CN102731646B - 蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的基因，其具有SEQ ID NO：1中第145-297位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO：1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO：1 中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。本发明的多肽用于制备蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。

Description

蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列和应用。

背景技术

[0002] 害虫一直严重威胁着全球农作物的安全生产，每年都造成全球粮食产量约1/4的减产，经济损失巨大。在我国，农业害虫也一直是制约农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计全国病虫害发生面积年已由2000年的50亿亩/次增加至2009年的70亿亩/次。每年通过防治病虫害挽回的粮食损失约占总产的15%-20%，即便如此，每年粮食损失仍可达300亿~500亿斤。

[0003]自化学农药DDT问世以来，害虫的防治一直主要依赖化学农药，其后果是出现了害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等严重问题。人们一直探索寻找新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，随着转基因技术的出现，又提供了一种新思路去解决害虫问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，使害虫的有效控制出现了转机。据统计，全球转基因作物种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2008年的125百万公顷(其中抗虫的有46百万公顷)，增长了 70多倍，其中也产生了明显的经济与生态效应。

[0004] 但是，随着仅有单一 Bt基因抗虫Bt作物的连续种植，靶标害虫对其产生抗性的问题也随之日趋备受关注， 且在Bt棉田的美洲棉铃虫上已出现抗性迹象。为此，不少学者一方面又再去寻找发现新的Bt抗虫基因，另外还从微生物、植物和动物(主要是蝎子、蜘蛛)中挖掘具有杀虫活性的蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因植物，延缓或攻克害虫产生抗性问题。寄生蜂作为一类重要的害虫生物防治作用物，在传统生防中已得到充分肯定，在减少化学农药使用和环境污染等方面有着重要作用。寄生蜂能利用自身携带的多种寄生因子(如毒液(venom)、多分DNA病毒(polydnavirus, PDV)>类病毒颗粒(virus like particle, VLP)、类病毒纤丝(virus like filament, VLF)、卵巢蛋白(ovarian protein, OP)、畸形细胞(teratocyte)等)，以破坏寄主免疫反应,调节寄主生长发育，调控寄主血淋巴营养成分以及扰乱寄主生殖和内分泌系统等以保证其后代在寄主血腔或体表正常发育。若能将寄生蜂的寄生因子结合现代生物技术，可望用于研制新型生防制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因已成功转入烟草中，使害虫烟草天蛾(Manduca sexta)生长明显减缓，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫抑制作用(抑制血淋巴黑化)的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白基因PpKazal及其编码的蛋白质。[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

[0007] 备注说明:SEQ ID NO:2包含了信号肽。

[0008] 作为本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的改进:该多肽为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。[0009] 本发明还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的基因，其具有SEQ ID NO:1中第145-297位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者其核苷酸序列能在40_55°C条件下与SEQ ID NO:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。

[0010] 作为本发明的基因的改进:序列中包含8~66个连续核苷酸(即SEQ ID NO:1中第145-297位的核苷酸序列中8~66个连续核苷酸)。

[0011] 本发明还同时提供了上述蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的用途:用于制备蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。

[0012] 本发明还同时提供了一种提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫预防力的方法，包括用具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的基因转化十字花科蔬菜细胞，再将转化后的十字花科蔬菜细胞培育成植株。

[0013] 本发明所提供的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。

[0014] 本发明利用蝶蛹金小蜂毒腺转录组测序获得了毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂基因部分序列，设计引物利用5’ -RACE和3’ -RACE技术获得目的基因的非编码区，拼接后获得了基因的全长。获得蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal的氨基酸序列后，对其进行了多肽的化学固相合成以及原核表达后非变性条件下纯化，化学合成的PpKazal多肽及融合表达含GST标签的PpKazal都能够抑制农业害虫菜粉蝶(Pierisrapae)蛹及柑橘凤蝶(Papilio xuthus)蛹酹氧化酶前体(prophenoloxidase, ΡΡ0)的激活，阻止其形成有活性的酹氧化酶(phenoloxidase, PO),具有抑制寄主体液免疫的功能。

