CN102260348A

CN102260348A - 蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽及应用

Info

Publication number: CN102260348A
Application number: CN2011102019390A
Authority: CN
Inventors: 叶恭银; 王磊; 方琦; 王飞; 朱洋铿
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: CN102260348B

Abstract

本发明公开了一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，其具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的基因，其具有SEQ ID NO：1中第126-290位的核苷酸序列；或者与SEQ IDNO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽能用于制备蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于转基因作物或改造植物共生菌。

Description

蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列和应用。

背景技术

害虫一直严重威胁着全球农作物的安全生产，每年都造成全球粮食产量约1/4的减产，经济损失巨大。在我国，农业害虫也是一直制约农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计全国病虫害发生面积年已由2000年的50亿亩/次增加至2009年的70亿亩/次。每年通过防治病虫害挽回的粮食损失约占总产的15％-20％，即便如此，每年粮食损失仍可达300亿～500亿斤。

自化学农药DDT问世以来，害虫的防治一直主要依赖化学农药，其后果是出现了害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等问题。人们一直探索寻找新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，随着转基因技术的出现，又提供了一种新思路去解决害虫问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，使害虫的有效控制出现了新机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2008年的125百万公顷(其中抗虫的有46百万公顷)，增长了70多倍，其中也产生了明显的经济与生态效应。

但是，随着仅有单一Bt基因抗虫Bt作物的连续种植，靶标害虫对其产生抗性的问题也随之日趋备受关注，且这种担忧已在Bt棉田的美洲棉铃虫H.zea上已出现迹象。为此，不少学者一方面又再去寻找发现新的Bt抗虫基因，另外还从微生物、植物和动物(主要是蝎子、蜘蛛)中挖掘具有杀虫活性的蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因植物，延缓或攻克害虫产生抗性问题。寄生蜂作为一类重要的害虫生物防治作用物，在传统生防中已得到充分肯定，在减少化学农药使用和环境污染方面有着重要作用。寄生蜂能利用自身携带的多种寄生因子(毒液(venom)、多分DNA病毒(polydnavirus，PDV)、类病毒颗粒(virus like particle，VLP)、类病毒纤丝(virus likefilament，VLF)、卵巢蛋白(ovarian protein，OP)、畸形细胞(teratocyte))，以破坏寄主免疫反应、调节寄主生长发育、调控寄主血淋巴营养成分以及扰乱寄主生殖和内分泌系统等以保证其后代在寄主血腔或体表正常发育。若能将寄生蜂的寄生因子结合现代生物技术，可望用于研制新型生防制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，已成功将藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，并使烟草天蛾(Manduca sexta)生长明显减缓，危害程度明显低于非转基因对照。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫抑制作用(抑制黑化)的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白基因Pp-PI及其编码的蛋白质。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

作为本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的改进：Pp-PI多肽为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。

本发明还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的基因，其特征是：其具有SEQ ID NO：1中第126-290位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。

作为本发明的基因的改进：序列中包含8～66个连续核苷酸。

本发明还同时提供了上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的用途：用于制备蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于转基因作物或改造植物共生菌。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白Pp-PI氨基酸序列及其编码的核酸序列，包括：编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ IDNO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。

本发明所提供的蝶蛹金小蜂毒液蛋白Pp-PI及其编码的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和农药物并应用于农业害虫防治等多个领域。

本发明利用反向液相色谱技术分离蝶蛹金小蜂毒液中的活性成分，对各个组分进行活性测定并对其进行N端测序，利用测得的氨基酸序列设计兼并引物PCR扩增获得基因的片段，结合5’-RACE和3’-RACE技术获得目的基因的全长，基因的开放阅读框所推导的氨基酸序列与蛋白N端测序结果完全一致。获得蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI的氨基酸序列后，对其进行了多肽的化学固相合成及原核表达纯化，化学合成的Pp-PI及表达含GST标签的Pp-PI都能够抑制菜粉蝶(Pieris rapae)蛹及柑橘凤蝶(Papilio xuthus)蛹酚氧化酶前体(PPO)的激活，阻止其形成有活性的酚氧化酶(PO)，具有抑制寄主体液免疫的功能。

