FR2941588A1 - Biofertilisation azotobacterienne comprenant du molybdene et du tryptophane - Google Patents

Abstract

La solution technique proposée consiste en une combinaison du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) lorsqu'apportés en proximité des racines pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de cultures pailleux au sol ou d'engrais organo-minéraux non-bactéricides. Le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par pulvérisation liquide des résidus de culture pailleux au sol pré-semis d'une grande culture d'hiver. Pareillement, le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide et utilisé comme engrais starter au printemps ou comme fumure de fond à l'automne. Dans tous les cas, la dose-hectare de Mo ne dépasse pas 10 g, et celle du TRP 25 g. De plus, les lesdits résidus de culture pailleux au sol et EOM sont bactérisés à l'aide d'une dose hectare de biomasses Azotobacteracea rustiques, bien adaptées à la vie dans les sols arables et obtenues expressément à cet effet contenant au moins 5 x 10 cellules viables et correctement formulées et conditionnées. Les grandes cultures non-légumineuses sont choisies parmi un groupe comprenant les céréales d'hivers - y compris le blé, l'avoine, l'orge, le seigle et le triticale, le colza d'hiver, le maïs et le sorgho.

Description

DESCRIPTION DE L'INVENTION TITRE BIOFERTILISATION AZOTOBACTÉRIENNE COMPRENANT DU MOLYBDÈNE ET DU TRYPTOPHANE DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION Le domaine technique de l'invention concerne la biofertilisation bactérienne, notamment azotobactérienne des grandes cultures agronomiques. Il est aussi question de l'utilisation de coproduits issue de la fabrication industrielle de biomasses microbienne et contenant une certaine quantité d'oligo-élements, co-facteurs enzymatiques et précurseurs d'acides aminés. ÉTAT DE LA TECHNIQUE LA BIOFERTILISATION À L'AIDE DE BFCP AZOTOBACTÉRIENNES

Les BFCP (bactérie favorisant la croissance des plantes) jouent rôle important dans la croissance des plantes. Elles colonisent, outre les racines de certaines cultures, les résidus de cultures (pailleux), les engrais organominéraux et/ou les biomasses racinaires résiduelles. Les mécanismes responsables de l'amélioration de la croissance comprennent : (i) la production de sidérophores extracellulaires (agents microbiens de transport du fer) qui peuvent s'associer de manière efficace avec le fer présent dans l'environnement en le rendant moins disponible pour certaines microflores naturelles non-phytogènes, (ii) l'antibiose contre des bactéries et des champignons pathogènes, (iii) la production de substances favorisant la croissance, et iv) la solubilisation des phosphates organiques et inorganiques. Les BFCP appartiennent à plusieurs genres, y compris Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Cellulomonas, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, (Brady)rhizobium et Xanthomonas. Ces inocula sont, contrairement aux inocula constitués de rhizobia symbiotiques, généralement appliqués aux résidus de cultures pailleux au sol, aux engrais organominéraux. Le genre Azotobacter est composé d'au moins 6 espèces: Azotobacter armeniacus, Azotobacter beijerinckii, Azotobacter chroococcum, Azotobacter nigricans, Azotobacter paspali et Azotobacter vinelandi. Plus particulièrement, la biofertilisation azotobactérienne consiste en l'utilisation d'inocula BFCP diazotrophes, avantageusement du genre Azotobacter de la famille des Azotobaceracea. Les bactéries membre de la famillie Azotobacteracea sont de bactéries libres, aérobies et capables de fixer l'azote de manière non symbiotique. Leurs populations peuvent varier dans le sol mais ne dépasse que très rarement 102 à 103 par gramme de sol.

RÔLE DU MOLYBDÈNE (MO) COMME OLIGOÉLÉMENT EN PRODUCTION VÉGÉTALE ET EN BIOFERTILISATION 5 MICROBIENNE

Les oligoéléments constituent un groupe d'éléments nutritifs essentiels des plantes: bore, chlore, cuivre, manganèse, molybdène, zinc, nickel, cobalt et fer. Les plantes en ont besoin dans des quantités bien moins importantes que celles des éléments majeurs (i.e. N, P et K) ; on les 10 appelle aussi éléments nutritifs mineurs. Ils sont présents à des concentrations inférieures à 100 mg/kg (0,01%) dans les plantes. Aujourd'hui, le molybdène (Mo) joue un certain rôle en production végétale (Kaiser et al 2005), essentiellement entant que cofacteur enzymatique de plusieurs métabolismes importants, y compris celui des nitrates et de l'azote diatomique. Le Mo joue aussi un rôle dans la rhizosphère 15 du fait de son interaction avec certaines bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP), notamment pour ce qui concerne leurs enzymes nitrate réductase et nitrogenase (El-Samad et al. 2005). Les sols arables sont relativement pauvres en Mo (Goldberg et al. 2002). De plus, et à la vue de son utilité agronomque, le Mo est une matière première coûteuse û soit de l'ordre de 300 euros par kg. Par exemple, la dose-hectare (dose-hectare) habituellement recommandée pour les 20 légumineuses à grains est de 100 g, soit un prix de vente à l'agriculteur de l'ordre de 30{ ; ce prix de vente est généralement prohibitif pour ce qui concerne la production céréalière. La fertilisation Mo des légumineuses, bien qu'a priori la plus utile à ce jour du fait que leur symbiose avec certaines espèces Rhizobiacea diazotrophes est pourtant en principe difficile parce que les Rhizobiacea sont moins accessibles que des BFCP non - symbiotiques et qu'en plus le Mo 25 in planta est préférablement translocaliser vers les Rhizobiacea (Brodrick et Giller 1991). Les carences en Mo de ces symbiotes ne seront apparentes que lors de déficits majeurs de Mo peu réconciliables avec une gestion approprié des sols arables. Or, il existe pourtant aujourd'hui des produits biofertilisants à base de Mo (FixaMo , 100 g I ha, Agronutrition SA, France) destinés à l'optimisation de cette interaction Rhizobiacea x Leguminosea. 30 Dans la résidosphère, le métabolisme azotobactérien est affecté par la disponibilité du molybdène (Mo), cofacteur du complexe enzymatique nitrogenase responsable de la réduction de l'azote diatomique (Igarashi et Seefeldt 2003). En effet, la plupart des 50 enzymes molybdèniques, soit environ 90% sont exclusivement bactériennes (Mendel 2007). Parmi celles-ci, seule la nitrogenase comporte un facteur Mo qui n'est pas lié à une molécules ptérique (Mendel et Hànsch 35 2002). Le Mo, tout comme le fer (Fe), est dans une moindre mesure le vanadium (V) sont effectivement des cofacteurs essentiels pour le fonctionnement du complexe nitrogenase (Igarashi et Seefeldt 2003 ; Loveless et al. 1999). Bien que sa présence et ou sa concentration, au delà d'un certain seuil critique, ne sont pas nécessairement directement reliés au taux d'activité dudit complexe (Jacobson et al. 1986), l'apport de compléments de Mo est parfois jugé utile en 40 agronomie, du moins pour ce qui concerne les cultures légumineuses en symbioses avec des -3-

Rhizobiacea fixateurs d'azote, eg. environ 100 g / ha via certains produits tels que FIxAMo (Agronutrition SA, France). En situations écologique ou le taux de la production de biomasse aérienne (phytomasse, ou MSPA û matière sèche des parties aérienne) reste somme tout modéré, du moins en régions tempérées, la disponibilité du Mo dans les sols n'est pas limitative. Or, en situations agronomiques, surtout si l'activité azotobactérienne est augmentée suite à l'incorporation au sol de résidus de culture pailleux et/ou racinaire, voire par la bactérisation azotobactérienne de ceux-ci, la disponibilité du Mo peut en principe être insuffisante pour permettre le plein rendement de la diazotrophie azotobactérienne. Un éventuel effet favorable des Azotobacter sur les rendements serait donc minoré, voire indétectable. Dans de telles situations, l'apport de compléments de Mo est envisageable.

