CN111153977A - 一种与植物抗逆性相关蛋白质PwUSP1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与植物耐逆性相关的蛋白质PwUSP1及其编码基因与应用。所述蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。本发明证明在植物中过表达PwUSP1基因能够显著提高拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受能力。理论上通过如农杆菌侵染法、基因枪法等方式在植物中过表达PwUSP1基因或其同源基因能够大幅提升植物的耐逆能力。

Description

一种与植物抗逆性相关蛋白质PwUSP1及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关的蛋白质PwUSP1及其编码基因与应用。
背景技术
干旱、盐碱等非生物胁迫已经严重影响植物的生长发育，影响植物的自然分布，已成为制约我国农业、林业生产发展的重要因素。而植物应答非生物胁迫是一个非常复杂的过程，包括基因的表达和信号的调控等，随着现代生物技术的不断发展，近年来，研究人员通过基因克隆、基因功能验证等生物学手段，阐明了许多植物响应非生物胁迫的分子机制。普遍胁迫蛋白(Universal stress protein)是一种抗逆相关基因，它在非生物胁迫中发挥着非常重要的作用，目前已报道，在拟南芥、陆地棉、番茄等中都发现了USP蛋白，但是在裸子植物中关于USP的研究很少。
青杆(Picea wilsonii Mast.)，又名华北云杉，松科云杉属，适宜生长在凉爽湿润的气候以及排水良好的微酸性土壤环境中，常成单纯林或与白杄、白桦、黑桦等针阔叶树混生成林，也是我国重要的园林绿化树种。之前报道关于青杄的研究，多集中于群落生态和育苗栽培等方面，但随着生物技术的发展，利用生物学手段对青杄的研究也有了一定的进展。随着环境恶化，干旱、盐渍化等胁迫威胁着青杆分布及应用，本研究旨在研究青杄中的抗逆蛋白USP(universal stress protein)，研究其在逆境中的功能并进行验证，为分子育种在木本植物中的应用提供理论基础及丰富木本植物中逆境基因的相关作用机制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物耐逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关蛋白质。
本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白的名称为PwUSP1，来源于青杄(Piceawilsonii Mast.)，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
其中，序列2由172个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质PwUSP1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质PwUSP1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质PwUSP1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明又提供了与PwUSP1蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与PwUSP1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码PwUSP1蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PwUSP1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码PwUSP1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列1由1167个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。
本领域相关技术人员能够通过使用已知的如定向进化和点突变等实验方法，对本发明的编码PwUSP1的核苷酸序列进行突变。凡是经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PwUSP1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PwUSP1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码PwUSP1的核酸分子的表达盒(PwUSP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PwUSP1的DNA，该DNA不但可包括启动PwUSP1转录的启动子，还可包括终止PwUSP1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述PwUSP1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。使用PwUSP1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素、氯霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
扩增上述PwUSP1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的实施例中，所述重组载体具体可为在pCAMBIA1205载体的BamHI和KpnI位点间插入上述PwUSP1基因(序列1)得到的重组表达载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌为GV3101。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供PwUSP1蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了PwUSP1蛋白质或上述生物材料在提高植物耐逆性中的应用。
本发明还提供了PwUSP1蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。
