CN105524934A - 一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用。本发明提供了新型的属于糖苷水解酶系的β-1,6-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ？ID？NO.1，所编码的外膜型糖苷水解酶蛋白质氨基酸序列为：SEQ？ID？NO.2。该β-1,6-葡聚糖酶可以有效防止植物病原真菌对植物的侵染。利用该基因构建的工程菌株实现了β-1,6-葡聚糖酶基因的原核表达，并对其糖苷水解酶功能进行了验证，结果显示GluM可以有效地抑制稻瘟孢子的萌发，并能将稻瘟孢子分解。将β-1,6-葡聚糖酶基因转入到双子叶植物的模式物种拟南芥和单子叶植物的模式物种水稻中，得到的转基因植株分别显示出对灰霉和稻瘟具有较好的抗侵染效果。

Description

一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业微生物及植物保护领域，公开了一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用。

背景技术

植物病害是农作物高质优产的制约因素之一，据统计，全球因为植物病害导致的作物产量损失约占16％，每年直接经济损失多达数亿美元。在植物病害中，70％-80％的病害是由植物病原真菌侵染所引起的。植物真菌病害不仅直接造成作物产量下降和品质降低，而且部分病原真菌在侵染农作物的过程中，还能分泌多种人畜有害的毒素和代谢产物，对农产品的安全造成极大的威胁。

植物真菌病害控制难度大，生产上急需有效的控制手段，随着高效、内吸、选择性强的现代杀菌剂被开发和广泛应用，植物病害得到了一定的控制。但是也面临着植物对杀菌剂抗性越来越严重和普遍的状况，导致植物病害病害化学防治失败，农业生产遭受巨大损失。同时，杀菌剂在植物中积累，通过食物链的方式也会对动物造成危害。另外，植物抗病品种选育虽然安全可靠，但是选育过程十分耗时，因此广谱抗真菌蛋白对抗病育种提高植物抗病能力具有重要研究价值。

β-1,6-葡聚糖是真菌细胞壁中的特有结构，是专一性的抗真菌靶点。研究发现β-1,6-葡聚糖酶在生防木霉重寄生过程有一定的作用，但对其在抗真菌过程中的作用还未受到重视。到目前为止关于β-1,6-葡聚糖酶的报道也仅有少数几例，来源于TrichodermaharzianumCECT2413的一个酸性β-1,6-葡聚糖酶BGN16.3以及来源于Trichodermaharzianum的内切型β-1,6-葡聚糖酶等。β-1,6-葡聚糖是真菌细胞壁中重要的交联结构，将长链的β-1,3-葡聚糖以及外层甘露聚糖交联形成网状结构，β-1,6-葡聚糖联结的破坏将破坏整个细胞壁结构。

β-1,6-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)能够有效的裂解植物病原真菌细胞壁的重要组成成分β-1,6-葡聚糖，从而破坏真菌细胞壁的结构，裂解菌丝，达到生物防治的效果。因此这种抗菌蛋白因其诱发植物自身抗性、可行性强、无种属专一性、作用持久等特点，对抗病育种具有重要价值。同时β-葡聚糖也是白色念珠菌以及造成灰指甲的病原真菌等人源致病菌细胞壁含量最高的多糖，因此，β-1,6-葡聚糖酶同样能够破坏该类病原真菌的细胞壁结构，从而为外涂抗真菌药物的开发提供实验材料。

目前来源于微生物的β-1,6-葡聚糖酶主要来源于哈茨木霉以及放线菌，但由于其活性较低以及相关性质的限制影响其应用。因此开发高活性广谱高效抗菌β-1,6-葡聚糖酶具有重要的研究价值以及应用价值。根据报道AFP、β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶已经被成功应用到作物抗病育种中，这也为β-1,6-葡聚糖酶在抗病性作物育种方面提供了方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因，所述酶可以通过氨基酸序列基序(一级结构)、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线BLAST比对来识别。该β-1,6-葡聚糖酶为一种抗病原真菌的广谱抗病蛋白。

本发明的另一目的是提供含有该β-1,6-葡聚糖酶基因的基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。

本发明所述β-1,6-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为3222bp，G+C含量为65.8％，编码1073个氨基酸，理论分子量大小为116.13KD，等电点为5.37。

本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶基因编码的β-1,6-葡聚糖酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。所述的β-1,6-葡聚糖酶最适反应pH为7.0，最适反应温度为50℃，并在20℃-50℃(1h)和pH5.0-10.0(24h)之间保持活性稳定，该蛋白为典型的β折叠桶状结构，具有专一性水解β-1,6-葡聚糖的功能。

本发明所述的β-1,6-葡聚糖水解酶的活性分布区域为ATG起始端第79个碱基至第1500个碱基，其核苷酸序列为：SEQIDNO.4；氨基酸区域为N端第27个氨基酸至第500个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQIDNO.5。

由本发明所述的SEQIDNO.2或SEQIDNO.5序列中一个或者多个氨基酸残基取代、缺失或者添加所得到的多肽或蛋白，具有与本发明所述的GluM蛋白相同的β-1,6-葡聚糖水解酶活性的，也在本发明保护范围内。

