ES2335753T3 - Quitinasa que codifica para una molecula de adn de algodon expresada preferentemente en fibras durante la deposicion de la pared celular secundaria y el correspondiente promotor. - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada de plantas de algodón que codifica para una quitinasa endógena de algodón, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria y en la que la molécula de ácido nucleico: a. comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una quitinasa endógena de algodón y que hibrida con una molécula de ADN que tiene una secuencia según la SEQ. ID. No. 1 en condiciones rigurosas caracterizadas por un tampón de hibridación que comprende 1 x SSC a una temperatura de 61ºC; b. tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No. 1; o c. codifica para la proteína o el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No.

Description

Quitinasa que codifica para una molécula de ADN de algodón expresada preferentemente en fibras durante la deposición de la pared celular secundaria y el correspondiente promotor.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un gen que se expresa en fibras durante la deposición de la pared celular secundaria y al promotor del correspondiente gen.

Antecedentes de la invención

Las células fibrosas de algodón (Gossypium hirsutum L. y otras especies Gossypium incluyendo G. barbadense L., G. arboreum L., y G. herbaceous L.), un cultivo de enorme importancia económica para la agricultura mundial, son células epidérmicas diferenciadas de la vaina de la semilla. En la madurez, la célula fibrosa, considerada desde el interior hacia el exterior, consiste en un lumen celular, una pared celular secundaria, una pared celular primaria y una cutícula cerosa delgada. La pared celular primaria está constituida por compuestos pécticos, componentes de hemicelulosa, celulosa y proteína. La pared celular secundaria consiste principalmente (aproximadamente el 95%) en celulosa con pequeños porcentajes de otros componentes aún no identificados de manera concluyente.

El desarrollo de la fibra de algodón se caracteriza por las fases de iniciación, deposición de la pared celular primaria, deposición de la pared celular secundaria y desecación. Durante la fase de pared primaria del desarrollo de fibras, se produce la deposición de la pared primaria para facilitar la elongación de las fibras. Durante la fase de la pared secundaria del desarrollo de fibras, se produce la deposición de la pared secundaria para llevar a cabo el espesamiento de las fibras. La deposición de la pared primaria y secundaria implica la síntesis de todos los componentes de la pared celular característicos de cada fase y el ensamblaje de las moléculas en una pared celular organizada fuera de la membrana plasmática. Se requieren muchos cientos de genes para la diferenciación y el desarrollo de la fibra vegetal. El trabajo sobre las proteínas fibrosas traducidas in vitro (Delmer et al., "New Approaches to the Study of Cellulose Biosynthesis", J. Cell Sci. Suppl., 2:33-50 (1985)), proteína aislada de fibra (Graves y Stewart, "Analysis of the Protein Constituency of Developing Cotton Fibers", J. Exp. Bot., 39:59-69 (1988)) y el análisis de genes particulares (Wilkins et al., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, págs. 231-270 (1999)) sugiere claramente la expresión génica diferencial durante diversas fases del desarrollo de la célula. Sin embargo, se han identificado sólo algunos de los genes implicados en la biosíntesis del gran número de ceras, polisacáridos, enzimas o proteínas estructurales que potencian las fibras o específicas de fibras (John et al., "Gene Expression in Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber: Cloning of the mRNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5769-5773 (1992); John, "Characterization of a Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber mRNA (Fb-B6)", Plant Physiol., 107:1477-1478 (1995)). Puesto que estos genes y sus interacciones con el entorno determinan la calidad de la fibra, se considera que su identificación y caracterización es un aspecto importante de la mejora de los cultivos de algodón.

En particular, cómo se sintetizan las paredes celulares secundarias, cómo ayudan a la función, adaptación y defensa de la planta y cómo sus propiedades se traducen en utilidad industrial son cuestiones importantes relacionadas con los mecanismos biológicos básicos, la ecología y la mejora de la planta. Las paredes celulares secundarias vegetales se sintetizan en algunos tipos de células especializados para facilitar funciones particulares, tales como la conducción de agua a larga distancia (elementos traqueales), el control de la transpiración (células oclusivas) y la dispersión de semillas (fibras de algodón). Estas paredes celulares secundarias tienen un mayor contenido en celulosa de alta resistencia a la tracción, que normalmente supera el 40% en peso y son mucho más gruesas que las paredes celulares primarias. Por consiguiente, su contenido en hemicelulosa, pectina y proteína se reduce, produciéndose la reducción más extrema en el caso de las paredes celulares secundarias de fibra de algodón que son aproximadamente el 95% de celulosa. Por otra parte, durante la deposición de la pared primaria, el contenido en celulosa es normalmente del 9-30% (p/p) (Meinert et al., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59:1088-1097 (1977); Darvill et al., "The Primary Cell Walls of Flowering Plants", The Biochemistry of Plants, 1:91-162 (1980); Smook, Handbook for Pulp and Paper Technologists, Vancouver, Canadá: Angus Wilde Publications, pág. 15 (1992)). Ya que las paredes celulares secundarias son fuertes y representan una fuente voluminosa de celulosa química, se han aprovechado como importantes recursos renovables, por ejemplo en fibras de lana y algodón.

Las células fibrosas de algodón tienen dos fases de desarrollo distintas que incluyen la deposición de la pared secundaria. Muchos estudios del aumento del peso y la longitud de la fibra, la morfología, la composición de la pared celular, las tasas de síntesis de celulosa y la expresión génica han confirmado el resumen de las fases del desarrollo de fibras presentado a continuación, y revistas actuales contienen muchas referencias primarias para confirmar estos hechos (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, New York: Haworth Press, págs. 85-112 (1999); Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", en Basra ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, New York: Haworth Press, págs. 1-46 (1999); Wilkins et al., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers, en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology Quality Improvement, and Textile Processing", Nueva York, New York: Haworth Press, págs. 231-270 (1999)). Tras la iniciación de las fibras mediante la expansión de una célula epidérmica por encima de la superficie, comienza la elongación de las fibras. Se requiere la deposición de la pared primaria para facilitar la elongación de las fibras, y la deposición de la pared primaria continua sola durante al menos 12 días tras la iniciación de las fibras. Este periodo representa exclusivamente la fase de la pared primaria del desarrollo de fibras. Entonces comienza la deposición de la pared secundaria mientras que la deposición de la pared primaria continua, aunque normalmente a una velocidad más lenta. Esta fase del desarrollo de fibras representa la transición entre la deposición de la pared primaria y secundaria, y comienza normalmente en G. hirsutum L. entre 14 - 17 días tras la antesis (DPA). Posteriormente, la elongación de las fibras y la deposición de la pared primaria cesan, normalmente entre 18 - 24 DPA, y la deposición de la pared secundaria continua exclusivamente hasta 34 - 50 DPA. La variación en el tiempo de iniciación y duración de cada fase del desarrollo de fibras depende del cultivar de algodón y las condiciones de temperatura (DeLanghe, "Lint Development" en Mauney, eds., Cotton Physiology, Memphis, Tennessee: The Cotton Foundation, págs. 325-349 (1986); Haigler et al., "Cultured Cotton Ovules as Models for Cotton Fiber Development Under Low Temperatures", Plant Physiol., 95:88-96 (1991); Thaker et al., "Genotypic Variation and Influence of Diurnal Temperature on Cotton Fiber Development", Field Crops Research, 22:129-141 (1989)). Por ejemplo, en G. barbadense L. cultivado en campo, no se produjo la deposición de la pared secundaria extensa hasta después de 20 DPA, la elongación continuó hasta 39 DPA y la deposición de la pared secundaria cesó a los 48 DPA (Schubert et al., "Growth and Development of the Lint Fibers of Pima S-4 Cotton", Crop Sci., 16:539-543 (1976)).

Las tasas de síntesis de celulosa cambian desde baja, hasta media, hasta alta, respectivamente, en las fases de la pared primaria, la transición y la pared secundaria del desarrollo de fibras (Meinert et al., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59:1088-1097 (1977); Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers", Ph.D. dissertation, Texas Tech University, Lubbock, TX, EE.UU. (1999)). Un ejemplo se encuentra en fibras que se desarrollan en óvulos de algodón cultivados a una temperatura óptima de 34ºC constantes, que maximiza la tasa de evolución durante las fases del desarrollo de fibras. Combinando los resultados de fibras en óvulos de dos cultivares de algodón de G. hirsutum L. cultivados en esta condición, la deposición de la pared primaria junto con una baja tasa de síntesis de celulosa se produce hasta los 12 - 14 DPA, la transición entre la deposición de la pared primaria y secundaria y una tasa intermedia de síntesis de celulosa comienza a los 14 - 16 DPA, y la deposición de la pared secundaria continua junto con una alta tasa de síntesis de celulosa que comienza a los 16 - 21 DPA (Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers", Ph.D. dissertation, Texas Tech University, Lubbock, TX, EE.UU. (1999)). Otras características bioquímicas demuestran que la iniciación de la deposición de la pared secundaria por medio de una tasa intermedia de síntesis de celulosa en la fase de transición caracteriza un acontecimiento del desarrollo distinto: el contenido en celulosa del nuevo material de pared aumenta bruscamente de modo que el porcentaje global de celulosa en toda la pared fibrosa se duplica en un día (Meinert et al., "Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development", Plant Physiol., 59: 1088-1097 (1977)), la tasa de respiración disminuye de manera transitoria, y la acumulación intercelular en la fibra de UDP-glucosa y glucosa-6-P comienza a aumentar (Martin, "Cool-Temperature-Induced Changes in Metabolism Related to Cellulose Synthesis in Cotton Fibers", Ph.D. dissertation, Texas Tech University, Lubbock, TX, EE.UU. (1999)). Estos son indicios de una aparición repentina de la deposición de la pared secundaria (DeLanghe, "Lint Development" en Mauney, eds., Cotton Physiology, Memphis, Tennessee: The Cotton Foundation, págs. 325-349 (1986)).

La deposición de la pared primaria y secundaria parece estar controlada por diferentes factores genéticos (Kohel et al., "Fiber Elongation and Dry Weight Changes in Mutant Lines of Cotton", Crop Sci., 14:471-474 (1974)), y ambas fases pueden probablemente manipularse de manera independiente mediante ingeniería genética para lograr la fibra más larga, más fuerte, más fina (de diámetro más pequeño) y más madura (en relación con el espesor de la pared secundaria) que desea la industria textil. Sin embargo, este objetivo sólo puede lograrse conociendo más acerca de los genes que controlan y contribuyen a cada fase del desarrollo de fibras.

Después de que las fibras maduran, se abre la cápsula protectora y la fibra seca cuelga con frecuencia durante varias semanas sobre la planta hasta que todo el cultivo madura (a menos se pare mediante la destrucción por temperaturas frías) y el crecimiento vegetativo muere o se destruye químicamente para permitir la recolección. Durante este periodo, la fibra se somete a la degradación mediante actividad enzimática de hongos, que se ve potenciada con frecuencia por el tiempo húmedo con precipitaciones (Simpson et al., "The Geographical Distribution of Certain Pre-Harvest Microbial Infections of Cotton Fiber in the U.S. Cotton Belt", Plant Disease Reporter, 55:714-718 (1971)). En algunos años, este tiempo de espera en el campo provoca el deterioro sustancial de la calidad de la fibra de modo que el productor recibe un precio rebajado y se pone en peligro la producción de materiales textiles e hilos de calidad. Por tanto, la eficacia de la producción de algodón se mejorará con más conocimiento de cómo se lleva las fibras sin dañar desde el campo hasta la planta textil. Es relevante para lograr este objetivo un mejor entendimiento de protecciones endógenas frente a la degradación fúngica que podría introducirse o potenciarse en la fibra.

Particularmente debido a su papel defensor en plantas (Gooday, "Aggressive and Defensive Roles for Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs. 157-170 (1999)), se han caracterizado varias proteínas y genes de quitinasa en diversas especies vegetales. La familia de proteínas y genes de quitinasa ha sido el objeto de muchas revisiones (incluyendo Graham et al., "Cellular Coordination of Molecular Responses in Plant Defense", Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI, 4:415-422 (1991); Cutt et al., "Pathogenesis-Related Proteins", en Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense, Springer Verlag/Nueva York. págs. 209-243 (1992); Meins et al., "The Primary Structure of Plant Pathogenesis-Related Glucanohydrolases and Their Genes", en Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense Springer Verlag/Nueva York, págs. 245-282 (1992); Collinge et al., "Plant Chitinases", Plant J., 3:31-40 (1993); Sahai et al., "Chitinases of Fungi and Plants: Their Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction", FEMS Microbiology Rev., 11: 317-338 (1993); Meins et al., "Plant Chitinase Genes", Plant Molecular Biology Reporter, 12:522-528 (1994); Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", Journal of Molecular Evolution, 44:614-624 (1997)) y de un libro editado (Jolles, eds. Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, 340 págs. (1999)). Estas fuentes contienen muchas referencias primarias a los hechos bien conocidos resumidos a continuación. Las quitinasas se encuentran entre un grupo de genes que pueden inducirse en plantas mediante el ataque patógeno, lo que corresponde a la aparición frecuente de quitina en paredes celulares fúngicas y exoesqueletos de insectos. En su papel defensor, las quitinasas catalizan la hidrólisis de quitina. La quitina estructural se produce como microfibrillas cristalinas compuestas por un homopolímero lineal de residuos de N-acetil-D-glucosamina unidos en \beta-1,4, (GlcNAc)_{n}. La hidrólisis de quitina defiende la planta frente a depredadores o patógenos, particularmente hongos invasores, debilitando o disolviendo su estructura corporal. Especialmente en combinación con glucanasas \beta-1,3 que sirven para eliminar el recubrimiento de las microfibrillas de quitina, las quitinasas pueden inhibir el crecimiento de muchos hongos provocando la lisis de la punta de la hifa debido a la pared de la hifa debilitada. Esto se ha demostrado mediante la inhibición del crecimiento fúngico en cultivos así como en plantas transgénicas que muestran daño por patógeno reducido en correlación con el aumento de la actividad quitinasa. La expresión génica o la actividad de quitinasas con una probable función defensora se han caracterizado anteriormente en raíces y hojas de algodón (Liu et al., "Detection of Pathogenesis-Related Proteins in Cotton Plants", Physiological and Molecular Plant Pathology, 47:357-363 (1995); Hudspeth et al., "Characterization and Expression of Chitinase and 1,3-\beta-Glucanase Genes in Cotton", Plant Molecular Biology, 31: 911-916 (1996); Dubery et al., "Induced Defence Responses in Cotton Leaf Disks by Elicitors From Verticillium dahliae", Phytochemistry, 44: 1429-1434 (1997)).