上述应用中，所述PwUSP1基因为植物耐逆性正向调控基因，所述培育高抗逆性的转基因植物的方法可为在转基因植物中过表达该基因以增强PwUSP1基因或其同源基因从而发挥正向调控功能，提高植物耐逆性。
上述应用中，所述抗逆性为对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。
为验证PwUSP1蛋白正向调控植物耐逆性的功能，本发明提供的与野生型植物相比对非生物胁迫更为耐受的转基因植物的方法包括提高受体植物中PwUSP1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对于高盐和干旱的耐受能力均高于所述受体植物。
上述方法中，所述提高受体植物中PwUSP1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达PwUSP1蛋白质。
上述方法中，所述过表达的方法为将PwUSP1蛋白质的编码基因导入受体植物；所述PwUSP1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。
在本发明的一个试验方法中，PwUSP1蛋白质的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有PwUSP1蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA1205-PwUSP1导入农杆菌GV3101中。所述重组载体pCAMBIA1205-PwUSP1为将序列表中序列1所示的PwUSP1插入表达载体pCAMBIA1205的BanmHI和KpnI酶切位点间，且保持pCAMBIA1205载体的其他序列不变后得到的载体。所述重组载体pCAMBIA1205-PwUSP1表达PwUSP1蛋白质。
上述方法中所述转基因植物的抗逆性高于所述野生型受体植物的具体表现为在逆境胁迫下产生如下方式：所述转基因植物在高浓度盐或干旱环境胁迫下存活率高于所述受体植物。上述高盐环境具体是200mM的NaCl水溶液引起的环境；上述干旱环境具体是停止浇水20天的干旱处理环境。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述PwUSP1基因导入受体植物得到的第一代转基因植物同时包括其子代，也包括通过如农杆菌侵染技术等方式过表达受体植物中的PwUSP1基因及其同源基因后所得到的第一代转基因植物同时包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)。
本发明首先发现了基因PwUSP1，然后将其导入拟南芥中得到转PwUSP1拟南芥，并发现转PwUSP1拟南芥对于高盐和干旱的耐受能力显著高于原受体植株，证明该基因为植物抵御逆境胁迫过程中的正向调控基因。其具体表现如下：在浇灌200mM浓度的NaCl溶液胁迫下，野生型植株的叶片明显变黄并且严重枯萎，甚至在第10天导致大量植株死亡，存活率低于45％，与此相比转基因植株在胁迫处理期间它们的生长相对健康，叶片只有少量的萎黄现象，存活率在90％以上；在200mM浓度的NaCl溶液胁迫下第6天，转基因植株的丙二醛含量显著低于野生型株系且SOD、POD、CAT酶活性均显著高于野生型植株。本发明获得的转PwUSP1拟南芥在培养基质中停止浇水20天，又复水3天后野生型植株的萎蔫情况没有得到缓解，最终其存活率低于20％，而转基因植株经过干旱后复水的存活率超过了90％；干旱处理14天后，转基因植株的丙二醛含量显著低于野生型株系且SOD、POD、CAT酶活性均显著高于野生型植株。上述结果表明，PwUSP1或其编码的蛋白质具备正向调控植物耐旱性和耐盐性的功能。
附图说明
图1为PwUSP1基因在逆境条件下的表达情况。
图2为转PwUSP1拟南芥分子检测结果。
图3为转PwUSP1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在干旱处理20天，复水3天后的观测情况、存活率和失水率结果。
图4转PwUSP1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在200mM的NaCl处理10天后的观测情况及存活率结果。
图5为转PwUSP1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在200mM的NaCl处理和干旱处理后的生理指标结果。
图6转PwUSP1拟南芥和野生型拟南芥植株在正常条件下植株生长量比较结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pCAMBIA1205载体记载于文献“ZhangTong，LiYanfang，ZhouYanni，ZhangLingyun，Cloning and Expression Analysis of a HomologousExpansin Gene EXP2 in Picea wilsonii.Journal of Forestry Research.2016,27(2):247–255.”中，公众可从申请人(北京林业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、PwUSP1及其编码基因的获得
一、PwUSP1及其编码基因的获得
本实验在通过对青杄响应干旱和盐处理的转录组数据筛选之后，获得了青杄PwUSP1基因的编码区序列，采用5’-ATGGAGAGTGGGGAGCATAG-3’和5’-TATTACTGATAGGTCTCCAGCC-3’为引物，以由英潍捷基(上海)公司完成的采用Gateway方法构建的青杄cDNA文库为模板，克隆得到PwUSP1的开放阅读框序列，连接到pEASY-T1载体上并对其进行测序。
测序结果表明：cDNA核苷酸序列为序列表中序列1，由1167个核苷酸组成，与Genbank中的序列进行比较，确定它属于USP家族，并将其所示的基因命名为PwUSP1，PwUSP1编码的蛋白质命名为PwUSP1，其氨基酸序列为序列表中序列2，由172个氨基酸组成。上述cDNA可以通过人工合成获得。
二、通过荧光定量PCR分析PwUSP1逆境胁迫下表达情况