本发明提供了β-1,6-葡聚糖酶氨基酸序列在线BLAST序列比对，并构建了该蛋白的进化树，得到来源于不同粘细菌属的与本发明的β-1,6-葡聚糖酶同源性高于50％的序列，发现相关序列均被预测为通道蛋白(TonBProtein)，与β-1,6-葡聚糖水解酶功能无关。本发明随机挑选具有代表性的九个与本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高于50％，且来源于不同种类粘细菌的同源蛋白或者假设蛋白进行异源表达功能验证，发现不同来源的同源蛋白均具有β-1,6-葡聚糖水解活性，这些蛋白也属于本发明保护范围。

含有本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶基因，所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域的重组表达载体。

本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶基因、该基因的活性分布区域、含有该基因的重组表达载体、含有该基因的宿主菌在构建抗真菌病害植物中的应用。

本发明提供了含有上述β-1,6-葡聚糖酶基因序列的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述基因序列直接转化或转导的宿主细胞。

本发明提供了一种抗植物病原真菌的转基因植株，转基因植株的构建过程包括两个主要内容：

(1)提供携带表达载体的农杆菌；

(2)所述的表达载体含有SEQIDNO.1或者SEQIDNO.4所述的β-1,6-葡聚糖酶的DNA编码序列，或者携带与SEQIDNO.2或者SEQIDNO.5所述氨基酸序列的变体、或者活性多肽片段、或活性多肽衍生物，且编码产物具备β-1,6-葡聚糖酶活性的基因序列；

转基因植株的构建过程为：将植物细胞或组织或器官与步骤⑴农杆菌接触，从而使β-1,6-葡聚糖酶基因编码序列转入植物细胞或者组织或者器官，并且整合到植物细胞的染色体。通过对上述转染的植物细胞或者组织或者器官进行再生植株后，得到含有目的基因的阳性转基因植株，对植株进行病原菌抗性鉴定，植株具有良好的抗性水平。本专利以拟南芥和水稻作为转基因对象。

本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM在植物病害的生物防治方面的应用。本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM为一种广谱抗真菌蛋白，本专利以典型的气传病害-稻瘟病菌进行生物防治实验，结果显示良好的抗性水平。

本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM优选在防治和控制植物病原真菌对植物的损害中的应用。

其中，所述的植物病原真菌对植物的损害选自半知菌亚门真菌导致的病害：黄瓜枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，卵菌门疫霉属真菌导致的病害：大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌；鞭毛菌亚门单轴霉属真菌导致的病害：葡萄霜霉病；子囊菌亚门单囊壳属真菌导致的病害：草莓白粉病；所述的植物选自小麦、玉米、大豆、水稻、黄瓜、番茄、草莓、棉花或拟南芥。

本发明提供了用于检测β-1,6-葡聚糖酶或者变体或者截短片段存在的抗体，检测为阳性且具有β-1,6-葡聚糖水解酶活性的蛋白或者肽段即为本专利所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM或者变体或者截短片段。制备该抗体所用的肽段序列为SEQIDNO.9或10或11。

专利补充说明

1.本专利描述了一种新的外膜型糖苷水解酶GluM，所述酶能够有效的水解酵母葡聚糖，昆布多糖，石耳素等以β-1,6-糖苷键连接的多糖，尤其对短链β-1,6-糖苷键连接多糖活性最好。

2.本专利所述β-1,6-葡聚糖酶GluM“变体”是指这样的蛋白，由于氨基酸的插入、缺失、突变、或取代而与本发明的参考氨基酸序列有差异。关于确定参考氨基酸序列中的哪些氨基酸残基可以取代、添加或缺失的指引，可以通过比较特定参考多肽的序列与同源多肽的序列，并使高度同源区(保守区)中被改变的氨基酸序列数目最小化，或通过用共有序列代替这些氨基酸来找到。变体蛋白可以具有被取代的氨基酸，但同时仍保留参考蛋白的功能活性。“变体”基因包括编码与参考基因编码相同的蛋白，或者与参考蛋白具有等价或相似活性的等价蛋白的核苷酸序列。在本发明中上述“参考氨基酸”、“参考蛋白”均指SEQIDNO.2所示的β-1,6-葡聚糖酶GluM。

3.在一些实施方案中，“变体”蛋白质相对于参考全长蛋白质是“截短的”。在一些实例中，截短的蛋白质保留参考蛋白质的功能活性。“截短的”蛋白质意思是指蛋白质的一部分可以被例如切掉，而剩下的截短的蛋白质在特异性表达后仍保留并显示期望的活性。

4.本领域的技术人员应当理解，许多水平的序列同一性均可用于鉴定与参考蛋白具有相同或相似功能或活性的多肽(例如，来自其它物种)。在一些实施方案中，具有例如但不限于：至少大约55％；至少大约60％；至少大约65％；至少大约70％；至少大约75％；至少大约80％；至少大约85％；至少大约90％；和至少大约95％序列同一性(当与参考多肽比较时，例如β-1,6-葡聚糖酶GluM)的变体蛋白具有与参考多肽相同或相似的功能。

