CN105200062B - 来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，属分子生物学应用技术领域，其特征在于烟草品种为小黄金，采用CTAB法提取其基因组DNA；按照Trizol试剂说明书提取其总RNA，利用M‑MLV反转录酶合成cDNA；根据GenBank已报道植物的PGIPs基因设计简并引物，PCR扩增获得NtPGIP基因片段；然后采用3’RACE和5’RACE技术获得NtPGIP全长基因。本发明采用分子生物学方法，分离鉴定了烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因；构建了烟草NtPGIP基因原核表达载体，并纯化了其表达蛋白；烟草NtPGIP基因表达蛋白能有效抑制病原菌分泌的PGs活性，抑制病菌的侵染，提高植物的抗病性，可应用于植物抗病品种的培育。

Description

来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因

技术领域：

本发明涉及来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，属分子生物学应用技术领域。

背景技术：

烟草是我国重要的经济作物，在生长过程中易受到病虫害的侵染，病害的发生严重影响了烟草的产量和质量。

近年来，烟草黑胫病的发生愈加严重，危害程度仅次于烟草病毒病，是烟草生产上最具毁灭性的病害之一。

烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)是引起烟草黑胫病的病原菌，其在侵染烟草时，首先分泌多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,PGs)，降解烟草的细胞壁，引起病害；烟草在受到病原物的侵染后，启动自身的防御系统，抵抗侵染；其中，多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibiting Proteins,PGIPs)能够特异性与PGs结合，降低其水解活性，提高植物的抗病性。

PGIPs最初在1971年由Albersheim等在菜豆下胚轴、番茄茎和桐叶槭悬浮培养细胞中发现，随后在苹果、豌豆、黄瓜、小麦、马哈利樱桃、棉花、桃等植物上分离到了能够抑制PGs活性的PGIPs。

研究发现，PGIPs可以特异性抑制病原真菌和昆虫分泌的PGs，可引起高浓度长链寡聚半乳糖醛酸(oligogalacturonides，OGs)的积累，激活寄主的防御系统，调控基因的表达，有效地阻断病菌侵染和抑制相应病程的发生与发展，增强寄主的抗病性。

研究表明，PGIPs蛋白的一级结构具有LRRs结构域，存在不同程度的糖基化，并在N端和C端存在4个高度保守的半胱氨酸残基。PGIPs的含量和分布，在时间、空间、品种和组织细胞中存在较大差异，并受到病原物、昆虫、机械损伤及水杨酸等因子的影响。

数据表明，PGIPs由复杂的多基因家族组成，且PGIPs家族的不同成员具有几乎相同的生化性质，但与不同真菌的PGs相互作用的能力不同。随后研究发现将外源PGIPs基因整合到植物基因组中，可提高植物的抗病性。

目前，PGIPs基因作为抵抗真菌病害的有效抗病基因，受到了国内外学者的青睐。将PGIPs基因转入目的植物，增强植物的抗病性，抑制病害的发生，减少农药的使用，已成为世界各国亟待解决的问题。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，并诱导其表达提高植物的抗病性。

本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。

1、烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因的克隆

烟草NtPGIP基因的克隆过程为：烟草品种为小黄金，采用CTAB法提取其基因组DNA；按照Trizol试剂说明书提取其总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA；根据GenBank已报道植物的PGIPs基因设计简并引物，PCR扩增获得NtPGIP基因片段；然后采用3’RACE和5’RACE技术获得NtPGIP全长基因。

