1% p/p). A noter en (a) un effet phytogène appréciable de TRP en termes de MSPA, et en (b) le contraire, un effet plutôt dépressif du TRP en terme de MOBN. L'analyse de variance (Anova) des données issues du dispositif schématisé à la Figure A a permis la comparaison des moyennes à l'aide de plus petites différences significatives (LSD selon Fisher, a = 5 %) ; les moyennes associées au même lettrage n'étant pas significativement différentes. Figure 3 : Représentation graphiques des ratières sèches des parties aériennes (MSPA, en g par pot x 100) et mobilisation de l'azote par celles-ci (MOBN, en mg-N par pot) 56 jours post-semis (jps, ou c2) sans (TRP-1) et avec (TRP-2) 10 g de TRP selon la dose de Mo (i.e. en g-Mo par hectare, soit équivalente à des ng-Mo par g-sol (109 g-sol par ha)) apportée aux résidus de culture pailleux au sol (1% p/p). A noter, par rapport à l'état de la MSPA et de MOBN 28 jps (Figure 2), une résorption apparente de l'effet phytogène du TRP en terme de MSPA (a), et une continuation de l'effet dépressif du TRP en termes de MOBN (b), mais cela à l'exception notable de la modalité recevant l'équivalent d 1 ng-Mo par g-sol, modalité pour laquelle l'effet du TRP est appréciablement positif - 15 - tant pour MSPA (a) que pour MOBN (b). L'analyse de variance (Anova) des données issues du dispositif schématisé à la Figure A a permis la comparaison des moyennes à l'aide de plus petites différences significatives (LSD selon Fisher, a = 5 %) ; les moyennes associées au même lettrage n'étant pas significativement différentes.

Figure 4 : Efficacité relative des 10 g de tryptophane (TRP) apportés au résidus de culture pailleux (1% p/p) en combinaison avec chacune des quatre (4) doses de Mo équivalentes à 0, 1 , 10 et 100 g-Mo par hectare de sol (109 g) en termes de MSPA (a) et de MOBN (b) 28 jps (c2). A noter une erTRP (i.e. le rapport des MSPA et MOBN obtenues avec / sans TRP) supérieure avec la plus petite nanodose de Mo, soit ici l'équivalent de 1 ng-Mo par g-sol, ou 1 g-Mo par hectare. L'analyse de variance (Anova) des valeurs erTRP issues du dispositif schématisé à la Figure A a permis la comparaison des moyennes à l'aide de plus petites différences significatives (LSD selon Fisher, a = 5 %) ; les moyennes associées au même lettrage n'étant pas appréciablement différentes. MODE DE REALISATION PREFERE DE L'INVENTION L'invention peut être réalisée dans le cadre de trois (3) types de systèmes de culture ; (i) cultures céréalière et de colza d'hiver en présence de résidus de culture au sol (ii) cultures intermédiaires pièges à nitrates (Cipan) avec fumure de fond 20 (iii) cultures de maïs et sorgho avec engrais starter

Pour les cultures céréalières et de colza d'hiver en présence de résidus de culture au sol, la bactérisation peut ce faire selon Claude et Fillion 2004, il est avantageux d'utiliser quelques grammes, soit ici envions 10, de tryptophane miscible à l'eau. Dans le cadre d'une implantation de 25 Cipan (culture intermédiaire piège à nitrate), il s'agit de préparer une fumure de fond organominérale pouvant être apportée avantageusement au semis ou en pré-semis d'une culture intermédiaire piège à nitrate (Cipan), à hauteur de 100 à 150 kg/ha, et avantageusement, mais pas nécessairement, granulées aux normes physico û mécaniques applicables aux engrais NPK. II est avantageux de procéder tel que décrit dans Claude et Giroux 2006, l'étape de cuisson et de 30 granulation des mélanges intervenant avant l'imprégnation des granules avec les Azotobacteraceae (AZB). Enfin, et pour la culture de maïs et de sorgho avec utilisation d'engrais starter, il faut surtout s'assurer que le mélange ayant servit à la constitution de la fumure de fond soit granulé de sort à permettre sont application en bandes en guise d'engrais starter en proximité de la semence ; voir Claude et Giroux 2006. 35 A noter qu'ici les AZB sont avantageusement produites industriellement par fermentation à l'état solide. Cette production industrielle pourra avantageusement assurer l'enkystement des cellules ; cet enkystement permet aux cellules de mieux résister lors de l'étape d'imprégnation.