[0015] 本发明具体是通过以下技术方案实现的:在本发明所分离出的DNA分子包括:编码具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQ ID N0:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列。

[0016] 本发明分离出的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal包括:具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO:2序列的多肽。

[0017] 本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8_66个连续核苷酸。

[0018] 本发明DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。[0019] 在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

[0020] 在本发明中，蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码的核酸序列指:编码具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1中第145-297位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO:1序列编码框第145-297位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ ID NO:1中第145-297位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO:1所述的序列。

[0021] 还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID N0:1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列的同源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

[0022] 在本发明中蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal或多肽指:具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与天然蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal相同功能的SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加 一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又别如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal的活性片段和活性衍生物。

[0023] 在本发明中蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal保守性变异多肽指:与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

[0024] 发明还包括蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal或多肽的类似物。这些类似物与天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的差别可以是氨基酸序列上的诧异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L 一氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y 一氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

[0025] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

[0026]在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal多肽时，可以将蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal表达载体。

[0027] 如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

[0028] 在本发明中宿主细胞为原核细胞。常用的原核宿主细胞指得是大肠杆菌细胞。

[0029] 还可用Northern印迹法技术或突光定量PCR分析蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal基因产物的表达，即分析蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

[0030] 此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸编码序列的8_66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal的核酸分子。

[0031] 本发明涉及检测样品中是否存在蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

[0032] 此外，根据本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal同源基因或同源蛋白。

[0033] 本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。

[0034] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0035] 此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

[0036] 除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用化学固相合成技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City, CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接产生全长的分子。利用本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal，通过各种常规筛选方法，可筛选出蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal发生相互作用的物质,或者受体等。

[0037] 本发明在十字花科蔬菜重要害虫菜粉蝶及柑橘害虫柑橘凤蝶血淋巴酚氧化酶激活试验中具有明显的抑制作用，对菜粉蝶及柑橘凤蝶的体液免疫有明显抑制效果。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal正是对农业害虫有免疫抑制作用的新蛋白，因此，具有很大的应用价值。

[0038] 本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码的核酸序列，可按照以下方法获得: [0039] (I)蝶蛹金小蜂毒腺的解剖及RNA提取:取羽化3天左右的蝶蛹金小蜂雌蜂于冰上进行麻痹，Olympus解剖镜下用DEPC处理的水(含有RNAase抑制剂)进行解剖，收集毒腺及毒囊于盛有Trizol试剂(Invitogen)的离心管(经DEPC处理)中，按照试剂说明书抽提其总RNA。

[0040] (2) cDNA第一链的合成

[0041]米用 ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)合成蝶蛹金小蜂毒腺第一链cDNA。

[0042] (3) PCR

[0043] 利用SEQ ID NO:1中蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码的核酸序列设计引物，以蝶蛹金小蜂毒腺第一链cDNA为模板进行PCR扩增，电泳检测后DNA测序即可得到PpKazal编码的核酸序列。

[0044] 本发明涉及的序列及记号分别如下:

[0045] (I)序列特征:

[0046] (A)长度:398 bp

[0047] (B)类型:核苷酸

[0048] (C)链型:单链

[0049] (D)拓扑结构:线性

[0050] (2)分子类型:核苷酸

[0051] (3)序列描述:

[0052] 浙江大学

[0053] 蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码序列

[0054] 398

[0055] DNA

[0056]蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)

[0057] I GAAAGCAAGTCGTCTGAATAATATTATTCCATAGTGCTTCTGCTCGTGTACCAACGCAAT

[0058] 6I ACAATTTTATTCAAAATTCACGGCAAAATGAACAAGCGCTTGATATCTGTGTTCTTTATT

[0059] I MNKRLISVFFI

[0060] I2I GTCATGATTGCCATGGCATTTGGATGTGAAGAAGAACAATGTCAAAAAGTTTACAATCCA[0061] 12 VMIAMAFGCEEEQCQKVYNP

[0062] 181 GTGTGTGATAATCTAGGAAATACACACATTAATCCGTGTTTATTCAGATGTGCAGCTGAA

[0063] 32 VCDNLGNTHINPCLFRCAAE

[0064] 24I GATTATAAGGCCGAGAATGGAACAGAACTCACTATTGTCAAGTACGAGGAATGTTAGATC

[0065] 52 DYKAENGTELTIVKYEEC*

[0066] 30I ATACCTTCCGCAACATCAAAATGTAACTACAATCCGTATTATCCATGTGTAAGTTTCAAT

[0067] 361 GTTCTTGAAATAAATTGATATTTAATCAAAAAAAAAAA

附图说明

[0068] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0069] 图1为本发明的PpKazal原核表达的分离纯化图；

