CN101328479A - 蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5及其编码的核酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp－AP5编码的核酸序列，所分离出的DNA分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp－AP5活性的多肽核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329－454位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者该核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329－454位的核苷酸序列杂交。本发明还同时公开了一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp－AP5，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp－AP5具有抗菌性能。

Description

蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5及其编码的核酸序列

技术领域

本发明涉及分子生物学、以及基因工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂中表达的抗菌肽Pp-AP5及其核酸序列。

背景技术

近年来，由于药物的滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，现有的抗生素药物正在失去原来的疗效，从而引发了人们对食品安全的关注，越来越多的国家开始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽(antibacterial peptides)因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们的极大的研究兴趣，成为分子生物学和生物化学研究领域的热点之一。各国的研究人员已经从哺乳动物及昆虫、两栖动物等中发现了几百种抗菌肽，其中有些已经分离提取了出来，并对其结构、抗菌活性等作了许多的研究，发现其抗菌活性高效、广谱，并且本身无毒、无害，对细菌、病毒、某些原虫、真菌及肿瘤细胞等具有选择性杀伤作用。

自1980年瑞典斯德哥尔摩大学Boman研究小组，首次由大肠杆菌注射诱导处理的惜古比天蚕蛾滞育蛹血淋巴中提纯得抗菌肽以来，国内外许多学者就昆虫源的抗菌肽已做了大量的筛选、活性测定，基因克隆与表达等工作，且明确昆虫抗菌肽可分成天蚕素(cecropins)、防卫素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-rich antibacterialpeptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich antibacterial peptides)(Brey&Hultmark，1998)。

作为地球上种类最多的生物，昆虫具有繁殖快、适应性广的特点，除海洋外，所有生态环境都有昆虫的分布。自19世纪起，昆虫就被作为免疫防卫系统的研究对象。尚存于地球上的昆虫都是在剧烈的生存竞争中取得胜利后才生存下来的，它们在进化的过程中增强了抵抗各种病原菌侵染的能力，这就为我们筛选具有抗菌作用的昆虫抗菌肽及其目的基因提供了丰富的基因资源库，众多研究人员从不同的昆虫中发现了数百种抗菌肽。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗菌性能的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5及其编码的核酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列，所分离出的DNA分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列杂交。

作为本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列的改进：该序列具有SEQID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列。

作为本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列的进一步改进：该序列包含8～126个连续核苷酸。

本发明还同时提供了一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

作为本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的改进：蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。

本发明所提供的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5及其编码的核酸序列，使其能够应用在蝶蛹金小蜂中表达的新的抗菌蛋白、编码序列及其在开发成有应用价值的食品添加剂和药物并应用于农业、工业和食品卫生等多个领域。

本发明的优点在于：本发明通过基于cDNA表达性文库的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白/肽基因的构建及高效克隆筛选方法，以蝶蛹金小蜂为实验材料，筛选其体内表达的抗菌蛋白。该方法鉴于潜在抗菌蛋白/肽目的表达物能致死本身宿主菌的特点，将潜在抗菌蛋白/肽的蝶蛹金小蜂的基因的表达与表达物抗菌活性初步测定紧密相合，进行筛选。当筛选到表达物能使宿主菌死亡的克隆时，也就获得了相应的源于蝶蛹金小蜂的插入之文库中的目的基因。

具有抗菌作用基因的质粒转化入SOLR菌后，在诱导剂IPTG(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的诱导下基因表达后产生抗菌的蛋白/肽，致使菌体的细胞膜收到破坏，从而允许染料分子进入细菌细胞，发生显色反应，即观察发现蓝色的克隆。所以，这些被染成蓝色的克隆就是含有抗菌基因的克隆。将它们挑出后测序，就可得到相应的基因序列及其编码的相应的抗菌蛋白。

本发明是通过以下技术方案实现的：在本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ IDNO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列。

本发明分离出的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-126个连续核苷酸。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5(或多肽)编码序列指：编码具有该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中第329-454位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列编码框第329-454位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ ID NO：1中第329-454位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5或多肽指：具有该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与天然该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又别如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的活性片段和活性衍生物。