Algunas quitinasas se inducen tras la invasión fúngica, acumulándose alrededor de las hifas fúngicas invasoras (Benhamou et al., "Subcellular Localization of Chitinase and Its Potential Substrate in Tomato Root Tissues Infected With Fusarium Oxysporium F. Sp. Radicislycopersici", Plant Physiology, 92:1108-1120 (1990); Wubben et al., "Subcellular Localization of Plant Chitinases and 1,3-\beta-Glucanases in Cladosporium Fulvum (Syn. Fulvia Fulva) Infected Tomato Leaves", Physiological and Molecular Plant Pathology 41:23 - 32 (1992)). Otras quitinasas se producen aparentemente de manera constitutiva en partes de la planta que son particularmente susceptibles a la invasión tal como las células epidérmicas, células corticales de la raíz, estomas, partes de las flores y células vasculares. Estas conclusiones surgen tanto a partir de la localización de ARNm de quitinasa mediante hibridación in si tu como el análisis de patrones de expresión del gen indicador GUS bajo el control de promotores de quitinasa (Samac et al., "Developmental and Pathogen-Induced Activation of the Arabidopsis Acidic Chitinase Promoter", The Plant Cell, 3:1063-1072 (1991); Zhu et al., "Stress Induction and Developmental Regulation of a Rice Chitinase Promoter in Transgenic Tobacco", The Plant Journal, 3:203-212 (1993); Büchter et al., "Primary Structure and Expression of Acidic (Class II) Chitinase in Potato", Plant Molecular Biology, 35:749-761 (1997); Ancillo et al., "A Distinct Member of the Basic (Class I) Chitinase Gene Family in Potato is Specifically Expressed in Epidermal Cells",. Plant Molecular Biology, 39:1137-1151 (1999)). En otro caso de posible anticipación de la invasión fúngica en tejidos deteriorados, el etileno induce quitinasa en zonas de abscisión de judía (del Campillo et al., "Identification and Kinetics of Accumulation of Proteins Induced by Ethylene in Bean Abscission Zones", Plant Physiology, 98:955-961 (1991)). Ninguno de estos estudios incluía el análisis de fibras de algodón ni mostraba la presencia de actividad quitinasa o proteínas relacionadas con quitinasa en fibras de algodón.

Otros estudios muestran que algunas quitinasas tienen un papel de desarrollo en plantas, aunque la quitina estructural auténtica no es una parte natural del organismo vegetal (Meins et al., "The Primary Structure of Plant Pathogenesis-Related Glucanohydrolases and Their Genes", en Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense, Springer Verlag/Nueva York, págs. 245-282 (1992)). Se ha demostrado que isoformas de quitinasa con papeles de desarrollo son al menos algunas veces distintas de aquéllas con papeles en las respuestas a estrés y defensa (Mauch et al., "Antifungal Hydrolases in Pea Tissue. I. Purification and Characterization of Two Chitinases and Two \beta-1,3-Glucanases Differentially Regulated During Development and in Response to Fungal Infection", Plant Physiology, 87:325-333 (1988)). Las quitinasas defensoras se unen a segmentos cortos (probablemente 3-6 residuos) de una cadena simple de N-acetil-glucosamina antes de escindir el enlace entre azúcares (Robertus et al., "The Structure and Action of Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs. 125-136 (1999)). Por tanto, las enzimas en la familia de quitinasa también pueden unirse a oligómeros de N-acetil-glucosamina dentro de otras moléculas tales como glicoproteínas o moléculas de señalización. Tales moléculas pueden tener papeles en la transducción de señales para regular las cascadas de expresión génica requeridas para las transiciones del desarrollo o en los procesos biosintéticos que implementan el programa de desarrollo.

La investigación anterior sobre la regulación de la deposición de la pared secundaria o la función al nivel molecular se centró en algunos genes implicados en la biosíntesis de celulosa, hemicelulosa, lignina o proteínas. Entre estas rutas, la síntesis de lignina se ha explorado y manipulado de la manera más extensa en plantas transgénicas (Merkle et al., "Forest Biotechnology", Current Opinion in Biotechnology, 11:298-302 (2000)). Sin embargo, las fibras de algodón no contienen lignina (Haigler, "The Functions and Biogenesis of Native Cellulose", en Zeronian, eds., Cellulose Chemistry and Its Applications, Ellis Horwood: Chichester, Inglaterra, págs. 30-83 (1985)). Los polisacáridos de hemicelulosa dentro de algunas paredes secundarias incluyen xilanos y glucomananos, pero las paredes secundarias de fibras de algodón no contienen cantidades significativas de ninguna molécula similar (Haigler, "The Functions and biogénesis of Native Cellulose", en Zeronian, eds., Cellulose Chemistry and Its Applications, Ellis Horwood: Chichester, Inglaterra, págs. 30-83 (1985)). Se han identificado sólo dos proteínas con posibles papeles estructurales en la pared secundaria de fibras de algodón. Una de éstas, H6, es una proteína de tipo arabinogalactano que se acumula hasta niveles detectables durante la deposición de la pared secundaria aunque la expresión de su gen comienza durante la rápida elongación incluyendo la deposición de la pared primaria (John et al., "Characterization of mRNA for a Proline-Rich Protein of Cotton Fiber", Plant Physiology, 108:669-676 (1995)). La segunda, FbL2A, carece de homología con cualquier proteína conocida, pero su secuencia sumamente repetitiva y alta hidrofilicidad sugieren que puede tener un papel estructural o proteger las fibras de algodón durante la desecación. La expresión de su gen comienza débilmente en la transición de la pared primaria a la secundaria (15 DPA) y es más fuerte en los 20 DPA (Rinehart et al., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112:1331-1341 (1996)).

Las enzimas que aumentan en actividad y/o expresión génica durante la deposición de la pared secundaria de fibras de algodón y que están relacionadas con la regulación de la síntesis de celulosa incluyen celulosa sintasa, sacarosa sintasa, sacarosa fosfato sintasa y UDP-glucosa pirofosforilasa (Basra et al., "Sucrose Hydrolysis in Relation to Development of Cotton (Gossypium spp.) Fibres", Indian Journal of Experimental Botany, 28:985-988 (1990); Wäfler et al., "Enzyme Activities in Developing Cotton Fibres", Plant Physiology and Biochemistry, 32:697-702 (1994); Amor et al., "A Membrane-Associated Form of Sucrose Synthase and its Potential Role in Synthesis of Cellulose and Callose in Plants", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 92:9353-9357 (1995); Pear et al., "Higher Plants Contain Homologs of the Bacterial celA Genes Encoding the Catalytic Subunit of Cellulose Synthase", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 93:12637-12642 (1996); Tummala, "Response of Sucrose Phosphate Synthase Activity to Cool Temperatures in Cotton", M.S. thesis, Texas Tech University, Lubbock, TX (1996)). La UDP-glucosa pirofosforilasa convierte la glucosa-1-P en UDP-glucosa o media la reacción inversa. En el contexto de la síntesis de celulosa, se cree que la sacarosa sintasa degrada la sacarosa y suministra UDP-glucosa a la celulosa sintasa. La celulosa sintasa transfiere la glucosa al polímero de celulosa unido en \beta-1,4 que está alargándose, mientras que UDP libre se reutiliza para la sacarosa sintasa. La sacarosa fosfato sintasa puede usar fructosa-6-P (por ejemplo que se deriva de la fructosa liberada mediante la acción degradante de la sacarosa sintasa) y la UDP-glucosa para sintetizar sacarosa adicional para ayudar a la síntesis de celulosa (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, págs. 85 - 112 (1999)).

Todas las enzimas que se acaban de tratar funcionan dentro de las rutas del metabolismo de azúcares conduciendo a la formación del polímero de glucano unido en \beta-1,4. Pruebas de otros sistemas y otras fibras de algodón implican otros posibles puntos de regulación de la síntesis de celulosa que coincide con o tras la formación del polímero de glucano, aunque las proteínas y rutas relevantes no se entienden de manera completa. Los ejemplos de otras proteínas relevantes incluyen glucanasa \beta-1,4 que puede actuar como editor de cadenas de glucano o en algún otro papel (Delmer, "Cellulose Biosynthesis: Exciting Times For a Difficult Field of Study", Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol., 50:245-276 (1999 b)) y glicoproteínas que pueden actuar como cebadores para la biosíntesis de celulosa (Lukowitz et al., "Arabidopsis cyt1 Mutants are Deficient in a Mannose-1-Phosphate Guanyltransferase and Point to a Requirement of N-Linked Glycosylation for Cellulose Biosynthesis", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 98: 2262-2267 (2001)). Las mutaciones que regulan por disminución la síntesis de glicoproteínas o la glucanasa \beta-1,4 provocan una reducción del contenido en celulosa en otros sistemas (Nicol et al., "Plant Cell Expansion: Scaling the Wall", Current Opinion in Cell Biology, 1:12-17 (1998); Lukowitz et al., "Arabidopsis cyt1 Mutants are Deficient in a Mannose-1-Phosphate Guanyltransferase and Point to a Requirement of N-Linked Glycosylation for Cellulose Biosynthesis", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 98:2262-2267 (2001)). En Arabidopsis, la mutación de genes de celulosa sintasa específicos de la pared secundaria de xilema provoca una reducción del contenido en celulosa y las paredes de xilema débiles (Turner et al., "Collapsed Xylem Phenotype of Arabidopsis Identifies Mutants Deficient in Cellulose Deposition in the Secondary Cell Wall", Plant Cell, 9:689 - 701 (1997)). En algodón, un aumento de la expresión de la sacarosa fosfato sintasa de espinaca provoca un aumento del contenido en celulosa en las paredes de fibras de plantas que crecen en un ciclo nocturno frío (Haigler et al., "Transgenic Cotton Over-Expressing Sucrose Phosphate Synthase Produces Higher Quality Fibers With Increased Cellulose Content and Has Enhanced Seed Cotton Yield", resumen 477. En: Proceedings of Plant Biology 2000, Julio 15 - 19, San Diego, CA. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, (2000)). Estos hallazgos indican que es posible manipular la cantidad de celulosa en paredes secundarias, pero actualmente no hay una identificación suficiente de genes diana que puedan manipularse de manera beneficiosa.

Los estudios que identifican genes que están bajo la regulación de desarrollo y específica de tejido son importantes para entender los papeles de proteínas en el desarrollo de fibras y la arquitectura de la pared celular (John, "Structural Characterization of Genes Corresponding to Cotton Fiber mRNA, E6: Reduced E6 Protein in Transgenic Plants by Antisense Gene", Plant Mol. Biol., 30:297-306 (1996)). Además, tales genes y sus elementos reguladores son herramientas importantes para la modificación de fibras a través de la ingeniería genética (John, "Prospects for Modification of Fibers Through Genetic Engineering of Cotton", en Gebelein, eds., Industrial Biotechnological Polymers, Lancaster, PA: Technomic, págs. 69-79 (1995); John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 271-289 (1999)).

En muchos casos, sería deseable para un transgén que se regulara en el desarrollo para tener una expresión exclusiva o preferente en las células fibrosas en una fase del desarrollo apropiada. Esta regulación puede llevarse a cabo de la manera más rápida mediante un promotor que pueda realizar la promoción de manera preferente.

Los promotores son elementos de ADN que dirigen la transcripción de ARN en células. Junto con otros elementos reguladores que establecen la especificidad temporal y de tejido de la expresión génica, los promotores controlan el desarrollo de organismos. Por tanto, ha habido un esfuerzo coordinado para identificar y aislar promotores a partir de una amplia variedad de plantas y animales.

Muchos promotores actúan de manera apropiada en sistemas heterólogos. Por ejemplo, los promotores tomados de genes vegetales tales como rbcS, Cab, calcona sintasa y el inhibidor de la proteasa de tabaco y Arabidopsis son funcionales en plantas transgénicas heterólogas. (Benfey et al., "Regulated Genes in Transgenic Plants", Science, 244:174-181, (1989)). Los ejemplos específicos de plantas transgénicas incluyen la expresión específica de tejido y regulada en el desarrollo del gen de proteína de almacenamiento de semillas 7s de soja en plantas de tabaco transgénicas (Chen et al., "A DNA Sequence Element That Confers Seed-Specific Enhancement to a Constitutive Promoter", EMBO J., 7:297-302, (1988)) y la expresión específica del órgano dependiente de la luz del promotor del gen de proteína de unión a/b de clorofila de Arabidopsis thaliana en tabaco transgénico (Ha et al., "Identification of Upstream Regulatory Elements Involved in the Developmental Expression of the Arabidopsis-thaliana Cab-1 Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8017-8021, (1988)). De manera similar, se demostró la actividad de promotor de la sacarosa sintasa-1 de maíz anaeróbicamente inducible en tabaco transgénico (Yang et al., "Maize Sucrose Synthase-1 Promoter Directs Phloem Cell-Specific Expression of Gus Gene in Transgenic Tobacco Plants", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4144-4148, (1990)). Se encontró que los promotores del polen de tomate dirigen la expresión génica específica de tejido y regulada en el desarrollo en Arabidopsis y tabaco transgénicos (Twell et al., "Pollen-Specific Gene Expression in Transgenic Plants Coordinate Regulation of Two Different Tomato Gene Promoters During Microsporogenesis", Development, 109:705-714, 1990). Por tanto, algunos promotores vegetales pueden utilizarse para expresar proteínas foráneas en tejidos vegetales de una manera regulada en el desarrollo.