将8周大的青杄幼苗根浸入150mmol/L NaCl溶液0、3、6和12小时，对照则是以正常生长的苗子浸入水中0、3、6、12小时；将幼苗置于吸水纸上处理0、3、6、12h进行干旱处理。所有处理重复三次,对照组为没有进行处理的植株,将所有处理完的植物材料用液氮速冻,置于-80℃冷冻留存。分别提取上述材料的RNA，反转录合成cDNA，然后分别以上述各胁迫处理后青杄的cDNA为模板，以RT引物5’-GAGAGTGGGGAGCATAGATGG-3’和5’-CCGCCATGCGACAGAGATGTA-3’为引物进行PCR扩增，检测PwUSP1基因在不同逆境胁迫下的表达情况。同时以EF1-α基因作为内参，扩增EF1-α基因的5’引物为：5’-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3’，3’引物为：5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。
RT-qPCR反应条件：先95℃预变性15min；然后95℃20sec，56℃28sec，72℃50sec，共33个循环；再72℃延伸5min。
PwUSP1基因对盐、干旱胁迫均有响应。盐胁迫下如图1a所示，1h、3h、6h的表达量变化不明显,和对照组的差异不大，但在12h时PwUSP1的表达量得到上调，为对照组的2倍左右。干旱胁迫与盐胁迫相似，如图1b所示在1h、3h、6h时表达量没有变化，但是在12h时，表达量出现大幅度提高，12h的表达量高达对照的5倍左右，1h、3h、6h则和对照组的差别不大。
实施例2、PwUSP1基因正向调控植物耐逆性
一、转PwUSP1拟南芥的构建
1、PwUSP1基因的获得
本实验以5’-ATGGAGAGTGGGGAGCATAG-3’和5’-TATTACTGATAGGTCTCCAGCC-3’为引物，以由英潍捷基(上海)公司完成的采用Gateway方法构建的青杄cDNA文库为模板，克隆得到PwUSP1的开放阅读框序列，连接到pEASY-T1载体上并对其进行测序。
测序结果表明：cDNA核苷酸序列为序列表中序列1，由1167个核苷酸组成，其氨基酸序列为序列表中序列2，由172个氨基酸组成。上述cDNA可以通过人工合成获得。
2、重组表达载体的获得
制备下述引物对：
引物1：5’-CGGGATCCAGAAAGAAGATAGATAAACG-3’；
引物2：5’-GGGGTACCGTGAAATGGAGCTTTGGCGA-3’。
以上述连接有PwUSP1序列的pEASY-T1的质粒为模板进行PCR扩增，后将PCR产物用限制性内切酶BamHI和KpnI进行双酶切，得到酶切产物。酶切产物与经相同酶切的pCAMBIA1205载体相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在含有35ug/ml氯霉素的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落于含有35ug/ml氯霉素的LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时提取质粒DNA进行序列测定。
测序结果表明，质粒为将序列表中序列1所示的PwUSP1插入表达载体pCAMBIA1205的BamHI和KpnI酶切位点间得到的重组载体，将其命名为pCAMBIA1205-PwUSP1。
3、转PwUSP1拟南芥的获得
1)转PwUSP1拟南芥的获得
将上述步骤2制备的重组载体pCAMBIA1205-PwUSP1转化农杆菌GV3101的感受态细胞(购置于上海唯地生物技术公司)，得到重组菌GV3101/pCAMBIA1205-PwUSP1(提取质粒送去测序，为重组载体pCAMBIA1205-PwUSP1)。
将重组菌GV3101/pCAMBIA1205-PwUSP1单克隆接种于含35mg/L氯霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养两天。将培养液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％SilwetL-77的侵染液悬浮。
采用花序浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)(购自ABRC)，收获当代转基因拟南芥植株所接的种子(T0代)，在含有40μg/ml潮霉素(Hygromycin B)和50μg/ml羧苄青霉素(Carbenicllin)的MS培养基筛选萌发的种子，获得了七个独立的PwUSP1过表达的T1品系，将在上述培养基上萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的转PwUSP1拟南芥植株(T3代)种子。最后将转PwUSP1拟南芥植株(T3代)种子直接播种到培养土中，长出的PwUSP1拟南芥植株(T3代)在长日照条件下生长两周左右开花。实验中选择了两个独立的稳定纯合的PwUSP1-Line-1(L1)和PwUSP1-Line-7(L7)T3代品系用于下述耐逆性实验，野生型株系(WT)和转空pCAMBIA1205载体的转基因株系(VC)作为对照。
2)转PwUSP1拟南芥的分子检测
分别提取转PwUSP1拟南芥T3代植株(L1、L7)、野生型株系(WT)和转空pCAMBIA1205载体的转基因株系(VC)的RNA，反转录合成cDNA，然后分别以上述各株系的cDNA为模板，以RT引物5’-GAGAGTGGGGAGCATAGATGG-3’和5’-CCGCCATGCGACAGAGATGTA-3’为引物进行PCR扩增，检测PwUSP1基因在不同逆境胁迫下的表达情况。同时以EF1-α基因作为内参，扩增EF1-α基因的5’引物为：5’-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3’，3’引物为：5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。RT-qPCR反应条件：先95℃预变性15min；然后95℃20sec，56℃28sec，72℃50sec，共33个循环；再72℃延伸5min。
PwUSP1基因的表达情况如图2所示。结果表明在转PwUSP1拟南芥(L1、L7)中PwUSP1基因大量表达，而在野生型株系(WT)和转空pCAMBIA1205载体的转基因株系(VC)则基本没有检测到PwUSP1基因的表达。
二、转PwUSP1拟南芥功能研究
1、成苗耐逆实验
1)耐盐性研究