在本发明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5保守性变异多肽指：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr

Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5或多肽的类似物。这些类似物与天然抗菌多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5多肽时，可以将该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5表达载体。

如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为原核细胞。常用的原核宿主细胞指得是大肠杆菌细胞。

还可用Northern印迹法技术分析该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5基因产物的表达，即分析该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5核苷酸编码序列的8-126个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5同源基因或同源蛋白。

为了得到与蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5基因相关的昆虫cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选蝶蛹金小蜂cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自蝶蛹金小蜂的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域总所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clonetech，Stratagene，Palo Alto......，这种筛选方法也可以识别与该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的基因家族的核苷酸序列。

本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接产生全长的分子。利用本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5，通过各种常规筛选方法，可筛选出该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或抗拮剂等。

本发明在抗性试验中具有明显的作用，对抑制细菌的生长有明显效果。我国拥有众多昆虫种类，却很少从其体内发现新的抗菌肽，本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5正是具备抗菌作用的新的蛋白，因此，具有很大的应用价值。

本发明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列，可按照以下方法获得：

(1)蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5基因的cDNA(互补脱氧核糖核酸)，表达性文库的构建：

自蝶蛹金小蜂分离总RNA，提取poly(A)+RNA，克隆构建得蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5基因的cDNA表达性文库；

(2)cDNA表达性文库的筛选：

a、制备SOLR菌液；

b、将原噬箘体文库转化入制备好的SOLR菌液中并测定效价；

c、制备LB/Amp+滤膜平板；

d、取已转化的SOLR菌液铺板，先在0.45毫米的琼脂糖/氨苄青霉素微孔滤膜平板上涂板，37摄氏度倒置培养15小时左右至膜上有较小的菌落形成；再转移至琼脂糖/氨苄青霉素/异丙基-b-d-硫代半乳糖苷培养基，37摄氏度倒置培养3～4小时，至菌落生长到正常大小(1毫米左右)，转至染色琼脂培养基，染色10分钟左右；同时与未经异丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养的作对照；挑取蓝色菌落，于100微升含20％甘油的琼脂糖/氨苄青霉素培养液中，零下70摄氏度贮存，得蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5基因。

上述步骤(1)中：总RNA自昆虫的整体或特定器官分离得到；采用纯化mRNA试剂盒获得poly(A)+RNA；采用cDNA合成试剂盒、

合成试剂盒和Gigapack III克隆试剂盒(由美国clontech公司Takana代理处购得，无中文名称)构建得cDNA表达性文库。

上述步骤(2)的d中：染色琼脂培养基按××百分比(按照如下百分比配制)：苔酚蓝0.0005％(0.005％)，溴酚蓝0.0005％(0.005％)，琼脂0.4％(称取0.5g苔酚蓝和0.5g溴酚蓝，分别溶解于9.5克水中，从而分别配成5％的苔酚蓝母液和溴酚蓝母液。另称取4克琼脂溶于1L水中，加热使其彻底溶解；加入1毫升苔酚蓝母液和1毫升溴酚蓝母液，使得两种染料的终浓度为0.005％，混匀后放置半小时使其冷却凝固即可。)。SOLR菌液cDNA合成试剂盒中自带该SOLR菌液。

步骤(2)的原噬箘体文库是(1)中所构建的cDNA表达性文库。

按照下列配方配制琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板：琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升。120摄氏度高温高压灭菌后冷却至50摄氏度左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素(Amp)母液(自配)1毫升，摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭菌过的微孔滤膜(孔径为0.45微米，购于河北省保定市万科实验仪器贸易有限公司)，此即琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板。

按照下列配方配制琼脂糖/氨苄青霉素/异丙基-b-d-硫代半乳糖苷培养基：琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升。120摄氏度高温高压灭菌后冷却至50摄氏度左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素(Amp)母液(自配)1毫升，0.5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)母液(自配)1毫升，摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后即琼脂糖/氨苄青霉素/异丙基-b-d-硫代半乳糖苷培养基。

本发明涉及的序列及记号分别如下：

(1)序列特征：

(A)长度：685bp

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(2)分子类型：核苷酸

(3)序列描述：

浙江大学

685

DNA

蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)