ROLE DU TRP COMME PRECURSEUR D'AUXINES CHEZ LES BACTERIES DU SOL L'utilisation de TRP comme précurseur d'auxines (ou IAA , de l'anglais indol acetique acid) est connue (Arshad et Frankenberger 1991, 1998). Par exemple, Zahir et al 2005 démontrèrent que des apports de TRP comme précurseurs d'IAA lors d'inoculations de sols et/ou de semences eurent des effets phytogènes, et cela à des doses équivalentes à quelques g par hectare, voire moins, bien que les auteurs reconnaissent que l'application agronomique de cette approche, dites précurseur û inoculum , fait aujourd'hui défaut (El-Samad et al 2005). La dose-hectare (dose-hectare) de TRP elle, même si on utilise du TRP raffiné quasi pur, précurseur à la production d'IAA d'origine azotobactérienne, n'est que de 2{ pour une dose-hectare d'environ 5 à 10 g (cf. Zahir et al. 2005, Ahmed et al. 2008). A noter aussi que chez les plantes le tryptophane n'est plus reconnu comme le véritable précurseur immédiate des auxines, comme c'est effectivement le cas chez les bactéries (Baldi et al. 1991) ; l'origine microbienne de cette phytohormone est donc d'autant plus importante pour la plante. En ce sens, il est intéressant de noter que certains milieux de culture pour Azotobacter (i.e. ATCC, milieu dit de Winogradsky, etc.) ne contiennent pas de TRP ; les Azotobacter doivent donc effectivement le synthétiser de novo.

INTERACTION PRIVILIEGIEE DE MO ET TRP AU SEIN DE LA COMPOSANTE I DE LA NITROGENASE AZOTOBACTERIENNE.

La nitrogenase est un complexe oligomérique composé de deux types bien différents de protéines. L'une, la ferro û protéine dite composante 1, est un homodimère (PM du protomère 34 000) qui enrobe un centre Fe4S4 et possède deux sites de fixation pour l'ATP. L'autre, la ferro û molybdo û protéine dite composante II, est un tetramère (PM 220 000) de stoechiométrie a2f32. Cette protéine, dépourvue de tryptophane, renferme deux atomes de Mo, de 28 à 32 atomes de Fe, et autant de S. Le rapport moléculaire Fe/Mo pour la composante ferro-molybdénique de la nitrogenase (i.e. la dinitrogenase) est donc d'environ 15.

Or, le Mo n'est présent que dans l'une des composante de complexe Nif, la composante I dont une des caractéristique, contrairement à l'autre composante dite Il, est de comporter un quantité appréciable de TRP, soit 2,5%, i.e. jusqu'à 4 à 5 fois plus que dans l'ensemble de la cellule, la composante Il ne contenant elle que du Fe et pas de Mo (Yates et Planqué 1975).

La présence du TRP dans le Composante l du complexe nitrogenase, dite Act et Av1, pour ce qui concerne Azotobacter chroococcum et A. vinelandii, respectivement, est donc caractéristique ; les Composantes II, dites Ac2 et Av2, n'en contiennent pas (Yates et Planqué 1975). De plus, seule les Composantes I contiennent aussi du Mo comme co-facteur ; les Composantes Il ne contiennent que du fer. Pourtant, la littérature scientifique et technique ne fait aucune mention de cette caractéristique (eg. Igarashi et Seefeldt 2003, Corbett et la. 2006, Hu et al. 2004 et 2006, Dean et al. 1993, Xie et al. 2004), caractéristique pourtant potentiellement conséquente pour la microbiologie des sols. Pire, cette présence de Mo et du TRP en association exclusive au sein de ladite composante I n'est jamais soulignée ou expliquée dans la littérature scientifique consultée. Par exemple, Deistung et Thorneley 1986 ont omis de déterminer la teneur en TRP de ladite composante I, sans pour autant expliquer le pourquoi de cette omission. L'étude la plus pertinente est celle d'El-Samad et al (2005) qui démontre un certain effet positif du Mo complémentaire sur l'activité diazotrophe d'Azospirillum inoculé aux racines de blé. Pourtant, ces Azospirillum sont apportées par pelliculage des semences et par bactérisation des résidus de culture ou d'amendement organiques, et cela sans un apport complémentaire de TRP.

Selon Davey et Bruijn (2000) et Yeliseev et al. (2000), la seule mention à ma connaissance d'une richesse particulière en tryptophane d'une quelconque protéine bactérienne, y compris la nitrogenase, un certain homologue d'une protéine riche en tryptophane, la TspO, serait impliquée dans la régulation du niveau de rusticité et d'adaptation à la vie dans les sols, ou plus exactement en réponse à des conditions de vie oligotrophiques. Or, une peu comme bon nombre de protéines, cet analogue intègre un fo-facteur ferrique sans pour autant nécessité du molybdène en association à la susdite richesse en tryptophane.

COMPETITIVITE DES BFCP A L'EGARDS DES RACINES POUR LE TRP ET LE MO Du fait de leurs métabolismes et de leurs petites tailles û d'où des surfaces unitaires très importantes et des capacités d'absorption d'autant plus grandes, les bactéries du sol, et les BFCP en particulier, sont reconnues comme étant plus compétitives à l'égards des racines pour les nutriments et cofacteurs métaboliques tels que le TRP et le Mo, voire à l'égard de l'ensemble des éléments nutritifs. Cette plus grande compétitivité est généralement désavantageuse en agronomie du fait qu'elle implique une certaine concurrence plant I microorganisme contreproductive, notamment en termes d'alimentation azotée. De plus, selon Kinraide (1981) le transport intercellulaire d'acides aminés est beaucoup plus versatile et spécifique (à chacune des espèces acides aminés) chez la bactérie que chez la plante. Chez la plante, le prélèvement et le transport d'un acide aminé inhibe généralement le prélèvement et le transport des autres acides aminés ; les acides aminés sont ainsi en compétition les unes avec les autres pour essentiellement -5

les mêmes mécanismes de transports et canaux moléculaires. Cela explique en partie pourquoi les bactéries du sol concurrences effectivement avec les racines pour les quelques acides aminés naturellement présentes dans les sols arables (Jones et al 2005a, 2005b), et que les plantes sont plus ou moins condamnées, du moins en situations agronomiques, à prélever essentiellement que de l'azote minéral. Or, et paradoxalement, toute mesure pouvant doper l'activité des bactéries en proximité des résidus de culture au sol une fois enfouis dans la couche arable, et plus particulièrement ici les bactéries de la famille des Azotobacteracea, pourra aussi à court terme concurrence la culture en cours d'implantation. Par exemple, l'apport ciblé de Mo ù bénéfique en principe à l'activité de la nitrogenase (NIF) azotobactérienne pourrait aussi avoir un effet temporairement délétère sur le développement initial de la culture céréalière d'hiver. Il serait utile de trouver une approche simple susceptible d'atténuer cette apparente contreperformance d'un telle biofertilisation azotobactérienne.

EFFICACITE PONDERALE DU MO : TROP FAIBLE ?