La expresión de genes específica de tejido y regulada en el desarrollo también se ha demostrado en células fibrosas. Varias de estas, tales como E6, ATPasa vacuolar y proteínas de tipo de transferencia de lípidos, tienen una fuerte expresión en fibras de algodón durante la deposición de la pared primaria (Wilkins et al., "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers", en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, págs. 231-270 (1999); Orford et al., "Expression of a Lipid Transfer Protein Gene Family During Cotton Fibre Development", Biochimica and Biophysica Acta, 1483:275-284 (2000)). Otros genes muestran expresión transitoria durante el desarrollo de fibras. Por ejemplo, Rac se expresa de manera transitoria en la transición de fases de pared primaria a secundaria (Delmer et al., "Genes Encoding Small GTP-Binding Proteins Analogous to Mammalian Rac are Preferentially Expressed in Developing Cotton Fibers", Mol. Gen. Genet., 248:43-51 (1995)) y otra proteína de tipo de transferencia de lípidos, FS18A (Orford et al., "Characterization of a Cotton Gene Expressed Late in Fibre Cell Elongation", Theoretical and Applied Genetics, 98:757-764 (1999)), se expresa de manera transitoria a los 24 DPA durante la deposición de la pared secundaria. Otro gene, H6, se expresa entre los 10 - 24 DPA, que incluye la deposición de pared tanto primaria como secundaria, pero la proteína H6 se acumula sólo durante la deposición de la pared secundaria a los 15 - 40 DPA (John et al., " Characterization of mRNA for a Proline-Rich Protein of Cotton Fiber", Plant Physiology, 108:669-676 (1995)). Al nivel de la expresión génica, se ha demostrado anteriormente que sólo ciertos genes de celulosa sintasa tienen una expresión preferente y prolongada en fibras de algodón durante la deposición de la pared secundaria, aunque había niveles inferiores de expresión durante la deposición de la pared primaria y en otras partes de la planta. Además, la celulosa sintasa no mostró fuerte expresión hasta los 20 DPA, con sólo una expresión débil observada a los 17 DPA (Pear et al., "Higher Plants Contain Homologs of the Bacterial celA Genes Encoding the Catalytic Subunit of Cellulose Synthase", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 93:12637-12642 (1996)). Otro gen, FbL2A, está regulado por incremento en la transición de pared primaria a secundaria (débilmente a los 15 DPA y fuertemente a los 20 DPA), pero no se mostraron los datos en la expresión génica durante las fases tardías del desarrollo de fibras (Rinehart et al., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112:1331-1341 (1996)).

Sería útil tener un promotor que condujera la expresión génica preferente y fuertemente en fibras por toda la deposición de la pared secundaria, es decir, fuerte y continuamente (por ejemplo a \geq 50% de su actividad máxima) desde la iniciación de la deposición de la pared secundaria hasta su finalización. La iniciación de la deposición de la pared secundaria se define como el tiempo cuando el peso seco/la longitud unitaria de una fibra de algodón comienza a aumentar o cuando el peso seco/área superficial unitaria de cualquier célula comienza a aumentar por medio de la síntesis de nuevo material de pared que contiene más del 40% (p/p) de celulosa. En el caso de la fibra de algodón de G. hirsutum L., esto se espera que se produzca entre los 14 - 17 DPA cuando las plantas de algodón se hacen crecer en condiciones típicas en el invernadero o el campo (temperatura diurna de 26 - 34ºC, temperatura nocturna de 20 - 26ºC, intensidad de la luz mayor que o igual a 1000 \mueinsteins/m^{2}/s, con nutrición adecuada de agua y minerales). Además, sería útil tener un promotor que condujera la expresión génica sólo o preferentemente en fibras mientras que se excluye o se minimiza la expresión en otros tejidos.

La presente invención se refiere a lograr estos objetivos.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada de algodón que codifica para una proteína endógena de algodón relacionada con quitinasa, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria. También se da a conocer un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico aislada.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un constructo de ADN que comprende un promotor operativamente unido en 5' a una molécula de ácido nucleico tal como se describe en el presente documento, y a una región reguladora en 3' operativamente unida a la molécula de ácido nucleico en el que dicho promotor es foráneo para dicha molécula de ácido nucleico. El constructo de ADN puede incorporarse en un sistema de expresión, una célula huésped, una planta o una semilla vegetal.

También se da a conocer un método para conferir resistencia a las plantas frente a insectos y hongos compuesto por transformar una planta con el constructo de ADN que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de regulación del contenido en celulosa de una fibra vegetal que comprende transformar una planta con el constructo de ADN que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención.

El hallazgo de que la molécula de ácido nucleico aislada dada a conocer en la presente invención se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria cuando la actividad celular se desvía fuertemente hacia la síntesis de celulosa concuerda con un papel de desarrollo para la correspondiente proteína relacionada con la quitinasa en la síntesis de celulosa. Alternativamente, la proteína podría "almacenarse" en la pared celular de fibra de algodón esperando el ataque fúngico tras la apertura de la cápsula. Sin embargo, cualquier quitinasa con esta función defensora en fibras de algodón puede ser relativamente ineficaz debido a que las fibras de algodón pueden infectarse y dañarse mucho por varias especies fúngicas (Simpson et al., "The Geographical Distribution of Certain Pre-Harvest Microbial Infections of Cotton Fiber in the U.S. Cotton Belt", Plant Disease Reporter, 55:714-718 (1971)). Ya sea actuando en el desarrollo o de manera defensora, la manipulación de la expresión de estas proteínas relacionadas con la quitinasa en fibras podría tener consecuencias importantes para la calidad y la producción del cultivo de fibras. Por ejemplo, el contenido en celulosa de las fibras podría potenciarse o disminuirse durante la biosíntesis y/o protegerse de la degradación fúngica durante la recolección y el procesamiento del cultivo.

Además, un promotor de un gen que se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria de plantas normales puede ser valioso para la ingeniería genética de fibras para lograr: (1) una productividad agrícola mejorada en condiciones normales y de estrés y (2) propiedades de fibra mejoradas que dependen de la modificación durante la deposición de la pared secundaria. Aunque el promotor para el gen FbL2A se ha sometido a prueba mediante fusión para dos genes indicadores (la ácido polihidroxialcanoico sintasa o PHA sintasa, una enzima que se detectó con un anticuerpo específico, y la acetoacetil-CoA reductasa, una enzima con actividad que se monitorizó mediante ensayo enzimático) y la transformación de algodón (Rinehart et al., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112:1331-1341 (1996)), se demostró la expresión del gen FbL2A en fibras de algodón débilmente a los 15 DPA y fuertemente a los 20 DPA sin datos proporcionados para la duración de la deposición de la pared secundaria hasta los 30 DPA o posterior. Con el uso de los dos constructos de promotor/gen indicador, se proporcionaron datos algo contradictorios sobre la utilidad del promotor de FbL2A. Cuando el gen de la acetoacetil-CoA reductasa estaba bajo el control del promotor FbL2A, se detectó la actividad acetoacetil-CoA reductasa en fibras de algodón durante la deposición de la pared primaria a los 5 - 10 DPA, y había actividad sustancial, constante en los 20 DPA durante la deposición de la pared secundaria, actividad máxima a los 35 DPA y actividad continuada hasta los 45 DPA entre una familia de plantas transformadas de manera independiente (Rinehart et al., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112: 1331-1341 (1996)). Sin embargo, la actividad enzimática tras los 20 DPA podría deberse a ARN mensajero de vida prolongada o proteína sintetizada a los 15 - 20 DPA, que es el periodo cuando los datos muestran directamente la expresión del gen FbL2A bajo el control de su propio promotor. Por el contrario, cuando el gen de la PHA sintasa estaba bajo el control del promotor FbL2A, la inmunotransferencia de tipo Western para detectar la PHA sintasa inmunológicamente en una planta transformada mostró sólo una señal muy débil durante la deposición de la pared secundaria a los 20 DPA, una señal traza a los 25 DPA y ninguna señal a los 30 o los 35 DPA (Rinehart et al., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112:1331-1341 (1996)). Además, el gen de la PHA sintasa bajo el control del promotor 35S supuestamente constitutivo del virus CaMV estaba correlacionado con la detección de la proteína PHA sintasa fuertemente durante la deposición de la pared primaria a los 10 DPA y que continuaba débilmente durante los 35 DPA de deposición de la pared secundaria. Los patrones comparativos durante la deposición de la pared secundaria concuerdan con la expresión transitoria del promotor FbL2A alrededor de los 20 DPA de la deposición de la pared secundaria. Los datos también muestran que el promotor FbL2A conducirá a la expresión génica foránea débil en fibras de algodón durante la deposición de la pared primaria (Rinehart et al., "Tissue-Specific and Developmental Regulation of Cotton Gene FbL2A", Plant Physiology, 112:1331-1341 (1996)). Por tanto, no se conoce ningún gen que codifica para una proteína funcional que se expresa preferente y fuertemente en fibras por toda la deposición de la pared secundaria. De manera correspondiente, no existe ningún promotor para conducir la expresión del gen foráneo preferente y fuertemente por toda la duración completa de la deposición de la pared secundaria de fibras. El promotor dado a conocer en la presente invención permite que se cumplan estos objetivos mientras que evita o minimiza los efectos pleiotrópicos sobre el desarrollo y crecimiento de las plantas u otras fases del desarrollo de fibras que podrían reducir el beneficio de los efectos seleccionados como objetivo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una imagen autorradiográfica sobre una película de un gel de fragmentos de ADNc marcados que surgen a través de la técnica de visualización diferencial de ARN aislado de fibras de algodón a los 18 y 12 DPA, respectivamente, de Gossypium hirsutum cv. Coker 312. La flecha apunta a la banda única para las fibras de algodón a los 18 DPA que corresponde al gen denominado posteriormente F285 y que muestra que tiene homología con las quitinasas.

La figura 2 muestra una transferencia de tipo Northern expuesta a película durante la noche que muestra el ARN total aislado de varios tejidos de algodón. El marco superior muestra la incubación con una sonda para F285, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda para ARN 18S para mostrar el nivel comparativo de la carga de ARN en cada carril, que se pretendía que fuera 15 \mug/carril.

La figura 3 muestra una transferencia de tipo Northern, que ilustra un transcurso del tiempo más detallado del desarrollo de fibras. El marco superior muestra la incubación con una sonda para F285, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda para ARN 18S para mostrar el nivel comparativo de la carga de ARN en cada
carril.

La figura 4 ilustra la detección de la actividad quitinasa en extractos de proteínas de diversos tejidos tal como sigue:

Zona 1:

fibras que crecieron en invernadero a los 8 DPA, no tratadas antes de la extracción de proteínas

Zona 2:

fibras que crecieron en invernadero a los 17 DPA, no tratadas antes de la extracción de proteínas

Zona 3:

fibras que crecieron en invernadero a los 24, no tratadas antes de la extracción de proteínas

Zona 4:

fibras que crecieron en invernadero a los 31, no tratadas antes de la extracción de proteínas

Zona 5:

hojas de 18 días, no tratadas antes de la extracción de proteínas.

Zona 6:

hojas de 18 días, tratadas con agua a los 16 días tras la plantación

Zona 7:

hojas de 18 días, tratadas con ácido salicílico (SA) a los 16 días tras la plantación

Zona 8:

control negativo (agua)

Zona 9:

fibras cultivadas a los 8 DPA, tratadas con agua

Zona 10:

fibras cultivadas a los 8 DPA, tratadas con SA en los 6 DPA

Zona 11:

control negativo (disolución de BSA)

Zona 12:

control positivo (quitinasa bacteriana comercial)

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La figura 5 muestra una transferencia de tipo Northern, sometiendo a prueba para determinar la inducción mediante SA o etefona (ETH) de la expresión de F285. El marco superior muestra la incubación con una sonda para F285, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda para ARN 18S para mostrar el nivel comparativo de la carga de ARN en cada carril. El tejido y el pretratamiento, si lo hubiera, se indican por encima de cada carril. Los tratamientos, si los hubo, se aplicaron a las plantas de semillero 16 días tras la plantación, y se recogieron los órganos dos días después. Los tratamientos, si los hubo, se aplicaron a los óvulos a los 6 DPA produciéndose la recogida a los
8 DPA.

La figura 6 muestra una transferencia de tipo Southern de ADN genómico de algodón digerido con enzimas de restricción EcoRI y Hind III y marcado con sonda con el ADNc de longitud completa de F285 y, posteriormente, con un fragmento de otro miembro de su familia génica, TAG1.

La figura 7 muestra una transferencia de tipo Northern sometiendo a prueba la expresión de TAG 1. El marco superior muestra la incubación con una sonda para TAG1, y el marco inferior muestra la incubación con una sonda para ARN 18S para mostrar el nivel comparativo de la carga de ARN en cada carril. Los tejidos sometidos a prueba, incluyendo raíces, tallos y hojas, y los óvulos desnudos a los 18 DPA, las fibras a los 8 DPA y las fibras a los 24 DPA, se indican por encima de cada carril.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada de algodón que codifica para una quitinasa endógena de algodón. La molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria. Normalmente, la fibra es fibra de algodón.

La expresión preferente en fibras durante la deposición de la pared secundaria significa la expresión génica en la célula fibrosa durante la deposición de la pared secundaria a un nivel más de 100 veces superior al de en otros tipos de células o en otras fases del desarrollo celular. Pueden evaluarse niveles comparativos de la expresión génica mediante diversas técnicas de biología molecular convencionales incluyendo la transferencia de tipo Northern semicuantitativa y la PCR cuantitativa a tiempo real.