GCAAACCGCC TCTCCCCGCG CGTTGGCCGA TTCATTAATG CAGCTGGCAC GACAGGTTTC    60

CCGACTGGAA AGCGGGCAGT GAGCGCAACG CAATTAATGT GAGTTAGCTC ACTCATTAGG    120

CACCCCAGGC TTTACACTTT ATGCTTCCGG CTCGTATGTT GTGTGGAATT GTGAGCGGAT    180

AACAATTTCA CACAGGAAAC AGCTATGACC ATGATTACGC CAAGCTCGAA ATTAACCCTC    240

ACTAAAGGGA ACAAAAGCTG GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGA ACTAGTGGAT    300

CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGCACGAG GGA AAA TGG GGT TGG ATT TAT ATA       352

                               Gly Lys Trp Gly Trp Ile Tyr Ile

                                1               5

ACA ATA CTT TTT GCT GAT GTG GGT GGG TTC AAG AGT TCA AGA CAT CCT      400

Thr Ile Leu Phe Ala Asp Val Gly Gly Phe Lys Ser Ser Arg His Pro

    10                   15                  20

GAA GAA AGA AGA GTT CAA GAA AGA AGA TTC AAG AGG ATT ACC AGG GGA      448

Glu Glu Arg Arg Val Gln Glu Arg Arg Phe Lys Arg Ile Thr Arg Gly

25                  30                   35                   40

CCC GAT TAA CTTAGAAATA CCTTTTGTCT GATAAAAATT GCATTTCGCGT TCGGTCACAG  508

Pro Asp

TAAATATCCC GTTGTTAAAA TATACAAGAC ATGGAAGGCG TTCGACTTAT GATGTAACTC    568

TCATAAGTCA TTAAAATTTG GTATAAGAGA GCATAAAATA TAATGGCGCT GGATACTTGG    628

CCAGTTAATA TACTGAATAA GTATAAACGG GTTGTTGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA       685

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的实施例的基于cDNA(互补DNA)表达性文库的昆虫源抗菌肽基因的高效克隆筛选技术方案示意图；

图2是本发明的实施例的筛选时滤膜上的SOLR菌菌落图；

注：在大量白色菌落中有形状较小的蓝色菌落，即是包含具潜在抗菌活性的目的基因；

图3是本发明的实施例的用纸片法测试合成的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5基因表达物对SOLR菌的抑制效果图；

图中：“1”代表100微摩尔样品；“2”代表10微摩尔样品；“3”代表1微摩尔样品；“4”代表1mM氨苄青霉素对照；“5”代表1mM样品物。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：(参照图1：)

1.蝶蛹金小蜂cDNA(互补DNA)表达性文库的构建

蝶蛹金小蜂来源于浙江大学昆虫科学研究所昆虫生理生化实验室。

a、自蝶蛹金小蜂的整体分离总RNA，以纯化mRNA试剂盒获得poly(A)+RNA，再采用cDNA合成试剂盒、

合成试剂盒和

Gigapack III克隆试剂盒(由美国clontech公司Takana代理处购得，无中文名称)构建得cDNA(互补DNA)表达性文库。

b、根据，参照试剂盒操作说明进行各步操作，即构建得cDNA(互补DNA)表达性文库。

2.蝶蛹金小蜂cDNA(互补DNA)表达性文库的筛选

a、制备SOLR(大肠杆菌的一种，无中文名)菌液：接菌环在酒精灯上灼烧至红，冷却后蘸取少量大肠杆菌SOLR甘油菌(菌液和甘油的混合物，甘油的体积比约为20％，有利于菌液在低温下保存而不影响其正常活性)于含卡那霉素的琼脂糖培养基上划线，37摄氏度培养12小时。挑取单菌落于50毫升的琼脂糖丰富培养基(LB营养琼脂)中，37摄氏度，200转/分(rpm)培养12小时左右。转移至50毫升离心管中，1000转/分，4摄氏度离心10分钟。去上清液，再用10毫摩尔的硫酸镁溶液悬浮沉淀，调解OD600值为1.0。

b、制备琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板：制备含100微克/毫升的氨苄青霉素的琼脂糖平板若干。LB/Amp⁺滤膜平板的制备方法如下：

