CN101781362B

CN101781362B - 植物发育相关蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN101781362B
Application number: CN2009102377957A
Authority: CN
Inventors: 王志勇; 种康; 路铁刚; 白明义; 张丽颖; 朱佳瑛; 林文慧
Original assignee: Institute of Botany of CAS; Biotechnology Research Institute of CAAS; Carnegie Institution of Washington
Current assignee: Institute of Botany of CAS; Biotechnology Research Institute of CAAS; Carnegie Institution of Washington
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2029-11-19
Also published as: CN101781362A

Abstract

本发明公开了一种植物生长发育相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由其衍生的蛋白质；所述植物发育体现在成株的株高和/或叶夹角大小和/或成株的育性和/或特定器官的大小性状上。本发明还获得了含有该编码基因OsIBP1的重组表达载体，用重组载体转化目的植物，可以得到成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因植物。因此OsIBP1可以作为一种潜在的分子育种工具，改良植物株型，提高植物产量。

Description

植物发育相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物发育相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

理想的株型是水稻提高产量的决定因素。在水稻的理想株型中，半矮化和叶片直立是两个对增产非常有利的性状(Wang Y and Li J，.2008，Annu.Rev.PlantBiol.，59：253-279)。绿色革命就是通过改良水稻株型提高水稻产量的成功例证。近年的一些研究表明叶片直立也是成就水稻高产株型的目标之一。叶片直立可提高冠层光合速率，改善群体下部光照，增加物质生产量；同时增加冠层基部光量，增强根系活力，提高抗倒性；且利于密植，提高单位土地面积上的净光合速率。研究表明油菜素内酯(BRs)影响着水稻的许多重要农艺性状，如株高、叶片角度、分蘖角度、种子形态等(Yamamuro C et al.，2000 Plant Cell 12：1591-1605；HongZ et al.，2005，Plant Cell 17：2243-2254；Tanabe S et al.，2005，Plant Cell17：776-790；Wang et al.，2008，PLoS ONE 3：e3521)。尤其是最近对BRs突变体的研究表明通过密植具有直立叶片的水稻品种可以达到增产的目的(Morinaka Yet al.，2006，Plant Physiol 141：924-931；Sakamoto T et al.，2006，NatBiotechnol 24：105-109)，所以人们推测水稻BRs信号途径的关键基因或BRs合成途径的关键酶是改良水稻株型的潜在分子工具。

一个成功的例子是通过突变OsDWARF4基因，它编码水稻BRs合成途径的关键酶，获得了叶片直立而育性正常的水稻品种，密植这种水稻品种可以提高水稻产量(Sakamoto et al.，2006)。这使人们对通过调控BRs途径关键基因，改良水稻株型、提高水稻产量的策略信心倍增。迄今为止，人们分离到的水稻BRs信号途径的关键基因有OsBRI1，OsBZR1和OsBIN2，其中人们对OsBRI1的突变体在水稻增产方面的应用进行了详细的研究。研究表明由于OsBRI1是水稻的BRs受体，它在水稻BRs信号途径的核心作用使得它突变后很难找到弱突变体。人们在筛选了100多个突变体后，找到了OsBRI1的弱突变体d61-7，虽然该突变体密植可以增加水稻的生物量，但因为d61-7结小种子所以并没有带来产量的增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物发育相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白(OsIBP1)，来自粳稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonicacv.Nipponbare)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列3的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由其衍生的蛋白质；所述植物发育体现在成株的株高和/或叶夹角大小和/或成株的育性和/或特定器官的大小等性状上。

为了使(a)中的OsIBP1便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsIBP1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsIBP1的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因(OsIBP1)可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

2)序列表中序列5所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有OsIBP1基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用OsIBP1构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为将所述OsIBP1基因插入pSN1301的多克隆位点得到的重组表达载体。

所述质粒pSN1301是将质粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位点间插入35S-Noster序列得到的；所述35S-Noster序列是用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切质粒pUC19-35S-Noster得到的；所述质粒pUC19-35S-Noster是将质粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位点间插入35S启动子片段得到的；所述35S启动子片段是用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切质粒pBI221得到的；所述质粒pUC19-Noster是将质粒pUC19的Sac I和EcoR I酶切位点间插入Noster poly A终止序列得到的；所述Noster poly A终止序列是用限制性内切酶Sac I和EcoR I双酶切质粒pBI 221得到的。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到转基因植物。

所述转基因植物可为与目的植物相比成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因植物。所述特定器官变小，具体可为叶宽变小、叶枕部位细胞变小、叶柄缩短、叶片变小等。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的OsIBP1基因导入植物细胞，可获得成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因细胞系及转基因植株。携带有OsIBP1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可为单子叶植物或双子叶植物，如禾本科植物水稻(如日本晴水稻)或拟南芥(Columbia拟南芥)。

所述方法中，具体可将所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到转基因植物。

本发明发现了一个新蛋白OsIBP1及其编码基因OsIBP1。OsIBP1可以与OsILI1相互作用并功能拮抗，因此两个基因可以同时使用达到控制对生长的促进或抑制。用组织特异性启动子可以特异性的控制特定器官(包括营养和有性生殖器官)的生长和大小。本发明还获得了含有该编码基因OsIBP1的重组表达载体，用重组载体转化目的植物，可以得到成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因植物。因此OsIBP1可以作为一种潜在的分子育种工具，改良植物株型，提高植物产量。