本发明是通过以下技术方案实现的：在本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列。

本发明分离出的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI包括：具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-66个连续核苷酸。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI编码的核酸序列指：编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ IDNO：1中第126-290位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列编码框第657-722位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ IDNO：1中第126-290位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI或多肽指：具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与天然蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又别如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI的活性片段和活性衍生物。

在本发明中蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI保守性变异多肽指：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

发明还包括蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI或多肽的类似物。这些类似物与天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的差别可以是氨基酸序列上的诧异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽时，可以将蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI表达载体。

如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为原核细胞。常用的原核宿主细胞指得是大肠杆菌细胞。

还可用Northern印迹法技术或荧光定量PCR分析蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI基因产物的表达，即分析蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP1核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI同源基因或同源蛋白。

本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接产生全长的分子。利用本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI，通过各种常规筛选方法，可筛选出蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI发生相互作用的物质，或者受体等。

本发明在菜粉蝶及柑橘凤蝶血淋巴酚氧化酶激活试验中具有明显的抑制作用，对菜粉蝶及柑橘凤蝶的体液免疫有明显抑制效果。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI正是对农业害虫有免疫抑制作用的新蛋白，因此，具有很大的应用价值。

本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI编码的核酸序列，可按照以下方法获得：

(1)蝶蛹金小蜂毒腺的解剖及RNA提取：取羽化3天左右的蝶蛹金小蜂雌蜂于冰上进行麻痹，Olympus解剖镜下用DEPC处理的水(含有RNAase抑制剂)进行解剖，收集毒腺及毒囊于盛有Trizol试剂(Invitogen)的离心管(经DEPC处理)中，按照试剂说明书抽提其总RNA。

(2)cDNA第一链的合成

采用ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)合成蝶蛹金小蜂毒腺第一链cDNA。

(3)PCR

利用SEQ ID NO：1中蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI编码的核酸序列设计引物，以蝶蛹金小蜂毒腺第一链cDNA为模板进行PCR扩增，电泳检测后DNA测序即可得到Pp-PI编码的核酸序列。

本发明涉及的序列及记号分别如下：

(1)序列特征：

(A)长度：365bp

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(2)分子类型：核苷酸

(3)序列描述：

蝶蛹金小蜂(pteromalus puparum)

G 1

AAAATCATTCTCGTTTCATACGTTAAAAGCGTAAGTGAGATCAGAAAATTTCTAAGTAGT 61

CAAAATGTCGAAAATTTTGAAAGTCGCTCTACTTTTACTACTGGTGGCAGTAGCTGTATC 121

M S K I L K V A L L L L L V A V A V S 19

TTCATATTCTGTACAAGATGAGGACGATGAAAGCAATCTTCCACACATTGATGATTATAG 181

S Y S V Q D E D D E S N L P H I D D Y S 39

CGAAACCAATAAGTGCCCACCTAATCAAAGATTCATGTGGAAGTGTAATTATTGTAAATG 241

E T N K C P P N Q R F M W K C N Y C K C 59

TGGTCCTAAAGGAAAGGATGCTGCATGCACACGAATGAATTGCTCTTAGGTGATTAAATC 301

G P K G K D A A C T R M N C S * 74

CTATCAAATGTACACAACCTTGAATAAAGAATTCATTGAATATTATTAAACCAAAAAAAA 361

AAAA 365

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的基于反向液相色谱(RP-HPLC)所分离到的蝶蛹金小蜂毒液组分的液相色谱图谱；

注：其中2#峰是蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI。

图2为本发明的原核表达的分离纯化图；

注：M为标准蛋白，1道为未诱导菌株，2道为诱导后上清，3道为诱导后沉淀，4道为过纯化柱后的流出液，5，6道为洗脱纯化柱的流出液，7道为纯化后的融合蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI。