5.在实施方案中，本专利所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM的存在可以通过相关技术检测植物细胞中核酸分子或多肽编码序列而实现。也可以通过相关技术检测与β-1,6-葡聚糖酶GluM具有相同功能的同源蛋白的存在而实现。例如，分子的存在可以通过多种方法加以确定，包括使用序列的引物或探针、ELISA测定检测编码的蛋白质、Western印迹检测蛋白质、或Northern或Southern印迹检测RNA或DNA。另外，可以使用本领域中常用的制备能够检测β-1,6-葡聚糖酶GluM蛋白质存在的抗体。其它技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可以用于检测特定植物器官或组织中重组构建体的存在或表达。转基因可以在植物的一些组织或一定的发育阶段中选择性表达，或者转基因可以在基本上所有植物组织中、基本上在其整个生命循环中表达。然而，任何组合表达模式也可以使用。

6.本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶全长基因gluM为在异源表达和转基因植株构建过程中为去掉N端前26个氨基酸的信号肽之后的完整基因片段，即SEQIDNO.1所示序列第79bp至3222bp。

有益效果

1.本发明以从土样中筛选出的粘细菌菌株EGB为材料，从该菌的发酵上清中纯化出一个高活性β-1,6-葡聚糖酶，比酶活高达24000U/mg，命名为GluM。通过蛋白质氨基酸测序结合PCR扩增，成功获得β-1,6-葡聚糖酶基因序列，命名为gluM。

2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为3222bp，G+C含量为65.8％，编码1073个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含NdeI和XhoI酶切位点的完整的β-1,6-葡聚糖酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体pET-29α(+)(购自Novegen公司)的NdeI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3)(购自Invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达，实现该酶的原核表达，并进行了β-1,6-葡聚糖水解酶功能验证。

4.通过对该β-1,6-葡聚糖酶进行截短表达，得到了该酶的活性分布区域。构建了β-1,6-葡聚糖酶的蛋白序列进化树，得到了与GluM同源性高于50％的的多个蛋白序列。对上述与GluM序列同源性高于50％，且来源与不同种类粘细菌和其他微生物的同源蛋白进行异源表达功能验证，发现这些来源的同源蛋白均具有β-1,6-葡聚糖水解活性。

5.将该β-1,6-葡聚糖酶全长基因通过农杆菌介导的方法转入到拟南芥中，结果发现转基因阳性植株显示出很好的灰霉抗性。

6.将该β-1,6-葡聚糖酶全长基因(79-3222bp)和活性分布区域(79-1500bp)转化到日本晴水稻中，结果发现转基因水稻阳性植株均显示出较好的稻瘟病抗性。

7.将含有β-1,6-葡聚糖酶的菌株EGB上清酶液产生β-1,6-葡聚糖酶酶制剂，该酶制剂对稻瘟病菌具有良好的生防效果。

8.含有该β-1,6-葡聚糖酶的酶制剂可用于食品工业、酿造、发酵、纺织工业、医药、农产品处理以及农业病害防治等方面。

附图说明

图1：纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图以及β-1,6-葡聚糖酶酶谱分析图。

其中1:Marker2:纯化后蛋白3：酵母平板变性酶谱分析

图2：纯化β-1,6-葡聚糖酶基本性质研究

A：底物特异性B：温度和pH对酶活影响

图3：β-1,6-葡聚糖酶基因克隆的策略图

图4：β-1,6-葡聚糖酶基因在E.coliBL21(pET-29a(+))中原核表达实验方案图

图5：β-1,6-葡聚糖酶GluM对孢子萌发的影响

a正常孢子；b7kDa超滤下液+孢子；c热失活上清酶液+孢子；d上清粗酶液+孢子；e野生菌纯化蛋白pGluM；f重组蛋白rGluM。4h：孢子附着管的形成；8h：孢子附着孢的形成

图6：含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的上清酶液对稻瘟菌侵染的防治

a正常水稻叶片b稻瘟孢子处理cEGB胞外上清酶液截留分子为10kDa的超滤下液d先接稻瘟孢子后喷洒上清酶液e先喷洒上清酶液后接稻瘟孢子f稻瘟孢子与上清酶液混合喷洒

图7：含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的上清酶液对霜霉病和白粉病的防治

A：对葡萄霜霉病的防治B：对草莓白粉病的防治

图8：β-1,6-葡聚糖酶GluM区域表达结构示意图

aGluM不同区域结构示意图；b以相同蛋白量测定不同区域的葡聚糖酶活性，以OD540值表示。

图9：β-1,6-葡聚糖酶GluM序列进化树。

GluM为一个全新的糖苷水解酶家族，定义为GH136，图为糖苷水解酶家族GH136代表性蛋白系统进化树。

图10：β-1,6-葡聚糖酶GluM的WesternBlot抗体检测。

根据β-1,6-葡聚糖酶GluM序列比对结果，随机选择三个来源于不同粘细菌种属的GluM同源蛋白进行WesternBlot检测，结果均为阳性。

图11：含有β-1,6-葡聚糖酶全长基因的转基因拟南芥(Columbia野生型)对灰霉的抗性实验

分别在4d和5d生长时间下，转基因拟南芥T-46(8)，T-17(9)和T-17(10)系列苗株对灰霉抗性验证结果，并与空载和野生型WT作为对照。

图12：含有β-1,6-葡聚糖酶GluM全长基因和β-1,6-葡聚糖酶活性区域片段基因的转基因水稻(日本晴)离体叶片对稻瘟菌侵染的抗性实验

转基因水稻对稻瘟菌侵染抗性验证试验，并与正常水稻叶片和空载野生型作为对照。

生物材料保藏信息

CorαllococcuscoralloldesEGB，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCCNO：M2012528。