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，在培养基质中生长14天后，浇以200mM NaCl溶液，每三天浇一次，10天后统计存活率。实验重复3次，结果取平均值。其实验结果如图4所示(WT表示野生型拟南芥，VC表示转空载体拟南芥，L1、L7表示转PwUSP1拟南芥植株T3代)，在200mM NaCl处理6天后，野生型和转空载体拟南芥植株的叶片明显变黄并且严重枯萎，且随着盐胁迫处理时间的增加，野生型和转空载体拟南芥叶片的萎黄现象逐渐加剧，盐胁迫处理10天后野生型和转空载体拟南芥植株大量死亡，存活率低于45％，而转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)株系在盐胁迫处理期间，相对于野生型和转空载体株系，其叶片只出现少量的萎黄表型，存活率高于90％。在盐胁迫处理10天时，转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)植株成活率显著高于野生型和VC型植株(图4b)。上述结果表明，PwUSP1的过表达能够显著提高植物对盐胁迫的耐受能力。
野生型拟南芥(WT)和空载体过表达拟南芥植株(VC)的结果无显著差异。
2)耐旱性研究
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，在培养基质中生长14天后，停止浇水20天，复水3天后统计存活率。实验重复3次，结果取平均值。其实验结果如图3所示(WT表示野生型拟南芥，VC表示转空载体拟南芥，L1、L7表示转PwUSP1拟南芥植株T3代)，干旱处理20天后，WT和VC植株严重萎蔫，大量植株死亡，而转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)中的萎蔫现象显著低于WT和VC植株(图3a)。复水3天后，WT和VC植株的萎蔫表型并没有恢复，其复水后存活率低于20％，而转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)在复水后多数叶片表型恢复正常，其存活率都超过了90％(图3b)。通过将离体的叶片于空气中脱水处理2h，我们统计了不同株系的叶片失水率情况。在2h的脱水处理中，每个株系的含水量都显著下降，但是野生型株系和空载体株系的含水量明显下降的幅度更大，在2h时，过表达株系的含水量在45％左右，而WT和空载体株系的含水量在25％左右，差异明显(图3c)。以上结果表明PwUSP1基因的过表达能够显著提高植物在干旱胁迫下的耐受能力，PwUSP1基因起到正向调控植物耐逆性的功能。
野生型拟南芥(WT)和空载体过表达拟南芥植株(VC)的结果无显著差异。
2、转PwUSP1基因对活性氧清除的影响
1)生理指标的测定
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，在培养基质中生长14天后，以正常生长的株系为对照组，实验组用200mM的盐溶液处理6天或者干旱14天。分别取对照组和实验组相同位置的莲座叶作为实验材料，丙二醛(MDA)采用南京建成公司的丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)进行测定；超氧化物歧化酶(SOD)采用南京建成公司的总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法)进行测定；过氧化氢酶(CAT)采用南京建成公司的过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)进行测定；过氧化物酶(POD)采用南京建成公司的过氧化物酶(POD)测定试剂盒(测植物)(比色法)进行测定。每个实验均重复三次。实验结果如图5a-d所示(WT表示野生型拟南芥，VC表示转空载体拟南芥，L1、L7表示转PwUSP1拟南芥植株T3代)，在正常生长条件下，四种株系的MDA含量并没有明显的差异，在干旱和盐处理后，四种株系的MDA含量均有所提升，但是相比于WT和VC，L1和L7株系的上升程度显著降低，与WT和VC差异明显(图5a)。在正常条件下，四种株系的SOD、POD、CAT含量并没有明显的差异，在干旱和盐处理后，四种株系的SOD、POD、CAT含量均有所上升，但相对于WT和VC，L1和L7株系的上升程度明显更大(图5b、c、d)。以上结果表明，PwUSP1基因的过表达能够促进抗氧化酶的产生，进而提高植株对活性氧的清除能力，以减少ROS的积累，降低植物细胞膜的过氧化损伤，提高植物自身的抗氧化能力。
2)DAB和NBT染色检测ROS积累情况
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，在培养基质中生长14天后，以正常生长的株系为对照组，实验组用200mM的盐溶液处理6天或者干旱14天。分别取对照组和实验组相同位置的莲座叶作为实验材料，浸泡在DAB和NBT染液中2h。染色后，用无水乙醇脱色2h然后拍照。通过DAB和NBT染色检测了不同株系受到胁迫后，叶片中过氧化氢和超氧离子的积累情况。染色结果如图5e、f所示，在正常生长条件下，DAB和NBT在四种株系中的染色程度均较浅，过氧化氢和超氧阴离子的积累在四种株系间并没有显著差异。但当受到干旱和盐胁迫后，四种株系的DAB和NBT染色程度都显著加深。然而，相比于WT和VC株系，过表达株系L1、L7的染色情况明显更浅，以上结果表明，过表达PwUSP1会降低植物在干旱和盐胁迫时的ROS积累。
以上结果表明，在植物中过表达PwUSP1基因能够增强拟南芥对干旱胁迫和盐胁迫的耐受能力，PwUSP1基因起到正向调控植物耐逆性的功能，所以通过农杆菌侵染法、基因枪法等生物技术过表达受体植物中的PwUSP1基因或其同源基因，可大幅提高植物对干旱胁迫和盐胁迫的耐受能力。
实施例3、PwUSP1基因对植物生长的影响
一、转PwUSP1基因对植物生长量的影响
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中进行培养，正常条件下培养3周后对各株系的莲座叶的大小进行观测，正常培养5周后对各株系的株高进行观测，其实验结果如图6所示(WT表示野生型拟南芥，VC表示转空载体拟南芥，L1、L7表示转PwUSP1拟南芥植株T3代)，在正常生长条件下，各株系的株高和莲座叶的大小基本一致，并无明显差异(图6a、c、d)，该实验结果表明，PwUSP1基因作为正向调控植物耐逆性的基因能够显著提高植物在盐和干旱胁迫下的耐受能力，但在正常条件下对植物的生长不产生影响，因此当对受体植物的PwUSP1基因或其同源基因进行过表达所产生的转基因品系理论上能够在不牺牲植物生长量的条件下大幅提升植物的耐逆能力。
二、转PwUSP1基因对植物产量的影响
1、转PwUSP1基因对植物花期的影响