40 Les quantités de Mo et de TRP directement assimilables par les azotobactéries ne devraient pas dépasser 10 g et 25 g, respectivement, soit environs le poids de la biomasses azotobactérienne présente dans les mélanges (i.e. ù 5x1012 à 1x1013 cellules par dose-hectare). Il est permit15 -16- d'utiliser des biosolides et des coproduits des fermentations microbiennes impliquées, par exemple, dans la production de biomasses azotobactériennes. En effet, certains de ces produits contiennent des quantité parfois non négligeables de Mo et de TRP pouvant servir à la présente invention. Si ces biosolides et/ou des coproduits suffisamment riches en Mo et/ou TRP ne sont pas disponibles, ces matières premières peuvent être incorporées aux mélanges. APPLICATIONS BIOINDUSTRIELLES ET AGRONOMIQUES L'invention est donc susceptible d'être appliquée de deux façons ; (i) via la flore (azoto)bactérienne de la résidusphère, application dites MSL au sens de Claude et Fillion 2004, et (ii) via l'intégration d'une flore (azoto)bactérienne à des engrais organo-minéraux, application dites EOM au sens de Claude et Giroux 2006. Pour illustrer ici que l'invention est susceptible d'être appliquée au secteur agronomique de la production des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de culture pailleux au sol nous avons établit en serre des dispositifs expérimentaux en carré latin constitué de pots de 500 ml contenant 350 g de sol reconstitué par séchage et tamisage à 4 mm. L'analyse physico-chimique de ce sol est rapportée au Tableau A. Tableau A : Analyse physico-chimique du sol alsacien utilisé CEC (cmol) 121 pH 6,7 MO (%) 1,84 P205 (Dyer) 0,190 P205 (Joret-Hebert) 0.069 Texture A-L-S (g/kg-sol) 218-673-84 K20 (g/kg-sol) 0,12 MgO (g/kg-sol) 0,16 CaO (g/kg-sol) 3,2 Na2O (g/kg-sol) 0,025 Fe (mg/kg-sol) 73,3 Mn (mg/kg-sol) 28,7 Zn (mg/kg-sol) 2,8 Cu (mg/kg-sol) 2,5 B (mg/kg-sol) 0,44 II s'agit donc en tout de 32 pots de 350 g de sol. Avant d'incorporer aux pots leurs 350 g de sol, nous avons mélangé à ceux-ci 3,5 g de résidus de culture hachés et tamisés à 2 mm et dûment imprégnés par aspersion des susdites modalités sur une base pondérale, soit de 0.0, 0.035, 0.0035 ou 0.00035 mg Mo, et de 0.0 et 0.0035 mg de TRP par 3,5 g de résidus de culture pailleux et par pot. Outre le Mo, au semis, et cela jusqu'à cl 28 jours post-semis (jps), nous n'avons pas apporté d'azote ou de solution nutritive ; dès cl nous avons apporté une solution nutritive contenant 35 mg N-NO3NH4 / kg sol et un complément micro- et macro-élémentaire û sans Mo comme de raison (Tableau B), nécessaire à une croissance sans carences des plantules de Lolium multiflorum (0,4 g de semences par pot et recouvertes de sables siliceux inerte). Les poids de matières sèches des parties aériennes (MSPA) ont été déterminés à et et c2, soit 28 et 56 jps, respectivement. - 17 - Tableau B : Préparation des solutions nutritives Quatre solutions molaires (1M) pour les apports de N/P/K/S/Mg ; Deux solutions oligo-élémentaire, soit pour 1 L ; Pour prépare 1 L de solution nutritive ; 2,33 ml Ca(NO3)2 1,67 ml KNO3 2 ml KH2PO4 2 ml MgSO4 1 ml oligo-éléments (sans Mo) Dans les faits, j'ai mené deux expérimentations en serre. Une première expérimentation (Expérimentation 1) avec et sans une pleine dose ù hectare de Mo de 40 g par hectare (i.e. 40 ng-Mo par g de sol reconstitué) combiné à l'équivalent de 20 g-TRP par hectare ; il s'agissait ici simplement de démontrer l'utilité de combiner Mo et TRP par rapport à un témoin non-traité. Il s'agit donc surtout d'un contre-exemple nous amenant à la deuxième expérimentation. C'est cette deuxième expérimentation (Expérimentation 2) qui illustre concrètement le bien fondé de l'invention en termes d'activité inventive.