具体实施方式

实施例1β-1,6-葡聚糖酶的纯化与基因克隆

1.1β-1,6-葡聚糖酶的分离纯化

将菌株Corαllococcussp.EGB(CCTCCNO：M2012528)接种至VY/4液体培养基中(VY/4培养基：0.25％酵母细胞，0.1％CaCl₂，pH7.0)，30℃摇床培养2-3d，离心收集发酵上清液，40％-80％硫酸铵梯度沉淀对上清液进行浓缩，通过DEAE弱阴离子交换柱，疏水柱，sephardexG200分子筛并结合葡聚糖底物吸附解吸等手段，纯化得到目的蛋白。通过酶谱分析(如图1)，确定SDS-PAGE蛋白电泳上分子量约为97KD的条带为目的条带。

以酵母葡聚糖，β-1,3-葡聚糖，昆布多糖，石耳素，葡聚糖BIWP2(doi:10.1016/j.carbpol.2012.12.036)，燕麦葡聚糖，纤维素，木聚糖为底物，对纯化的β-1,6-葡聚糖酶进行底物特异性分析(如图2A)，结果发现该β-1,6-葡聚糖酶对如酵母葡聚糖和葡聚糖BIWP2等短结构β-1,6-葡聚糖糖链活性最高。并以酵母葡聚糖为底物，计算出该β-1,6-葡聚糖酶的比活力，得到该β-1,6-葡聚糖酶的比活力达到近24000U/mg。同时对温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)以及pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)对该β-1,6-葡聚糖酶的活性的影响进行研究，实验结果表明该β-1,6-葡聚糖酶的最适温度为50℃，并在20℃-50℃之间保持稳定，最适反应pH为7.0，并在pH5.0-10.0保持稳定(如图2B)。

1.2β-1,6-葡聚糖酶肽指纹图谱测序

将所纯化出的β-1,6-葡聚糖酶进行SDS-PAGE蛋白电泳之后，通过酶谱确定目的条带位置，然后切胶回收，由上海博苑科技公司进行肽指纹图谱测序比对，结合肽段碎片质谱信息以及数据库检索比对，结果比对出三条Score值>60的肽段。分别为

1.DDGNTYFLGNPGSGFAK

2.DKLWFFAGFAPSFQR

3.EFNISNALSASIGLSYR

1.3β-1,6-葡聚糖酶基因的克隆

通过对肽指纹图谱测序得到的肽段信息并结合NCBI基因组信息进行ORF预测，以全长序列设计β-1,6-葡聚糖酶基因引物，以EGB菌的基因组DNA为模板，进行β-1,6-葡聚糖基因全长的PCR扩增，得到β-1,6-葡聚糖酶基因的全长序列，所用引物为F1和R。同时去掉β-1,6-葡聚糖酶的信号肽序列，设计引物进行PCR扩增，得到去掉信号肽的β-1,6-葡聚糖酶基因的全长序列，所用引物为F2和R。具体过程参照图3。

F1：catATGCCGGAGTTCGGTCGCT(NdeI)(SEQIDNO.6)

F2：catatgCAGTCCAGCGTCATCATCGG(NdeI)(SEQIDNO.7)

R：ctcgagTCACGTGGTCGGGTGACTAGAAC(XhoI)(SEQIDNO.8)

1.3.1E.coliDH10B电转感受态的制备

从-80℃冰箱中取菌种E.coliDH10B划线于新鲜的LB平板上，培养过夜，挑取单菌落接入没有添加Mg²⁺的SOB试管，37℃培养至OD600到达1.0后，以1/100的接种量接入装有100mlSOB培养基的0.5L摇瓶，18℃，220rpm培养至OD600到达0.7～0.8之间；将摇瓶置于冰浴中，冷却10min之后，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；等体积的灭菌超纯水重悬、洗涤菌体后，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；重复洗涤一次；100ml10％甘油重悬菌体，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；重复洗涤一次；小心弃上清，倒置离心瓶于灭菌吸水纸上沥干约1min。每1000ml培养物用2ml10％甘油小心重悬，每管100μl分装于离心管后迅速放入-80℃冰箱保存备用。

1.3.2酶连转化

经PCR产生的β-1,6-葡聚糖酶DNA片段与pMD19-TVector(TaKaRaCode：D102Α)按摩尔比3:1混合，在连接液作用下，16℃水浴过夜。酶连体系如下：

将10μl酶连产物加入到200μl在冰上融化后的E.coliDH5α感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后。快速转移到冰浴中冷却1～2min，向每管中加入800μl液体LB培养基，37℃摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μl感受态细胞涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，平板倒置于37℃培养箱培养。

1.3.3目的基因质粒的提取与测序

挑取1.3.2中的单菌落在含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，12000rpm离心10min收集菌体，利用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海英潍捷基生物有限公司测序。结果该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为3222bp，G+C含量为65.8％，序列为SEQIDNO.1；该基因编码1073个氨基酸。通过对该基因所编码的氨基酸序列进行分析，其N端开始后的前26个氨基酸为一个典型的信号肽，基因全长69bp，G+C含量为55.13％。