图3为本发明的化学合成的和原核表达的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI/肽基因表达物对菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；

注：阴性对照为TBS缓冲液，阳性对照为0.5μg微黄滕球菌，合成Pp-PI是含0.5μg微黄滕球菌和0.5μg化学合成的Pp-PI，表达Pp-PI是指含0.5μg微黄滕球菌和0.5μg表达含GST标签的融合Pp-PI，GST对照是表达的GST蛋白0.5μg，加入2μl菜粉蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，加入200μl L-dopa(2mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.001OD的量。数据采用DPS数据分析软件进行方差分析(唐启义和冯明光，2007)。

图4为本发明的化学合成的和原核表达的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI/肽基因表达物对柑橘凤蝶蛹的血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；

注：缓冲液是指Tris-Ca2+缓冲液，对照是牛血清蛋白BSA，合成Pp-PI是0.5μg化学合成的Pp-PI，表达Pp-PI是0.5μg表达含GST标签的融合Pp-PI，GST对照是表达的GST蛋白0.5μg，加入2μl柑橘凤蝶蛹血淋巴后在室温下放置50分钟，加入200μl L-dopa(2mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.001OD的量。数据采用DPS数据分析软件进行方差分析(唐启义和冯明光，2007)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

1、蝶蛹金小蜂毒液蛋白组分的分离及N端测序：

取羽化3天～6天的蝶蛹金小蜂雌蜂于冰上进行麻痹，利用Olympus解剖镜及解剖针在冰上PBS(含PMSF)中解剖蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)雌蜂的毒囊和毒腺，于16000g离心1min取上清，冷冻干燥后作为样品溶于去离子水用于毒液蛋白的分离。

色谱柱为Aligent C18柱(15cm×4.6mm，粒度5μm)；流动相为三氟乙酸(TFA)(A--1∶1000，即含TFA0.1％的水溶液)和乙腈(B)，在40min内乙腈浓度从0～40％(乙腈的体积浓度)，流速1.0mL/min，检测波长为214nm，对单峰进行收集。

委托中科院生物物理所完成质谱鉴定，检测条件：N2激光器，激光波长337nm；加速电压19kV；基质CCA(α2氢基242羟基肉桂酸)用φ＝50％乙腈溶液饱合；1μL样品(1g·L-1水溶液)与1μL基质混合后滴于不锈钢靶上，空气中自然干燥后，推入离子源中测定。同时委托美国堪萨斯州立大学生物测试中心进行N端测序。

2、蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI基因克隆：

根据N端测序结果设计一对兼并引物，SP：CTTCCACARATTGACGA CTAT，AP：CATTCGTGTGCANGCAGCATC，以毒腺cDNA为模板PCR扩增获得一个约200bpPCR片段。PCR扩增体系和扩增条件具体如下：

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，AxyAprep DNA凝胶回收试剂盒(Biosciences)纯化后，用TA克隆法连接入载体(Promega)，送含插入片段的阳性菌落去上海博尚生物公司测序。测序完成后再根据序列信息设计5’和3’RACE引物，按照Takara 5’和3’RACE试剂盒说明书进行2轮PCR扩增，切胶回收连接T载体后后送上海博尚生物公司测序。最后利用DNASTAR软件对PCR片段、3’RACE和5’RACE进行序列拼接，并利用SignalP 3.0在线预测信号肽。

P1-3′-1：ACTTGACGACTATAACGAAACC

P1-3′-2：AGTGCCCACCTAATCAAAGA

P1-5′-1：CATGCAGCATCCTTTCCTTTA

P1-5′-2：TAGGTGGGCACTTATTGGTTT

3、蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP1的人工合成(由上海波泰生物科技有限公司完成)

a、试剂

芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸为美国SIAM公司产品；PyBOP、Wang树脂为美国SIAM公司产品；六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本进口(使用前先经茚三酮浸泡和