按照下列配方配制LB培养基：琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升；均匀混合后，120℃高温高压(0.4Mpa)灭菌后冷却至50℃左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素母液1毫升；摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭菌过的孔径为0.45微米的微孔滤膜，即得LB/Amp⁺滤膜平板；即取已灭菌的滤膜(孔径0.45μm)铺于LB/Amp⁺平板上，注意膜与平板之间无气泡。

c、将原噬箘体文库转(即步骤1所构建的cDNA表达性文库)化入制备好的SOLR菌液中并测定效价：将原噬箘体文库加双蒸水稀释50倍，分别取稀释过的菌液1微升于于步骤(a)所得的200微升SOLR菌液中，37摄氏度温育15分钟，取100微升在琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板上涂板，用在酒精灯上灼烧并冷却过的三角棒涂开，正面向上放置20分钟后37摄氏度倒置培养12小时。

查看细菌生长情况，从而决定转化反应体系中原噬粒文库的稀释倍数，由于稀释50倍及100倍后转化效果不好，使得生长浓度较低(每块培养基上应该生长数千个克隆)从而不稀释。取100微升的昆虫噬粒(即我们自己构建的昆虫的cDNA表达性文库)于2毫升步骤(a)所得的SOLR菌液中，37摄氏度温育15分钟，取100微升在琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板上涂板，用在酒精灯上灼烧并冷却好的三角棒涂开，正面向上放置20分钟后37摄氏度倒置培养12小时，查看结合效果。将上步所得的昆虫噬粒与SOLR的结合产物2毫升置于50毫升琼脂糖丰富培养液(LB营养液)中，37摄氏度，200转/分振荡培养4～5小时，至稠，再取100微升在琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板上涂板，37摄氏度倒置培养12小时，测定效价。将上步所得的50毫升菌液按20％比例加入甘油，摇匀后分装成1毫升/管，于零下70摄氏度贮存备用。

按100倍、1000倍和10000倍的比例稀释上述菌液后，各取100微升在琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板上涂板，正面向上放置20分钟后37摄氏度倒置培养12小时。观察膜上菌落生长情况以找出最佳倍数。

通过测定效价和最佳稀释倍数。找出最佳反应菌液体积，即100微升/板，培养后每块LB滤膜平板上有几千个菌落。

d、铺板、染色：

取零下70摄氏度贮存的已转化的SOLR菌液100微升在琼脂糖/氨苄青霉素滤膜平板上涂板，正面向上放置20分钟后，于37摄氏度倒置培养15小时左右至膜上有较小(一般为0.1～0.5mm)的菌落形成。再转移至琼脂糖/氨苄青霉素/异丙基-b-d-硫代半乳糖苷培养基(LB/Amp⁺/IPTG⁺培养基)，37摄氏度倒置培养3～4小时，至菌落生长到正常大小，转至染色琼脂培养基，染色10分钟左右，参见图2，仔细观察后用灭菌牙签挑取蓝色菌落，于100微升含20％甘油的琼脂糖/氨苄青霉素培养液中，并记录挑取的菌落大小及染色深浅情况，涡旋振荡混匀后分成两管，在两管上标上相同的号码，如PP1a，零下70摄氏度贮存。

上述染色琼脂培养基的制作方法如下：称取0.5g苔酚蓝和0.5g溴酚蓝，分别溶解于9.5克水中，从而分别配成5％的苔酚蓝母液和溴酚蓝母液；另称取4克琼脂溶于1L水中，加热使其彻底溶解，再加入1毫升苔酚蓝母液和1毫升溴酚蓝母液，混匀后放置半小时使其冷却凝固即可。即所得染色琼脂培养基为：苔酚蓝0.0005％，溴酚蓝0.0005％，琼脂0.4％。