El término "fibra" se usa con frecuencia para unificar un grupo diverso de tipos de células vegetales que tienen en común las características de tener una forma alargada y abundante celulosa en las paredes celulares gruesas, normalmente, pero no siempre, descritas como paredes secundarias. Tales paredes pueden estar o no lignificadas, y el protoplasto de tales células puede o no seguir vivo en la madurez. Tales fibras tienen muchos usos industriales, por ejemplo en productos de madera y de madera manufacturados, papel, materiales textiles, material para cajas y arpillera, cordelería, cepillos y escobas, material de relleno y de llenado, calafateado, refuerzo de otros materiales y fabricación de derivados de celulosa. En algunas industrias, el término "fibra" normalmente incluye células conductoras de pared gruesa tales como vesículas y traqueidas y agregados fibrilares de muchas células fibrosas individuales. En este caso el término "fibra" se usa en su sentido más global, por ejemplo incluyendo: (a) células conductoras y no conductoras de pared gruesa del xilema; (b) fibras de origen extraxilar, incluyendo aquéllas de floema, corteza, tejido fundamental y epidermis; y (c) fibras de tallos, hojas, raíces, semillas y flores o inflorescencias (tales como las de Sorghum vulgare usadas en la fabricación de cepillos y escobas). Además de la madera de los árboles, algodón y cultivos de forraje, la invención puede aplicarse a todas las fibras, incluyendo, pero no exclusivamente, aquéllas en residuos agrícolas tales como maíz, caña de azúcar y tallos de arroz que pueden usarse en la fabricación de pulpa, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp. (por ejemplo sisal).

La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede tener una secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No. 1 tal como sigue:

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1

La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención también comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida con una molécula de ADN que tiene una secuencia según la SEQ. ID. No. 1 en condiciones rigurosas caracterizadas por un tampón de hibridación que comprende 1 x SSC a una temperatura de 61ºC.

La molécula de ácido nucleico aislada de la SEQ. ID. No. 1 codifica para una proteína o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ. ID. No. 2 tal como sigue:

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2

Esta secuencia de aminoácidos muestra homología con las quitinasas vegetales que son importantes en la defensa o en el desarrollo de la fibra de algodón. La presente invención también se refiere a un polipéptido que está codificado por la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ. ID. No. 2.

La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se expresa preferentemente en fibras de algodón comenzando de 14 a 17 DPA, extendiéndose preferiblemente hasta la finalización de la deposición de la pared secundaria. De la manera más preferible, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se expresa preferentemente en fibras de algodón comenzando de 14 a 17 DPA hasta los 31 DPA. La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención es el primer gen de algodón con homología con la quitinasa que se sabe que se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria. La regulación temporal precisa del gen con la deposición de la pared secundaria sugiere que el gen podría manipularse para cambiar el desarrollo de fibras o las propiedades defensoras.

En una forma preferida de la presente invención, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención está en un constructo de ADN que comprende un promotor operativamente unido en 5' a un segundo ADN que codifica para una proteína o un polipéptido para inducir la transcripción del segundo ADN. El segundo ADN comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Una región reguladora en 3' está operativamente unida a la molécula de ácido nucleico siendo dicho promotor foráneo a dicha molécula de ácido nucleico.

En otra realización, la presente invención es un sistema de expresión que incluye un vector adecuado que contiene el constructo de ADN de la invención. El sistema de expresión contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de las secuencias que codifican para las proteínas insertadas. En la preparación del constructo de ADN para la expresión, las diversas secuencias de ADN pueden insertarse o sustituirse normalmente en un plásmido bacteriano. Puede emplearse cualquier plásmido conveniente, que se caracterizará por tener un sistema de replicación bacteriano, un marcador que permite la selección en una bacteria, y generalmente uno o más sitios de restricción únicos, ubicados de manera conveniente. Están disponibles numerosos plásmidos, denominados vectores de transformación para la transformación de plantas. La selección de un vector dependerá de la técnica de transformación preferida y las especies diana para la transformación. Están disponibles una variedad de sectores para la transformación estable usando Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo que provoca agallas del cuello. Agallas del cuello se caracterizan por tumores o agallas que se desarrollan en el tallo inferior y raíces principales de la planta infectada. Estos tumores se deben a la transferencia e incorporación de parte del ADN de plásmido bacteriano en el ADN cromosómico de la planta. Este ADN de transferencia (ADNt) se expresa junto con los genes normales de la célula vegetal. El ADN de plásmido, pTI, o ADNti, para el "plásmido que induce tumores", contiene los genes vir necesarios para el desplazamiento del ADNt en la planta. El ADNt porta genes que codifican para proteínas implicadas en la biosíntesis de factores reguladores de la planta y nutrientes bacterianos (opinas). El ADNt está delimitado por dos secuencias de repetición directas imperfectas de 25 pb denominadas las "secuencias límites". Retirando los genes de opinas y el oncogén, y sustituyéndolos por un gen de interés, es posible transferir ADN foráneo en la planta sin la formación de tumores o la multiplicación de A. tumefaciens (Fraley et al., "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells", Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 80: 4803-4807 (1983).

La mejora adicional de esta técnica condujo al desarrollo del sistema de vectores binario (Bevan, M., "Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation", Nucleic Acids Res., 12:8711-8721 (1984). En este sistema, todas las secuencias de ADNt (incluyendo las límites) se retiran del pTi, y se introduce un segundo vector que contiene ADNt en A. tumefaciens. Este segundo vector tiene la ventaja de poder replicarse en E. coli así como A. tumefaciens y contiene un sitio de clonación múltiple que facilita la clonación de un transgén. Un ejemplo de un vector usado comúnmente es pBin19 (Frisch, et al., "Complete Sequence of the Binary Vector Bin19", Plant Molec. Biol., 27:405-409 (1995). Cualquier vector adecuado conocido ahora o descrito posteriormente para la transformación de la planta es adecuado para su uso con la presente invención.

La patente estadounidense número 4.237.224 concedida a Cohen y Boyer, describe la producción de sistemas de expresión en forma de plásmidos recombinantes usando escisión con enzimas de restricción y ligamiento con ADN ligasa. Estos plásmidos recombinantes se introducen entonces por medio de transformación y se replican en cultivos unicelulares, incluyendo organismos procariotas y células eucariotas que se hacen crecer en cultivo tisular.

Una vez que se ha clonado el constructo de ADN de la presente invención en un sistema de expresión, tal como se describió anteriormente, están listos para incorporarse en una célula huésped. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células por medio de la transformación, particularmente transducción, conjugación, movilización o electroporación. Las secuencias de ADN se clonan en el vector usando procedimientos de clonación convencionales en la técnica, tal como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989).

Las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bacterias, virus, levadura, células de mamífero, insecto, planta y similares. Preferiblemente, las células huésped son o bien una célula bacteriana (por ejemplo, Agrobacteria) o una célula vegetal. Los ejemplos de células vegetales incluyen células de algodón, maíz, caña de azúcar y tallos de arroz que pueden usarse en la fabricación de pulpa, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp. (por ejemplo sisal). De la manera más preferible, la célula vegetal es de algodón.

En otras realizaciones de la presente invención, se producen plantas o semillas mediante transformación con el constructo de ADN de la presente invención.

La presente invención también se refiere a un método para conferir resistencia frente a insectos y hongos que implica transformar una planta con el constructo de ADN que contiene la molécula de ácido nucleico que codifica para quitinasa de la presente invención. El constructo de ADN de la presente invención puede utilizarse para conferir resistencia frente a insectos y hongos para una amplia variedad de plantas que producen fibras tales como algodón, maíz, caña de azúcar, y tallos de arroz que pueden usarse en la fabricación de pulpa, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp. (por ejemplo sisal). El constructo de ADN es particularmente muy adecuado para conferir resistencia al algodón.

Un enfoque para transformar células vegetales con la molécula de ácido nucleico de la presente invención es el bombardeo de partículas (también conocido como transformación biolística) de la célula huésped. Esto puede llevarse a cabo en uno de varios modos. El primero implica lanzar partículas inertes o biológicamente activas a las células. Esta técnica se da a conocer en las patentes estadounidenses números 4.945.050, 5.036.006 y 5.100.792, todas concedidas a Sanford, et al. Generalmente, este procedimiento implica lanzar partículas inertes o biológicamente activas a las células en condiciones eficaces para penetrar la superficie externa de la célula y que van a incorporarse dentro del interior de las mismas. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede introducirse en la célula mediante recubrimiento de las partículas con el vector que contiene el ADN heterólogo. Alternativamente, la célula diana puede estar rodeada por el vector de modo que el vector va hacia el interior de la célula mediante la activación de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células bacterianas secas que contienen el vector y ADN heterólogo) también pueden lanzarse hacia las células vegetales. También pueden usarse otras variaciones del bombardeo de partículas, conocidas actualmente o desarrolladas a continuación en el presente documento.

La expresión transitoria en protoplastos permite estudios cuantitativos de expresión génica puesto que la población de células es muy alta (del orden de 10^{6}). Para suministrar ADN dentro de los protoplastos, se han propuesto varias metodologías, pero las más comunes son la electroporación (Fromm et al., "Expression of Genes Transferred Into Monocot and Dicot Plants by Electroporation", Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82:5824-5828 (1985)) y captación de ADN mediada por polietilenglicol (PEG) (Krens et al., "In Vitro Transformation of Plant Protoplasts with Ti-Plasmid DNA", Nature 296:72-74 (1982)). Durante la electroporación, el ADN se introduce en la célula por medio de un cambio reversible de la permeabilidad de la membrana celular debido a la exposición a un campo eléctrico. La transformación con PEG introduce el ADN cambiando la elasticidad de las membranas. A diferencia de la electroporación, la transformación con PEG no requiere ningún equipo especial y los rendimientos de transformación pueden ser igual de altos. Otro método apropiado de introducción del constructo de gen de la presente invención en una célula huésped es la fusión de protoplastos con otras entidades, o bien minicélulas, células, lisosomas, o bien otros cuerpos de superficie lipídica que pueden fusionarse que contienen el gen quimérico (Fraley, et al., "Liposome-Mediated Delivery of Tobacco Mosaic-Virus RNA Into Tobacco Protoplasts - A Sensitive Assay for Monitoring Liposome-Protoplast Interactions", Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79:1859-1863 (1982)).

Se prefieren transformantes estables para los métodos de la presente invención. Un método apropiado de introducción estable del constructo de ADN en células vegetales es infectar una célula vegetal con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes transformadas previamente con el constructo de ADN. En condiciones apropiadas conocidas en la técnica, las células vegetales transformadas se hacen crecer para formar brotes o raíces, y se desarrollan adicionalmente en plantas. En una realización de la presente invención, los transformantes se generan usando el método de Frary et al, Plant Cell Reports 16: 235 (1996)) para transformar explantes de plantas de semillero.

Los tejidos vegetales adecuados para la transformación incluyen, pero no se limitan a, brotes florales, tejidos de hoja, tejido de raíz, tejido de hipocótilo, meristemos, embriones cigóticos y somáticos, megasporas y anteras.

Tras la transformación, las células vegetales transformadas pueden seleccionarse y regenerarse. Preferiblemente, las células transformadas se identifican en primer lugar usando un marcador de selección introducido simultáneamente en las células huésped junto con el constructo de ADN de la presente invención. El gen indicador más ampliamente usado para los experimentos de fusión génica ha sido uidA, un gen de Escherichia coli que codifica para la proteína \beta-glucuronidasa, también conocida como GUS. Jefferson et al., "GUS Fusions: \beta-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants", EMBO Journal 6:3901-3907 (1987)). GUS es una proteína de 68,2 kd que actúa como un tetrámero en su forma nativa. No requiere cofactores o condiciones iónicas especiales, aunque puede inhibirse mediante cationes divalentes como Cu^{2+} o Zn^{2+}. GUS es activa en presencia de agentes reductores de tiol como \beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT).

Otros marcadores de selección adecuados incluyen, sin limitación, marcadores que codifican para la resistencia a antibióticos, tales como el gen nptII que confiere resistencia a kanamicina (Fraley, et al., "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-4807 (1983)) y el gen dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Bourouis et al., "Vectors Containing a Prokaryotic Dihydrofolate Reductase Gene Transform Drosophila Cells to Methotrexate-Resistance", EMBO J. 2:1099-1104 (1983)).

Una vez que se ha obtenido un tejido o una célula vegetal recombinante, es posible regenerar una planta de crecimiento completo a partir de los mismos. Los medios para la regeneración varían entre especies de plantas, pero generalmente se proporciona en primer lugar una suspensión de protoplastos transformados o una placa Petri que contiene explantes transformados. Se forma el tejido calloso y pueden inducirse brotes del tejido calloso y posteriormente se enraízan. Alternativamente, la formación de embriones puede inducirse en el tejido calloso. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo generalmente contendrán diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para tales especies como el maíz y la alfalfa. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y del historial del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es normalmente reproducible y puede repetirse.

La regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans, et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol, 1: (MacMillan Publishing Cb., Nueva York, 1983); y Vasil I.R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984, y Vol. III (1986)).

Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo pero sin limitarse a, todas las especies principales de algodón, arroz, trigo, cebada, centeno, girasol, cacahuete, maíz, patata, boniato, judía, guisante, endibia, lechuga, escarola, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, zapallo, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar.

Después de que la molécula de ácido nucleico de la presente invención se incorpora de manera estable en las plantas transgénicas, puede transferirse a otras plantas mediante entrecruzamiento sexual o preparando cultivares. Con respecto al entrecruzamiento sexual, puede usarse cualquiera de varias técnicas de cultivo convencionales dependiendo de las especies que van a entrecruzarse. Los cultivares pueden propagarse de acuerdo con procedimientos agrícolas comunes conocidos para los expertos en el campo. Alternativamente, se recuperan semillas transgénicas de las plantas transgénicas. Entonces pueden plantarse las semillas en la tierra y cultivarse usando procedimientos convencionales para producir plantas transgénicas.

La presente invención también se refiere a un método de regulación del contenido en celulosa de una fibra vegetal que implica transformar una planta con el constructo de ADN que contiene la molécula de ácido nucleico que codifica para quitinasa de la presente invención. Pueden usarse los mismos enfoques para transformar células vegetales con la molécula de ácido nucleico de la presente invención mencionados anteriormente. Puede utilizarse el constructo de ADN de la presente invención para modular el desarrollo de fibras regulando la síntesis de celulosa para una amplia variedad de plantas que producen fibras tales como algodón, maíz, caña de azúcar y tallos de arroz que pueden usarse en la fabricación de pulpa, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp. (por ejemplo sisal). El constructo de ADN es particularmente muy adecuado para modular el desarrollo de fibras de algodón.