实施例2.β-1,6-葡聚糖酶基因gluM异源表达

2.1表达载体gluM-pET-29a(+)的构建

将1.3.3中提取的重组质粒和pET-29a(+)(Merck-Novαgen，CatNO.69871)用NdeI和XhoI双酶切

酶切体系：

在37℃水浴中，过夜酶切反应。酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。将回收片段酶切好的pET-29a(+)进行酶连得到含β-1,6-葡聚糖酶基因的pET-29a(+)重组质粒。

酶连好的含β-1,6-葡聚糖酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)(NBE，CatNO.C2527H)获得重组微生物E.coliBL21(DE3)，涂布含有50mg/L卡那霉素的LB平板，挑取单菌落提取质粒经测序验证基因序列无误，具体过程参照图4。

2.2β-1,6-葡聚糖酶基因在E.coliBL21(DE3)中的异源表达

2.1中经测序后接单菌至LB培养基中37℃培养至0D_600nm在0.5-0.6之间，加IPTG至浓度0.2mM，18℃继续培养24h。收集菌体用Tris-HCl(pH7.0)重悬后，用超声处理破碎菌体细胞，12000rpm离心20min，所得上清即为β-1,6-葡聚糖酶粗酶液。取适量β-1,6-葡聚糖粗酶液加至1ml含有0.5％的β-1,6-葡聚糖的Tris-HCl缓冲液中，于50℃反应30min后，通过DNS检测还原糖的生成情况。酶活单位定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量即为一个活力单位。但是由于该β-1,6-葡聚糖酶在大肠杆菌的表达量非常低，虽然能检测到酶活，但是因为蛋白量过低而无法进行纯化。

由于小规模摇瓶培养无法满足对重组β-1,6-葡聚糖酶进行纯化，因此将β-1,6-葡聚糖酶基因的重组微生物E.coliBL21(DE3)三角瓶培养作为种子液，进行50L发酵罐大量发酵培养，后续收集菌体以及破碎收集酶活同上。对产生的β-1,6-葡聚糖酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，并结合吸附解吸等纯化手段，对重组β-1,6-葡聚糖酶进行纯化，并对对纯化的β-1,6-葡聚糖酶进行透析处理，保存备用。

实施例3.β-1,6-葡聚糖酶GluM功能验证

采用产孢培养基培养稻瘟病菌，收集稻瘟孢子，来源于诱导表达后的的重组β-1,6-葡聚糖酶GluM-BL21(β-1,6-葡聚糖酶全长基因，基因序列位置：79bp-3222bp，SEQIDNO.1；氨基酸序列位置：27AA-1073AA，SEQIDNO.2；去掉信号肽)和来源于上清粗酶液的β-1,6-葡聚糖酶GluM-S与稻瘟孢子在疏水膜上进行共培养，间隔时间观察稻瘟孢子管的萌发以及附着孢的形成情况。同时以菌株上清粗酶液、上清酶液超滤下液(截留分子量10KD)以及热失活酶液作为对照处理，结果如图5。结果显示，处理4h后，与正常的稻瘟孢子对照相比，超滤下液以及热失活上清酶液不影响附着管的形成，而上清酶液，重组表达的目的蛋白以及上清纯化的目的蛋白均能够抑制稻瘟孢子附着管的形成，其中重组表达目的蛋白抑制率达到95％；处理8h后，与正常的稻瘟孢子对照相比，超滤下液以及热失活上清酶液对附着孢的形成没有影响，上清酶液，重组表达的目的蛋白以及上清纯化的目的蛋白均能够抑制稻瘟孢子附着管的形成，其中重组表达目的蛋白抑制率达到93％。说明在菌株上清粗酶液对稻瘟病原菌的裂解作用，是因为上清中含有的β-1,6-葡聚糖酶的作用，而与所含的小分子次级代谢产物无关。

基于以上实验，说明EGB上清酶液对病原真菌的抑制主要是通过β-1,6-葡聚糖酶GluM作用的，为了验证该含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的胞外上清酶液对病原真菌的实际防控作用，选取气传性病原真菌-稻瘟病菌作为供试菌，分别以不同处理作为对照：a正常水稻叶片；b稻瘟孢子处理；cEGB胞外上清酶液截留分子为10kDa的超滤下液；d先接稻瘟孢子后喷洒上清酶液；e先喷洒上清酶液后接稻瘟孢子；f稻瘟孢子与上清酶液混合喷洒，结果如图6。结果表明，超滤下液不影响稻瘟的致病性(c)，与对照(b)相比，发病情况基本相同，叶片上稻瘟病斑较多，个别斑点较大，发病严重。上清酶液处理组中稻瘟孢子的致病性明显下降，叶片上稻瘟病斑与对照相比明显减少，已发病斑点较小，发病明显减弱。从叶片的病斑数可以看出，上清酶液喷洒时间和方式上存在差别：先接稻瘟孢子后喷洒上清酶液的处理方式(d)水稻叶片上稻瘟病斑较小，但是数量依然较多；先喷洒上清酶液后接Guy11孢子的处理方式(e)水稻叶片上稻瘟病斑明显减少；上清酶液与稻瘟孢子混合喷洒的处理方式(f)效果最好，水稻叶片上几乎看不见稻瘟病斑。说明含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的胞外上清酶液对稻瘟的侵染有很好的保护作用，且这种保护作用主要是通过β-1,6-葡聚糖酶GluM起作用的。