上述LB/Amp⁺/IPTG⁺培养基的制备方法如下：

按照下列配方配制LB培养基：琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升；均匀混合后，120℃高温高压灭菌后冷却至50℃左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素母液1毫升，0.5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后，即得LB/Amp+/IPTG+培养基。

e、涂板法验证：

取出上述d步骤保存的PP1a菌液样品，置于冰上。吸取5微升涂于LB/Amp⁺/IPTG^-及LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜平板，正面向上放置10分钟后37摄氏度倒置培养12小时。

LB/Amp⁺/IPTG^-滤膜平板的制备方法如下：

按照下列配方配制LB培养基：琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升；均匀混合后，120℃高温0.4Mpa灭菌后冷却至50℃左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素母液1毫升；摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭菌过的孔径为0.45微米的微孔滤膜，即得LB/Amp⁺/IPTG^-滤膜平板。

LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜平板的制备方法如下：

按照下列配方配制LB培养基：琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升；均匀混合后，120℃高温高压灭菌后冷却至50℃左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素母液1毫升，0.5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭菌过的孔径为0.45微米的微孔滤膜，即得LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜平板。

将膜取下置于染色琼脂培养基上染色，比较膜上同一样品菌落生长的大小、密度、着色度及在LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜平板上的菌落是否呈现统一颜色的情况，将详细情况进行记录。将新挑出的菌落(PP1b)保存于100微升含20％甘油的琼脂糖/氨苄青霉素培养液中，涡旋振荡混匀后分成两管，在两管上标上与原样品相同的号码，如PP1b，b表示是涂板法验证后重新挑取的菌液样品，零下70摄氏度贮存。根据染色的不同情况，作出不同的处理：

①如果两张膜上的菌落均不被染成蓝色，则说明此样品不含杀菌作用的基因，可丢弃该样品。

②如果菌落在LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜上被部分染成蓝色，而在LB/Amp⁺/IPTG^-不染色，说明挑取的样品具有杀菌作用的基因，但此样品混合了其他不含杀菌作用基因的克隆，则挑取LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜上被染成蓝色的单菌落于100微升含20％甘油的琼脂糖/氨苄青霉素培养液中，涡旋振荡混匀后分成两管，在两管上标上与原样品相同的号码，如PP1b，b表示是划线法验证后重新挑取的菌液样品，零下70摄氏度贮存。

③如果菌落在LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜上被全部染成蓝色，而在LB/Amp⁺/IPTG^-上不染色，说明挑取的样品具有杀菌作用的基因，且此样品只含有该种克隆，则挑取在LB/Amp⁺/IPTG^-上的无色单菌落于含20％甘油的100微升琼脂糖/氨苄青霉素培养液中，涡旋振荡混匀后分成两管，在两管上标上与原样品相同的号码，如PP2b，零下70摄氏度贮存。

④如果菌落在LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜上被部分染成蓝色，而在LB/Amp⁺/IPTG^-膜上也有部分被染成蓝色，说明挑取的样品含有杀菌作用的基因，且该基因在没有异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导的情况下也能表达从而产生杀菌效果；但此样品混合了其他不含杀菌作用基因的克隆，处理方法同②。

⑤如果菌落在LB/Amp⁺/IPTG⁺及LB/Amp⁺/IPTG^-两张滤膜上全部被染成蓝色，说明挑取的样品含有杀菌作用的基因，且该基因在没有异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导的情况下也能表达从而产生杀菌效果，且此样品只含有该种克隆，因此只需保存原先保存的样品，不用再挑取新的菌落。

对于还没有纯化的样品如情况②和④还需进行再次涂板，直至在LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜平板上呈现统一的蓝色为止。蓝色是因为该菌落中昆虫源基因表达的蛋白/肽能使SOLR菌死亡，死亡的细胞被苔酚兰染色成蓝色，否则为白色。