Varias clases de pruebas sugieren que las quitinasas están ubicadas en órganos sanos de la planta, y se ha caracterizado bien un papel de desarrollo de una quitinasa en la embriogénesis. Puede rescatarse un defecto mutante de la zanahoria en la embriogénesis somática mediante la adición de una quitinasa extracelular, glicosilada, ácida (EP3) al medio de cultivo (de Jong et al., "A Carrot Somatic Embryo Mutant is Rescued by Chitinase", Plant Cell, 4:425-433 (1992)). El rescate puede duplicarse mediante la adición de oligosacáridos de lipoquitina (Schmidt et al., "Signal Molecules Involved in Plant Embryogenesis", Plant Molecular Biology, 26:1305-1313 (1994)) y por alguna pero no todas las otras quitinasas (Kragh et al., "Characterization of Chitinases Able to Rescue Somatic Embryos of the Temperature-Sensitive Carrot Variant TS11", Plant Molecular Biology, 31:631-645 (1996)). El gen EP3 se expresó en un subconjunto pequeño de células de frutas jóvenes y semillas maduras, lo que sugiere que la quitinasa actúa para liberar oligómeros de quitina como señales de desarrollo (posiblemente para reiniciar la división celular) para desarrollar embriones cigóticos (van Hengel, "Expression Patterns of the Carrot EP3 Endochitinase Genes in Suspension Cultures and in Developing Seeds", Plant Physiology, 117:43-53 (1998)). La expresión del gen de quitinasa también se ha asociado con la embriogénesis somática en otras especies (Dong et al., "Endochitinese and \beta-1,3-Glucanase Genes are Developmentally Regulated durante Somatic Embryogenesis in Picea glauca", Planta, 201:189-194 (1997). Las proteínas de arabinogalactano (AGP) son otra clase de moléculas requeridas para la embriogénesis somática, y algunas AGP de zanahoria contienen glucosamina y N-acetil-D-glucosaminilo y son sensibles a la escisión mediante quitinasas. El pretratamiento de las AGP con la quitinasa las hace más activas para promover la embriogénesis de protoplastos de zanahoria, suponiendo que el rescate de embriones mediante la quitinasa puede estar mediado por su acción hidrolítica sobre las AGP (van Hengel et al., "N-Acetylglucosamine and Glucosamine-Containing Arabinogalactan Proteins Control Somatic Embryogenesis", Plant Physiology, 125:1880-1890 (2001)). En este caso, las AGP serían un sustrato endógeno para las quitinasas. Se ha encontrado que una proteína de tipo AGP se acumula durante la deposición de la pared secundaria de fibras de algodón (John et al., "Characterization of mRNA for a Proline-Rich Protein of Cotton Fiber", Plant Physiology, 108:669-676 (1995)).

Las quitinasas se han asociado con varios otros tejidos vegetales sanos, incluyendo semillas germinativas (Petruzzelli et al. "Distinct Ethylene- y Tissue-Specific Regulation of \beta-1,3-Glucanases and Chitinases During Pea Seed Germination", Planta, 209:193-201 (1999)). La expresión del gen de quitinasa está asociada con la formación de flores de nuevo de explantes de células de tabaco (Neale et al., "Chitinase, \beta-1,3-Glucanase, Osmotin, and Extensin are Expressed in Tobacco Explants During Flower Formation", Plant Cell, 2:673-684 (1990). Se ha encontrado actividad de enzima quitinasa en flores sanas de petunia, siendo particularmente alta en el estigma tras abrirse las anteras (Leung, "Involvement of Plant Chitinases in Sexual Reproduction of Higher Plants", Phytochemistry, 31:1899-1900 (1992)). De manera similar, se identificó una proteína inmunológicamente relacionada con la quitinasa básica tanto en las anteras como la parte superior de los pistilos de la judía (que contienen el estigma) (del Campillo et al., "occurrence of 9.5 Cellulase and Other Hydrolases in Flower Reproductive Organs Undergoing Major Cell Wall Disruption", Plant Physiology, 99:1015-1020 (1992)). En las flores, la quitinasa podría tener un papel de desarrollo o un papel defensor en la anticipación de una posible invasión fúngica de los tejidos frágiles que son esenciales para el éxito reproductivo. Algunas proteínas extraídas de paredes celulares primarias y secundarias de diversas especies vegetales en cultivo en suspensión y secuenciadas en su extremo N-terminal tienen homología con las secuencias de quitinasa en las bases de datos de la judía francesa (P80800, P80808, P80792, P82432) y el tabaco (P80783, P8233) (Robertson et al., "Differential Extraction and Protein Sequencing Reveals Major Differences in Patterns of Primary Cell Wall Proteins from Plants", The Journal of Biological Chemistry, 272:15841-15848 (1997); Blee et al., "Proteomic Analysis Reveals a Novel Set of Cell Wall Proteins in a Transformed Tobacco Cell Culture That Synthesizes Secondary Walls as Determined by Biochemical and Morphological Parameters", Planta, 212:404-415 (2001)). Sin embargo, puesto que sólo están disponibles las secuencias peptídicas cortas tras la secuenciación N-terminal (máximo de dieciocho aminoácidos), no pueden hacerse conclusiones definitivas sobre la presencia de quitinasas auténticas en estas paredes celulares.

No se han caracterizado otros sustratos endógenos de quitinasas vegetales distintos de las AGP que contienen N-acetil-glucosamina asociadas con el rescate de embriones (van Hengel et al., "N-Acetylglucosamine and Glucosamine-Containing Arabinogalactan Proteins Control Somatic Embryogenesis", f1mn Physiology, 125:1880-1890 (2001)) a los niveles estructurales o funcionales. Sin embargo, existen pruebas de que sustratos endógenos de quitinasa de diversos tipos moleculares existen en plantas sanas. Por ejemplo, una lectina de unión a quitina, aglutinina de germen de trigo (WGA) o quitinasa marcada con oro coloidal de densidad electrónica marcó las paredes celulares secundarias vasculares de manera muy densa en plantas sanas de patata, berenjena, tomate y olmo. Las paredes primarias adyacentes o las regiones de la laminilla media no estaban marcadas, lo que sostiene la especificidad de la reacción (Benhamou et al., "Attempted Localization of Substrate for Chitinases in Plant Cells Reveals Abundant N-Acetyl-D-Glucosamine Residues in Secondary Walls", Biologie Cellulaire, 67:341-350 (1989)). Este marcaje podría no suprimirse mediante el pretratamiento con proteasa para digerir la proteína o una quitinasa microbiana, pero se suprimió mediante el pretratamiento con lipasa para digerir lípidos. La ausencia de marcador tras el tratamiento con lipasa parece que colocaría estas moléculas de pared secundaria en una clase diferente de las AGP que contienen N-acetil-glucosamina que se han asociado con el rescate de embriones. Más bien, los datos sugieren que los oligómeros de quitina existen dentro o en asociación con una molécula que contiene lípidos en paredes celulares secundarias. (0067) Las moléculas que contienen tanto oligómeros de quitina como lípido (un único grupo acilo graso que varía desde C 16:0 hasta C20:4)) se conocen en forma de oligosacáridos de lipoquitina (LCO), que se sintetizan y se segregan por bacterias nodulares (Rhizobium) para inducir la formación del nódulo radical simbiótico mediante su huésped vegetal (Bakkers et al., "Function of Chitin Oligosaccharides in Plant and Animal Development", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs.71-84 (1999)). Esto indica que las plantas tienen capacidad para reconocer tales moléculas suministradas de un organismo exógeno como señales de desarrollo, en este caso para iniciar la formación de nódulos. Además, pueden existir moléculas similares de manera endógena dentro de las plantas. La cromatografía de capa fina (CCF) de compuestos lipófilos en extractos de flores de la planta Lathyrus odoratus mostró que migraban de manera similar a los LCO y que algunas de ellos eran susceptibles a la digestión con quitinasa (Spaink et al., "Rhizobial Lipo-Oligosaccharide Signals and Their Role in Plant Morphogenesis: Are Analogous Lipophilic Chitin Derivatives Produced by the Plant?", Australian Journal of Plant Phyrsiology, 20:381-392 (1993)).

Las moléculas vegetales endógenas similares a los LCO podrían contener oligómeros de quitina reguladores del crecimiento que pueden liberarse por las quitinasas vegetales endógenas. Los datos sobre el rescate de embriones por la quitinasa ya descrito proporcionan un ejemplo. Además, las células en suspensión de tomate responden a los LCO u oligómeros de quitina (tal como podrían liberarse de moléculas endógenas más complejas mediante la acción limitada de la quitinasa) aumentando de manera transitoria el pH de su medio de cultivo (Staehelin et al., "Perception of Rhizobium Nodulation Factors by Tomato Cells and Inactivation by Root Chitinases", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 91:2196-2200 (1994)). Otras respuestas de planificación asociadas con oligómeros de quitina incluyen la síntesis de fitoalexinas antifúngicas, la inducción de quitinasas, la inducción de liberación de K+ y de Cl^{-}, y la síntesis de H_{2}O_{2} (Gooday, "Aggressive and Defensive Roles for Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs. 157-170 (1999)). Las plantas de tabaco transformadas para sobreexpresar genes que sintetizan LCO (NodA y NodB, o bien por separado o bien en combinación) de Rhizobium redujeron el crecimiento y alteraron la forma de la hoja (Schmidt et al., "Alteration of Plant Growth and Development by Rhizobium noda y Nodb Genes Involved in the Synthesis of Oligosaccharide Signal Molecules", The Plant Journal, 4:651-658 (1993)), lo que sugiere que NodA y NodB pueden interferir con procesos biosintéticos de la planta requeridos para la morfogénesis (Bakkers et al., "Function of Chitin Oligosaccharides in Plant and Animal Development", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs.71-84 (1999)). Tal interferencia puede producirse a muchos niveles. Sin embargo, puesto que tanto la tasa de crecimiento global como la morfogénesis de órganos de la planta normal dependen mucho de la síntesis de celulosa, es posible que NodA y NodB interfieran directamente con la síntesis de celulosa. Quizás NodA y NodB se unen a y procesan de manera inapropiada un sustrato vegetal que contiene N-acetil-glucosamina endógeno, creando un análogo no funcional de una molécula endógena requerida para la síntesis de celulosa.

A la inversa, las plantas de tabaco transformadas para sobreexpresar una quitinasa de clase I ácida de maíz mostraron una correlación positiva entre la actividad quitinasa y el peso en seco de las plantas de semillero (Patil et al., "Possible Correlation Between Increased Vigour and Chitinase Activity Expression in Tobacco", Journal of Experimental Botany, 48:1943-1950 (1997)), que tiene un gran componente de celulosa. Aunque no se proporcionó ninguna explicación mecanística, es posible que la actividad quitinasa foránea provoque la sobreproducción de oligómeros de quitina que estimulan la síntesis de celulosa. Los oligómeros de quitina podrían modular la síntesis de celulosa o bien como señales de desarrollo o bien como participantes directos en el proceso biosintético de la celulosa. Por ejemplo, los oligómeros del heteropolímero de hialuronano que contiene N-acetilglucosamina, (\beta-1,4-GlcA \beta-1,3-Glc-NAc)_{n}, interaccionan con un receptor particular para activar Rho y Rac1 GTPasas, que conducen a la reorganización del citoesqueleto de actina (Lee et al., "Hyaluronan: A Multifunctional, Megadalton, Stealth Molecule", Current Opinion in Cell Biology, 12:581-586 (2000)). La reorganización del citoesqueleto de actina se produce en la transición de pared primaria a secundaria en fibras de algodón para mediar la orientación cambiada de microfibrillas de celulosa (Seagull, "Cytoskeletal Involvement in Cotton Fiber Growth and Development", Micron, 24:643-660 (1993)). Un gen Rac se expresa de manera transitoria en fibras de algodón en el momento de esta reorganización y (Delmer et al., "Genes Encoding Small GTP-Binding Proteins Analogous to Mammalian Rac are Preferentially Expressed in Developing Cotton Fibers", Mol. Gen. Genet., 248:43-51 (1995)) un aumento súbito de de H_{2}O_{2} relacionado también puede mediar esta transición (Potikha et al., "The Involvement of Hydrogen Peroxide in the Differentiation of Secondary Walls in Cotton Fibers", Plant Physiology, 119: 849-858 (1999)). Sin embargo, la expresión prolongada de la molécula de ácido nucleico aislada dada a conocer en la presente invención a lo largo de la deposición de la pared secundaria aboga por un papel más allá del control transitorio de las cascadas de traducción de señales y la organización del citoesqueleto implicando Rac y H_{2}O_{2} en la transición de la pared primaria a secundaria.

Pueden proponerse otras posibilidades de la participación de la molécula de ácido nucleico aislada dada a conocer en la presente invención en la síntesis de celulosa de fibras de algodón por analogía con otros sistemas. Los LCO o moléculas similares tales como dolicol-(N-acetil-glucosamina)_{n} podrían donar oligosacáridos que contienen quitina a una proteína como cebadores en un proceso biosintético (Spaink et al., "Rhizobial Lipo-Oligosaccharide Signals and Their Role in Plant Morphogenesis: Are Analogous Lipophilic Chitin Derivatives Produced by the Plant?", Australian Journal of Plant Physiology, 20:381-392 (1993)), tal como se da como ejemplo mediante la biosíntesis de quitina en insectos (Palli et al., "Molecular and Biochemical Aspects of Chitin Synthesis Inhibition", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs. 85-98 (1999)). Se ha observado que se ha prestado poca atención al hecho de que dos quitinasas fúngicas y lisozima de huevo actúan como catalizadores en reacciones de transglicosilación (Collinge et al., "Plant Chitinases", Plant J., 3:31-40(1993)). Los mutantes cytl de Arabidopsis carecen de actividad manosa-1-fosfato guaniltransferasa suficiente, y por consiguiente carecen de producción de GDP-manosa tal como se requería para la N-glicosilación de proteínas. También muestran una reducción de 5 veces del contenido en celulosa y no pueden continuar hacia el desarrollo embrionario normal (Lukowitz et al., "Arabidopsis cyt1 Mutants are Deficient in a Mannose-1-Phosphate Guanyltransferase and Point to a Requirement of N-Linked Glycosylation for Cellulose Biosynthesis", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 98:2262-2267 (2001). Puesto que el inhibidor de la N-glicosilación, tunicamicina, también provoca la carencia de celulosa, estos autores sugieren que un péptido N-glicosilado podría actuar como un cebador para la síntesis de celulosa, que es una resurrección de una antigua y muy debatida hipótesis de que la síntesis de celulosa no requiere un cebador (Maclachlan, "Does \beta-Glucan Synthesis Need A Primer", en Brown, Jr., ed., Cellulose and Other Natural Polymer Systems: Biogenesis, Structure, and Degradation, Plenum Press: NY, págs. 327-339 (1982).