为了验证该含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的胞外上清酶液对病原真菌的实际防控作用，本专利选取葡萄霜霉病和草莓白粉病两种病害作为酶制剂的防治对象。由于这两种真菌为活体寄生性真菌，因此本专利选取染病较为严重的葡萄苗和草莓苗作为供试苗株，以含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的胞外上清酶液喷洒的方式对选取的植物病害进行防治，结果如图7。结果表明，该酶制剂对葡萄霜霉病具有很好的防治效果，酶处理后叶片上的菌丝出现断裂和坍塌的现象(7A)，对草莓白粉病也具有较好的防治效果(7B)，酶处理后叶片上的菌丝与处理葡萄霜霉病现象相同。说明含有β-1,6-葡聚糖酶GluM的胞外上清酶液在以喷洒的方式对葡萄霜霉病和草莓白粉病两种植物病害均具有良好的防治效果，能够有效降低该植物性病害的发病率。

实施例4.β-1,6-葡聚糖酶序列分析及同源蛋白的功能验证

4.1β-1,6-葡聚糖酶GluM序列分析

通过对β-1,6-葡聚糖酶GluM序列进行NCBI在线BLAST比对显示，该蛋白与来源于不同种属粘细菌的TonB-dependentreceptor(TonB)基因序列同源性较高，而与其他已报道的糖苷水解酶没有任何的同源性，也没有典型的结构域和活性位点保守区域。通过对该蛋白的全基因进行截短表达和区域表达，发现该β-1,6-葡聚糖酶的活性区域集中在N端前500个氨基酸序列(图8)。

4.2GluM同源蛋白的功能验证

根据已报道的粘细菌全基因组序列，通过BLAST在线服务器和ClustalW程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对GluM蛋白序列进行分析，序列比对结果发现，GluM与来源粘细菌不同种属的多个TonB蛋白以及假设蛋白均有较高的序列一致性，而与现有的糖苷水解酶也没有任何的同源性，定义为一个全新的糖苷水解酶家族GH136(图9)。将其中代表性的TonB蛋白以及假设蛋白的编码基因构建表达载体，具体过程参照实施例2，并对诱导表达后的重组蛋白粗酶液进行β-1,6-葡聚糖酶活性测定，结果见表1。最终得出，来源于CorallococcuscoralloidesDSM2259的未知功能蛋白TonB-dependentreceptor(TonB)与β-1,6-葡聚糖酶GluM氨基酸序列同源性90％，通过功能验证，具备β-1,6-葡聚糖酶水解β-1,6-葡聚糖活性；来源于MyxococcusXanthusDK1622的TonB-dependentreceptor(TonB)与β-1,6-葡聚糖酶GluM氨基酸序列同源性73％，通过功能验证，具备β-1,6-葡聚糖酶水解β-1,6-葡聚糖活性；与来源于标桩菌属Stigmatellaaurantiaca的TonB-dependentreceptor一致性为65％，通过功能验证，具备β-1,6-葡聚糖酶水解β-1,6-葡聚糖活性；与来源于胞囊杆菌属Cystobacterviolaceus的TonB-dependentreceptor一致性为63％，通过功能验证，具备β-1,6-葡聚糖酶水解β-1,6-葡聚糖活性。以上结果说明了以下问题：1这些来源于不同菌株的未知功能蛋白与本专利所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM序列一致性高于50％，；2经本专利实施例4验证发现，这些来源于不同菌株的未知功能蛋白均具有与本专利所述的蛋白GluM相同的β-1,6-葡聚糖酶功能，因此可以证明这些来源于不同菌株的未知功能蛋白为本专利所述的GluM同源蛋白，应属于本专利的保护范围。

表1

菌株	蛋白及序列号	与GluM蛋白序列一致性	OD540
				Corallococcus sp.EGB	GluM	100％	1.2
Corallococcus coralloides DSM2259	TonB-dependent receptor AFE09679	90％	1.1
				Myxococcus Xanthus DK1622	Oar AAB27614	73％	0.67
Myxococcus fulvus	TonB-dependent receptor WP046711538	69％	0.55
				Hyalangium minutum	TonB-dependent receptor WP044190542	67％	0.62
Stigmatella aurantiaca	TonB-dependent receptor WP002610395	65％	0.59
				Cystobacter violaceus	TonB-dependent receptor WP043394069	63％	0.51
Archangium gephyra	TonB-dependent receptor WP047855898	63％	0.51
				Archangium gephyra	Hypothetical protein AKJ01279	63％	0.38
Chondromyces apiculatus	TonB-dependent receptor WP044245628	50％	0.36

糖苷水解酶对多糖底物的水解所产生的寡糖或者单糖具有还原性末端，在沸水浴条件下可以与DNS试剂(酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，溶解后依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml)发生显色反应，反应液颜色在540nm的吸光值的高低与酶解所产生的还原糖量成正比，即OD540值表示酶活力的高低程度。本实施例通过对基因诱导表达后的粗酶液进行活性测定，以DNS法测活并以OD540值表示，所选基因来源于不同粘细菌种属。