Expérimentation 1

Les données issus de cette première expérimentation sont rapportées au Tableaux C.

Tableau C : Matières sèches des parties aérienne (MSPA ; mg/plantule), teneur en N de cette MSPA (NVEG ; %) et sa mobilisation de l'azote (MOBN ; ug-N/plantule) du Lolium multiflorum (0,2 g de semences par pot recouvertes de sable siliceux inerte ; le nombre de plantule pot a ici été déterminé, permettant de calculer MSPA et MOBN par plantule), 28 et 56 jours post-semis (jps) MSPA (mg/plantule) témoin (t) 40 g-Mo + 20 g-TRP Mo+TRP / t cl (28 jps) 7,57 Al" 7,31 A 0,97 c2 (56 jps) 19,4 A 17,3 AB 0,89 NVEG (% de MSPA) témoin (t) 40 g-Mo + 20 g-TRP Mo+TRP / t cl (28 jps) 0,094 0,087 0,93*(2) c2 (56 jps) 1,19 1,31 1,10** MOBN (ug-N/plantule) témoin (t) 40 g-Mo + 20 g-TRP Mo+TRP / t cl (28 jps) 71,1 A 63,6 AB 0,89 c2 (56 jps) 230 AB 227 AB 0,99 Note 1 : Pour une coupe (cn) données ù ici 28 ou 56 jps, les moyennes MSPA, NVEG et MOBN associées au même lettrage ne sont pas significativement différentes (Anova Fisher LSD (a = 5%).

Note 2 : NVEG a été déterminer pour l'ensemble de la MSPA produites par chacune des modalités ; la précision analytique selon les donnée inter-laboratoire de la Sade est ici au maximum de 0,04. 1. Ca(NO3)2.4H20 236.1 g/I 2. KNO3 101.1 g/I 3. KH2PO4 136.1 g/I 4. MgSO4.7H2O 246.5 g/I H3BO3 2.8 g MnCl2.4H20 1.8 g ZnSO4.7H20 0.2 g CuSO4.5H20 0.1 g FeSO4.7H20 0.0078 g

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A noter que ces données sont obtenues en présence cette fois-ci de 20 ng-TRP et 40 ng-Mo par g de sol apportés directement au résidus de culture pailleux (1% plp), sans affecter significativement MSPA, ce mélange provoque néanmoins dès 28 jps une importante chute de la teneur en N (NVEG ; %) de cette MSPA, et donc nécessairement une certaine chute de MOBN aussi.

Ce qu'il y a de remarquable ici c'est que û contre-intuitivement il me semble, il n'y a pas une simple synergie entre des (nano)doses quelconque de Mo et TRP. Pourtant et en effet, ces deux molécules sont aux yeux de l'homme de métier impliqués dans la diazotrophie et l'auxèse, respectivement. De plus, et cela à la lumière de l'état de la technique, il y a même un jeu croisé entre ces deux agents phytogènes puisque Mo û dont le rôle essentiel est d'être cofacteur de NIF Azotobacteraceae, est aussi impliqué dans l'enzymologie des auxines. TRP lui û dont le rôle essentiel est d'être le précurseur d'auxines, est aussi une acide aminée caractéristique de la composante I de NIF. Pourtant, la simple combinaison de quelques dizaines (40) de ng par g de sol de chacune de ces molécules û doses habituellement préconisée en agronomie à ce jour, n'est pas en soi phytogène ; elle semble même être dans une certaine mesure contreproductive.