对所克隆的NtPGIP基因进行DNA测序，其DNA序列如下：

序列表 SEQ ID NO:1

<110> 长江大学

<120> 来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因

<130> 2014

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1412

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

ccattaatag aagtattgaa tttgcttcta agttccctga tattatcacc aataagaccc 60

agcttcaaca attcctagga agcttaaatt atatttctcc ctttataaag gatttagcca 120

aagatacttc tcttctttat gatggattga agaagaatcc gaaagcttgg actgatagtc 180

atacaaatgc ttcataaaat gaaaacctct gtagtttccc ttctttattt ttcgttcttc 240

ttcctttctc aattctccac atctctctct gaaagatgca atccaaatga caaaaaagcc 300

ctcctagaaa tcaagaaagg cctaggcaat ccctatgact tgatcacatg ggatccaaaa 360

accgattgtt gtactgattg ggttgaagcc actctctcat gtgatgacaa aaacaatcgt 420

gttacttcct taaacctctt taaaattgaa gacgttggct acctctcgcc cgcgttcgga 480

gacttgccgt atctccaaag tttggacatc aataatgtgc gcaatctctc aggtccaatt 540

ccgcccacaa ttgccaaact ctcaaagctc acattcttga gaattagtca aacaaacatt 600

tcaggaccag tccctggatt tcttagtaag ttgaaaaaac taacatacat caacttgtca 660

tacaataaac tcgttggtac tatccctcct ccactttctc agctgtcaaa tctcgagttc 720

cttggtttag acaggaacaa acttactgga ccaatcccag aatccttcgg taactttgct 780

ggaaaactca cgtatcttta ccttggccac aaccaattaa ccgggtctgt gcctaaatct 840

tttggtggtt ggagtcttga gacaattgac ttgtctggaa acatgcttga aggagatatt 900

tctttcttgt ttggcaaaga taagacaaca tttcaaatgc ttttagatca taataagttt 960

gcattcgact tctcgaaggc aaagtttggg aaaagattat ggaggttgga cttgaaccat 1020

aataaaattt atgggaatct tccagcagct ataacgaaac aaccatggca gcttttcaac 1080

gtgagttata acaggctttg tgggaagatt ccacaaggtg gggaaataaa gaattatgat 1140

atttatgttt atctccacaa caaatgcttg tgtgactctc cgttgccacc ttgtaaatcg 1200

tgatgatttg ctgtcatttc tttgagaaat aagagtggat agtctactcc gtgtttttgt 1260

ggtcctaaat ctatttatgt atttgaacct ttctctttgt atgtcaatag gccagcaaac 1320

ttaagatgag gctgcctaat aagtcaagat gtgatttaag aatgacaaag ctcattgtgt 1380

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1412

烟草NtPGIP基因cDNA全长1412 bp，包含一个长186 bp的5’UTR和长209bp的3’UTR区域，其开放阅读框从187bp-1200bp，长1017bp。

NtPGIP基因编码蛋白质的氨基酸序列如下：

序列表 SEQ ID NO:2

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Leu His Lys Met Lys Thr Ser Val Val Ser Leu Leu Tyr Phe Ser

1 5 10 15

Phe Phe Phe Leu Ser Gln Phe Ser Thr Ser Leu Ser Glu Arg Cys Asn

20 25 30

Pro Asn Asp Lys Lys Ala Leu Leu Glu Ile Lys Lys Gly Leu Gly Asn

35 40 45

Pro Tyr Asp Leu Ile Thr Trp Asp Pro Lys Thr Asp Cys Cys Thr Asp

50 55 60

Trp Val Glu Ala Thr Leu Ser Cys Asp Asp Lys Asn Asn Arg Val Thr

65 70 75 80

Ser Leu Asn Leu Phe Lys Ile Glu Asp Val Gly Tyr Leu Ser Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ser Leu Asp Ile Asn Asn Val Arg

100 105 110

Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro Pro Thr Ile Ala Lys Leu Ser Lys Leu

115 120 125

Thr Phe Leu Arg Ile Ser Gln Thr Asn Ile Ser Gly Pro Val Pro Gly

130 135 140

Phe Leu Ser Lys Leu Lys Lys Leu Thr Tyr Ile Asn Leu Ser Tyr Asn

145 150 155 160

Lys Leu Val Gly Thr Ile Pro Pro Pro Leu Ser Gln Leu Ser Asn Leu

165 170 175

Glu Phe Leu Gly Leu Asp Arg Asn Lys Leu Thr Gly Pro Ile Pro Glu

180 185 190

Ser Phe Gly Asn Phe Ala Gly Lys Leu Thr Tyr Leu Tyr Leu Gly His

195 200 205

Asn Gln Leu Thr Gly Ser Val Pro Lys Ser Phe Gly Gly Trp Ser Leu

210 215 220

Glu Thr Ile Asp Leu Ser Gly Asn Met Leu Glu Gly Asp Ile Ser Phe

225 230 235 240

Leu Phe Gly Lys Asp Lys Thr Thr Phe Gln Met Leu Leu Asp His Asn

245 250 255

Lys Phe Ala Phe Asp Phe Ser Lys Ala Lys Phe Gly Lys Arg Leu Trp

260 265 270

Arg Leu Asp Leu Asn His Asn Lys Ile Tyr Gly Asn Leu Pro Ala Ala

275 280 285

Ile Thr Lys Gln Pro Trp Gln Leu Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu

290 295 300

Cys Gly Lys Ile Pro Gln Gly Gly Glu Ile Lys Asn Tyr Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Val Tyr Leu His Asn Lys Cys Leu Cys Asp Ser Pro Leu Pro Pro Cys

325 330 335

Lys Ser

该蛋白含有338个氨基酸，4个N-糖基化位点和10个重复的LRR保守序列，其中之一为典型的24氨基酸长的富含亮氨酸重复序列(LSQLSNLEFLGLDRNKLTGPIPES)。

2、外界胁迫因子影响烟草NtPGIP表达差异、以提高烟草抗病性的分析

胁迫因子为水杨酸、脱落酸、NaCl、冷冻、烟草疫霉菌等，处理8-10叶期的烟草叶片，0、4、12、24、36、48、72小时取样；按照Trizol试剂说明书提取其总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA；根据NtPGIP基因序列，设计特异引物，Real-time PCR检测烟草叶片在胁迫条件下NtPGIP基因表达差异情况。

结果显示，外界胁迫因子处理烟草叶片后，NtPGIP基因的表达程度增强，说明胁迫因子可以诱导NtPGIP表达以提高烟草的抗病性。

3、烟草NtPGIP基因抗病功能的验证

具体过程如下：构建NtPGIP基因原核表达重组质粒pET-Tpgip，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导其表达，用His Trap FF镍离子亲和层析柱纯化原核表达蛋白，并进行Western Blotting检测，分光光度法和琼脂扩散法测定NtPGIP基因原核表达蛋白对辣椒疫霉菌PGs的抑制活性。

结果显示烟草NtPGIP基因表达蛋白显著抑制了辣椒疫霉PGs的活性。

序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经与美国生物信息数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对比证实，该序列与苹果(Malus domestica，Md)、樱桃(Prunusmahaleb，Pm)、马铃薯(Solanum tuberosum，St)、海岛棉(Gossypium barbadense，Gb)、辣椒(Capsicum annuum，Ca)和巨桉(Eucalyptus grandis，Eg)的PGIPs基因具有70-80％的同源性，其中与辣椒的PGIPs基因(登录号ADH03020)同源性达79.9％。

数据库检索表明，尚未有烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其编码蛋白记录。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、采用分子生物学方法，首次分离鉴定了烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因。

2、利用基因工程技术，构建了烟草NtPGIP基因原核表达载体，并纯化了其表达蛋白，为进一步制备抗体奠定基础。

3、烟草NtPGIP基因表达蛋白能有效抑制病原菌分泌的PGs活性，抑制病菌的侵染，提高植物的抗病性，可应用于植物抗病品种的培育。

附图说明

图1为外界胁迫因子对烟草NtPGIP表达的影响。

图中：a图为低温处理烟草后NtPGIP的表达分析，36h时表达量最高；b图为烟草疫霉菌处理烟草后NtPGIP的表达分析，36h时表达量最高；c图为SA处理烟草后NtPGIP的表达分析，12h时表达量最高；d图为ABA处理烟草后NtPGIP的表达分析，4h时表达量最高；e图为NaCL处理烟草后NtPGIP的表达分析，48h时表达量最高。

图2为烟草NtPGIP基因的诱导融合表达SDS-PAGE电泳图。

图中：泳道4-8：融合蛋白pET-Tpgip分别在诱导后2h,2.5h,3h，3.5h，4h的表达，均表达出分子量约为37KD的蛋白，而空白质粒对照和未诱导的重组菌则检测不到蛋白的表达。