Au sein de la dinitrogenase, il existe une molécule (atom ; pm 95) de Mo pour environs 25 molécules de tryptophane (pm : 138). Bien qu'en principe les besoins en TRP sont donc de 25 fois ceux du Mo ù pour ce qui concerne la formation de la dintitrogenase du moins, c'est pourtant le Mo qui est le plus souvent limitant. En ce sens, les teneurs en Mo des sols arables sont généralement limitatives, et même l'apport de 100 g de Mo par hectare, soit dix fois plus qu'une dose-hectare de TRP préconisée, ne représente que 1/10, voir 1/100 des disponibilités en Mo d'un milieu de culture microbiologique enrichis pour Azotobacteracea. En effet, dans un sol arable le rapport entre l'extractabilité du Fe par rapport à celui du Mo est d'environ 1 500 ; les teneurs en Fe de la plante entière et, plus particulièrement de sa dinitrogenase sont en moyenne de 150 et 15 fois supérieure à celles du Mo. Cependant, les sols agricoles ne sont pas nécessairement capables de fournir un plein complément de Mo à une flore azotobactérienne en pleine expansion du fait d'un apport massif de substrat carboné, suite à l'enfouissement des résidus de culture au sol par exemple. En effet, l'activité de la nitrogenase azotobactérienne peut être utilisée comme indicateur de la biodisponibilité d'un sol arable (Franco et al. 1978). Pour faire simple, actuellement l'efficacité pondérale du Mo en situations agronomiques fait que ses doses-hectare sont nécessairement dix fois plus grandes que celles du TRP. Étant donné le coût du Mo ù environ 300{ el kg en 2008, soit plus de 4 fois celui du TRP, l'efficacité pondérale du Mo peut être vue comme 40 fois trop faible pour assurer une véritable rentabilité agronomique de ce cofacteur métallique, notamment s'il doit être apporté conjointement avec du TRP. A noter enfin que le fer (Fe) est tout aussi essentiel au fonctionnement de la dinitrogenase ù via la formation d'un cofacteur tandem Fe-Mo. Or les teneurs en fer assimilable des sols arables sont très supérieures à celles du Mo, soit par un facteur de 100, voire 1 000. Cette disproportion remet encore plus en perspective le rôle limitant du Mo en situations agronomiques.

DÉFINITIONS Résidusphère : Volume ou zone du sol entourant immédiatement les résidus de culture pailleux, engrais organominéraux et/ou biomasses racinaires résiduelles, et plus ou moins influencé par ceux-ci. Il est aussi question d'un noyau où se situe la décomposition desdits résidus de culture. Les microorganismes responsables de la décomposition occupent moins de 1% du sol et sont particulièrement actifs dans la résidusphère. Cofacteurs enzymatiques : petite molécules, par rapport à la taille de l'enzyme, généralement un élément métallique tel que le molybdène, le manganèse, ou le fer, qui assure une configuration à l'enzyme.

Non seulement ce co-facteur est essentiel au fonction de l'enzyme, mais il lui permet aussi de moduler sont activité selon le pH et la puissance ionique de sont environnement ; sont importance en biologie est donc tant structurelle que métabolique. Précurseurs métaboliques : principale molécule lors du déroulement d'une cascade enzymatique permettant l'apparition d'un métabolite particulier et recherché, comme par exemple les auxines. Ledit précurseur est généralement abondant, contrairement au co-facteur par exemple, et la stoechiométrie est généralement avantageuse. Il peut cependant existe plusieurs précurseurs métabolique pour un métabolite donnée. Phytohormone : produit organique spécifique transporté vers une partie de la plante où, à de faibles concentrations, elle stimule, inhibe ou modifie quantitativement un processus biologique.

Phytogène : Une molécule ou un microorganisme est dit phytogène s'il permet d'augmenter la production de biomasse végétale (phytomasse) de façon non - pondérale, c'est-à-dire de façon disproportionnée par rapport aux augmentation de rendements normalement attribuables aux engrais NPK plus conventionnels. Matières organiques résiduelles (RCsol, EOM, BRR) : matière organique produites par les grandes cultures et les prairies, ou présente au moment de leurs ensemencement. Trois types de matières organiques résiduelles existent ; (i) les résidus de culture pailleux au sol (RCsol), les engrais organominéraux (EOM) û souvent composés de fumiers, composts ou lisiers issue de productions animale, et (iii) les biomasses racinaires résiduelles (BRR) abondantes en prairies existantes et anciennes. Fumure de fond : engrais ou de fumier appliquée avant ou pendant le semis. La plupart des éléments nutritifs secondaires et des oligoéléments incorporés au sol font partie de la fumure de fond avec une partie de N et l'ensemble de P et K pour les cultures annuelles. Engrais starter : Une fumure de fond particulière, granulée et généralement déposée en bandes en proximité des semences au moment du semis. Un engrais starter est généralement riche en P afin d'éviter la fixation ce celui-ci, élément nutritif peu/pas mobile in situ, avant l'arrivé des racines.

Engrais organominéraux : Engrais ayant été préparé par l'enrichissement d'amendement organique ou de compost avec des fertilisants et/ou des minéraux. Les fertilisants et les minéraux peuvent être ajoutés au cours du compostage, afin d'augmenter le niveau faible en éléments nutritifs des composts ordinaires. Biofertilsants : il s'agit de matières fertilisantes comportant des microorganismes pouvant favoriser la croissance des plantes, et/ou de simples molécules û chimiquement assez simple par définition (eg. oligoéléments, acides aminées, sucres simples ou osides, capable de stimuler l'activité et l'efficacité agronomique relative de tels microorganismes par rapport à des parcelles témoins non-traitées. Plus particulièrement, les biofertilisants dits azotobactériens comprennent une certaine quantité de bactéries de la famille des Azotobacteracea. -6-45 DIVULGATION DE L'INVENTION Problème technique Le problème technique provient du fait que l'efficacité pondéral du Mo est trop faible pour permettre l'utilisation d'une dose-hectare économiquement rentable sur grandes cultures non-légumineuses. Étant donnée le coût du Mo, la dose-hectare généralement applicable aux cultures légumineuses à grains telles que le soja est trop importante pour être économiquement rentable en production céréalière. Donc, et bien qu'en principe le Mo peut complémenter l'activité du complexe NIF azotobactérien, la dose-hectare de Mo habituellement apportée au culture légumineuses devra être réduite d'environ 90%, soit avantageusement de l'ordre de 5à 10 g au lieu de 100, pour être économiquement rentable en production céréalière. De plus, des apports ciblés de Mo à la flore azotobactérienne du sol pourrait s'avérer contreproductives à court terme du fait d'une importante concurrence ponctuelle des Azotobacteracea pour divers éléments nutritifs autrement facilement prélevés par les racine de la culture en place. Normalement, i.e. sans l'inoculation azotobactérienne des résidus de culture au sol et des engrais organo-minéraux, voire d'une certaine suractivité du complexe nitrogenase dans la résidosphère, le Mo n'est pas limitatif et l'apport de TRP peu recommandable économiquement.

En effet, et faute de méthodes de biofertilisation innovantes en ce sens, l'utilisation simple de ces matières engendraient des coûts des doses - hectare (dose-hectare) de l'ordre de 35-40{ ; a noter que le prix de revient d'une dose-hectare de biofertilisants devrait avantageusement être aux alentours de 7,5{. Or, en présence d'une telle suractivité, induite soit par l'incorporation desdits résidus de culture inoculés par exemple, la disponibilité du Mo peut être limitative du fait de la prolifération du complexe nitrogenase. Pire, cette suractivité azotobactériennes peut même à court terme compromettre la production de phytomasse par la culture en cours d'implantation du fait d'une concurrence pour les éléments nutritifs autrement facilement prélevés par les racines. Le problème technique consiste donc à trouver un moyen de compléter l'alimentation en Mo et en TRP de la flore azotobactériennes du sol capable de favoriser la croissance des plantes, et cela à partir de substances somme tout relativement coûteuses, et cela tout en atténuant une éventuelle contre-productivité de cette stimulation des Azotobacteracea sur la production de phytomasse par la culture en cours d'implantation.