Or, le deuxième essai que j'ai menés a démontré que cette contre-productivité est toute relative et dépends en fait de la dose de Mo apportée. Contre toute attente, c'est en minorant ces nanodoses de Mo que l'efficacité relative du TRP (erTRP) est améliorée. En effet, en présence de 10 g de TRP et de 1 g de Mo par hectare au sens de la présente invention û au lieu des 10, 40 voire 100 g autrement, ce TRP est tout aussi efficace en terme de MSPA et de MOBN tant à c1 (28 jps ; Figure 2) qu'à c2 (56 jps ; Figure 3). Cependant, en absence de TRP, ce même nano-gramme (ng) de Mo est nettement contreproductif à c2, tant en terme de MSPA que de MOBN (Figure 3).

Expérimentation 2 J'ai répartis aléatoirement au sein de ce dispositif huit (8) traitements au sein de quatre (4) modalités principales avec (TRP-2) et sans (TRP-1) TRP ; 0 g Mo / ha avec et sans 10 g TRP / ha (i.e. 109 g de sol) 1 g Mo / ha avec et sans 10 g TRP / ha (i.e. 109 g de sol) 10 g Mo / ha avec et sans 10 g TRP / ha (i.e. 109 g de sol) 100 g Mo / ha avec et sans 10 g TRP / ha (i.e. 109 g de sol) Ces huit (8) traitement ont été déposées au sein de quatre (4) unités expérimentales permettant d'apparier les traitements avec (+) et sans (-) TRP, et du coup d'en calculer l'efficacité relative +/-. Ces quatre unités expérimentales û i.e. l'équivalent de 0, 1, 10 et 100 g de Mo par hectare ou encore autant de nanogrammes (ng) de Mo par g de sol puisque qu'un hectare de sol arable avec résidus de culture pailleux enfouis représente sur 10 cm de profondeur environ 109 g, sont par la suite disposées en carré latin. II s'agit donc d'un dispositif 4x(4x2) en forme de carré latin avec les deux traitements TRP û avec et sans TRP, imbriqués au sein de chacune des quatre modalités -19-

principales ; voir la Figure A pour une représentation schématique de ce dispositif. J'ai par la suite effectué une analyse de variance (Anova ; a = 5%) permettant de départager les variances (variabilité) imputables aux modalités Mo et/ou aux sous-modalités TRP, de celles imputables à la gradation des linges et/ou colonnes dudit carré latin. Les moyennes pour chacune des modalités et sous-modalité imbriquées, ainsi que pour l'ensemble des interactions Mo x TRP ont été comparées à l'aide des plus petites différences significatives ù dites LSD (least signification differences) calculées selon la méthode dite de Fisher (XLStatTM, v2009).

Comme nous pouvons le voir aux Tableau D, bien que la présence du TRP semble favoriser ù sans grande surprise, la MSPA (ici à c1, 28 jps), elle inhibe cependant la MOBN.

Tableau D : MSPA (matière sèche des parties aérienne ; en g/pot) et mobilisation de l'azote (MOBN ; en mg-N/pot) par ces MSPA de plantules de Lolium multiflorum sans et avec l'apport de TRP 28 jours post semis (jps). Anova (ci = 5%) ; les moyennes MSPA et MOBN associées aux mêmes lettrages ne sont pas appréciablement différentes. Modalité MSPA (g/pot) sans TRP 144,813 avec TRP 151,063 Groupes B A Modalité MOBN (mg-N/pot) sans TRP 12,486 avec TRP 11,782 Note 1 : Les moyennes MSPA et MOBN associées au même lettrage ne sont pas significativement différentes (Anova Fisher LSD (a = 5%). Cette stimulation de la MSPA et inhibition de MOBN à et (28 jps) et c2 (56 jps) est aussi figurée aux Figures 2 et 3. A noter ici que cette inhibition de MOBN par TRP est surtout appréciable en absence de Mo, notamment 28 jps (cl) ; la présence de Mo tend ici à minimiser cette contreproductivité du TRP (Figure 2), voire tout bonne l'abolir 56 jps dans le cas de Mo = 1 ng par g de sol (c2 ; Figure 3).