[0070] 注:M为标准蛋白，I道为未诱导菌株大肠杆菌BL21，2道为含pGEX-PpKazal质粒大肠杆菌BL21诱导后上清，3道为含pGEX-PpKazal质粒大肠杆菌BL21诱导后沉淀，4道为含pGEX-PpKaZal质粒大肠杆菌BL21诱导后上清过纯化柱后的流出液，5，6道为洗脱纯化柱的流出液，7道为纯化 后的融合蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal。

[0071] 图2为本发明的化学合成的和原核表达的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal/肽基因表达物对菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；

[0072] 注:阴性对照为TBS缓冲液；阳性对照I为0.5 Ug微黄滕球菌(M.1uteus);阳性对照2为0.5 Ug微黄滕球菌(M.1uteus)和0.5 Ug牛血清蛋白；合成PpKazal为含0.5 μ g微黄滕球菌和0.5 μ g化学合成的PpKazal ;表达PpKazal为含0.5 μ g微黄滕球菌和0.5 μ g表达含GST标签的融合PpKazal ;GST对照为0.5 μ g表达的GST蛋白和0.5μ g微黄滕球菌(M.1uteus);分别加入2 μ I菜粉蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，加Λ 200 μ I L-dopa (2 mM/L)在470 nm波长下测定30分钟,酹氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.0010D的量。数据采用DPS数据分析软件进行方差分析，不同字母表示有显著性差异(唐启义和冯明光，2007 )。

[0073] 图3为本发明的化学合成的和原核表达的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal/肽基因表达物对柑橘凤蝶蛹的血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；

[0074] 注:缓冲液对照为Tris-Ca2+缓冲液；蛋白对照为0.5 μ g牛血清蛋白BSA ;合成PpKazal为0.5 μ g化学合成的PpKazal ;表达PpKazal为0.5 μ g表达含GST标签的融合PpKazal ;标签蛋白对照为0.5 μ g表达的GST蛋白；分别加入2 μ I柑橘凤蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，加入200 μ I L-dopa (2 mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.0010D的量。数据采用DPS数据分析软件进行方差分析不同字母表示有显著性差异(唐启义和冯明光，2007)。

具体实施方式

[0075] 下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。[0076] 实施例1:

[0077] 1、蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal基因克隆:

[0078] 根据蝶蛹金小蜂毒腺转录组数据得到的Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂基因部分序列设计一对引物(正向引物Kaz-SP: 5’ -CATGGCATTTGGATGTGAAG-3’，反向引物Kaz-AP:5’ -TCTGTTCCATTCTCGGCCTT-3’ )以蝶蛹金小蜂毒腺cDNA为模板PCR扩增验证转录组结果，PCR获得一个约200 bp的PCR片段。PCR扩增体系和扩增条件具体如下:

[0079] PCR扩增体系为:

[0080]

[0082] 扩增条件为:

[0083]

[0084] PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，AxyAprep DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用TA克隆法连接入pGEM®-T_easy载体(Promega),送含插入片段的阳性菌落去上海博尚生物公司测序。

[0085] 测序完成后再根据序列信息设计5 ’ - RACE引物(Kaz-5 ’ - RACE Primer:5， -AGCTGCACATCTG- AATAAACAC-3，)和 3， -RACE 引物(Kaz_3，_ RACE Primer:5’ -GTGTTTATTCAGATGTGCAGCT-3’)，按照 Takara 5 ’和 3’ -RACE 试剂盒说明书进行 PCR 扩增；[0086] PCR扩增体系为:

[0087] 5’ - RACE扩增体系为:

[0088]

[0089] 3’ - RACE扩增体系为:

[0090]

总体积50 μΐ,

[0091] 5’ - RACE 和 3’ - RACE PCR 扩增条件均为:

[0092]

[0093] 切胶回收连接T载体后后送上海博尚生物公司测序。最后利用DNASTAR软件对PCR片段(即上文中PCR获得一个约200 bp的PCR片段)、3’ -RACE产物和5’ -RACE产物进行序列拼接，得SEQ ID NO:1所述序列(即序列表中的第一条序列);并利用SignalP 3.0在线预测信号肽。

[0094] 2、蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂的化学合成(委托上海波泰生物科技有限公司完成)

[0095] a、试剂

[0096] 芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸为美国SIAM公司产品；PyBOP、Wang树脂为美国SIAM公司产品；六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本进口(使用前先经茚三酮浸泡和3A分子筛脱水，并测定无游离氨基)；二氯甲烷(DCM)为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品(使用前用无水碳酸钾浸泡处理);三氟乙酸(TFA)为GEELBELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。

[0097] b.仪器

[0098] 431A型多肽合成仪为Applied biosystems产品，高效液相色谱为安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E ;冷冻干燥机(FREEZE DRYER 18)为LABC0NC0产品；质谱仪为 Finnigan LCQ。

[0099] c.制备方法

[0100] (I)肽链的合成

[0101] 肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法

[0102] Fmoc保护基团的脱除用30%六氢吡啶的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂 (三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚/三异丙基硅烷=81.5/5/5/5/2.5/1，体积比)。

[0103] 接肽前树脂处理:

[0104] ①称取200毫克Boc-Phe-Merrifield resin到砂芯过滤反应器中；

[0105] ②加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；

[0106] ③加入10%的TFA (二氯甲烷作溶剂)5毫升，室温反应2小时，以除去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；

[0107] ④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作溶剂)5毫升，2次中和PH值(B卩加入5毫升5%的三乙胺2次)后再用二氯甲烷洗涤6次，DMF洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。

[0108] 接肽在431 A自动合成仪上进行,称取30 mg Boc-Phe-Merrif ield resin放入反应器中，然后按下列量在合成仪中依次加入以下各种Fmoc-氨基酸(反应过程中加入的FMOC-氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟,在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂)。

[0109] 合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂(即本条多肽Phe-Merrifield r esin),浸泡洗漆 5 遍后加入第 2 个氨基酸 Fmoc-Lys (Boc)-OH、PyBop>HOBT, NMM,反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约10分钟，在脱除FMOC后，用DMF或二氯甲烷洗涤树脂6_9次，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行(六氢吡啶显强碱性，不利于接肽反应);

[0110] 第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc-Lys (Boc)-OH和PYBOP、相同摩尔的NMM试剂和HOBT试剂,然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Lys - Merrifield resin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余的氨基酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行18步循环后即可完成多肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其它试剂(PYBOP、NMM试剂和HOBT试剂)的量保持不变。

[0111] 接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保持在O度以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收其滤液并浓缩抽干(这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml (81.5%TFA、5%thioanisole、5%phenol、5%water、2.5%EDTU%TIS)0 25°C下搅拌反应3小时。取出过滤，收集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入10 ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得粗品约60 mg。 [0112] (2)肽链的纯化

[0113] 先采用安捷伦1100分析系统确定目标肽，使用C18反相柱子，条件为:A相为95%的水(甲醇配比，体积比，即5%甲醇水溶液)，B相为95%的甲醇(甲醇配比，体积比)，然后各加0.1 9^^TFA，常规条件:在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长:220nm，流速:lmL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。

[0114] 确定目标肽后，采用WaterseOOE纯化系统进行多肽制备:使用C18反相制备柱子，条件为:A相为95%的水(乙腈配比，体积比，即5%乙腈水溶液)，B相为95%的甲醇(乙腈配t匕，体积比)，然后各加0.1 9^^TFA，常规条件:从A相到B相为70分钟梯度。检测波长:220nm,流速:36mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，然后与分析仪器配合确定样品的目标峰，所获产物经冷冻干燥即得化学合成的多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示(即序列表中的第二条序列，备注说明:其所对应的为在SEQ ID NO:1中标有下划线的)。