Solution technique La solution technique proposée consiste à rendre plus efficace sur grandes cultures non û légumineuses une dose-hectare réduite de Mo, soit de l'ordre de 10 g au lieu des habituelle 100 g actuellement recommandé pour les grandes cultures légumineuses. Cette amélioration de l'efficacité du Mo entant que cofacteur du complexe NIF azotobactérien est vraisemblablement rendu possible par le double rôle que joue maintenant le TRP, a savoir ; 1) entant que précurseur -7- -8

d'auxines phytogènes, et 2) entant que constituants caractéristiques de la Composante I du complexe NIF azotobactérien dit soit Av1 ou Act selon qu'il provient d'Azotobacter vinelandii ou Azotobacter chroorococum, respectivement (Yates et Planqué 1975). Or, ce second rôle, et bien qu'il est depuis longtemps démontré que TRP est absent des Composantes II (eg. Av2, Ac2) du complexe enzymatique nitrogenase, dit NIF, n'as jamais été remarqué et/ou valorisé agronomiquement. Cette omission, bien qu'étonnante en soi, est probablement attribuable au fait que l'azotobactérisation de mélanges organo-minéraux et/ou de résidus de culture au sol à jusqu'à récemment fait défaut (voir Claude et Fillion 2004 et Claude et Giroux 2006). L'activité azotobactériennes des résidusphère n'ayant pas été dans le passé très importante, l'apport de Mo et/ou TRP ne fit jamais l'objet de mise au point ou de recherches approfondies. En ce sens, il est maintenant proposé d'alimenter la diazotrophie résidosphérique à l'aide d'un mélange Mo-TRP dans un rapport d'environs 1 : 1, complémentant ainsi la composante I du complexe Nif malgré une faible disponibilité du Mo édaphique. Schématiquement, nous pouvons illustrer cette plus grande aptitude à valoriser des apports (conjoints) de Mo et de TRP (Figure 1). Chez la bactérie le Mo est cofacteur de la composante I de la dinitrogenase (Nif) ET de l'enzyme AO (aldehyde oxidase ; Mendel et Hànsch 2002) responsable de la synthèse des auxines (IAA), tandis qu le TRP est lui aussi un constituant caractéristique de ladite composante I de Nif ; ce jeux croisé permet une certaine interaction plus ou moins directe entre TRP et Mo (Figure lb). La possibilité d'une telle interaction Mo x TRP est beaucoup plus réduite chez la plante du fait notamment le Nif n'intervient plus que le TRP n'est plus le principal précurseur d'IAA (Figure la). Mieux, nous pouvons aussi valoriser la présence de TRP exogène, étant donné l'existence d'une protéine régulatrice d'ndi ù Tsp, particulièrement riche en tryptophane ; cette régulation est d'autant plus effective sir les stresses oxidatifs contraires au bon fonctionnement de Nif (via FixL par exemple) sont importants. Encore une fois, ce jeu croisé entre la diazotrophie et l'AVS chez certaines bactéries du sol nous permet maintenant d'entrevoir une certaine interaction Mo x TRP susceptible d'être appliquée en agronomie. La solution technique proposée consiste donc en une combinaison du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) lorsqu'apportés en proximité des racines pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de cultures pailleux au sol ou d'engrais organo- minéraux non-bactéricides. Le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par pulvérisation liquide des résidus de culture pailleux au sol pré-semis d'une grande culture d'hiver, avantageusement selon le mode opératoire décrit dans Claude et Fillion 2004. Pareillement, le Mo et le TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide et utilisé comme engrais starter au printemps ou comme fumure de fond à l'automne, avantageusement selon le mode opératoire décrit dans Claude et Giroux 2006. La dose-hectare de Mo se situe entre 1 et 33 g, plus particulièrement entre 5 et 25, et avantageusement entre 8 et 12 g, tandis que celle du TRP se situe entre 5 et 50 g, plus particulièrement entre 12 et 36, et avantageusement entre 24 et 26 g. De plus, lesdits résidus de culture pailleux au sol et EOM peuvent être avantageusement bactérisés à l'aide d'une dose -9-

hectare de biomasses Azotobacteracea (AZB) obtenues expressément à cet effet contenant entre 1 x 1012 et 1 x 1013, voire plus avantageusement 5 x 1012 cellules viables et correctement formulées et conditionnées ; à noter que ces biomasses sont avantageusement obtenues selon le protocole d'obtention décrit dans FR01/15542. Enfin, les grandes cultures non-légumineuses sont choisies parmi un groupe comprenant les céréales d'hivers û y compris le blé, l'avoine, l'orge, le seigle et le triticale, le colza d'hiver, le maïs et le sorgho. Il s'agit donc en principe de biofertilisants pour grandes culture non-légumineuses combinant le Mo et le TRP, et cela avantageusement en présence d'au moins 5 x 1012 cellules Azotobacteracea réintroduites expressément à cet effet sur lesdits résidus de culture pailleux au sol ou au sein desdits EOM.

Avantages apportés

Vue la proximité des Azotobacteracea ainsi réintroduites (AZB) et de la résidusphère, les molécules de TRP éventuellement placées au sein de cette résidusphère pourront elles aussi être métabolisées et servir de précurseurs d'IAA (auxines) phytogènes. Mieux, et c'est ce qu'il y a d'étonnant, la présence d'autres acides aminées, notamment la sérine précurseur de TRP, permettra aussi de compléter la constitution d'Acl dont une des caractéristique, jusqu'à ce jour peu ou pas valorisée agronomiquement, est de contenir du Mo ET de la TRP, et cela contrairement à Act, par exemple. L'apport conjoint donc de Mo et de TRP non raffiné, contenant notamment de la sérine, permet d'obtenir un triple effet (Figure 1), et du coup une synergie Mo x TRP d'autant plus importante. Soit la complémentation ; - du cofacteur Mo-Fe d'Acl (Mo) - du précurseur de la biosynthèse bactérienne d'Acl (TRP) 25 - des constituants caractéristiques d'Acl (Mo et TRP) Cette triple action des apports de Mo-TRP via une certaine interaction au niveau d'Acl n'avait jamais fait l'objet d'une valorisation agronomique avant aujourd'hui. A noter aussi que cette triple action, du fait du double rôle du TRP (i.e. précurseur d'auxine ET constituant d'Acl) n'est 30 véritablement possible qu'en présence d'Azotobacteracea réintroduite au sens de Claude et Fillion 2004. Cette utilité relative du TRP qu'en présence d'Azotobacteracea est d'autant plus défendable qu'il est reconnu que le prélèvement du TRP par les plantes n'est pas une des principales voies de biosynthèse d'auxines. L'invention permet aussi une certaine flexibilité lors de la biofertilisation des grandes 35 cultures non - légumineuses. Par exemple, les résidus de culture au sol peuvent maintenant être bactérisés directement par pulvérisation. On peut aussi ensemencer via un épandage d'une fumure de fond intégrant une dose-hectare dudit inoculum azotobactérien. On peut aussi placer en bandes près des semences, en guise d'engrais starter un granulé, essentiellement comparables à la susdite fumure de fond mais avantageusement enrichi de phosphate 40 d'ammonium (MAP, DAP). -10-BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS ET FIGURES Figure 1 : Représentation des liens métaboliques entre le Mo, la synthèse des auxines (IAA), le complexe Nif et le tryptophane (TRP), ainsi que les mécanismes Tsp et ndi, chez la plante (a) et chez l'azotobactérie (b). Du fait d'un plus grand maillage de ces liens chez l'azotobactérie, une interaction plus ou moins directe en TRP et Mo est beaucoup plus grande que chez la plante. Chez la bactérie le Mo est cofacteur de la composante I de la dinitrogenase (Nif) et de l'enzyme aldehyde oxidase impliquée dans la synthèse des IAA, tandis que le TRP est lui aussi un constituant caractéristique de ladite composante I de Nif ; ce jeu croisé permet une interaction plus ou moins directe entre TRP et Mo (b), beaucoup plus que chez la plante (a). De plus, la présence de TRP exogène, étant donné l'existence d'une protéine régulatrice d'ndi ù Tsp, particulièrement riche en TRP. Figure 2 : Matière sèche des parties aériennes (MSPA ; mg/10 sec par pot) produites ne serre par le Lolium multiflorum Lam. avec et sans TRP (10 ug/kg-sol) selon le taux de Mo exogène (en mg-Mo / kg-sol) dès la première coupe (cl) 28 jours post-semis. Figure 3 : Somme de la matière sèche des parties aériennes (MSPA ; mg/10 sec par pot) produites en serre par le Lolium multiflorum Lam. avec et sans TRP (10 uglkg-sol) selon le taux de Mo exogène (en mg-Mo / kg-sol) dès première et deuxième coupes (c12). Figure 4 : Schéma d'un procédé de fabrication de granules organominérales à partir de coproduits de la fabrication de biomasses microbienne, une certaine dose de TRP et de Mo au sens de l'invention, ainsi qu'une dose-hectare d'AZB. A noter que les granules ainsi formée contiennent au moins 40% de matières organiques (MO) et qu'elles ne sont pas bactéricides.