分子筛脱水，并测定无游离氨基)；二氯甲烷(DCM)为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品(使用前用无水碳酸钾浸泡处理)；三氟乙酸(TFA)为GEELBELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。

b.仪器

431A型多肽合成仪为Applied biosystems产品，高效液相色谱为安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E；冷冻干燥机(FREEZE DRYER 18)为LABCONCO产品；质谱仪为Finnigan LCQ。

c.制备方法

(1)肽链的合成

肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法

Fmoc保护基团的脱除用30％六氢吡啶的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂(三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚/＝81.5/5/5/5/2.5/1，体积比)。

接肽前树脂处理：

①称取200毫克Boc-Phe-Merrifield resin到砂芯过滤反应器中；

②加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；

③加入10％的TFA(二氯甲烷作溶剂)5毫升，室温反应2小时，以除去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；

④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5％的三乙胺(二氯甲烷作溶剂)5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗涤6次，DMF洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。

接肽在431A自动合成仪上进行，称取30mg Phe-Merrifield resin放入反应器中，然后按下列量在合成仪中依次加入以下各种Fmoc-氨基酸(反应过程中加入的FMOC-氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂)

合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂(即本条多肽Phe-Merrifieldresin)，浸泡洗涤5遍后加入第2个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、PyBop、HOBT、NMM，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约10分钟，在脱除FMOC后，用DMF或二氯甲烷洗涤树脂6-9次，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行(六氢吡啶显强碱性，不利于接肽反应)；

第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH和PYBOP、相同摩尔的NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Lys-Merrifield resin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余的氨基酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行18步循环后即可完成多肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其它试剂(PYBOP、NMM试剂和HOBT试剂)的量保持不变。

接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保持在0度以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收其滤液并浓缩抽干(这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml(81.5％TFA、5％thioanisole、5％phenol、5％water、2.5％EDT、1％TIS)。25℃下搅拌反应3小时。取出过滤，收集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得粗品约60mg。

(2)肽链的纯化

先采用安捷伦1100分析系统确定目标肽，使用C18反相柱子，条件为：A相为95％的水(甲醇配比，体积比，即5％甲醇水溶液)，B相为95％的甲醇(甲醇配比，体积比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长：220nm，流速：1mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。

确定目标肽后，采用Waters600E纯化系统进行多肽制备：使用C18反相制备柱子，条件为：A相为95％的水(乙腈配比，体积比，即5％乙腈水溶液)，B相为95％的甲醇(乙腈配比，体积比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：从A相到B相为70分钟梯度。检测波长：220nm，流速：36mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，然后与分析仪器配合确定样品的目标峰，所获产物经冷冻干燥即得化学合成的多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4、Pp-PI原核表达及纯化

根据已经获得的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI基因全长序列设计引物，以蝶蛹金小蜂毒腺cDNA为模板PCR扩增该基因的ORF(去除信号肽)，其中正向引物Pp-PI-SP含有Nde I酶切位点(5′-GGAATTCCATATGTATTCTGTACAAGATGAGGACGA-3′)，反向引物Pp-PI-AP含有BamH I酶切位点(5′-CGCGGATCCCTAAGAGCAATTCAT TCGTGTG-3′)。PCR反应条件为：94℃预变性3min后开始如下循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环后72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，TA克隆法连接入

载体，得到的pGEM-T-Pp-PI质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α后，用X-gal和IPTG进行蓝白斑筛选。挑取白斑，含Amp LB液体培养基37℃震荡培养过夜，抽质粒。Nde I和BamH I(Takara)双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，用T4DNA连接酶(Takara)将酶切片段与Nde I和BamH I双酶切后的pGEM-4T-2载体(GE)连接。得到的表达质粒pGEM-4T-Pp-PI转化E.coli BL21(DE3)，接种含50μg/ml Amp的LB平板，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养基过夜培养，抽质粒，Nde I和BamH I双酶切鉴定表达载体成功构建与否。挑取含表达质粒的单菌落接种于5ml LB培养基(含50μg/ml Amp)，37℃震荡培养过夜，取上述100μl菌液于新鲜的5ml LB培养基中培养至OD 0.6-0.8(约2-3h)，加入IPTG，30℃诱导表达培养4-5h，收集细胞，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴5min，12000g离心10min去除不溶物，取样10μl进行10％SDS-PAGE电泳检测，以未诱导的pGEM-4T-Pp-PI菌液和pGEM-4T-2载体的诱导液作为对照。