Una forma de ADN que codifica para una proteína adecuada para su uso en el constructo de ADN de la presente invención es la molécula de ácido nucleico aislada de la invención, preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida con una molécula de ADN que tiene una secuencia según la SEQ. ID. No. 1 en condiciones rigurosas caracterizadas por un tampón de hibridación que comprende 1 x SSC a una temperatura de 61ºC, que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No. 1, o que codifica para una proteína o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No. 2.

El ADN que codifica para una proteína adecuado para su uso en la presente invención incluye ADN que se ha amplificado, alterado químicamente o de otro modo modificado. La modificación de tales ADN que codifican para una proteína puede producirse, por ejemplo, tratando el ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que puede unirse operativamente al promotor. La modificación también puede producirse mediante técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio.

El ADN que codifica para una proteína también incluye ADN que es completamente sintético, semisintético o derivado biológicamente, tal como ADN derivado mediante transcripción inversa de ARN. Tal ADN incluye, pero no se limita a, genes no vegetales tales como los de bacterias, levaduras, animales o virus; genes modificados, partes de genes, genes quiméricos, así como ADN que codifica para aminoácidos que son precursores químicos o compuestos biológicos de valor comercial, tales como polímeros o biopolímeros (Pool et al., "In Search of the Plastic Potato", Science, 245:1187-1189 (1989)). ADN adecuado es cualquier ADN para el que la expresión es beneficiosa para la planta transgénica o para el que es beneficioso de otro modo tener el ADN expresado bajo el control de un promotor de ADN que conduce la expresión preferentemente durante la fase de pared secundaria del desarrollo de fibras.

Los ejemplos de otras moléculas de ADN que codifican para una proteína que pueden expresarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, celulosa sintasas homólogas y heterólogas (genes CesA), tanto en forma normal como mutada (Arioli et al., "Molecular Analysis of Cellulose Biosynthesis in Arabidopsis", Science, 279:717-720 (1998); Holland et al., "A Comparative Analysis of the Plant Cellulose Synthase (CesA) Gene Family", Plant Physiol., 123:1313-1324 (2000)), genes que pueden modular la división de carbonos para dar celulosa (Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers" en: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 85-112 (1999)); tales como sacarosa sintasa (Amor et al., "A Membrane-Associated Form of Sucrose Synthase and Its Potential Role Synthesis of Cellulose and Callose in Plants", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9353-9357 (1995)); sacarosa fosfato sintasa (Haigler et al., "Transgenic Cotton Over-Expressing Sucrose Phosphate Synthase Produces Higher Quality Fibers with Increased Cellulose Content and Has Enhanced Seed Cotton Yield" resumen 477. en: Proceedings of Plant Biology 2000, julio 15 - 19, San Diego, CA. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, (2000), UDPG-pirofosforilasa (Waffler y Meier, "Enzyme Activities in Developing Cotton Fibers", Plant Physiol. Biochem, 32:697-702 (1994)); pirofosfatasa inorgánica (Geigenberger et al., "Overexpression of Pyrophosphatase Leads to Increased Sucrose Degradation and Starch Synthesis, Increased Activities of Enzymes for Sucrose-Starch Interconversions, and Increased Levels of Nucleotides in Growing Potato Tubers", Planta, 2 05:428-437(1998)), hexocinasas (Smeekens, "Sugar Regulation of Gene Expression", Curr. Op. Plant Biol., 1:230-234 (1998)), e invertasas (Sturm y Tang, "The Sucrose-Cleaving Enzymes of Plants are Crucial for Development. Growth, and Carbon Partitioning", Trends Plant Sci., 4:401-407 (1999)); genes que pueden afectar a las propiedades moleculares y biofísicas de la celulosa incluyendo el grado de polimerización, el grado de cristalinidad, el tamaño de unidad cristalina y la orientación de microfibrillas (es decir genes para codificar proteínas, incluyendo polímeros de proteína de cristalinización conjunta o dominios de unión a celulosa, y enzimas que sintetizan polisacáridos y otras) (Delmer, "Cellulose Biosynthesis: Exciting Times for a Difficult Field of Study", Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 50:245-276 (1999); Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 85-112 (1999); Hsieh, "Structural Development of Cotton Fibers". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 137-166 (1999), factores de transcripción tales como genes MYB que pueden prolongar el crecimiento de elongación y/o pueden cambiar el tiempo o la extensión de la deposición de la pared secundaria (Wilkins y Jernstedt, "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 231-270 (1999), genes para realizar la síntesis de hormonas vegetales y cambiar las propiedades de las fibras (John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 271-289 (1999)); genes para los elementos citoesqueléticos o proteínas asociadas al citoesqueleto que pueden afectar a las propiedades de las fibras (Seagull, "Cytoskeletal Involvement in Cotton Fiber Growth and Development", Micron, 24:643-660 (1993)); genes para sintetizar lípidos o modificar enzimas que pueden cambiar las propiedades de la membrana y mejorar de ese modo la calidad de las fibras, incluyendo en condiciones ambientales de estrés (Haigler, "The Crystallinity of Cotton Cellulose in Relation to Cotton Improvement", Proc. Cotton Fiber Cellulose: Structure, Function, and Utilization Conference, National Cotton Council of America: Memphis, TN., págs. 211-225 (1992)), enzimas tales como xiloglucano endotransferasa, peroxidasa, expansina o ATPasa vacuolar que pueden, aumentando o reduciendo la actividad, prolongar o aumentar el crecimiento de extensión durante la deposición de la pared secundaria (Wilkins y Jernstedt, "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers". En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 231-270 (1999)); genes para polímeros de plástico o proteína que pueden estar retenidos en el lumen fibroso o estar integrados en la pared celular para aumentar la resistencia de las fibras o cambiar sus propiedades textiles (John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification", En: A.S. Basra (ed.). Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 271 - 289 (1999); Guda et al., "Hyperexpression of an Environmentally Friendly Synthetic Polymer Gene", Biotechnology Letters. 17:745-750 (1995)); genes para enzimas biosintéticas de matriz de pared celular vegetal o sus proteínas reguladoras de modo que otros hidratos de carbono puedan integrarse en la pared celular y cambiar las propiedades de las fibras (Haigler, "The Relationship Between Polymerization and Crystallization in Cellulose Biogenesis", en C. H. Haigler y P. Weimer, eds., Biosynthesis and Biodegradation of Cellulose, Nueva York: Marcel Dekker, págs. 99-124 (1991); Andrawis et al., "Cotton Fiber Annexins: A Potential Role in the Regulation of Callose Synthase", Plant J., 3: 763-772 (1993)); genes para moléculas tales como taninos, suberinas o colorantes que pueden conferir color valioso a las fibras (Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 1-46 (1999), que se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia); genes para moléculas tales como cutina, suberina o cera que pueden cambiar la capacidad de absorción y la resistencia de las fibras de algodón (May, "Genetic Variation in Fiber Quality", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 183-230 (1999); Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation", En: A.S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, Nueva York, págs. 1-46 (1999)); y genes para las moléculas de transducción de señales tales como Rac que pueden regular los desplazamientos entre las fases del desarrollo de fibras (Delmer et al., "Genes Encoding Small GTP-Binding Proteins Analogous to Mammalian rac are Preferentiallly Expressed in Developing Cotton Fibers", Mol. Gen. Genet., 248: 43-51
(1995)).

El constructo de ADN de la presente invención también incluye una región reguladora en 3' operable, seleccionada de entre las que pueden proporcionar la finalización de la transcripción correcta y la poliadenilación de ARNm para la expresión en células vegetales, operativamente unida a la molécula de ADN que codifica para una proteína de elección. Se sabe que varias regiones reguladoras en 3' son operables en plantas. Las regiones reguladoras en 3' a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, la región reguladora en 3' de nopalina sintasa (Fraley, et al., "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells", Proc. Natl Acad. Sci. USA, 80:4803-4807 (1983)) y la región reguladora en 3' del virus del mosaico de la coliflor (Odell, et al., "Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter", Nature, 313(6005): 810-812(1985)). Prácticamente cualquier región reguladora en 3' que se sabe que es operable en plantas sería suficiente para la expresión apropiada de la secuencia codificante del constructo de ADN de la presente invención.

La molécula de ADN que codifica para una proteína, el promotor de la presente invención y una región reguladora en 3' pueden ligarse juntos usando técnicas de clonación molecular bien conocidas tal como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, NY (1989).

En otra realización, la presente invención es un sistema de expresión que incluye un vector adecuado que contiene el constructo de ADN anterior de la invención. La presente invención también incluye células huésped que incluyen el constructo de ADN de la invención descrito anteriormente, semillas y plantas transgénicas producidas.

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Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de F285, un clon de ADNc expresado preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria

Mediante presentación diferencial comparando las fibras de algodón a los 12 y 18 DPA (así como óvulos desnudos y fibras en varias edades), se identificó un fragmento de ADNc (F285) que parece que se expresaba preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria (figura 1). En el procedimiento de presentación diferencial, se usó d(T)_{12}-GA como cebador de anclaje y GTCCTGGGTT como el 10-mero aleatorio. Tras la clonación y la secuenciación parcial, se encontró que el fragmento de ADNc era homólogo a las quitinasas conocidas tal como se describe posteriormente.

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Ejemplo 2 Expresión de F285 en fibras durante la deposición de la pared secundaria

El análisis de transferencia de tipo Northern (expuesto durante la noche a película) de tejidos de algodón indicaba que el gen F285 se expresa en fibras que crecieron en invernadero sólo en la fase de pared secundaria a los 18, 24 y 27 DPA (figura 2). No hubo pruebas de expresión en fibras durante la deposición de la pared primaria a los 8 DPA, o en hojas, tallos, raíces u óvulos desnudos de fibra a los 8, 18 y 24 DPA. (Los datos de los óvulos desnudos a los 8 y 18 DPA no eran tan buenos debido al nivel inferior de carga de ARN. Sin embargo, ninguna expresión fuerte similar a la mostrada para las fibras a los 18, 24 y 27 DPA habría sido evidente incluso con la carga inferior).

El análisis temporal más detallado indicaba que la expresión en fibras que crecieron en invernadero no había comenzado en los 12 DPA, pero era fuerte en los 15 DPA y seguía siendo fuerte durante los 31 DPA (figura 3). Por tanto, la transcripción de F285 se inicia a los 13-15 DPA, que está próxima a la aparición de la deposición de la pared secundaria en fibras de algodón cuando las plantas de algodón se hicieron crecer en condiciones de invernadero (aproximadamente 32ºC día/22ºC noche).

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Ejemplo 3 Secuenciación de F285 y comparación de su secuencia de aminoácidos traducida a otras proteínas

El examen por PCR de una biblioteca de ADNc de fibras de algodón Acala-SJ2 de 21 DPA (proporcionadas amablemente por la Dr. Deborah P. Delmer y la Universidad Hebrea de Jerusalén, (The Hebrew University of Jerusalem)) identificó 3 clones de longitud similar. La secuenciación completa y repetida de éstos los resolvió para dar una secuencia de longitud completa con 957 nucleótidos y un marco de lectura abierto. La secuencia de aminoácidos deducida de 318 residuos tiene una pI predicha de 7,98 y un peso molecular predicho de 35.246 Da. La proteína traducida tiene una mezcla diversa de aminoácidos, una secuencia señal N-terminal predicha y sitios para la modificación postraduccional mediante: N-glicosilación, fosforilación mediante cuatro tipos diferentes de proteína cinasas; amidación; y N-miristoilación. La proteína F285 tiene una mezcla de regiones hidrófilas e hidrófobas, regiones extensas de hélice alfa, cadena extendida y espiral aleatoria y hélices alfa transmembrana no predichas.

Las búsquedas con BLASTX que traducían la secuencia de nucleótidos de F285 en todos los posibles marcos de lectura y comprobaban la homología con otras secuencias de aminoácidos mostraron homología con numerosas quitinasas. La búsqueda con BLASTX más reciente (4/9/01) confirmó que existen sólo dos homólogos próximos de F285 que se descubrieron a través de la secuenciación del genoma de Arabidopsis thaliana, uno en el cromosoma 3 (BAA94976.1) y uno en el cromosoma 1 (AAF29391.1). A continuación en el presente documento, éstos se denominan los homólogos de Arabidopsis de F285. La siguiente coincidencia más próxima era con una quitinasa de Arabis microphylla (AAF69789.1) (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution", Proc, Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)).

La búsqueda BLAST también confirmó que F285 era similar a pero distinta de quitinasas de algodón de longitud completa o de longitud casi completa (Q39799, Q39785, AAD11255 y S72528, en las que las primeras tres secuencias enumeradas están relacionadas de manera muy próxima) en las bases de datos (véase la Tabla I). Una búsqueda con BLASTP con la secuencia de aminoácidos traducida de F285 no reveló ninguna secuencia muy similar adicional, excepto que otra secuencia de Arabis que estaba relacionada de manera próxima con AAF69789.1 (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)) se colocó como la tercera coincidencia más alta.