Nous interprétons ù et cela en accords avec l'état de la technique décrit ci-haut, cette inhibition contre intuitive de MOBN par TRP comme le résultat d'un accaparement contreproductif du TRP et accessoirement du Mo aussi, par la flore Azotobacteraceae au profit de la construction de son appareil diazotrophe (Nif) et au dépends de la plante ù du moins dans l'immédiate ; voir en ce sens l'Expérimentation 1.

Cela dit, à terme, ces suractivités des appareilles diazotrophes et auxinogènes Azotobacteraceae ne peuvent qu'être phytogènes. Encore faut-il s'assurer que cette contre-productivité initiale soit la plus faible possible. Il semble que cette avantageux compromis entre diazotrophie et auxèse est atteint à faibles doses (nanodoses) de Mo. En effet, selon les données rapportées graphiquement à la Figure 4 c'est avec 1 g-Mo par hectare (1 ng-Mo par g de sol reconstitué) que l'efficacité relative du TRP est la plus grande, et non avec 10 ou 100 g comme nous aurions pu s'y attendre. A B -20-

Or, cette plus grande efficacité relative du TRP (erTRP) à 1 ng-Mo par g de sol a pour effet de rendre l'efficacité de cette nanodose de Mo en terme de MSPA et de MOBN d'autant plus comparable à celles de doses Mo nettement plus importantes. Pour preuve, j'ai chiffré l'efficacité relative de cette nanodose de Mo par rapport à des doses 10 (1/10) et 100 (1/100) fois plus importantes, avec et sans TRP (+/- TRP ; Tableau E).

Tableau E : Efficacité relative des nanodoses de 1 et 10 (1/10) et 1 et 100 (1/100) ng-Mo par g-sol reconstitué sans et avec 20 ng-TRP par g-sol reconstitué. Les données, dont certaines sont rapportées au Figures 2 et 3, proviennent de MSPA et de MOBN prélevées 28, 56 et 84 jours post- semis (jps). Efficacité relative des nanodoses de 1, 10 et 100 ng-Mo par g-sol reconstitué 1 / 10 1 / 100 coupe paramètre jps sans TRP avec TRP +1- TRP sans TRP avec TRP +1- TRP cl MSPA 28 0,97 0,97 1,00 0,95 0,96 1,01 c12 MSPA 56 0,96 0,97 1,01 0,95 0,97 1,02 c12 MOBN 56 0,95 0,98 1,03 0,98 1,01 1,03 c123 MSPA 84 0,95 0,96 1,01 0,96 0,98 1,02 Moyenne 0,96 0,97 1,01 0,96 0,98 1,02 Comme nous pouvons le voir, c'est quasi-systématiquement que l'efficacité phytogène relative en termes de MSPA et/ou de MOBN de cette nanodose de 1 ng-Mo est d'autant plus proche de celles des doses Mo plus forte, et cela vraisemblablement en raison de la présence conjointe du TRP.

En effet, les MSPA et/ou MOBN produites 28, 56 et 84 jps (nb. MOBN 84 jps nd) sont quasi-systématiquement plus comparables avec TRP que sans. Cette capacité qu'a TRP à rehausser l'efficacité phytogène d'une nanodose de Mo (1 ng-Mo / g-sol) est donc susceptible de rendre inutile le recours à des (nano)doses plus importantes.

Sur la base ce ces quelques résultats analytiques, et étant donné l'intérêt d'apporter du TRP - du fait de son effet positif sur MSPA (Figure 2a), et du Mo - du fait de sont rôle comme cofacteur de NIF et donc de son effet positif sur MOBN en présence de TRP (Figure 2b), mieux vaut donc minorer ces nano-doses de Mo aux alentours de 1 ng par g de sol apporté directement ici au résidus de culture pailleux enfouis (intégrés) au sol, plutôt que chercher à les majorer au-delà de 10, 40 voire 100 ng par g de sol. C'est cette plus grande efficacité relative du TRP à faibles (nano) doses de Mo par g de sol, mais non à plus forte doses, qui est au coeur de la présente invention. En effet - cette plus grande erTRP à 1 ng-Mo / g-sol, permet vraisemblablement aux plantules ne recevant que cette nano-dose de mobiliser autant d'N (MOBN ; Figures 2b et 3b) que ceux en recevant 10, 40 voire 100 fois plus. Ce faisant, cette plus grande erTRP améliore l'efficacité pondérale du Mo applicable à une telle biofertilisation azotobactérienne

-21-

sur résidus de culture pailleux rendant ainsi l'utilisation agronomique de cet oligoélément û somme tout assez couteux, plus économique et rentable.