4.3GluM变体蛋白的功能验证

通过对本发明所述的SEQIDNO.2或SEQIDNO.5序列进行序列分析，改变其某一个氨基酸或者某一段氨基酸片段，最终得到了一个或者多个氨基酸残基取代、缺失或者添加而形成的多个氨基酸序列，并对不同改变后得到的氨基酸序列对应的基因编码序列进行诱导表达，对表达后的重组蛋白粗酶液进行β-1,6-葡聚糖酶活性测定，结果见表2。通过表达验证，这些变体蛋白均具有β-1,6-葡聚糖水解酶活性，且相应位点的改变对β-1,6-葡聚糖酶GluM活性没有影响。

表2

4.3β-1,6-葡聚糖酶GluMWesternBlot检测

根据GluM蛋白序列预测其可能的抗原决定簇，设计并合成多肽SEQIDNO.19、SEQIDNO.10及SEQIDNO.11。分别将多肽偶联KLH载体蛋白免疫新西兰白兔，经过4次免疫之后，使用抗原亲和纯化的方法获得针对多肽的特异性多克隆抗体。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对多肽的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

通过对β-1,6-葡聚糖酶GluM蛋白序列进行分析发现，GluM与来源于粘细菌以及其他菌属的多个TonB蛋白以及假设蛋白均有较高的序列一致性，说明β-1,6-葡聚糖酶GluM部分区域高度保守。对随即挑选的三个不同粘细菌来源的TonB蛋白进行抗体检测，结果显示所选三条抗体检测结果均为为阳性(图10)。结合2.4.2异源表达功能验证结果，可以说明这些来源于不同菌株的未知功能蛋白，与本专利所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM同源性高于50％，且经过WesternBlot检测为阳性的蛋白，具有与本发明所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM相同的功能，应该为属于本发明保护范围。

实施例5β-1,6-葡聚糖酶基因gluM转基因植株抗性验证

5.1gluM转基因拟南芥对灰霉的抗性验证

PCR获得β-1,6-葡聚糖酶gluM基因序列，将gluM基因连接到植物过表达载体pSUPER1300+,成功构建基因表达载体pSUPER1300+(gluM)，具体酶连转化过程参照实施例2，所用引物为：

F-5’aagcttATGCAGTCCAGCGTCATCATCG(HindIII)(SEQIDNO.12)；

R-5’ggtaccCCTAGAACGTGTACCGGACACCGAAG(KpnI)(SEQIDNO.13)

通过热激的方法将构建好的载体导入农杆菌GV3101，用转化介质重悬成菌液用于拟南芥的转化。用于转化的拟南芥是Columbia生态型。本实验采用花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥。收取转基因种子在含有25μg/ml潮霉素的抗性培养基上萌发生长，10天后挑取正常生长(根长明显较长的幼苗)的转化苗移入土壤中继续生长。

PCR检测为阳性的转基因植株经过两代自交后就能得到转基因植株纯系，抗性具有3:1的分离比，本代植株抗性为100％，并于后代植株保持100％抗性用于进一步的实验。成功转入抗真菌蛋白基因的植株进行灰霉菌胁迫试验，测定转基因植株的抗真菌侵染能力。实验结果发现成功转入β-1,6-葡聚糖酶基因gluM的拟南芥植株具有很好的灰霉抗性(图11)，说明β-1,6-葡聚糖酶在植物体内成功表达并对病原真菌显示抗性。

5.2gluM转基因水稻(日本晴)对稻瘟病抗性验证

PCR扩增出β-1,6-葡聚糖酶全长基因gluM(基因序列位置：79bp-3222bp，SEQIDNO.1；氨基酸序列位置：27AA-1073AA，SEQIDNO.2)，以及β-1,6-葡聚糖酶活性区域gluM-1500(基因序列位置：79bp-1500bp，SEQIDNO.4；氨基酸序列位置：27AA-500AA，SEQIDNO.5)通过普通酶连转化的方法将全长基因gluM以及活性区域片段基因gluM-1500连接至表达载体pCAMBIA1300s,成功构建转基因表达载体pCAMBIA1300s-gluM和pCAMBIA1300s-gluM-1500，载体构建过程参考实施例2所述。

全长基因gluMPCR扩增所用引物为：

F3222-5’ggtaccATGCAGTCCAGCGTCATCATCGG(KpnI)(SEQIDNO.14)；

R3222-5’tctagaTTATCAGAGCTCGTCCTTGAACGTGTACCGGACACCGAAGC(XbaI)(SEQIDNO.15)。

β-1,6-葡聚糖酶活性区域gluM-1500PCR扩增所用引物为：

F1500-5’ggtaccGCCACCATGGGCTTCGTCCTCT(KpnI)(SEQIDNO.16)；

R1500-5’tctagaTTATCAGAGCTCGTCCTTGATGAGGTAC(XbaI)(SEQIDNO.17)；

通过热激的方法将构建好的载体导入农杆菌EHA105。用农杆菌介导法转化至粳稻日本晴(OryzasativaL.)，PCR验证并结合Westernblot分析筛选出转基因阳性植株，并将幼苗移栽到水稻田里。采集部分水稻苗相似苗龄心叶的离体叶片，采用稻瘟孢子悬液点叶片的方法，对转基因植株进行初步的抗性验证。结果显示(图12)，与对照相比，转基因阳性植株对稻瘟病有一定的抗性，稻瘟病斑较小，说明转入抗性基因后，水稻稻瘟病原菌的侵染能力有一定的下降，达到一定的防控效果。