MODE DE REALISATION PREFERE DE L'INVENTION L'invention peut être réalisée dans le cadre de trois (3) types de systèmes de culture ; (i) cultures céréalière et de colza d'hiver en présence de résidus de culture au sol (ii) cultures intermédiaires pièges à nitrates (Cipan) avec fumure de fond (iii) cultures de maïs et sorgho avec engrais starter Pour les cultures céréalières et de colza d'hiver en présence de résidus de culture au sol, la bactérisation peut ce faire selon Claude et Fillion 2004, il est avantageux d'utiliser quelques grammes, soit envions 10, de tryptophane miscible à l'eau. Dans le cadre d'une implantation de Cipan, il s'agit de préparé une fumure de fond organominérale pouvant être apportée avantageusement au semis ou en pré-semis d'une culture intermédiaire piège à nitrate (Cipan), à hauteur de 100 à 150 kg/ha, et avantageusement, mais pas nécessairement, granulées aux normes physico ù mécaniques applicables aux engrais NPK. Il est avantageux de procéder tel que décrit à la Figure 2, l'étape de cuisson et de granulation des mélanges intervenant avant l'imprégnation des granules avec les AZB. A noter qu'ici les AZB sont avantageusement produite -11-

industriellement par fermentation à l'état solide. Cette production industrielle pourra avantageusement assurer l'enkystement des cellules ; cet enkystement permet aux cellules de mieux résister lors de l'étape d'imprégnation. Il est permit d'utiliser des biosolides et des coproduits des fermentations microbiennes impliquées, par exemple, dans la production de biomasses azotobactériennes. En effet, certains de ces produits contiennent des quantité parfois non négligeables de Mo et de TRP pouvant servir à la présente invention. Enfin, et pour la culture de maïs et de sorgho avec utilisation d'engrais starter, il faut surtout s'assurer que le mélange ayant servit à la constitution de la fumure de fond soit granulé de sort à permettre sont application en bandes en guise d'engrais starter en proximité de la semence ; voir en ce sens Claude et Giroux 2006. Les quantités de Mo et de TRP directement assimilables par les azotobactéries ne devraient pas dépasser 10 g chacune, soit environs la biomasses azotobactérienne inoculantes présente dans les mélanges (i.e. 5x1012 à lx1013 cellules par dose-hectare). Si des biosolides et/ou des coproduits suffisamment riches en Mo et/ou TRP ne sont pas disponibles, ces matières premières peuvent être incorporées aux mélanges ; vue les quantités maintenant nécessaires, du fait de la présente invention, les coûts restent, le cas échéant, faibles soit ù 0,70{ par hectare. APPLICATIONS BIOINDUSTRIELLES ET AGRONOMIQUES L'invention est susceptible d'être appliquée de deux façons ; (i) via la flore (azoto)bactérienne de la résidosphère, application dites MSOL au sens de Claude et Fillion 2004, et (ii) via l'intégration d'une flore (azoto)bactérienne à des engrais organo-minéraux, application dites EOMI au sens de Claude et Giroux 2006. (i) MSOL : Pour démontrer que l'invention est susceptible d'être appliquée au secteur agronomique de la production des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de culture pailleux au sol nous avons établit en serre un dispositif expérimental en carré latin constitué de pots de 500 ml contenant 350 g de sol reconstitué par séchage et tamisage à 4 mm ; l'analyse physico-chimique de ce sol est la suivante ; Analyse physico-chimique du sol alsacien utilisé CEC (cmol) pH MO (%) P205 (Dyer) P205 (Joret-Hebert) Texture A-L-S (g/kg-sol) K20 (g/kg-sol) MgO (g/kg-sol) CaO (g/kg-sol) Na2O (g/kg-sol) Fe (mg/kg-sol) Mn (mg/kg-sol) Zn (mg/kg-sol) Cu (mg/kg-sol) B (mg/kg-sol) 121 6,7 1,84 0,190 0.069 218-673-84 0,12 0,16 3,2 0,025 73,3 28,7 2,8 2,5 0,44 -12- Nous avons répartit aléatoirement au sein de ce dispositif huits (8) modalités ; 0g Mo/ha avec et sans 10gTRP/ha 1 g Mo/ha avec et sans 10gTRP/ha 10 g Mo / ha avec et sans 10 g TRP l ha 100 g Mo / ha avec et sans 10 g TRP / ha L'absence et la présence du TRP étant un dimension de chacune des seize (16) unités expérimentales ; il s'agit donc en tout de 32 pots de 350 g de sol. Avant d'incorporer aux pots leurs 350 g de sol, nous avons mélangé à ceux-ci 3 g de résidus de culture hachés et tamisés à 2 mm et dûment imprégnés par aspersion des susdites modalités sur une base pondérale, soit de 0.0, 0.03, 0.003 ou 0.0003 mg Mo, et de 0.0 et 0.003 mg de TRP par 3 g de résidus de culture pailleux et par pot. Outre le Mo, au semis, et cela jusqu'à cl 28 jps, nous n'avons pas apporté d'azote ou de solution nutritive ; dès cl nous avons apporté une solution nutritive contenant 35 mg N-NO3NH4 / kg sol et un complément micro- et macro-élémentaire nécessaire à une croissance sans carences. Les poids de matières, sèches (MSPA) et fraiches (MFPA) ont été déterminés à c1 et c2, soit 28 et 56 jours post-semis (jps) respectivement. La composition de la susdite solution nutritive est présentée à la page suivante. -------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------Pr éparation des solution nutritives avec et sans N Quatre solutions molaires (1M) pour les apports de N/P/K/S/Mg ; 1. Ca(NO3)2.4H2O 236.1 g/l 2. KNO3 101.1 g/1 3. KH2PO4 136.1 g/I 4. MgSO4.7H2O 246.5 g/1 Deux solutions oligo-élémentaire, soit pour 1 L ; H3B03 2.8 g MnCl2.4H20 1.8 g ZnSO4.7H20 0.2 g CuSO4.5H20 0.1 g, et, le cas échéant, NaMoO4 0.025 g (Nb. Il est nécessaire de préparer deux solutions oligo-élémentaires, l'une avec et l'autre sans Mo.) Une solution de Fe-EDTA ; 10.4 g EDTA.2Na 7.8 g FeSO4.7H20 56.1 g KOH ... pour I L de KOH, ajuster à pH 5,5 avec de l'acide sulfurique, et ajouter l'EDTA.2Na et le FeSO4.7H20 Pour prépare 1 L de solution nutritive, dite de Hoagland , à l'aide de ces solutions de base, les combiner dans les proportions suivantes ; 7 ml Ca(N 03)2 5 ml KNO3 2 ml KH2PO4 2 ml MgSO4 1 ml oligo-éléments (avec ou sans Mo) 1 ml FeEDTA QSP 1 L eau déminéralisée Les quantités (ml) de solution nutritive à apporte par pot dépendra comme de raison de la dose N-P recherchée, ainsi que de la quantité de sol par pot. - 13 -