3.抗菌活性的初步验证

液体抑菌实验

a、取保存的菌液样品(经上述步骤⑤验证后保存的菌液)涂于LB/Amp⁺/IPTG^-及LB/Amp⁺/IPTG⁺滤膜平板，培养过夜后转至染色琼脂培养基染色，如果LB/Amp⁺/IPTG⁺板上的克隆全部染色，则挑取LB/Amp⁺/IPTG^-板上白克隆5～10个；如果LB/Amp⁺/IPTG⁺板上的克隆不是全部染色的话，说明菌样在保存后经过多次操作，可能已经不纯，则挑取LB/Amp⁺/IPTG⁺板上的染色克隆5～10个。

b、将挑取的克隆接入5豪升LB/Amp+培养液，37℃、200rpm震荡培养10h左右，使细菌的OD600达到1.0左右。

c、取上述菌液(即OD₆₀₀达到1.0左右的菌液)30μl于3ml琼脂糖/氨苄青霉素培养液(氨苄青霉素新鲜加入)中，(每个样品接4管，2管LB/Amp⁺/IPTG⁺，2管LB/Amp⁺/IPTG^-)。分别培养2，3，4小时后测OD600(经常观察，当琼脂糖/氨苄青霉素的菌液的OD600值大致在0.5左右时测其值)。通过观察发现，琼脂糖/氨苄青霉素/异丙基-b-d-硫代半乳糖苷的菌液与琼脂糖/氨苄青霉素的菌液相比较为澄清，或者有沉淀出现，而琼脂糖/氨苄青霉素的菌液则呈现出絮状的菌丝；通过分光光度计的测定，琼脂糖/氨苄青霉素/异丙基-b-d-硫代半乳糖苷的菌液的OD600值明显小于琼脂糖/氨苄青霉素的菌液，说明在异丙基-b-d-硫代半乳糖苷的诱导下抗菌肽基因表达，从而对细菌生长产生抑制作用。

4.测序：

筛选所得并经过验证的含抗菌肽的质粒的菌液样品送至测序公司进行测序；详细序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，本发明新的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5全长cDNA的长度为685bp，其中开放阅读框位于329-454位核苷酸。根据全长cDNA推导出蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的氨基酸序列，共42个氨基酸残基，分子量5047kD，PI值10.93。

将该蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的全长cDNA序列及其编码蛋白质用Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和AMP数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php；http://reseach.izr.astar.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC)进行核苷酸和蛋白质相似物和同源物的检索。通过序列比对判断所筛选的基因是新基因，与目前已发现的各类抗菌肽/多肽在基因和蛋白水品上没有明显的同源性。

5.蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5的人工合成(由上海波泰生物科技有限公司完成)

a、试剂

芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸为美国SIAM公司产品；PyBOP、Wang树脂为美国SIAM公司产品；六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本进口(使用前先经茚三酮浸泡和

分子筛脱水，并测定无游离氨基)；二氯甲烷(DCM)为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品(使用前用无水碳酸钾浸泡处理)；三氟乙酸(TFA)为GEELBELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。

b、仪器

431A型多肽合成仪为Applied biosystems产品，高效液相色谱为安捷伦1100色谱仪；冷冻干燥机(FREEZE DRYER 18)为LABCONCO产品；质谱仪为Finnigan LCQ。

c、方法

合成序列：GKWGWIYITILFADVGGFKSSRHPEERRVQERRFKRITRGPD

肽链的合成

肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc的脱帽用30％六氢吡啶的DMF溶液。肽链从树脂上的切落用切肽试剂(三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚/＝81.5/5/5/5/2.5/1)。称取100mg Fmoc-Ile-wang resin，依次按各种Fmoc-氨基酸每步接肽反应加入

PyBOP--------Mwt：520.30----------------1123.9[mg/coupling]

HOBt+H2O--Mwt：153.10----------------4320[micro-L/coupling]

NMM----------109.95[mL/mol]----------3240[micro-L/coupling]

脱帽反应加入：

六氢吡啶-----------30％------------------------9000×2[micro-L/coupling]

洗涤时用

DMF----------------------------------------------9000×5[micro-L/coupling]

接肽在431A自动合成仪上进行，接完的树脂全部转移至茄形瓶中，加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml。25℃下搅拌反应2小时。过滤，收集滤液。树脂用少量三氟乙酸洗3次。将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀。离心收集，真空干燥。得粗品约30mg。