Las secuencias de aminoácidos de BAA94976.1, AAF69789.1 y Q39799 se sometieron individualmente a la alineación de secuencias múltiples con CLUSTAL W con la secuencia de aminoácidos de F285 para comparar la identidad, similitud o diferencia de aminoácidos en cada posición (Tabla 1). F285 es mucho más similar a su homólogo de Arabidopsis (puntuación BLAST 542; un 76,28% de aminoácidos idénticos) que a la quitinasa de Arabis (puntuación BLAST 212; un 35,22% de aminoácidos idénticos) o algodón (puntuación BLAST 196; un 31,66% de aminoácidos idénticos). Puesto que el género Arabis contiene los miembros de la familia más cercanos de Arabidopsis thaliana (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)) la distancia comparativa entre estas cuatro secuencias es la primera indicación de que F285 y su homólogo de Arabidopsis representan un nuevo tipo de proteína relacionada con la quitinasa.

TABLA 1 Resultados de la alineación de secuencias múltiples con CLUSTAL W y datos de BLASTX

3

F285 tiene homología con quitinasas en regiones correspondientes al sitio activo (dentro de 0, 6 nm de un sustrato unido; Brameld et al., "The Role of Enzyme Distortion in the Single Displacement Mechanism of Family 19 Chitinases", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 95:4276-4281 (1998)), incluyendo en un sitio (cerca de NYNY) que es importante para la unión de quitina en muchas quitinasas (Verburg et al., "Identification of an Essential Tyrosine Residue in the Catalytic Site of a Chitinase Isolated From Zea mays That is Selectively Modified During Inactivation With 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide", J. Biol, Chem., 267:3886-3893 (1992); Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997); Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000) Tabla 2). Quitina es un polisacárido estructural, un homopolímero de N-acetil glucosamina unida en \beta-1,4, que se encuentra en los exoesqueletos de insectos y la pared celular de hongos (Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997)). Sin embargo, en este caso la "unión de quitina" se refiere a la unión de la enzima con segmentos cortos (probablemente de 3 - 6 azúcares) de residuos de N-acetilglucosamina que interaccionan con la enzima durante la hidrólisis de quitina (Robertus et al., "The Structure and Action of Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag: Basilea, págs. 125-136 (1999)). Por tanto, una enzima con topología de sitios activos similar podría unirse con oligómeros de N-acetil-glucosamina encontrados en otras moléculas o aislados. Además, podría interaccionar con otras moléculas que contienen N-acetil-glucosamina dentro de heteropolímeros o glicoproteínas. Como ejemplo, algunas quitinasas tienen actividad lisozima (Sahai et al., "Chitinases of Fungi and Plants: Their Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction", FEMS Microbiol, Rev., 11:317-338 (1993), que significa la capacidad para degradar peptidoglicano bacteriano, que contiene un heteropolímero de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico.

TABLA 2 Comparación entre F285 y otras secuencias relacionadas

4

40

401

400

La proteína de Arabis enumerada en las Tablas 1 y 2 es homóloga a la quitinasa de clase I de Arabidopsis, que ha demostrado actividad quitinolítica y la actividad defensora frente a hongos (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution", Proc. Nat'l, Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327(2000)). Sin embargo, no se ha comprobado ninguna función para F285 o sus homólogos de Arabidopsis. Tras aparecer en la base de datos como parte del genoma de Arabidopsis completamente secuenciado, los homólogos de Arabidopsis de F285 se categorizaron con quitinasas en la familia 19 de glicosil hidrolasas (CAZy, enzimas activas con hidratos de carbono; http://afmb.cnrs-mrs.fr/\simpedro/CAZY/db.html). Enzimas en la configuración de la familia 19 (Henrissat, "Classification of Chitinase Modules", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, Basilea: Birkhaüser Verlag, págs. 137-156 (1999)). Sin embargo, en el contexto de similitud global con las quitinasas, pueden identificarse diferencias específicas en dominios funcionales entre F285 y sus dos homólogos de Arabidopsis frente a auténticas quitinasas. Por ejemplo, F285 y sus homólogos de Arabidopsis carecen de características que son típicas de algunas, pero no todas, quitinasas: (a) un dominio de unión a quitina N-terminal rico en cisteína que facilitaría la interacción con la quitina; (b) una región bisagra rica en P (prolina)/T (treonina) antes de la región catalítica; y (c) un dominio de selección como diana vacuolar C-terminal (Meins et al., "The Primary Structure of Plant Pathogenesis-Related Glucanohydrolases and Their Genes", en Boller, eds., Genes Involved in Plant Defense, Springer Verlag/Nueva York, págs. 245-282 (1992)). En ausencia del dominio de selección como diana vacuolar, se espera que F285 se segregue fuera de la membrana plasmática. Su sitio de miristoilación también confiere potencial para la acilación mediante la adición covalente de miristato (un ácido graso saturado en C14), que facilitaría la interacción reversible con la membrana plasmática (Thompson et al., "Lipid-Linked Proteins of Plants", Prog. Lipid Res., 39:19 - 39 (2000)).

Además, F285 y sus homólogos de Arabidopsis tienen sustituciones de aminoácidos no conservativas (es decir con un tipo químico diferente o distinto de aminoácidos) en regiones que se comprueban mediante mutagénesis que son críticas para la función de las quitinasas típicas (Iseli-Gamboni et al., "Mutation of Either of Two Essential Glutamates Converts the Catalytic Domain of Tobacco Class I Chitinase Into a Chitin-Binding Lectin", Plant Sci., 134:45-51 (1998), y en otras regiones que se predicen mediante la estructura cristalina que son importantes para la catálisis, la geometría de sitios activos o la unión a sustratos (Hart et al., "The Refined Crystal Structure of an Endochitinase From Hordeum vulgare L. Seeds at 1.8 A Resolution", J, Mol, Biol., 248:402-413 (1995); Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997); Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)). Por ejemplo, de once aminoácidos en una quitinasa de Arabis que son supuestos sitios de unión a sustrato (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)), dos están sin cambiar, tres están sustituidos por aminoácidos similares y seis están sustituidos por aminoácidos diferentes en F285. Esto sugiere que F285, aunque está relacionado con quitinasas, podría tener una única estructura proteica que permite un único papel celular. Algunos de estos cambios no conservativos y, a la inversa, aminoácidos que se retuvieron tal como se esperaba por las quitinasas en las secuencias de F285 y sus homólogos de Arabidopsis, se resumen en la Tabla 3 (recopilada de Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997); Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)). Los aminoácidos con asteriscos (*) han demostrado mediante mutagénesis que son importantes para la función de auténticas quiti nasas (Iseli-Gamboni et al., "Mutation of Either of Two Essential Glutamates Converts the Catalytic Domain of Tobacco Class I Chitinase Into a Chitin-Binding Lectin", Plant Sci., 134:45-51 (1998)). Se ha usado la secuencia de una quitinasa de Arabis para el sistema numérico de aminoácidos de referencia debido a su anotación anterior en la bibliografía (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)). Cuando se muestran las sustituciones de aminoácidos, se encontraron las mismas en esa posición en F285 y sus homólogos de Arabidopsis, excepto para una excepción para AAF29391.1 tal como se observa en la nota a pie de tabla.
El "tipo de sustitución" es tal como se definió en el programa de alineación de secuencias múltiples CLUSTAL W.

TABLA 3 Comparación de aminoácidos funcionales en quitinasas con la secuencia de proteína F285

5

La diferencia entre F285, su homólogo de Arabidopsis más próximo, y otras quitinasas se enfatiza comparando sus secuencias similares cerca de NYNY (un sitio de unión a sustrato) con una supuesta secuencia consenso descrita para varias clases de quitinasas (Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997)) y con la quitinasa de Arabis (AAF69789.1) como representante de la secuencia de tipo consenso (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)). En este caso, los huecos insertados en todas las secuencias, incluyendo la supuesta secuencia consenso, pueden crear la mejor alineación mutua. Tal como se observa en la Tabla 4, la secuencia de F285 y su homólogo de Arabidopsis podían observarse en comparación con la secuencia consenso y de Arabis cuando: (a) se añade Y con el resultado de que se alarga el dominio hidrófobo que contiene NYNY; (b) se deleciona QLS con el resultado de que un P conservado (en 38 de 39 secuencias de quitinasa enumeradas, Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997)) está más cerca del dominio NYNY; y (c) se añade AL con el resultado de que el GRG conservado (en 38 de 39 secuencias de quitinasa enumeradas, Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997)) sigue siendo 5 residuos desde el dominio NYNY. Aunque este razonamiento es hipotético, se enfatiza la diferencia entre las secuencias de F285 y su homólogo de Arabidopsis en comparación con las secuencias de quitinasa descritas anteriormente. Se comprueba que tanto Q como S son esenciales para la catálisis en algunas quitinasas (Hamel et al., "Structural and Evolutionary Relationships Among Chitinases of Flowering Plants", J. Mol. Evol., 44:614-624 (1997); Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000)), y o bien su sustitución con aminoácidos diferentes (Tablas 2 y 3) o bien la deleción hipotética (Tabla 4) pueden provocar que la función de F285 y su homólogo de Arabidopsis diverjan de la esperada normalmente de las quitinasas. Alternativamente, F285 y sus homólogos de Arabidopsis podían ser un tipo de quitinasa no reconocido anteriormente con un único papel celular.

TABLA 4 Alineación optimizada entre una secuencia consenso de quitinasa, quitinasa de Arabis, F285 y el homólogo de Arabidopsis más próximo a F285

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Se observa una divergencia similar entre F285 y su homólogo de Arabidopsis con otras quitinasas de la familia 19 en una región que define anteriormente una parte de una "secuencia distintiva" que contiene regiones de los aminoácidos supuestamente no cambiados (subrayados) en esta familia de glicosil hidrolasas (Robertus et al., "The Structure and Action of Chitinases", en Jolles, eds., Chitin and Chitinases, págs. 125-136 (1999); Tabla 5). La secuencia distintiva contiene dos residuos de ácido glutámico (E; en las posiciones 122 y 144 de F285) que se han comprobado mediante mutagénesis que son residuos catalíticos (Iseli-Gamboni et al., "Mutation of Either of Two Essential Glutamates Converts the Catalytic Domain of Tobacco Class I Chitinase Into a Chitin-Binding Lectin", Plant Sci., 134:45-51 (1998)). En F285 y su homólogo de Arabidopsis, el E catalítico supuestamente conservado en la posición 122 está sustituido con K, que es un aminoácido muy similar aunque está positivamente cargado a pH 6 mientras que E está negativamente cargado y tiene un extremo terminal amino de su grupo R mientras que E tiene un extremo terminal carboxilo. La sustitución mediante mutagénesis dirigida de este E con A (un tipo de aminoácido diferente) suprime la actividad catalítica en algunas quitinasas, cambiando la proteína en una lectina de unión a quitina (Iseli-Gamboni et al., "Mutation of Either of Two Essential Glutamates Converts the Catalytic Domain of Tobacco Class I Chitinase Into a Chitin-Binding Lectin", Plant Sci., 134:45-51 (1998). Sin embargo, se desconoce el efecto del cambio a K en F285, aunque la sustitución con aminoácidos similares puede provocar cambios en las interacciones de unión de las quitinasas (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000). También existen muchos otros ejemplos de sustitución de aminoácidos similares dentro de los residuos de la secuencia distintiva supuestamente no cambiados. Además, dentro de los residuos de la secuencia distintiva supuestamente no cambiados, existen tres sitios (indicados con x) de sustitución de diferentes aminoácidos en F285 y su homólogo de Arabidopsis. Lo más probable es que éstos tengan mayores consecuencias funcionales que las sustituciones de aminoácidos similares. Obsérvese que la secuencia de F285 y su homólogo de Arabidopsis son idénticos en esta región, lo que sugiere que los cambios que pueden mostrar ambos en comparación con la secuencia distintiva son importantes para su función particular. Por el contrario, la secuencia de la quitinasa de Arabis (AAF69789) con un papel defensor (Bishop et al., "Rapid Evolution in Plant Chitinases: Molecular Targets of Selection in Plant-Pathogen Coevolution, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 97:5322-5327 (2000) hace coincidir las regiones de aminoácidos no cambiados en la secuencia distintiva de manera exacta y tiene sólo sustituciones similares en otras ubicaciones.

TABLA 5 Comparación entre la parte de una secuencia distintiva de la familia 19, quitinasa de Arabis, F285 y el homólogo de Arabidopsis más próximo con F285

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10

En resumen, los datos muestran que F285 y su homólogo de Arabidopsis más próximo son mucho más similares entre sí que con la mayoría de las quitinasas en las bases de datos de secuencias. Los datos permiten la posibilidad de que F285 y sus homólogos de Arabidopsis tengan una función algo diferente que la descrita anteriormente para las quitinasas. Lo más probable es que el cambio en la estructura proteica cerca de los sitios de unión al sustrato y en la región catalítica sea importante para la función especial y/o la función óptima de F285 y sus homólogos de Arabidopsis. Por ejemplo, estas proteínas podrían interaccionar con oligómeros o heteropolímeros de N-acetil-glucosamina encontrados en moléculas de sustratos aún no identificadas. Las posibles moléculas de sustratos incluyen moléculas de señalización o glicoproteínas que contienen homo o heterooligómeros de N-acetilglucosamina, no sólo quitina estructural en insectos u hongos (Sahai et al., "Chitinases of Fungi and Plants: Their Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction", FEMS Microbiology Rey., 11:317-338(1993).

El hecho de que se descubriera F285 analizando cambios en la expresión génica en el contexto de un acontecimiento de desarrollo particular (la iniciación y la continuación de la deposición de la pared secundaria en fibras de algodón) y se descubrieran los homólogos de Arabidopsis de F285 sólo mediante secuenciación completa del genoma de Arabidopsis sugieren que estas proteínas relacionadas con quitinasa se expresa muy pocas veces en la planta. Esta posibilidad concuerda con los datos de las transferencias de tipo Northern de diversos tejidos de algodón (figura 2). La alta identidad de aminoácidos, de especies cruzadas, de F285 y su homólogo de Arabidopsis más próximo (idéntico en un 76%; Tabla 1) sugiere de manera intuitiva que estas proteínas tienen un papel crítico, posiblemente un papel de desarrollo, en la vida de la planta. Por el contrario, las quitinasas tales como se codifican por AAF69789.1 de Arabis y Q39799 de Gossypium, que son muy distintas a F285, se han asociado de la manera más clara con papeles defensores. La existencia de los homólogos de Arabidopsis de F285 abre vías eficaces para someter a prueba la función de proteína examinando reservas de mutantes insercionales de Arabidopsis mediante técnicas de biología molecular convencionales. Además, la expresión génica podría regularse por disminución en Arabidopsis o algodón mediante la tecnología de ARNi o antisentido que son técnicas de biología molecular convencionales.