Comme nous pouvons le voir à la Figure 2 il existe un effet TRP, ainsi qu'un effet Mo sur la production de MSPA récoltée lors de la première coupe (cl), et cela donc en absence d'Nm apporté par fertilisations. Ce qu'il faut noter à ce stade (cl) c'est que l'interaction Mo x TRP est plus négative que positive à ce stade, supposément du fait d'une partage des 10 g de TRP apportés entre la fourniture de précurseurs pour la synthèse d'auxines et des composantes I de la nitrogenase ; cette concurrence entre ces deux fonction pour TRP est normale étant donnée le nombre limité de molécules de Mo apportées, notamment au taux d'un gramme (1g) par hectare. Paradoxalement, la présence de Mo, en stimulant l'activité diazotrophique des Azotobacter en proximité des résidus de culture pailleux provoque une certaine carence û en terme de production de MSPA par pot du moins, en TRP ; l'effet anti-phytogène de cette carence est atténuée par l'interaction favorable entre Mo et TRP. Ce qu'il faut noter c'est que cette atténuation û l'effet recherchée ici est tout aussi importante à 10 qu'à 100 g de Mo par hectare, ou l'équivalent de. Nous avons mené cet essai pendant 28 jours supplémentaires au-delà de cl jusqu'à c2 56 jours post-semis. Comme nous pouvons le voir à la Figure 2 l'amélioration de l'effet relatif du Mo est améliorer en présence de Mo, du moins jusqu'à concurrence de l'équivalent de 10 g de Mo par hectare. Encore une fois, ce qu'il y a d'étonnant donc c'est qu'à partir de l'équivalent del 0 g de Mo apporté par hectare, l'effet phytogène du TRP redevient comparable à celui obtenue en absence de Mo. La stimulation de la nitrogenase du fait de l'apport de Mo û et donc du coup un certaine détournement du TRP vers celle-ci, dépend desdites auxines, vraisemblablement ne ce fait plus au dépends de l'effet phytogène immédiate du TRP ; les stimulations (augmentation) de ces deux activités, nitrogenase et auxinogène, ce fait donc conjointement, bienque leurs effets phytogènes risquent d'être décalé dans le temps. En effet, l'effet phytogène du TRP/auxine est plus ou moins immédiat, tandis que celui du Mo/nitrogenase lui nécessite le re-largage de l'azote diatomique ainsi réduit intra-cellulairement. A terme, dans un contexte agronomique in situ (au champ) notamment, le re-largage de ce surcroit d'azote réduit du fait d'une diazotrophie azotobactérienne dopée par la présence de 10 g de Mo apporté par hectare, contribuera d'autant plus à l'alimentation en N de la culture et à l'augmentation de son rendement. L'invention repose donc sur un constat nouveau selon lequel le TRP apporté au résidosphères, avantageusement azotobactérisées, a une double fonction ; i) entant que précurseur à la synthèse de auxines (i.e. il est auxinogène), et ii) entant qu'élément essentielle de la composante II de la nitrogénase d'Azotobacterspp., mais cela qu'en présence de suffisamment de Mo en guise de cofacteurs. C'est pourquoi, étonnamment, la présence de Mo va initialement réduire l'effet phytogène du TRP immédiatement appréciable du fait d'un parcours (cascade enzymatique) somme toute assez court par rapport à celle du système Nif. De plus, la double application de Mo et de TRP va contribuer initialement à stimuler la croissance cellulaire d'AZB au dépends - nécessairement, de la MSPA produite jusqu'à c2. Or, en situations agronomique, et a mesure que cette croissance d'AZB pourra contribuer au bilan N du système sol/plante, et/ou à la synthèse d'IAA, la production de MSPA sera rétablie, voire surpassera celle des témoins sans Mo et/ou TRP ; ce n'est qu'une question de laisser le temps au AZB de re-larguer l'N réduit d'origine diazotrophique. - 14-

Paradoxalement donc, cette apparente contreperformance du Mo en terme de production de phytomasse par les plantules de Lolium permet de mieux apprécier l'atténuation de ce phénomène par l'interaction Mo * TRP. Cette contreproductivité des faibles doses de Mo est quasi-complètement atténuée du fait de cette interaction rendue possible par la co-formulation Mo- TRP proposée ici. Du coup, ces faibles doses de Mo sont maintenant susceptibles d'être appliquées en production des grandes cultures non-légumineuses, notamment celles pouvant bénéficier de biofertilisations azotobactériennes. D'un point d vue agronomique, ce qu'il faut noter c'est ce cumul des effets phytohormonal et diazotrophe est en voie d'être quasi optimal dès l'apport de 10 g de Mo par hectare, soit un ordre de grandeur (10 fois) moins que l'apport de FixMo tel que préconisé pour les grandes cultures légumineuses, cultures pourtant en symbioses avec des Rhizobiacea, et/ou les quelques 100 g par hectare ici apporté sans le TRP. Le TRP, du fait de son interaction avec le Mo au niveau enzymatique au sens de la présente invention (Figure 1) permet donc d'effectivement améliorer l'efficacité pondérale du Mo, matière première dont le prix de revient peut-être onéreux en productions végétales. (ii) EOMI : Pour démontrer l'utilité de l'invention une série de dispositifs en serre, avec est sans la bactérisation de mélanges organo-minéraux constitués des biosolides dits ici AFE , composés en partie de terre diatomée (Tableau A) et PRT (Tableau B), pour l'essentiel un sous produit de la production bio-industrielle d'acide glutamique à l'aide d'actinobactéries. L'invention peut être réalisée à l'aide de ces mélanges organo-minéraux (0,01% p/p sol, ou environ 100-150 Kglha ; Figure 4) en présence de résidus de culture pailleux au sol (1% p/p sol) au sens de l'invention, et l'équivalent d'une dose hectare de 5x1012 cellules azotobactériennes (Claude et Fillion 2004, Claude et Giroux 2006).

Pour fin d'expérimentation, nous nous sommes limité au simple mélange mécanique des ces préparation organominérales inoculantes enrichis de Mo et de tryptophane au sens de l'invention ET des résidus de culture pailleux. Une fois intégrée par malaxage aux sols reconstitués, (voir infra) ce mélange résidus de culture / préparation organominéral simulera un certain compromis entre les trois systèmes de cultures concernés par l'invention.

Les cellules AZB sont avantageusement obtenues selon le protocole d'obtention décrit dans la demande de brevet français FR 01/15542. Les susdits mélanges organo-minéraux et les résidus de cultures sont incorporés aux sols arables reconstitués et placés en pots en serre pour la culture éventuelle des plantes test selon les règles de l'art. L'utilité d'un apport conjoint de Mo et de TRP, et donc de la double fonction du TRP entant que précurseur d'IAA et de constituant d'Acl, seront démontrés. Ces exemples d'applications devront aussi démonter que seule les triples interactions AZB x Mo x TRP rendant utile une dose-hectare de Mo d'au plus 10 g, soit à peine 10% de celle normalement recommandée pour les symbioses Rhizobiacea l Leguminosea. En principe, une partie de ce Mo provient des biosolides (Tableau A). Or vue la teneur en Mo de ce type de coproduit industriel, il est avantageux de supplémenter les préparations avec 10 g de Mo par dose-hectare. Idem pour ce qui est du TRP -15-

contenue dans d'éventuels coproduits (Tableau B) ; un apport de 10 g de TRP (- 0,70 {) est recommandé.