图3为烟草NtPGIP基因的融合表达蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图。

图中：泳道1-4：分别用20mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和400mmol/L咪唑洗脱后的产物；S:上清；P:沉淀；N:总体重组蛋白。经过多次洗脱后，获得电泳纯的重组蛋白。

图4为烟草NtPGIP纯化蛋白和重组蛋白的Western Blotting图。

图中：泳道1的纯化蛋白和泳道3的总体重组蛋白都可以特异性和anti-His一抗发生特异性识别，充分表明构建的重组质粒pET-Tpgip可成功表达融合蛋白；而对照则没有与一抗发生识别。

图5为烟草NtPGIP蛋白与辣椒疫霉菌PGs活性柱状图。

随着烟草NtPGIP蛋白浓度升高，对辣椒疫霉菌PGs活性抑制程度逐渐增强。

图6为琼脂扩散法测定烟草NtPGIP蛋白与辣椒疫霉菌PGs活性图。

图中显示随着NtPGIP蛋白浓度的增加，透明圈逐渐减小，说明烟草NtPGIP蛋白抑制了辣椒疫霉菌的PGs活性。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中的试验方法，如无特殊说明均为常规方法。

实施例1：烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因的克隆

取烟草品种小黄金的健康叶片(6叶期)，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取。cDNA合成按照M-MLV反转录酶说明书进行合成，合成的cDNA在基因扩增前于﹣80℃低温保存。根据GenBank数据上报道的苹果(JQ001783)、辣椒(HM132879)、葡萄(JN797496)、沙梨(JF727573.1)和番木瓜(HQ290129)等物种PGIPs基因设计简并引物P-F和P-R，进行烟草NtPGIP基因cDNA片段的扩增；

引物P-F，引物序列gamgacaaaa agtyctcct，

引物P-R，引物序列ccacacahct gttgtagctc ac，

PCR反应体系：ddH₂O(16.2μL)，10×buffer(2.5μL)，dNTP(2μL)，P-F(1μL)，P-R(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.3μL)，总体积25μL。PCR反应程序：94℃4min；94℃1min，50℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物回收后克隆至pMD-19T载体，挑取阳性克隆送上海博尚生物科技有限公司进行DNA测序，测序结果表明烟草NtPGIP基因cDNA片段长为814bp。

根据所得cDNA片段设计特异性引物P-GSP5和P-GSP3用来进行5’和3’RACE-PCR扩增；

引物P-GSP5，引物序列ggcttcaacc caatcagtac aacaatcgg，

引物P-GSP3，引物序列acaaccatgg cagctcttca acgtg，

cDNA第一条链的合成根据Smart RACE试剂盒说明书进行。按照如下程序进行touch-down反应：94℃4min；94℃1min，68℃45s，72℃2min，共5个循环；94℃1min，60℃30s，72℃2min，共30个循环。PCR扩增产物回收纯化后克隆至pMD-19T载体，挑取阳性克隆送上海博尚生物科技有限公司测序。将所得5’UTR和3’UTR及cDNA片段进行拼接获得烟草NtPGIP基因全长，并设计特异性引物P-ORF-F和P-ORF-R扩增烟草NtPGIP基因全长ORF(1017bp)，根据基因全长序列推测其氨基酸序列及其编码的蛋白质分子量(约35KD)；

引物P-ORF-F，引物序列atgcttcata aaatgaaaac ctc，

引物P-ORF-F，引物序列tcacgattta caaggtggca a。

实施例2：外界胁迫因子影响烟草NtPGIP表达差异、以提高烟草抗病性的分析

1)烟草叶片的处理

取生长至8-10叶期的烟草，15棵/组，分成若干组，置于光照培养箱中，16h/8h光照/黑暗培养，准备接受胁迫处理。

喷施处理：分别用等量的5mM水杨酸(SA)、100μM脱落酸(ABA)、300mM NaCL以及蒸馏水对照混以0.05％Tween20均匀喷施烟草叶面，并用塑料袋套在烟草植株上防止蒸发。