含GST标签的融合Pp-PI的纯化按照GST·Bind^TM纯化试剂盒的说明书进行。用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml抽提试剂。室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂(以及其它很多类似纯化系统)。蛋白溶液在冰上可以短时存放(2-3小时)，也可在-20℃长时间存放直至下步分析。

柱层析步骤：(1)轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。为了避免出现气泡，往柱子中添加树脂时将吸头尖端始终置于柱子液面以下。等待树脂沉降。(2)当储存缓冲液(20％乙醇)液面降到柱床上沿以下时，用5倍体积1×GST Bind/Wash Buffer洗树脂。注意：在上样前将蛋白抽提液置于室温水浴以快速使之升温至室温。(3)待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液。将流速控制在每小时10倍柱体积为宜。如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质。收集穿过组分并置于冰上。(4)以10倍体积1×GST Bind/Wash Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上。(5)以3倍体积1×GST Elution Buffer洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续分析。(6)分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。对收集到的目的Pp-PI样品用Bradford法测定蛋白浓度后，-70℃保存或立即用于对酚氧化酶活性的测定。

5、合成及表达的Pp-PI对菜粉蝶及柑橘凤蝶PPO激活抑制作用的测定

在冰上单头取菜粉蝶蛹及柑橘凤蝶蛹血淋巴于1.5ml预冷离心管中，立即置于冰上，在4℃下，3300g离心5分钟后，取上清于一新预冷的1.5ml离心管中，去除血细胞，用于酚氧化酶本底的测定。

每个样品分别取2μl血淋巴加入到96孔板空里含10μl TBS(pH7.4)和10μl TBS里含0.5μg微黄滕球菌(M.luteus)里，室温放置60分钟，加入200μl L-dopa(2mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.001OD的量。选取血淋巴样品在TBS里只有很低或没有酚氧化酶活性，而在微黄滕球菌(M.luteus)里有很高的酚氧化酶活性的样品用于酚氧化酶前体(PPO)激活的实验。

菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶前体(PPO)激活抑制试验：TBS缓冲液为阴性对照，0.5μg微黄滕球菌为阳性对照，同时设置表达的GST蛋白0.5μg为GST对照，合成Pp-PI中含0.5μg微黄滕球菌和0.5μg化学合成的Pp-PI，表达Pp-PI中含0.5μg微黄滕球菌和0.5μg表达含GST标签的融合Pp-PI，每个处理中加入2μl菜粉蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，加入200μl L-dopa(2mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.0010D的量，每个样品重复3次，数据采用DPS数据分析软件进行方差分析统计分析(唐启义和冯明光，2007)。

柑橘凤蝶蛹的血淋巴酚氧化酶前体(PPO)激活抑制试验：以Tris-Ca²⁺缓冲液为缓冲液，牛血清蛋白BSA作为对照，合成Pp-PI是0.5μg化学合成的Pp-PI，表达Pp-PI是0.5μg表达含GST标签的融合Pp-PI，表达的GST蛋白0.5μg作为GST蛋白对照，每个处理加入2μl柑橘凤蝶蛹血淋巴后在室温下放置50分钟，加入200μl L-dopa(2mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.001OD的量，每个样品重复3次，数据采用DPS数据分析软件进行方差分析(唐启义和冯明光，2007)。