Tableau A : Caractérisation biosolides AFE - voir Figure 4 Paramètres analysés Unités sec brut Matières Sèches (MS) g/kg 1000 418,7 Carbone Organique total (COT) g/kg 199,8 83,7 Azote total (NtK) g/kg 33,4 14 Azote ammoniacal (N-NH4) g/kg 2,5 1 Rapport C/N 6,5 pH eau 3,7 Calcium total(CaO) g/kg 29,4 12,3 Magnesium total (MgO) g/kg 0,8 0,3 Phosphore total (P2O5) g/kg 0,9 0,4 Potassium total (K2O) g/kg 4,8 2 Oligo-éléments* : mg/kg 1,9 0,8 Bore total (B) Cobalt (Co) mg/kg < 8,63 < 3,62 Cuivre (Cu) mg/kg 7,6 3,2 Fer (Fe) g/kg 1,9 0,8 Manganèse (Mn) mg/kg 25,8 10,8 Molybdene (Mo) mg/kg 3,2 1,3 Zinc (Zn) mg/kg 11,9 5 Tableau B : Caractérisation biosolides PRT - voir Figure 4 (sur produit brut) Valeur Unité Matière séche 93 % Protéines brutes 69 % Fibres brutes 1,0 Matières grasses 6,0 0/0 Potassium 0,2 % Sodium 1,5 Calcium 0,03 Magnésium 0,06 Phosphore 0,3 % Chlorures 0,9 Sulfates 6 Acides aminés 5 % Acide aspartique Thréonine 3,0 % Sérine 2,2 % Acide glutamique 12,3 % Glycine 2,4 % Alanine 6,0 % Valine 2,9 % Isoleucine 2,2 % Leucine 3,1 % Tyrosine 1,3 % Phénylalanine 1,9 % Lysine 0,9 % Histidine 0,9 cl/o Arginine 3,1 % Méthionine 0,9 % Cystine 0,2 Proline 1,6 Tryptophane 0,5 % -16- Vingt cinq (25) plantules de Lolium multiflorum Lam. sont établis en serre dans des pots contenant 1 kg de sol reconstitué. Une première coupe peut intervenir 35 jours post semis (jps), et trois fois à 10 jours d'intervalle par la suite ; au total 4 coupes seront effectuées, la somme de ces coupes constituant la MSPA (matière sèche des parties aérienne) produite par pot. Le Lolium permet d'effectuer des coupes multiples dès 35 jours post semis (jps) et au 10 jours par après (45, 55, 65 jps, etc.). Les plantules de Lolium sont alimentées en sels minéraux fertilisants à l'aide d'une solution nutritive conventionnelle (eg. Hogland). Enfin, et afin d'éviter une carence trop marquée en azote, l'équivalent de 35 mg/kg d'azote sous forme de nitrate d'ammonium est aussi apportée dès la première coupe effectuée 35 jps.

Expérimentation 1 : Seize pots (25 plants / Kg sol) sont disposés dans 4 blocs Fischer (RCBD ; 4 x 16 = 64 unités expérimentales). Les MSPA ainsi produites par le Lolium selon les différentes modalité sont rapportées au Tableau 1.

Tableau 1 -------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------------sans AZB avec AZB efficacité relative (dose-hectare Mo -* 100 g 10 g 100 g 10 g 100 g 10 g) Mo TRP mg MSPA / pot (25 plants) non non 85 84 95 95 1,12 1,12 oui non 90 91 102 93 1,13 1,04 non oui 100 100 112 105 1.12 1,05 oui oui 104 103 132 132 1,27 1,28 -------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------- A noter qu'en présence d'AZB l'apport d'un complément de TRP à un milieux avec Mo (1,02 à 1,32 d'efficacité relative, ou er ) est beaucoup plus conséquent que l'apport d'un complément de Mo à un milieux avec TRP (1,12 à 1,32 d'er). De même, en présence d'AZB l'apport simple de TRP (sans Mo) est aussi plus effiace (0,85 à 1,00 d'er) que l'apport simple de Mo (sans TRP ; 0,85 à 0,90 d'er).

Pris ensembles, ces observations sont conforment avec notre hypothèse selon laquelle le TRP agit entant que précurseur d'IAA ET constituant caractéristique de la Composante I de la dinitrogenase d'Azotobacter chroococcum (iAcl) ; c'est cette double action, ce double rôle du TRP qui vraisemblablement le rend ici plus conséquent que le Mo.

Expérimentation 2 : Les huits (8) pots (25 plant I Kg sol) ont été disposé en carrés latins (8 x 8 = 64). Afin de démontrer qu ele Mo agit bel et bien au niveau de la dinitrogenase, un témoins sans Mo et avec un ajout de 75 mgN / Kg sol sous forme de nitrate d'ammonium est inclut. Comme de raison, chaque modalité a reçu l'équivalent de 10 g de TRP par ha en sus du TRP que contient le PRT. Les MSPA produites sont rapportées au Tableau 2. Comme nous pouvons le voir, c'est seulement en présence des AZB que les apports de Mo sont valorisés du fait de la présence du TRP (voir Expérimentation 1). Or, ces apports de Mo peuvent être, en présence d'AZB, aussi faibles que 10 g par ha. Enfin, l'ajout de nitrate d'ammonium confirme que l'effet phytogène du Mo est lié à la diazotrophie des AZB. -17- -------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------- Tableau 2 - -------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------- sans AZB avec AZB efficacité relative ---- mg MSPA / pot (25 plants) ---- 100 112 1,12 103 132 1,28 102 115 1,13 128 121 0,95 Sans Mo dose-hectare 100 g Mo dose-hectare 10 g Mo Avec Mo + NO3NH4 - -------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------- Expérimentation 3 : Au sein de deux (2) dispositifs en carré latins (Tableaux 3a et 3b ; 6 x 6 = 36) l'essentiel de l'Expérimentation 1 est repris, en prenant soins de remplacer le témoins sans Mo avec un témoin avec l'équivalent de 75 mgN / Kg sol sous forme de nitrate d'ammonium (idem Expérimentation 2). Le premier dispositif comprend des dose-hectare de Mo de 100 g, et le second de 10 g. -------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------Tableau 3a : dose-hectare Mo 100 g -------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------- sans AZB avec AZB efficacité relative ---- mg MSPA / pot (25 plants) ---- Sans TRP 90 102 1,10 Avec TRP 104 132 1,26 Avec TRP + NO3NH4 130 127 0,98 -------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------Tableau 3b : dose-hectare Mo 10 g -------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------- sans AZB avec AZB efficacité relative ---- mg MSPA/ pot (25 plants) ---- Sans TRP 90 94 1,05 Avec TRP 104 132 1,26 Avec TRP + NO3NH4 130 127 0,98 - -------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------35 En présence d'AZB, les mélanges organo ù minéraux à base de biosolides AFE et de PRT comportant les dose-hectare Mo et de TRP de 10g chacune sont aussi efficaces que ceux enrichis de 100 g de Mo. II semble donc qu'effectivement la présence des AZB permet au TRP d'améliorer l'efficacité du complexe Nif en rendant plus directement disponible le TRP entant que constituant

40 caractéristique de sa Composante I ET précurseur d'IAA. Ce rapprochement entre TRP doublement utile, la diazotrophie des AZB et un complément de Mo est, paradoxalement, beaucoup moins opérable dans le cas des légumineuses en symbioses avec des Rhizobiacea du fait que ces bactéroides sont moins accessibles et dépendent plus du Mo végétale recyclé in planta (Brodrick et Giller 1991).

45 Références, bibliographie et brevets pertinents Ahmad, Rizwan, Azeem Khalid, Muhammad Arshad, Zahir A. Zahir and Tariq Mahmood. 2008. Effect of compost enriched with N and L-tryptophan on soit and maize Agronomy for Sustainable Development 50 28 (2) 299-305 (2008) Arshad, M. et W.T. Frankenberger, Jr. 1991. Microbial production of plant hormones. Plant and Soit 133:1-8. Arshad, M. et W.T. Frankenberger, Jr. 1998. Plant growth-regulating substances in the rhizosphere : microbial production and function. Advances in Agronomy 62: 45-151. 25 30 -18- Baldi, B. B.R. Maher, J. Pernise Slovin et J.D. Cohen. 1991. Stable isotope labeling, in Vivo, of D- and L-tryptophan pools in Lemna gibba and the low incorporation of label into Indole-3-acetic acid. Plant Physiol. 95:1203-1208. Brodrick, S.J. et K.E. Giller. 1991. Root nodules of phaseolus : efficient scavengers of molybdenum for N2 5 fixation. J. Exp. Bot. 42:679-686. Claude, P-P. et L. Fillion. 2004. Effet de l'apport d'un inoculum bactérien aux résidus de culture de maïs-grain au sol sur le rendement et la qualité de blés d'hiver panifiables en France. Agrosol (depuis Agrosolutions ) 15(1) :23-29. Claude, P-P. et M. Giroux. 2006. Effet des engrais organo ù minéraux inoculés (EOMI) sur la croissance des 10 plants de maïs - grain, les rendements, les prélèvements des éléments nutritifs et la qualité des grains. Agrosolutions 17(1) : 51-64. Corbett, Mary C., Yilin Hu, Aaron W. Fay, Markus W. Ribbe, Britt Hedman, and Keith O. Hodgson. 2006. Structural insights into a protein-bound iron-molybdenum cofactor precursor. PNAS103;1238-1243 Davey, M.E. et Frans J. De Bruijn. 2000. A Homologue of the Tryptophan-Rich Sensory Protein TspO and 15 FixL Regulate a Novel Nutrient Deprivation-Induced Sinorhizobium meliloti Locus. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2000, p. 5353ù5359 Vol. 66, No.