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Ejemplo 4 Ensayo de la actividad quitinasa

Para comenzar a explorar el papel biológico de la proteína relacionada de F285, se evaluó la actividad quitinasa en limbos de plantas de semillero y fibras de algodón cultivado y que creció en invernadero en presencia y ausencia de ácido salicílico (SA) y etefona (ETH), un compuesto que produce etileno. Se usaron SA y ETH para pulverizar hojas o fibras de algodón cultivado, porque estos compuestos inducen quitinasas en muchos otros sistemas (Cutt et al., "Pathogenesis-Related Proteins", en Boller eds., Genes Involved in Plant Defense, Nueva York, Nueva York: Springer-Verlag/Viena, págs. 209-243 (1992). Se pulverizaron las plantas de semillero con SA, ETH o agua (como control) 16 días tras la plantación y se recogieron las hojas y los tallos 2 días después. Se retiraron los óvulos cultivados en 1 DPA de los matraces de cultivo, se pulverizaron de manera similar en los 6 DPA y se volvieron a colocar en matraces, seguido por la recogida de las fibras en los 8 DPA. Se aplicaron gotas de extractos de tejido (10 \mug de proteína total; extraídos por métodos de Mauch et al., "Antifungal Hydrolases in Pea Tissue. I. Purification and Characterization of Two Chitinases and Two \beta-1,3-Glucanases Differentially Regulated During Development and in Response to Fungal Infection." Plant Physiology, 87: 325-333 (1998) o disoluciones control a las zonas (indicadas por 1-12 en la figura 4) en un gel de poliacrilamida que contenía glicol-quitina suspendida y se llevó a cabo la incubación para permitir la actividad enzimática durante 1 h a 37ºC. Se aplicó un avivador fluorescente, Tinopal LPW, con alta afinidad para la quitina polimérica y se excitó el gel con luz UV. Posteriormente, se detectó la actividad quitinasa en extractos de tejido midiendo la capacidad para aclarar (degradar) glicol-quitina soluble en agua suspendida en el gel de poliacrilamida (Trudel et al., "Detection of Chitinase Activity After Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Anal. Biochem., 178:362-366 (1989). Las zonas oscuras indican que se degradaba la quitina polimérica en esa ubicación de modo que el colorante fluorescente no se unía más a la misma. Por tanto, las zonas oscuras demuestran actividad quitinasa en la disolución aplicada.

El control positivo (zona 12) mostró fuerte actividad quitinasa. Los controles negativos (zonas 8 y 11) no mostraron actividad quitinasa. Todos los tejidos de algodón sometidos a prueba mostraron actividad quitinasa y no se observó inducción por SA de actividad enzimática mediante esta prueba cualitativa.

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Ejemplo 5 Inducción de la expresión de F285 en fibras por SA (sólo para referencia)

Se realizaron transferencias de tipo Northern para indicar si el promotor de F285 era sensible o no a las mismas señales inductoras de muchas otras quitinasas vegetales (figura 5). Se usó el tratamiento con agua como control negativo. Se sometieron a prueba las fibras a los 8 y 24 DPA tal como se indica mediante las etiquetas de carril y se recogió el tejido de tallos y hojas a los 18 días tras el tratamiento, si hubo alguno, a los 16 días. No se encontró ninguna inducción de la expresión de F285 en las hojas tratadas con SA o ETH o en tallos de plantas de semillero tratados con ETH. Sin embargo, se detectó una expresión débil en fibras de 8 DPA tratadas con SA, pero no tratadas con ETH o H_{2}O de óvulos cultivados (se expuso la transferencia a película durante 4 días). Estos datos sugieren que el promotor de F285 es sólo débilmente sensible a inductores de otros genes defensores y esto puede sugerir un papel de desarrollo de
F285.

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Ejemplo 6 Identificación de una posible familia de genes F285

La figura 6 muestra una transferencia de tipo Southern de ADN genómico de algodón (preparado a partir de hojas de plantas de semillero de 18 días) digerida con enzimas de restricción EcoR1 y Hind III y sometida a sondas con el ADNc de longitud completa de F285; el patrón de bandas sugiere 4-5 miembros de la familia. Con el fin de comenzar a entender la diversidad genómica y funcional de una posible familia de genes de F285, se usó un cebador de una región característica (6 repeticiones TAG) cerca del extremo no traducido en 3' de la secuencia de F285 en el examen por PCR de la biblioteca de ADNc de fibras, seguido por la clonación de los productos de PCR amplificados. Se seleccionaron tres colonias para la secuenciación de extremos del inserto, uno de las cuales se encontró que era diferente de las otras dos. Este clon, designado TAG1, se usó para la hibridación de tipo Southern (figura 6) y de tipo Northern (figura 7). La transferencia de ADN genómico usada para la hibridación de F285 se desnudó y se volvió a someter a sondas con TAG1, que hibridaban con un conjunto similar de fragmentos con diferentes intensidades de hibridación. Por tanto, F285 y TAG1 están relacionados al nivel de ADN.

Se expresó TAG1 en fibras que crecieron en invernadero a los 8 DPA (fase de pared primaria) y se regularon por aumento en fibras a los 24 DPA (fase de pared secundaria). También se detectó la expresión débil en óvulos desnudos de fibras (aunque no pueden excluirse algunas partes de fibra contaminantes) y en raíces y tallos. No se detectó la expresión en hojas. Por tanto, TAG1 tenía un patrón de expresión más amplio que F285.

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Ejemplo 7 Identificación del promotor de F285

Usando el fragmento de ADNc de F285 marcado con ^{32}P como sonda, se aislaron seis placas de una biblioteca de lambda Fix II (biblioteca especializada, Stratagene, La Jolla, CA) tras tres ciclos de selección. Se aisló el ADN del cultivo de cinco placas y se digirió con la enzima de restricción XbaI. El patrón de restricción reveló que existían al menos cuatro bandas en el ADN de cada una de las placas. La hibridación de tipo Southern mostró que sólo una banda, de 4,3 kb de tamaño, hibridaba con la sonda del fragmento de F285. Se cortó el fragmento de 4,3 kb del gel y se purificó con el kit de extracción de gel Jetsorb (PGC Scientific, Gaithersburg, MD) para la subclonación.

Se digirió el vector, pBS, con XbaI y se desfosforiló. Se realizó el ligamiento con el fragmento de 4,3 kb con la T4 ADN ligasa a 15ºC durante la noche en un volumen total de 5 \mul. Se transformaron las células competentes de DH-\alpha5 y se seleccionaron los transformantes en placas de X-gal/IPTG.

Un producto de PCR, usando la secuencia de promotor de T3 y un cebador inverso diseñado a partir del número de nucleótido 159 a 178 de la secuencia de F285 como cebadores, mostró un fragmento de 2,3 kb, lo que indica que puede cubrirse el promotor, la secuencia no traducida en 5' y posiblemente intrón/intrones. Se llevó a cabo la secuenciación con un sintetizador de oligo ADN automatizado (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA). Se diseñaron más cebadores a medida que seguía el desplazamiento sobre el cromosoma hasta que se pasó por la secuencia de promotor de T3 del vector. Se realizó una secuenciación inversa de toda la región secuenciada para garantizar la lectura correcta de la impresión del electroferograma.

<110> Haigler, Candace H.

\hskip1cm Zhang, Hong

\hskip1cm Wu, Chunfa

\hskip1cm Wan, Chun-Hua

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<120> QUITINASA QUE CODIFICA PARA UNA MOLÉCULA DE ADN DE ALGODÓN EXPRESADA PREFERENTEMENTE EN FIBRAS DURANTE LA DEPOSICIÓN DE LA PARED SECUNDARIA Y EL CORRESPONDIENTE PROMOTOR

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<130> 201304/1050

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<140>

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<141>

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 957

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<212> ADN

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<213> Gossypium hirsutum

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<400> 1

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11

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<210> 2

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<211> 318

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<212> PRT

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<213> Gossypium hirsutum

\newpage

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<400> 2

12

13

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<210> 3

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<211> 1022

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<212> ADN

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<213> Organismo desconocido

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Organismo desconocido: secuencia de promotor

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<400> 3

14

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<210> 4

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<211> 59

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (18)

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<223> X en la posición 18 es un aminoácido que es poco o muy similar a I

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 26 es un aminoácido que es poco o muy similar a E

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 29 es un aminoácido que es poco o muy similar a D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 37 es un aminoácido que es poco o muy similar a N

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 42 es un aminoácido que es poco o muy similar a I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (54)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 54 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

15

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<210> 5

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<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabis microphylla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 2 es un aminoácido que es poco o muy similar a Y

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 5 es un aminoácido que es poco o muy similar a T

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (11)

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<223> X en la posición 11 es un aminoácido que es poco o muy similar a H

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 15 es un aminoácido que es poco o muy similar a A

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 16 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (18)

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<223> X en la posición 18 es un aminoácido que es poco o muy similar a I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 31 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 38 es un aminoácido que es poco o muy similar a H

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 40 es un aminoácido que es poco o muy similar a E

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 42 es un aminoácido que es poco o muy similar a I

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 45 es un aminoácido que es poco o muy similar a N

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SIMILAR

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<222> (47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en la posición 47 es un aminoácido que es poco o muy similar a T

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (48)

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<223> X en la posición 48 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (51)

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<223> X en la posición 51 es un aminoácido que es poco o muy similar a Q

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (54)

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<223> X en la posición 54 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

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<400> 5

16

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<210> 6

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<211> 59

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<212> PRT

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<213> Gossypium hirsutum

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (1)

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<223> X en la posición 1 es un aminoácido que es poco o muy similar a T

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (5)

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<223> X en la posición 5 es un aminoácido que es poco o muy similar a T

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (9)

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<223> X en la posición 9 es un aminoácido que es poco o muy similar a S

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (11)

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<223> X en la posición 11 es un aminoácido que es poco o muy similar a H

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (15)

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<223> X en la posición 15 es un aminoácido que es poco o muy similar a A

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (16)

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<223> X en la posición 16 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (18)

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<223> X en la posición 18 es un aminoácido que es poco o muy similar a I

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (26)

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<223> X en la posición 26 es un aminoácido que es poco o muy similar a E

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (31)

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<223> X en la posición 31 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (32)

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<223> X en la posición 32 es un aminoácido que es poco o muy similar a K

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (38)

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<223> X en la posición 38 es un aminoácido que es poco o muy similar a H

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (40)

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<223> X en la posición 40 es un aminoácido que es poco o muy similar a E

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (42)

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<223> X en la posición 42 es un aminoácido que es poco o muy similar a I

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (43)

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<223> X en la posición 43 es un aminoácido que es poco o muy similar a E

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (44)..(45)

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<223> X en la posición 44 y 45 es un aminoácido que es poco o muy similar a N

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (46)

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<223> X en la posición 46 es un aminoácido que es poco o muy similar a A

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (48)

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<223> X en la posición 48 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (49)

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<223> X en la posición 49 es un aminoácido que es poco o muy similar a A

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (51)

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<223> X en la posición 51 es un aminoácido que es poco o muy similar a Q

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<220>

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (52)

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<223> X en la posición 52 es un aminoácido que es poco o muy similar a A

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<220>

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<221> SIMILAR

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<222> (54)

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<223> X en la posición 54 es un aminoácido que es poco o muy similar a L

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<220>

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<400> 6

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17

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<210> 7

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso

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<400> 7

18

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<210> 8

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia distintiva de aminoácidos supuestamente no cambiados

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<400> 8

19

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<210> 9

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Arabis microphylla

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<400> 9

20

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<210> 10

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 10

21

Claims (19)

1. Molécula de ácido nucleico aislada de plantas de algodón que codifica para una quitinasa endógena de algodón, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria y en la que la molécula de ácido nucleico:

a.

comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una quitinasa endógena de algodón y que hibrida con una molécula de ADN que tiene una secuencia según la SEQ. ID. No. 1 en condiciones rigurosas caracterizadas por un tampón de hibridación que comprende 1 x SSC a una temperatura de 61ºC;

b.

tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No. 1; o

c.

codifica para la proteína o el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No. 2.

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2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la fibra es fibra de algodón.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa en fibras de algodón comenzando de 14 a 17 días tras la antesis (DPA).

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa en fibras de algodón hasta la finalización de la deposición de la pared secundaria.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa en fibras de algodón hasta los 31 DPA.

6. Polipétido codificado por la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No. 2.

8. Constructo de ADN que comprende un promotor operativamente unido en 5' a una molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 1 a 5 y una región reguladora en 3' operativamente unida a dicha molécula de ácido nucleico, en el que dicho promotor es foráneo a dicha molécula de ácido nucleico.

9. Célula vegetal que comprende un constructo de ADN según la reivindicación 8.

10. Célula vegetal transgénica que comprende un transgén, comprendiendo dicho transgén un constructo de ADN según la reivindicación 8.

11. Célula vegetal según la reivindicación 9 ó 10, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute; kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp.

12. Planta que comprende en sus células un constructo de ADN según la reivindicación 8.

13. Planta transgénica que comprende en sus células un transgén, comprendiendo dicho transgén un constructo de ADN según la reivindicación 8.

14. Planta según la reivindicación 12 ó 13, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp.

15. Semilla vegetal que comprende un constructo de ADN según la reivindicación 8.

16. Semilla vegetal transgénica que comprende un transgén, comprendiendo dicho transgén un constructo de ADN según la reivindicación 8.

17. Semilla vegetal según la reivindicación 15 ó 16, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp.

18. Método de regulación del contenido en celulosa de una fibra vegetal que comprende la etapa de transformar una planta con un constructo de ADN según la reivindicación 8.

19. Método para proporcionar una planta que tiene resistencia frente a insectos y hongos que comprende la etapa de transformar una planta con un constructo de ADN según la reivindicación 8.