冷冻处理：将整株烟草放入4℃冰箱中。

烟草疫霉菌处理：将烟草疫霉在燕麦培养基上培养5-7天后，用打孔器打取直径为0.5cm的菌块，接种于烟草叶片，每个叶片接种4-5块菌块。

样品处理完成后，除冷冻处理外，其余均放入光照培养箱正常培养，分别隔0h、4h、12h、24h、36h、48h、72h后取样，每个处理3棵植株重复，用液氮速冻，并放入﹣80℃中保存。

2)Real-time PCR反应

按照Trizol试剂说明书提取上述处理烟草叶片的总RNA，根据M-MLV反转录酶说明书合成cDNA，合成的cDNA于﹣80℃低温保存。据已克隆到的烟草NtPGIP基因cDNA序列，设计特异性引物RT-PGF1和RT-PGR1，进行Real-timePCR反应；

引物RT-PGF1，引物序列ctagaaacat gcttgaagga ga，

引物RT-PGR1，引物序列ggcaacggag agtcacacaa。

Real-time PCR反应体系：cDNA(1μL)，AYBR Premix Ex TaqTM(10μL)，ROXreference dyeⅡ(0.4μL)，RT-PGF1(0.4μL)，RT-PGR1(0.4μL)，ddH₂O(7.8μL)，总体积20μL。Real-time PCR反应程序：95℃30s；95℃5s，58℃25s，72℃1min，共40个循环。

以不加模板为空白对照，烟草18S rRNA作为内参，其扩增引物18S-F和18S-R分别如下所示：

引物18S-F，引物序列ggatagatca ttgcaattgt tgg，

引物18S-R，引物序列ggttcaatgg acttctcgcg ac；

结果表明，烟草受到外界胁迫因子影响后，叶片内的NtPGIP表达活性明显增强。

实施例3：烟草NtPGIP基因抗病功能的验证

1)烟草NtPGIP基因原核表达载体的构建

根据已经获得的烟草NtPGIP全长cDNA序列和信号肽预测结果，设计特异性引物P-28-F和P-28-R，用以扩增烟草NtPGIP去除信号肽的部分；

引物P-28-F，引物序列gccgaattcg aaagatgcaa tccaaatga，

引物P-28-R，引物序列ccgaagcttc gatttacaag gtggcag。

为实现该片段在pET-28a(+)的正确重组和表达，分别在上游引物P-28-F上添加了EcoR I酶切位点，下游引物P-28-R上添加了Hind III酶切位点。扩增片段经克隆至pMD-19T载体序列测定后和pET-28a(+)一起进行双酶切。双酶切产物经回收、纯化后用T₄DNAligase进行连接，16℃过夜。将连接产物转化感受态DH5α后在含有50μg/mL卡那霉素平板上过夜培养。挑取单克隆在含有50μg/mL卡那霉素液体LB培养基摇培6h后提取质粒并进行双酶切鉴定和质粒PCR鉴定。经鉴定为阳性的菌株送上海博尚生物科技有限公司测序，经过测序验证正确的质粒命名为pET-Tpgip。

2)重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

将上述测序正确的重组质粒pET-Tpgip1μg转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素平板上37℃过夜培养至单克隆出现。挑取单克隆于含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中培养8h。按照1:100的比例将培养液重新接种于含有50μg/mL卡那霉素的新鲜液体LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8后，加入IPTG至终浓度为1.0mM，37℃继续培养4h，分别在2h，2.5h，3h，3.5h，4h取样用于SDS-PAGE检测。SDS-PAGE电泳分析采用分子克隆常规方法进行，分离胶浓度12％，浓缩胶浓度为5％。对照分别采用转空白质粒菌株和转重组质粒未添加IPTG诱导菌株。

将阳性重组菌在1mM/L的IPTG37℃条件下培养6h取1mL菌液12000rpm下4℃离心5min收集菌体，加入裂解液(0.1M氯化钠，0.1mM Tris-Cl0.5mM PMSF，50μg/mL溶菌酶)后在冰浴条件下进行超声波破碎至菌液澄清。然后菌液在12000rpm下4℃离心5min收集上清和沉淀。分别向上清和沉淀中加入等体积5×上样缓冲液，沸水浴5min后取20μL样品上样进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白的可溶性。SDS-PAGE分析发现，阳性重组菌诱导不同时间后均表达出分子量为37KD的融合蛋白，且主要分布在上清液中。