[0115] 3、PpKazal原核表达及纯化

[0116] 根据已经获得的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal基因全长序列(SEQ ID N0:1)设计引物，以蝶蛹金小蜂毒腺cDNA为模板PCR扩增该基因的ORF (去除信号肽)，其中正向引物PpKazal-SP含有BamH I酶切位点(5’- CGC-GGATCC-TGTGAAGAAGAACAATGTCAAAAA-3’)，反向引物 PpKazal-AP 含有 Xho I 酶切位点(5’ - CCG-

ClCfiAf1-CTAACATTCCTCGTACTTGACAA-3’ )。

[0117] PCR 体系为:

[0118]

SXTransSlart FastPfu Buffer 10 JiI

[0119]

[0120] PCR反应条件为:94° C预变性3 min后开始如下循环；94°C变性30 s, 55° C退火30 S，72° C延伸I min ；30个循环后72° C延伸5 min。

[0121] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，TA克隆法连接入pGEM®-T-easy载体，得到的pGEM-T-PpKazal质粒转化大肠杆菌E.coli DH5 α后,用X_gal和IPTG进行蓝白斑筛选。挑取白斑，含Amp+ LB液体培养基(Amp的浓度为50 μ g/ml) 37°C震荡培养过夜，抽质粒。BamH I和Xho I (Takara)双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，用T4 DNA连接酶(Takara)将酶切片段与BamH I和Xho I双酶切后的pGEM_4T_2载体(GE)连接。得到的表达质粒 pGEM-4T-PpKazal 转化 E.coli BL21(DE3)，接种含 50 μ g/ml Amp 的 LB 平板，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养基(Amp的浓度为50 μ g/ml)过夜培养,抽质粒，BamH I和Xho I双酶切鉴定表达载体成功构建与否。挑取含表达质粒的单菌落(经过提取单菌落质粒后测序验证质粒中含有插入PpKazal序列，外在表现为在含Amp的LB固体培养基上能够生长)接种于5 ml LB培养基(含50 μ g/ml Amp)，37° C震荡培养过夜，取上述100 μ I菌液于新鲜的5 ml LB培养基中培养至OD 0.6-0.8 (约2~3 h)，加入500 mM IPTG 10μ I至终浓度0.5mM, 30° C诱导表达培养4~5 h，收集细胞，加入2 X SDS-PAGE上样缓冲液0.5 ml，沸水浴5 min, 12000 g离心10 min去除不溶物，取样10 μ I进行10% SDS-PAGE电泳检测，以未诱导的pGEM-4T-PpKazal菌液和pGEM_4T_2载体的诱导液作为对照。

[0122] 当未诱导的pGEM-4T_PpKazal菌液SDS-PAGE检测没有表达，pGEM_4T_2载体的诱导液的蛋白分子量小于诱导的pGEM-4T-PpKazal菌液，说明插入的序列在大肠杆菌中成功表达。

[0123] 含GST标签的融合PpKazal (利用pGEM_4T_2表达载体在大肠杆菌中表达)的纯化按照GST*Bind™纯化试剂盒的说明书进行。用经预先称重的离心管10，OOOg离心10分钟从液体培养体系收集细胞。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5 ml抽提试剂。室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10~20分钟。4°C下16，OOOg离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂(以及其它很多类似纯化系统)。蛋白溶液在冰上可以短时存放(2~3小时)，也可在_20°C长时间存放直至下步分析。

[0124] 柱层析步骤:(1)轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。为了避免出现气泡，往柱子中添加树脂时将吸头尖端始终置于柱子液面以下。等待树脂沉降。(2)当储存缓冲液(20%乙醇)液面降到柱床上沿以下时，用5倍体积IXGST Bind/Wash Buffer洗树脂。注意:在上样前将蛋白抽提液置于室温水浴以快速使之升温至室温。(3)待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液。将流速控制在每小时10倍柱体积为宜。如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质。收集穿过组分并置于冰上。(4)以10倍体积IXGST Bind/Wash Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上。(5)以3倍体积I XGSTElution Buffer洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续分析。(6)分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。对收集到的目的PpKazal样品用Bradford法测定蛋白浓度后，-70° C保存或立即用于下述对酚氧化酶活性的测定。