Claims (22)

1.β-1,6-葡聚糖酶基因，该基因全长核苷酸序列为：SEQIDNO.1。

2.权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因编码的β-1,6-葡聚糖酶GluM，其特征在于氨基酸序列为：SEQIDNO.2。

3.一种SEQIDNO.1所示β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或者与其互补的序列，其特征在于具有与SEQIDNO.1所示序列50％以上的相似度。

4.根据权利要求3所述的变体，同系物或片段，或者与其互补的序列，其特征在于与权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因核苷酸序列同源性高于50％，来自于孢囊杆菌亚目下的其他科以及粘球菌科下的其他属，且其编码产物具有β-1,6-葡聚糖酶活性功能。

5.权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域，其特征在于所述的活性分布区域为从该基因全长的ATG起始端第79个碱基至1500个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

6.权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域编码的β-1,6-葡聚糖酶截短片段，其氨基酸序列为SEQIDNO.5。

7.权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因ATG起始端的78个碱基所编码的26个氨基酸的信号肽序列，其特征在于氨基酸序列为：SEQIDNO.3。

8.权利要求2或权利要求6所示氨基酸序列的变体、或者活性多肽片段、或活性多肽衍生物；其特征在于：由SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示序列被一个或者多个氨基酸残基取代、缺失或者添加而形成的，且具有β-1,6-葡聚糖水解酶活性的氨基酸序列。

9.与权利要求2和权利要求6所述的β-1,6-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高于50％的氨基酸序列，来自于孢囊杆菌亚目下的其他科以及粘球菌科下的其他属，且具有β-1,6-葡聚糖酶活性功能。

10.用于检测权利要求2所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM、权利要求6所述的β-1,6-葡聚糖酶截短片段、权利要求8所述的变体、或者权利要求2所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM的同源蛋白或者肽段的抗体，其特征在于制备抗体所用的肽段序列为SEQIDNO.9或10或11。

11.含有权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因，权利要求3所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域的重组表达载体。

12.含权利要求11所述的重组表达载体的基因工程菌，或由权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因、权利要求3所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域直接转化或转导宿主菌所获得的基因工程菌，其特征在于以E.coliBL21(DE3)为宿主菌。

13.权利要求12所述的基因工程菌的应用，其特征在于所述的基因工程菌用于发酵产生β-1,6-葡聚糖酶或其截短片段或变体。

14.由权利要求12所述的基因工程菌转化或转导的宿主细胞，其特征在于所述细胞中含有权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因，权利要求3所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域，且宿主细胞选自植物细胞或微生物细胞。

15.一种转基因植物，其特征在于所述转基因植物基因组中稳定整合了权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因，权利要求3所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域作为异源核酸。

16.根据权利要求15所述的转基因植物，其特征在于所述植物选自小麦、玉米、大豆、水稻、黄瓜、番茄、草莓、棉花或拟南芥。

17.权利要求15或16所述的转基因植物对植物病原真菌具有抗性，能够在抵御植物病原真菌导致的病害中应用；所述的病原真菌来源于半知菌亚门真菌、卵菌门疫霉属真菌、鞭毛菌亚门单轴霉属真菌，子囊菌亚门单囊壳属真菌；所述的半知菌亚门真菌导致的病害有：黄瓜枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病等，卵菌门疫霉属真菌导致的病害有：大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌；鞭毛菌亚门单轴霉属真菌导致的病害有：葡萄霜霉病；子囊菌亚门单囊壳属真菌导致的病害有：草莓白粉病。

18.权利要求1所述的基因、权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域、权利要求11所述的重组表达载体、权利要求12所述的宿主菌在构建抗真菌病害的植物中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于所述的真菌病害选自半知菌亚门真菌导致的病害：黄瓜枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，卵菌门疫霉属真菌导致的病害：大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌；鞭毛菌亚门单轴霉属真菌导致的病害：葡萄霜霉病；子囊菌亚门单囊壳属真菌导致的病害：草莓白粉病；所述的植物选自小麦、玉米、大豆、水稻、黄瓜、番茄、草莓、棉花或拟南芥。

20.权利要求2所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM在植物病害的生物防治方面的应用。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM在防治和控制植物病原真菌对植物的损害中的应用。

22.根据权利要求21的应用，其特征在于所述的植物病原真菌对植物的损害选自半知菌亚门真菌导致的病害：黄瓜枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，卵菌门疫霉属真菌导致的病害：大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌；鞭毛菌亚门单轴霉属真菌导致的病害：葡萄霜霉病；子囊菌亚门单囊壳属真菌导致的病害：草莓白粉病；所述的植物选自小麦、玉米、大豆、水稻、黄瓜、番茄、草莓、棉花或拟南芥。