上述试验结果证明：本发明的Pp-PI多肽对菜粉蝶及柑橘凤蝶的PPO激活有抑制作用。

实施例2

1、PpPI基因植物二元表达载体构建

利用植物二元表达载体pBI121中GUS基因两侧花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子和NOS终止子，插入PpPI基因构成一个完整的表达框架。本试验选用BamHI和SacI作为酶切位点将GUS基因代换为PpPI，从而利用GUS基因两侧的表达框控制PpPI基因在拟南芥植物中的表达。

根据蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂的ORF设计带有BamH I和Sac I酶切位点的引物，以蝶蛹金小蜂毒腺cDNA为模板PCR扩增以构建植物表达载体。引物序列为：

PpPI-SP：TCGGGATCCATTCTGTACAAGATGAGGACGAT，

PpPI-AP：CGCCTAAGAGCAATTCATTCGTGTG，

其中，GGATCC为BamH I酶切位点，

Sac I酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR反应条件和体系同实例1-2。PCR产物回收、连接至pMD18-T载体中，转化大肠杆菌Trans T1感受态细胞，经Amp+抗性筛选，挑取克隆送上海博尚公司测序。提取pMD18-PpPI质粒，利用限制性内切酶BamH I和Sac I对pMD18-PpPI质粒进行双酶切，切胶回收小片段。

从过夜培养的菌液中利用小量质粒抽提试剂盒(Axygen)提取pBI121质粒，利用限制性内切酶BamH I和Sac I对pBI121质粒进行双酶切，切胶回收大片段。将酶切后的pBI121质粒和pMD18-PpPI质粒利用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，经Kan+抗性筛选，挑取pBI121-PpPI克隆送上海博尚公司测序，验证插入片段的正确性。

2、pBI121-PpPI转化农杆菌

(1)农杆菌感受态细胞的制备

a、将EHA105菌株在含有50mg/L Rif的YEP固体培养基上划线培养，28℃培养24-48h；

b、挑单克隆菌株于5ml含50mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃振荡培养24-48h；

c、将5ml上述菌液加入到含有50mg/L Rif的100mlYEP液体培养基中，28℃振荡培养5-6h，直到OD₆₀₀＝0.8。

d、在4℃条件下，5000rpm离心15min，收集细胞沉淀。加入50ml冰冷的无菌水，悬浮细菌沉淀；

e、在4℃条件下，5000rpmm离心15min，再用10ml冰冷的无菌水重复操作；

f、加入10ml预冷的10％无菌甘油，重悬沉淀；

g、离心，弃上清，用2ml预冷的10％无菌甘油悬浮沉淀，分装并贮存于-70℃。(2)农杆菌的电击转化

取出电击杯，先用双蒸水洗两遍，再以75％乙醇洗1-2遍(加入75％乙醇后轻晃两次即可)，放入超净台，口向内吹干(大约为10-20分钟)，吹干后的电击杯盖上盖子放置于冰上。

自-70冰箱，取一支农杆菌感受态细胞，放于冰上，等其融化为液态时，于超净台中，向感受态细胞中加入2ul pBI121-PpPI质粒，用手轻弹混匀并放于冰上，然后以移液器转移至电击杯的中间夹缝中。打开电击仪，以吸水纸擦干电击杯外面的水，放入电击杯，并将齿轮旋转至紧。调节电击参数(1440HV，125Ω，50uF)，电击完毕后放置于冰上2-3分钟，然后轻轻地向电击杯加入800ul LB培养基，轻轻地用移液器吹几下然后转移至EP管中。

28℃静置培养48小时，4000rpm离心5分钟，然后涂含有Kana抗生素的平板。长出的菌落先在另一块平板上划线，再继续生长24小时后，进行PCR验证，因为农杆菌所含质粒拷贝数很低，PCR的循环数要设置为40个循环。

3、农杆菌转化拟南芥

拟南芥的转化采用花粉管通道法(Clough and Bent 1998)。具体过程如下：

挑取生长LB固体培养基上含pBI121-PpPI的农杆菌单菌落，于4ml的LB液体培养基中培养过夜，按照1∶500的比例扩大培养。待菌液的OD₆₀₀吸收值达到0.6-1.0时，4000rpm离心5分钟收集农杆菌。