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中进行培养，观察并记录各株系的开花时间，其实验结果如图6所示(WT表示野生型拟南芥，VC表示转空载体拟南芥，L1、L7表示转PwUSP1拟南芥植株T3代)，在正常生长条件下，各株系的基本都在移苗后20天左右开始开花(图6f)，该实验结果表明，PwUSP1基因作为正向调控植物耐逆性的基因能够显著提高植物在盐和干旱胁迫下的耐受能力，对植物的开花周期没有影响，因此当对受体植物的PwUSP1基因或其同源基因进行过表达所产生的转基因品系理论上在能够大幅提升植物的耐逆能力的条件下能够正常的进行开花结实，不会影响转基因品系的产量。
2、转PwUSP1基因对植物果实的影响
实验中取转PwUSP1拟南芥植株(L1、L7)、转空载体拟南芥植株(VC)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光照强度为120μmol m-2s-1，温度为20-21℃，相对湿度为60-70％。待种子萌发14天后将拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中进行培养，在各株系果夹成熟时对果夹的形状及长度进行观测，其实验结果如图6所示(WT表示野生型拟南芥，VC表示转空载体拟南芥，L1、L7表示转PwUSP1拟南芥植株T3代)，在正常生长条件下，各株系的果夹长度均在16mm左右，且果夹饱满，没有畸形出现，各株系间并无明显差异(图6b、e)，该实验结果表明，PwUSP1基因作为正向调控植物耐逆性的基因能够显著提高植物在盐和干旱胁迫下的耐受能力，对植物的结实能力及产量没有影响，因此当对受体植物的过表达PwUSP1基因或其同源基因所产生的转基因品系理论上能够在不牺牲植物产量的条件下大幅提升植物的耐逆能力。
综上所述，PwUSP1基因作为正向调控植物耐逆性的转录因子，其在植物中过表达PwUSP1基因时能够显著提高拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受能力，而通过如农杆菌侵染法、基因枪法等方式过表达受体植物中的PwUSP1基因或其同源基因后所产生的转基因品系在理论上能够在不牺牲植物的生长量、产量等的条件下大幅提升植物的耐逆能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> 一种与植物抗逆性相关蛋白质PwUSP1及其编码基因与应用
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcacgcagat atttgtcatg tgtatatatt tttccagagt ctgatcaaag tggagaaaga 60
agatagataa acgaagttat attggtgatc cccaaaaacc ttgcaattca atccaaccag 120
tgtgagaagt atttacagac aagtacggaa acaattatgg agagtgggga gcatagatgg 180
aaagaagtaa atctgtcagc cctctttaag aagcagctgg agccagagct agaaagagag 240
acaggtgaaa gaagaagagg gcgtgacatt atggtcagcg tagatcacgg accccagagc 300
aaacatgcat ttgattgggc cattgtacat ctctgtcgca tggcggatac gctccacctt 360
gttcatgttg ttcccaattc agatgatgag gtgctgtttg gagccacaca agctctaatg 420
gaaaggcttg caatagaagc atatgaagtt gccatggtgc aaacagtagc taggattata 480
gagggtgaca taggtaaggc aatttgccgt gaagctgcaa gaatcaagcc tgctgcactt 540
gtattgggaa caagaggccg ggggataatc aagagtgtat tgcaagggag tgtgagtcag 600
tactgcttca atcattgtag ctgccctgta gtgattgttc ctcccaaaga ggctggagac 660
ctatcagtaa tatagaaatt tcgccaaagc tccatttcac atggacatac ggaagcatat 720
ttgcatttgg tatgatttta gtgccatttt caggtgatgg tggattaatt tattagcaga 780
aattgattgt gtttatgggt tgagcgctag tgattttaaa ctagctgacc aagctggact 840
ggtttaatca atgtatttgg gttgttcata agttgtatat tcgagttttg aactgtttga 900
gatgaagtct gttgtcctgg ccatcttatg gattttgcta actcaatatc ttagtaccat 960
gtctgcttta gatgaagctt gagttgtcat aaaaatattt gaaattgttt aaaggttcag 1020
aacaaatgcc tgtataattg aatcatatgg tatttttggg gggctagctt agaccaagac 1080
agtttttaag gattttgtca tgttgtttga ataatggaag aattttaaat ttcacaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1167
<210> 2
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys
1 5 10 15
Ala Thr Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr
20 25 30
Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys
35 40 45
Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly
50 55 60
Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala
100 105 110
Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Ala Gly Ala
115 120 125
Thr Cys Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys
130 135 140
Ala Ala Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr
145 150 155 160
Gly Gly Gly Cys Cys Ala Thr Thr Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr
165 170 175
Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr
180 185 190
Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys
195 200 205
Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Thr Thr Cys
210 215 220
Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly
225 230 235 240
Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Gly
245 250 255
Cys Thr Cys Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr
260 265 270
Thr Gly Cys Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Thr Ala Thr
275 280 285
Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys
290 295 300
Ala Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Thr Ala Gly Gly Ala Thr
305 310 315 320
Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Thr Ala
325 330 335
Gly Gly Thr Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gly Cys Cys
340 345 350
Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr
355 360 365
Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Thr
370 375 380
Gly Thr Ala Thr Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly
385 390 395 400
Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala
405 410 415
Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Gly
420 425 430
Ala Gly Thr Gly Thr Gly Ala Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr
435 440 445
Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Thr Ala Gly
450 455 460
Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly Thr Gly Ala Thr Thr
465 470 475 480
Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly
485 490 495
Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys Ala Gly Thr
500 505 510
Ala Ala Thr Ala Thr Ala Gly
515

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；
或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；
或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。
6.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述过表达该基因的转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(2)中任一种：
(1)转基因植物的存活率高于受体植物；
(2)转基因植物的活性氧积累低于受体植物。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：
所述提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中表达量提高或过表达权利要求1所述的蛋白质；
或，所述提高或过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在受体植物中过表达；
或，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。
10.根据权利要求4或5所述的应用或根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
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CN107827964A (zh) * 2017-12-11 2018-03-23 北京林业大学 一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200515

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