L'invention apporte donc une solution technique au problème qu'est les déphasage des fournitures d'Nm dans le cadre d'une valorisation azotobactérienne des résidus de culture pailleux au sol, et cela en raison de n'avoir pas/plus recours systématiquement à la fertilisation raisonnée avec pilotage intra-saisonnier des apports d'engrais N. L'invention û dite OLA , permettra effectivement d'assurer un rationnement végétatif (i.e. ici une baisse de MOBN à et ; Figure 2) sans pour autant provoquer une trop forte baisse de la MSPA (Figure 2) et/ou une carence en N trop importante (i.e. voir ici une augmentation de NVEG à ce ; Tableau D), baisses qui pourraient autrement nuire somme tout à l'implantation de la culture.

Pour faire simple, disons que la présence de 1 ng-Mo par g de sol appliqué directement au résidus de culture pailleux au sol avant leur enfouissement permet et suffit à atténuer l'apparente contre- productivité du TRP en termes de MOBN (Figure 2). Or, l'efficacité de cette nanodose de Mo minorée est vraisemblablement le fait d'une plus grande efficacité du TRP en sa présence (Figure 3) ; cette amélioration d'erTRP est observable ici dès c2 (56 jps ; Figure 4), soit - en transposant in situ aux champs, dès la sortie d'hiver de 3 à 5 mois post-semis.

En présence de TRP, l'effet phytogène d'une nanodose de Mo de l'ordre d'un ng par g-sol se compare, se rapproche, à ceux obtenus avec des de (nano)doses de 10 à 100 fois plus importantes. Ce rapprochement est le fait d'une efficacité relative du TRP (erTRP) plus grande à faibles nanodoses de Mo. Il s'en suit que pour atteindre cette plus grande erTRP if faut û du moins et surtout en présence de TRP, minorer le nanodosage du Mo plutôt que chercher à la majorer.