以5％的蔗糖溶液重悬农杆菌，将菌液稀释至OD600约为0.5-0.8左右，在使用前加入0.03％的表面活性剂Silvet L-77。选取生长状态良好的拟南芥，将拟南芥的花蕾浸泡在农杆菌液体中20秒钟。以不透明的塑料布遮光保湿24小时，然后转移至光照培养箱中继续培养。在一周以后重复转化一次。

转化后的拟南芥可以放于长日照条件下，使得其快速生长结种子，收取T₀代种子。

4、转基因拟南芥的鉴定

(1)转基因植株的卡那霉素抗性筛选

a、取收获的T₀代种子拟南芥种子约100mg放入到一个1.5ml离心管中；

b、用70％的酒精消毒5秒，短暂离心后弃上清；

c、用10％NaHClO₃消毒2-3分钟，短暂离心后弃上清；

d、加入灭菌的蒸馏水重悬离心弃上清，洗数次；

e、加入1ml无菌的0.1％琼脂糖溶液悬浮种子；

f、把拟南芥种子铺在含50mg/L Kan+的l/2MS培养基上；

g、4℃低温春化2-5天；

h、移至拟南芥正常条件下培养，一周后，将出现抗Kan+的拟南芥苗，将抗性苗移栽到土∶蛙石＝l∶1的花盆中，放到培养室中生长，收集T₁代种子。

(2)拟南芥的PCR鉴定

取T₁代拟南芥幼苗嫩叶，提取植物基因组DNA，具体方法如下：

a、采集T₁代幼叶1片于1.5ml的离心管中，注入液氮，将样品研制粉末；

b、向装有样品的离心管中加入750μl提取缓冲液，迅速震荡混匀，将离心管置于65℃保温8-10min；

c、加入150μl 5M LiAc，轻缓的混匀，冰浴15-20min；

d、在4℃条件下13000rpm离心10min；

e、将800μl上清液转入一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀10min；

f、在4℃条件下13000rpm离心10min；

g、用75％乙醇洗涤沉淀，晾干；

h、将沉淀溶于10μl TE缓冲液中；

i、将提取的DNA样品稀释5-10倍作为PCR反应模板，按实例1-2方法进行PCR反应，鉴定T1代转基因情况。

用携带重组质粒pBI121-PpPI的农杆菌花粉管法转化了60株野生型拟南芥植株，每株收获几千粒种子。通过卡那抗性基因的表达来初步筛选出已经导入外源基因的种子，洒播了约5万粒的种子，最后得到了80粒具有卡那抗性。通过塑料袋包裹使植株自花授粉，获得T₁代种子，继续回交培养到T₃代纯合子，用于后续分析。

5、转PpPI基因拟南芥植株的抗虫分析

分别取10头2龄左右的菜青虫放到15cm培养皿中，培养皿中放置浸湿的棉团保湿。每个培养皿中加入等量的莲座8片叶期转PpPI拟南芥和野生型拟南芥的叶片任其取食，每个处理设置3个重复，记录各个处理存活和死忘虫数及幼虫生长状况，及时更换新鲜的叶片，统计菜青虫的死亡率。饲喂5天后，取食转PpPI拟南芥叶片的菜青虫死亡率为40％，明显高于对照的死亡率5％，说明转PpPI拟南芥能够抑制菜青虫的存活，对菜青虫有毒杀作用。预计蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpPI转入其他十字花科蔬菜如甘蓝等对菜青虫等鳞翅目害虫有防治作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，其特征是：具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，其特征是：所述Pp-PI多肽为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。

3.编码如权利要求1或2所述的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的基因，其特征是：其具有SEQ ID NO：1中第126-290位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征是：所述序列中包含8～66个连续核苷酸。

5.如权利要求1所述的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的用途，其特征是：用于制备蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于转基因作物或改造植物共生菌。