[0125]表达及纯化的具体结果如图1所示。

[0126] 4、合成及表达的PpKazal对菜粉蝶及柑橘凤蝶PPO激活抑制作用的测定

[0127] 在冰上单头取菜粉蝶蛹及柑橘凤蝶蛹血淋巴于1.5 ml预冷离心管中，立即置于冰上，在4°C下，3300g离心5分钟后，取上清于一新预冷的1.5 ml离心管中，去除血细胞，用于酚氧化酶本底的测定。

[0128] 每个样品分别取2 μ I血淋巴加入到96孔板孔里含10 μ I TBS (ρΗ7.4)和10μ I TBS里含0.5 yg微黄滕球菌(Μ.luteus)里，室温放置60分钟，加入200 μ I L-dopa(2 mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.0010D的量。选取血淋巴样品在TBS里只有很低或没有酚氧化酶活性，而在微黄滕球菌(M.luteus)里有很高的酚氧化酶活性的样品用于酚氧化酶前体(PPO)激活的实验。

[0129] 菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶前体(PPO)激活抑制试验:TBS缓冲液为阴性对照，0.5μ g微黄滕球菌为阳性对照，同时设置表达的GST蛋白0.5 μ g为GST对照，合成PpKazal中含0.5 μ g微黄滕球菌和0.5 μ g化学合成的PpKazal，表达PpKazal中含0.5 μ g微黄滕球菌和0.5 μ g表达含GST标签的融合PpKazal，每个处理中加入2 μ I菜粉蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，加入200 μ I L-dopa (2 mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.0010D的量，每个样品重复3次，数据采用DPS数据分析软件进行方差分析统计分析(唐启义和冯明光，2007)。

[0130] 具体结果如图2所示。

[0131] 柑橘凤蝶蛹的血淋巴酚氧化酶前体(PPO)激活抑制试验:以Tris-Ca2+缓冲液为缓冲液，牛血清蛋白BSA作为对照，合成PpKazal是0.5 Ug化学合成的PpKazal，表达PpKazal是0.5 μ g表达含GST标签的融合PpKazal，表达的GST蛋白0.5 Ug作为GST蛋白对照，每个处理加入2 μ I柑橘凤蝶蛹血淋巴后在室温下放置50分钟，加入200μ I L-dopa (2 mM/L)在470nm波长下测定30分钟,酹氧化酶活性单位U指每分钟变化的

0.0010D的量，每个样品重复3次，数据采用DPS数据分析软件进行方差分析(唐启义和冯明光，2007)。

[0132] 具体结果如图3所示。

[0133] 上述试验结果证明:本发明的PpKazal多肽对菜粉蝶及柑橘凤蝶的PPO激活有抑制作用。

[0134] 实施例2

[0135] UPpKazal基因植物二元表达载体构建

[0136] 利用植物二元表达载体pBI121中⑶S基因两侧花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子和NOS终止子，插入PpKazal基因构成一个完整的表达框架。本试验选用BamH I和Sac I作为酶切位点将⑶S基因代换为PpKazal，从而利用⑶S基因两侧的表达框控制PpKazal基因在拟南芥植物中的表达。

[0137] 根据蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂的ORF设计带有BamH I和Sac I酶切位点的引物，以蝶蛹金小蜂毒腺cDNA为模板PCR扩增以构建植物表达载体。引物序列为:

[0138] PpKazal-SP:TCGGGATCC TGTGAAGAAGAACAATGTCAAAAA,

[0139] PpKazal-AP: CGC GAGCTC CTAACATTCCTCGTACTTGACAA,

[0140] 其中，GGATCC为BamH I酶切位点，GAGCTC为Sac I酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成。[0141] PCR反应条件和体系等同于实例1-1 (即，反应体系中以“PpKazal-SP和PpKazal-AP"分别替代“正向引物Kaz-SP和反向引物Kaz_AP”)。PCR产物回收、连接至pMD18-T载体中，转化大肠杆菌Trans Tl感受态细胞，经Amp+抗性筛选，挑取克隆送上海博尚公司测序。提取pMD18_PpKazal质粒，利用限制性内切酶BamH I和Sac I对pMD18-PpKazal质粒进行双酶切，切胶回收小片段。

[0142] 从过夜培养的菌液中利用小量质粒抽提试剂盒(Axygen)提取pBI121质粒,利用限制性内切酶BamH I和Sac I对pBI121质粒进行双酶切，切胶回收大片段。将酶切后的PBI121质粒和pMD18-PpKazal质粒利用T4 DNA连接酶16°C连接过夜，转化大肠杆菌TransTl感受态细胞，经Kan+抗性筛选，挑取pBI121-PpKazal克隆送上海博尚公司测序(测序所得的序列如SEQ ID NO:1所述)，验证插入片段的正确性。

[0143] 2、pBI121_PpKazal 转化农杆菌

[0144] (I)农杆菌感受态细胞的制备

[0145] a、将EHA105菌株在含有50 mg/L Rif的YEP固体培养基上划线培养，28°C培养24 ~48 h ；

[0146] b、挑单克隆菌株于5ml含50 mg/L Rif的YEP液体培养基中，28°C振荡培养24_48h ；

[0147] C、将5 ml上述菌液加入到含有50 mg/L Rif的100 ml YEP液体培养基中，28°C

振荡培养5~6 h，直到OD6qq=0.8。

[0148] d、在4°C条件下，5000 rpm离心15 min，收集细胞沉淀。加入50 ml冰冷的无菌

水，悬浮细菌沉淀；

[0149] e、在4°C条件下，5000 rpm离心15 min，再用10 ml冰冷的无菌水重复操作；

[0150] f、加入10 ml预冷的10%无菌甘油，重悬沉淀；

[0151] g、离心,弃上清,用2 ml预冷的10%无菌甘油悬浮沉淀,分装并忙存于_70°C。

[0152] (2)农杆菌的电击转化

[0153] 取出电击杯，先用双蒸水洗两遍，再以75%乙醇洗I~2遍(加入75%乙醇后轻晃两次即可)，放入超净台，口向内吹干(大约为10~20分钟)，吹干后的电击杯盖上盖子放置于冰上。

[0154]自_70°C冰箱，取一支农杆菌感受态细胞，放于冰上，等其融化为液态时，于超净台中，向感受态细胞中加入2 ul pBI121-PpKazal质粒，用手轻弹混匀并放于冰上，然后以移液器转移至电击杯的中间夹缝中。打开电击仪，以吸水纸擦干电击杯外面的水，放入电击杯，并将齿轮旋转至紧。调节电击参数(1440 HV, 125 Ω，50 uF)，电击完毕后放置于冰上2~3分钟，然后轻轻地向电击杯加入800 ul LB培养基，轻轻地用移液器吹几下然后转移至EP管中。

[0155] 28°C静置培养48小时，4000 rpm离心5分钟，然后涂含有Kana抗生素的平板。长出的菌落先在另一块平板上划线，再继续生长24小时后，进行PCR验证，因为农杆菌所含质粒拷贝数很低，PCR的循环数要设置为40个循环。

[0156] 3、农杆菌转化拟南芥

[0157] 拟南芥的转化采用花粉管通道法(Clough and Bent 1998)。具体过程如下:

[0158] 挑取生长LB固体培养基上含pBI121_PpKazal的农杆菌单菌落，于4 ml的LB液体培养基中培养过夜，按照1:500的比例扩大培养。待菌液的OD6tltl吸收值达到0.6~1.0时,4000 rpm离心5分钟收集农杆菌。

[0159] 以5%的蔗糖溶液重悬农杆菌，将菌液稀释至OD6tltl约为0.5~0.8左右，在使用前加入0.03%的表面活性剂Silvet L-77。选取生长状态良好的拟南芥，将拟南芥的花蕾浸泡在农杆菌液体中20秒钟。以不透明的塑料布遮光保湿24小时，然后转移至光照培养箱中