纯化：

先用分析柱确定目标肽：

方法是：使用C18反相柱子，条件为：A相为95％的水(甲醇配比)，B相为95％的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：从A相到B相为20分钟梯度。检测波长：220纳米，流速：1毫升/分钟，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱20分钟，收集目标肽，然后做质谱鉴定。

制备：(使用仪器：Waters600E)

使用C18反相制备柱子，条件为：A相为95％的水(甲醇配比)，B相为95％的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：从A相到B相为30分钟梯度。检测波长：220纳米，流速：10毫升/分钟，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱30分钟，收集目标肽洗脱液，冻干。

6.合成肽抗菌活性的测定

a、制备合成肽溶液

将30mg合成肽溶解于140ul 0.1％的乙酸溶液中配成100mM的母液，分装成10管存于-20℃备用

b、制备试验菌液：为了排除抑菌作用由AMP引起的可能性，应使用带质粒的SOLR菌；将菌液培养到OD值为0.5左右时放置于4℃保存。

c、制备滤纸片：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6mm的小纸片，灭菌烘干备用。

d、按照琼脂1％w/v、蛋白胨1％w/v、酵母提取物0.5％w/v、氯化钠0.05％w/v配置琼脂糖培养基，将pH调至7.0后灭菌，倒板等其冷却后，取用LB液体培养基稀释100倍的上述试验菌液200微升均匀涂板，等菌液吸收10分钟后将三层滤纸片放置于培养基上。放三层纸片可以增大加样量。然后将合成肽溶液5微升加在滤纸片上，用卡那霉素做阳性对照，正面向上吸收完全后倒置培养过夜。观察抑菌圈(参见图3)，测其大小。观察抑菌圈实验的结果，发现滤纸周围没有细菌生长，因此呈现出明亮的抑菌圈。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

GCAAACCGCC TCTCCCCGCG CGTTGGCCGA TTCATTAATG CAGCTGGCAC GACAGGTTTC    60

CCGACTGGAA AGCGGGCAGT GAGCGCAACG CAATTAATGT GAGTTAGCTC ACTCATTAGG    120

CACCCCAGGC TTTACACTTT ATGCTTCCGG CTCGTATGTT GTGTGGAATT GTGAGCGGAT    180

AACAATTTCA CACAGGAAAC AGCTATGACC ATGATTACGC CAAGCTCGAA ATTAACCCTC    240

ACTAAAGGGA ACAAAAGCTG GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGA ACTAGTGGAT    300

CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGCACGAGGG AAAATGGGGT TGGATTTATA TAACAATACT    360

TTTTGCTGAT GTGGGTGGGT TCAAGAGTTC AAGACATCCT GAAGAAAGAA GAGTTCAAGA    420

AAGAAGATTC AAGAGGATTA CCAGGGGACC CGATTAACTT AGAAATACCT TTTGTCTGAT    480

AAAAATTGCA TTTCGCGTTC GGTCACAGTA AATATCCCGT TGTTAAAATA TACAAGACAT    540

GGAAGGCGTT CGACTTATGA TGTAACTCTC ATAAGTCATT AAAATTTGGT ATAAGAGAGC    600

ATAAAATATA ATGGCGCTGG ATACTTGGCC AGTTAATATA CTGAATAAGT ATAAACGGGT    660

TGTTGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA                                          685

SEQ ID NO：2

Gly Lys Trp Gly Trp Ile Tyr Ile Thr Ile Leu Phe Ala Asp Val

1               5                   10                  15

Gly Gly Phe Lys Ser Ser Arg His Pro Glu Glu Arg Arg Val Gln

                 20                  25                  30

Glu Arg Arg Phe Lys Arg Ile Thr Arg Gly Pro Asp

                35                   40

Claims (5)

1、一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列，其特征在于所分离出的DNA分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列杂交。

2、根据权利要求1所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列，其特征在于：该序列具有SEQ ID NO：1中从核苷酸第329-454位的核苷酸序列。

3、根据权利要求1所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5编码的核酸序列，其特征在于：该序列包含8～126个连续核苷酸。

4、一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5，其特征在于：具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

5、根据权利要求4所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5，其特征在于：所述蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。

Images