3)重组蛋白的纯化和Western blotting检测

将阳性重组菌在1L的摇瓶中诱导培养后，12000rpm下4℃离心15min收集菌体，进行超声波破碎。破碎后的溶液12000rpm下4℃离心15min去除沉淀后留取上清。将上清液进行0.45μm滤膜过滤后用于上柱亲和层析。先用结合缓冲液上清液加入His Trap FF镍离子亲和层析柱进行室温静置2-3h，用结合缓冲液洗(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20mM咪唑，pH7.4)平衡镍离子柱2次后，将上清上柱，室温孵育3h。然后分别用含有100mM咪唑、200mM咪唑和400mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH7.4)进行梯度洗脱。吸取20μL层析柱流出液进行12％SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测。

Western blotting检测采用以下步骤进行：将重组菌株诱导表达产物和初步纯化的重组蛋白同时在两块12％SDS-PAGE凝胶上进行电泳。一块凝胶电泳后直接染色并观察结果，另一块电泳后转NC膜进行Western blotting分析。转膜后的NC膜用含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液室温封闭1-2h，anti-His一抗用封闭液进行1000倍稀释后室温孵育2h，PBST缓冲液洗涤3次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗(1∶250稀释)孵育2h，PBST洗涤5次后，用DAB试剂盒黑暗条件下充分显色，反应终止后拍片保存。

Weatern blotting结果表明，重组菌表达的融合蛋白及进行亲和层析后的蛋白都可以特异性和anti-His一抗发生特异性识别，充分表明构建的重组质粒pET-Tpgip可成功表达融合蛋白。

4)PGs-NtPGIP活性测定

将辣椒疫霉菌接种于燕麦培养基上，28℃培养7天。从菌落边缘打10mm菌丝块，放入盛有100ml Czapek培养基的250ml三角瓶(每个菌丝块10ml培养基)。培养3-5天，培养物在12000rpm，4℃，离心30min，然后用Whatman GF/A过滤，用0.1M PH5.0乙酸钠透析浓缩即为粗PGs。

根据PGs降解多聚半乳糖醛酸生成还原性末端(醛基)及在单位时间内生成的还原性末端量与酶的催化反应速度成正比，采用3,5-二硝基水杨酸试剂显色法测定生成还原性末端的数量，从而确定PGs活力和PGIP活力。首先制作D-半乳糖醛酸标准曲线，再按照0.5％多聚半乳糖醛酸溶液0.3ml、PGs0.1ml、0.05M PH5.0醋酸缓冲液适量、使NtPGIP纯化蛋白浓度为0.0125μg/μL、0.025μg/μL、0.05μg/μL、0.1μg/μL，总体积为1ml，将反应液混匀，30℃孵育30min，加入DNS1ml，沸水浴10min，冷却，重复三次，测OD₅₇₅值。以加入灭活的PGs做阴性对照，灭活的NtPGIP蛋白作阳性对照。

结果显示，随着烟草NtPGIP蛋白浓度升高，PGs活性逐渐降低。

采用琼脂扩散法测定PGs-NtPGIP活性。首先倒琼脂板，用0.05M PH5.0醋酸缓冲液溶解0.5％多聚半乳糖醛酸和0.8％琼脂糖，每个板上打5个0.5cm圆孔。每孔加入60μL辣椒疫霉菌PGs浓缩液和适量的NtPGIP纯化蛋白和Tris-Cl(PH8.0)，使其浓度分别为0.0125μg/μL、0.025μg/μL、0.05μg/μL、0.1μg/μL，以加入40μL灭活的NtPGIP蛋白为对照。30℃孵育12h后，用0.1％钌红溶液静置染色1h左右，倒去表面残留的染色液，再用蒸馏水冲洗，观察透明圈的大小。根据透明圈的大小确定NtPGIP蛋白对辣椒疫霉菌PGs的抑制程度。

测定结果表明，烟草NtPGIP蛋白明显抑制了辣椒疫霉的PGs活性。

Claims (2)

1.来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，其特征在于NtPGIP基因的DNA序列，如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，其特征在于NtPGIP基因编码蛋白质的氨基酸序列，如序列表SEQ ID NO:2所示。