继续培养。在一周以后重复转化一次。

[0160] 转化后的拟南芥可以放于长日照条件下，使得其快速生长结种子，收取Ttl代种子。

[0161] 4、转基因拟南芥的鉴定

[0162] (1)转基因植株的卡那霉素抗性筛选

[0163] a、取收获的Ttl代种子拟南芥种子约100 mg放入到一个1.5 ml离心管中；

[0164] b、用70%的酒精消毒5秒，短暂离心后弃上清；

[0165] C、用10% NaHClO3消毒2~3分钟，短暂离心后弃上清；

[0166] d、加入灭菌的蒸馏水重悬离心弃上清，洗数次；

[0167] e、加入I ml无菌的0.1%琼脂糖溶液悬浮种子；

[0168] f、把拟南芥种子铺在含50 mg/L Kan+的1/2 MS培养基上；

[0169] glC低温春化2~5天；

[0170] h、移至拟南芥正常条件下培养，一周后，将出现抗Kan+的拟南芥苗，将抗性苗移栽到土:蛙石=1:1的花盆中，放到培养室中生长，收集T1代种子。

[0171] (2)拟南芥的PCR鉴定

[0172] 取T1代拟南芥幼苗嫩叶，提取植物基因组DNA，具体方法如下:

[0173] a、采集T1代幼叶I片于1.5 ml的离心管中，注入液氮，将样品研制粉末；

[0174] b、向装有样品的离心管中加入750 μ I提取缓冲液，迅速震荡混匀，将离心管置于65°C保温 8 ~IOmin ；

[0175] C、加入150 μ l 5Μ LiAc，轻缓的混匀，冰浴15~20min ；

[0176] d、在 4°C条件下 13000 rpm 离心 10 min ；

[0177] e、将800 μ l上清液转入一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，_20°C沉淀10 min ；

[0178] f、在 4°C条件下 13000 rpm 离心 10 min ；

[0179] g、用75%乙醇洗涤沉淀，晾干；

[0180] h、将沉淀溶于10 μ l TE缓冲液中；

[0181] 1、将提取的DNA样品稀释5~10倍作为PCR反应模板，按实例1_1方法进行PCR反应，鉴定Tl代转基因情况。

[0182] 用携带重组质粒pBI121_PpKazal的农杆菌花粉管法转化了 70株野生型拟南芥植株，每株收获几千粒种子。通过卡那抗性基因的表达来初步筛选出已经导入外源基因的种子，洒播了约5.3万粒的种子，最后得到了 84粒具有卡那抗性。通过塑料袋包裹使植株自花授粉，获得T1代种子，继续回交培养到T3代纯合子，用于后续分析。

[0183] 5、转PpKazal基因拟南芥植株的抗虫分析

[0184] 分别取10头2龄左右的菜青虫放到15 cm培养皿中，培养皿中放置浸湿的棉团保湿。每个培养皿中加入等量的莲座8片叶期转PpKazal拟南芥和野生型拟南芥的叶片任其取食，每个处理设置3个重复，记录各个处理存活和死忘虫数及幼虫生长状况，及时更换新鲜的叶片，统计菜青虫的死亡率。饲喂5天后，取食转PpKazal拟南芥叶片的菜青虫死亡率为42%，明显高于对照的死亡率5.7%，说明转PpKazal拟南芥能够抑制菜青虫的存活，对菜青虫有毒杀作用。预计蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpKazal转入其他十字花科蔬菜如甘蓝等对菜青虫等鳞翅目害虫有防治作用。

[0185] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有 变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其特征是:为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的基因，其特征是:为SEQ ID NO:1中第145-297位的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的用途，其特征是:用于制备蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。

4.一种提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫预防力的方法，其特征在于:包括用为SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列的基因转化十字花科蔬菜细胞，再将转化后的十字花科蔬菜细胞培育成植株；所述十字花科蔬菜为拟南芥。`