Tel que déjà mentionné, cette minoration est contre intuitive et contraire aux habitudes de l'homme de métier. Le préjudice habituel selon lequel d'une part les apports de Mo alimenteraient la diazotrophie (Nif), et d'autre part les apports de TRP l'auxèse amène l'homme de métiers à augmenter l'un et l'autre quasi proportionnellement. La présente invention permet de vaincre ce préjudice en minorant la dose-hectare de Mo en présence de TRP. En d'autre mots, cette plus grande efficacité relative des nanodoses de Mo par rapport à des doses de 10, 40 à 100 fois plus importantes qu'en présence de TRP permet effectivement ce nanodosage du Mo. Autrement, i.e. en absence de TRP, l'efficacité de ce nanodosage est compromis et le recours à des doses de Mo plus importantes û et donc a termes pollutantes, inévitable. Étant donnée l'état de la technique û qui d'une part ne fait aucune référence explicite au double rôle implicite du TRP comme précurseur d'auxines (reconnu explicitement) ET comme composante caractéristique de la composante I de NIF (non reconnu explicitement), et d'autre part reconnaît que Mo est cofacteur de ladite composante II de NIF, l'homme du métier est nécessairement amené à majorer plutôt que minorer les susdites nanodoses de Mo en présence de TRP. Ce faisant, l'homme de métier chercher à maximiser l'activité auxinogène des - 22 - Azotobacteraceae sans avoir pu prendre en compte que ù au sens de la présente invention, ces populations azotobactériennes devront nécessairement sur - consommer du TRP entant que composante de NIF, et cela nécessairement au dépends de son utilisation comme précurseur d'auxine. Or, c'est précisément pourquoi il faut ù étonnamment, non pas majorer mais minorer les nano-doses de Mo, faut de quoi cette sur ù consommation de TRP sera contreproductive. N'ayant pas pu tenir compte de cette compétition interne (intracellulaire en sorte) en terme d'utilisation de TRP entre NIF et la synthèse des auxines, l'homme de métier ne pourra que considéer comme complémentaires ù plutôt que concurrentes, les apports de Mo vers NIF et ceux de TRP vers la synthèse des auxines, contribuant ainsi à une efficacité relative de TRP (erTRP) de facto sous-optimale. Paradoxalement donc, cette apparente contreperformance du Mo à plus fortes nanodoses ù i.e. 10, 40 voir 100 ng plutôt que 1 ng par kg de sol, et cela en termes de production de phytomasses et/ou de mobilisation de l'azote par les plantules de Lolium permet de mieux apprécier l'atténuation de ce phénomène par l'interaction Mo * TRP à plus faibles nanodoses. Le TRP, du fait de son interaction avec le Mo au niveau enzymatique au sens de la présente invention (Figure 1) permet donc d'effectivement améliorer l'efficacité pondérale du Mo, matière première dont le prix de revient peut-être onéreux en productions végétales. Du coup, ces faibles doses de Mo sont maintenant susceptibles d'être appliquées en production des grandes cultures non-légumineuses, notamment celles pouvant bénéficier de biofertilisations azotobactériennes du fait d'une valorisation microbiologique des résidus de culture pailleux au sol. Références, bibliographie et brevets pertinents Ahmad, Rizwan, Azeem Khalid, Muhammad Arshad, Zahir A. Zahir and Tariq Mahmood. 2008. Effect of compost enriched with N and L-tryptophan on soil and maize Agronomy for Sustainable Development 28 (2) 299-305 Arshad, M. et W.T. Frankenberger, Jr. 1991. Microbial production of plant hormones. Plant and Soil 133:1-8.

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Claims (6)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation du molybdène (Mo) en nano-dosage et du tryptophane (TRP) lorsqu'apportés en proximité des racines pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de cultures pailleux au sol ou d'engrais organo-minéraux non-bactéricides, soit par pulvérisation liquide des résidus de culture pailleux au sol pré-semis d'une grande culture d'hiver, soit par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide et utilisé comme engrais starter au printemps ou comme fumure de fond à l'automne.
2. 2. Utilisation du molybdène (Mo) en nano-dosage et du tryptophane (TRP) selon la revendication 1 caractérisée en ce que la dose-hectare de Mo ce situe entre 1 et 33 g, tandis que celle du TRP ce situe entre 5 et 50 g, plus particulièrement entre 12 et 36 g, et avantageusement entre 24 et 26.
3. 3. Utilisation du molybdène (Mo) en nano-dosage et du tryptophane (TRP) selon une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la dose-hectare de Mo est réduite, soit avantageusement à 1, voire au plus 10 g.
4. 4. Utilisation du molybdène (Mo) en nano-dosage et du tryptophane (TRP) selon une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que lesdits résidus de culture pailleux au sol et EOM sont bactérisés à l'aide d'une dose hectare de biomasses Azotobacteracea (AZB) obtenues expressément à cet effet contenant entre 1 x 1012 et 1 x 1013, voire plus avantageusement 5 x 1012 cellules viables et correctement formulées et conditionnées..
5. 5. Utilisation du molybdène (Mo) en nano-dosage et du tryptophane (TRP) selon une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que les grandes cultures non-légumineuses sont choisies parmi un groupe comprenant les céréales d'hivers û y compris le blé, l'avoine, l'orge, le seigle et le triticale, le colza d'hiver, le maïs et le sorgho.
6. 6. Biofertilisant pour grandes culture non-légumineuses utilisant le Mo et le TRP selon une quelconque des revendications précédentes, avantageusement en présence d'au moins 5 x 1012 cellules Azotobacteraceae réintroduites expressément à cet effet sur lesdits résidus de culture pailleux au sol ou au sein desdits EOM. -25-