12 Dean, Dennis R., Jeffrey T. Bolin, And Limin Zheng. 1993. Nitrogenase Metalloclusters: Structures, Organization, and Synthesis. Journal of Bacteriology, Nov. 1993, p. 6737-6744 Vol. 175, No.

21 Deistung, Janet et Roger N. F. Thorneley. 1986. Electron transfer to nitrogenise Characterization of 20 flavodoxin from Azotobacterchroococcum and comparison of its redox potentials with those of flavodoxins from Azotobacter vinelandii and Klebsiella pneumoniae (nifF-gene product). Biochem. J. (1986) 239, 69-75 El-Samad, Abd H.M., H.M. El-Komy, M.A.K. Shaddad et A.M. Hetta. 2005. Effect of molybdenum on nitrogenase and nitrate reductase activity of wheat inoculated with Azospirillum brasilense grown 25 under drought stress. Gen. Appl. Plant Physiol. 31:43-54. Franco, A.A. J.R.R. Peres et M. Nery. 1978. The use of Azotobacter paspali N2-ase (C2H2 reduction activity) to measure molybdenum deficiency in soils. Plant and Soi! 50:1-11. Goldberg, S., S.M. Lesch et D.L. Suarez. 2002. Predicting molybdenum adsorption by soils using soi! chemical parameters in the constant capacitance model. Soil Sci. Soc. Am. J. 66:1836-1842.

30 Hu, Yilin Aaron W. Fay$, Benedikt Schmid , Beshoie Makar$, and Markus W. Ribbe. 2006. Molecular Insights into Nitrogenase FeMoco Insertion TRP-444 OF MoFe Protein-Subunit Locks FeMoco ln Its Binding Site. The Journal Of Biological Chemistry Vol. 281, NO. 41, pp. 30534ù30541, October 13, 2006 Hu, Yilin, Aaron W. Fay, Patricia C. Dos Santos, Farzad Naderi, and Markus W. Ribbe. 2004.

35 Characterization of Azotobacter vinelandii nifZ Deletion Strains Indication Of Stepwise MoFe Protein Assembly. The Journal Of Biological Chemistry Vol. 279, No. 52 pp. 54963ù54971, 2004 Igarashi, R.Y. et L.C. Seefeldt. 2003. Nitrogen fixation : the mechanism of the Mo-dependent nitrogenase. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 38:351-384. Jacobson, M.R., R. Premakumar et P.E. Bishop. 1986. Transcroptional regulation of nitrogen fixation by 40 molybdenum in Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol. 167:480-486 Jones, D.L., J.R. Healey, V.B. Willett, J.F. Farrar et A. Hodge. 2005a. Dissolved organic nitrogen uptake by plants ù an important N uptake pathway ? Soil Biol. Biochem. 37: 413-423. Jones, D.L., D. Shannon, T. Junvee-Fortune et J.F. Farrar. 2005b. Plant capture of free amino acids is maximized under high soil amino acid concentrations. Soil Biol. Biochem. 37: 179-181.

45 Kaiser, B.N., K.L. Gridley, J. Ngaire-Brady, T. Phillips et S.D. Tyerman. 2005. The role of molybdenum in agricultural plant production. Ann. Bot. 96:754-754. Kinraide, T.B. 1981. Interamino acid inhibition of transport in higher plants. Plant Physiol. 68:1327-1333. Loveless, T.M., J. Royden Saah et P.E. Bishop. 1999. Isolation of nitrogen fixing bacteria containing molybdenum-independent nitrogenases form natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 50 65:4223-4226. Mendel, R.R. 2007. Biology of the molybdenum cofactor. J. Exp. Bot. 58:2289-2296. Mendel, R.R. et R. Hénsch. 2002. Molybdoenzymes and molybdenum cofactor in plants. J. Exp. Bot. 53:1689-1698. Yates, M.G. et L. Planqué. 1975. Nitrogenase from Azotobacter chroococcum : purification and properties of 55 the component proteins. Eur. J. Biochem. 60:467-476. Yeliseev, Alexei A. et Samuel Kaplan. 2000. TspO of Rhodobacter sphaeroides A Structural And Functional Model For The Mammalian Peripheral Benzodiazepine Receptor. The Journal Of Biological Chemistry Vol. 275, No. 8, pp. 5657ù5667, 2000 Xie, Gary, Carol A Bonner, Jian Song, Nemat 0 Keyhani2 and Roy A Jensen. 2004. Inter-genomic 60 displacement via lateral gene transfer of bacterial trp operons in an overall context of vertical genealogy. BMC Biology 2004, 2:15 doi:10.1186/1741-7007-2-15 Zahir, A.Z., H.N. Asghar, M.J. Akhtar et M. Arshad. 2005. Precursor (L-tryptophan)-inoculum (Azotobacter) interaction for improving yields and nitrogen uptake of maize. J. Plant Nutr. 28:805-817.

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) lorsqu'apportés en proximité des racines pour la biofertilisation des grandes cultures non-légumineuses en présence de résidus de cultures pailleux au sol ou d'engrais organo-minéraux non-bactéricides.
2. 2. Utilisation du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) selon la revendication 1 caractérisée en ce que Mo et TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par pulvérisation liquide des résidus de culture pailleux au sol pré-semis d'une grande culture d'hiver.
3. 3. Utilisation du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) selon la revendication 1 caractérisée en ce que Mo et TRP sont apportés ensemble en proximité des racines de la grande culture non-légumineuse par incorporation à un engrais organo-minéral (EOM) non-bactéricide et utilisé comme engrais starter au printemps ou comme fumure de fond à l'automne.
4. 4. Utilisation du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) selon une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la dose-hectare de Mo ce situe entre 1 et 33 g, plus particulièrement entre 5 et 25, et avantageusement entre 8 et 12 g, tandis que celle du TRP ce situe entre 5 et 50 g, plus particulièrement entre 12 et 36, et avantageusement entre 24 et 26 g.
5. 5. Utilisation du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) selon une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que lesdits résidus de culture pailleux au sol et EOM sont bactérisés à l'aide d'une dose hectare de biomasses Azotobacteracea (AZB) obtenues expressément à cet effet contenant entre 1 x 1012 et 1 x 1013, voire plus avantageusement 5 x 1012 cellules viables et correctement formulées et conditionnées..
6. 6. Utilisation du molybdène (Mo) et du tryptophane (TRP) selon une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que les grandes cultures non-légumineuses sont choisies parmi un groupe comprenant les céréales d'hivers ù y compris le blé, l'avoine, l'orge, le seigle et le triticale, le colza d'hiver, le maïs et le sorgho.
7. 7. Biofertilisants pour grandes culture non-légumineuses utilisant le Mo et le TRP selon une quelconque des revendications 1 à 6, avantageusement en présence d'au moins 5 x 1012 cellules Azotobacteracea réintroduites expressément à cet effet sur lesdits résidus de culture pailleux au sol ou au sein desdits EOM. - 1.9 -