附图说明

图1为实施例1中ili1-D突变体植株和日本晴(WT)幼苗期的照片。

图2为实施例1中ili1-D突变体植株和日本晴(WT)分蘖期的照片。

图3为实施例1中种植于大田的扬花期的ili1-D和日本晴(WT)的旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角测量数据统计结果。

图4为实施例1中ili1-D突变体植株和日本晴(WT)幼苗叶枕部位近轴面细胞扫描电镜的照片。

图5为实施例1中ili1-D突变体植株和日本晴(WT)对外源施加表油菜素内脂敏感性的分析；A为ili1-D突变体植株和日本晴(WT)叶枕部位弯曲对表油菜素内脂敏感性的分析，其中横坐标轴表示24-epiBL的浓度(nM)，纵坐标为水稻叶枕部位弯曲的角度(°)；B为ili1-D突变体植株和日本晴(WT)胚芽鞘伸长对表油菜素内脂敏感性的分析，其中横坐标轴表示24-epiBL的浓度(nM)，纵坐标为水稻胚芽鞘的长度(cm)。

图6为实施例1中ili1-D突变体植株和日本晴(WT)中BRs的含量，其中实心方形代表野生型水稻，实心圆形代表的是ili1-D突变体，数值代表野生型及ili1-D突变体内BRs的含量(ng/g鲜重)。

图7为实施例1中ili1-D突变体、日本晴(WT)、ili1-D突变体转化RNAi载体的转基因阳性植株R2和R5的表型和OsILI1的表达量；A：阳性转基因植株的表型；B：实时定量PCR检测OsILI1在转基因植株中的相对表达量。

图8为实施例1中实时定量PCR的方法检测OsILI1在植物激素24-epiBL、2，4-D、KT、GA3处理3小时后的相对表达量。

图9为实施例1中实时定量PCR的方法检测用24-epiBL终浓度为1μM的水溶液分别处理水稻日本晴幼苗15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，120分钟，360分钟后，OsILI1的相对表达量。

图10为实施例1中实时定量PCR检测野生型水稻日本晴的种子、穗、根、茎干、叶片、叶枕及叶鞘部位中OsILI1的相对表达量。

图11为实施例2中OsILI1和OsIBP1相互作用的实验结果；A：酵母双杂交检测OsILI1和OsIBP1在体外的相互作用；B：烟草体内OsILI1-YFP和OsIBP1-myc免疫共沉淀的结果。

图12为实施例2中实时定量PCR的方法检测用24-epiBL终浓度为1μM的水溶液分别处理水稻日本晴幼苗15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟、360分钟后，OsIBP1的相对表达量。

图13为实施例2中实时定量PCR检测野生型水稻日本晴的种子、穗、根、茎干、叶片、叶枕及叶鞘部位中OsIBP1的相对表达量。

图14为实施例2中染色质免疫共沉淀检测转录因子OsBZR1与OsIBP1启动子的结合，其中附图上方为基因结构的示意图，白色方框表示启动子区域，黑色方框表示编码区域，黑色圆形表示预测的BR相应元件(BRRE)。

图15为实施例3中OsIBP1过表达植株(12#和14#)和日本晴(control)的表型、叶枕部位、OsIBP1的表达量和叶夹角统计数据；A：OsIBP1过表达植株和日本晴的表型；B：叶夹角部位的放大图；C：实时定量PCR检测OsIBP1的相对表达量；D：OsIBP1过表达植株和日本晴叶夹角的统计数据；E：OsIBP1过表达植株和日本晴叶片宽度的统计数据。

图16为实施例3中显微镜下OsIBP1过表达植株(12#)和日本晴(control)的叶枕部位的细胞照片。

图17为实施例4中OsIBP1过表达植株(2#、4#和5#)和Columbia拟南芥(WT)的表型和OsIBP1的表达量；A-C阳性转基因植株的表型；D：实时定量PCR检测OsIBP1在转基因植株中的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

日本晴水稻：中国科学院植物研究所；毛建军，，杨秀芬，曾洪梅，袁京京，邱德文.水稻品种日本晴粳稻组培培养基的筛选及转稻瘟菌蛋白激发子基因植株的获得.《农业生物技术学报》，2008年16卷5期，824-830；原始来源不清。

Columbia拟南芥(拟南芥Columbia)：中国科学院植物研究所；刘俊，蔡平钟，马林，张志雄，向跃武，王闵霞，张志勇.冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建.《西南农业学报》，2009年22卷2期，428-432。

农杆菌EHA105：中国科学院植物研究所；肖媛，李落叶，徐孟亮，崔延春，夏新界.根癌农杆菌介导的水稻两用不育系培矮64S遗传转化体系的建立.《农业现代化研究》.2009年30卷3期.364-368。

农杆菌GV3101：中国科学院植物研究所；郑银英，崔百明，常明进，彭明.转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究.《西北植物学报》.2009年29卷1期.75-79。

实施例中所用的培养基如下：

NBD2：N6盐分和维生素，500mg/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L gelrite，pH 5.8。

NBD2-S1：NBD2，25mg/L潮霉素(Hygromycine)，600mg/L头孢霉素，pH 5.8。

NBD2-S2：NBD2，50mg/L潮霉素(Hygromycine)，300mg/L头孢霉素，pH 5.8。

AAM-AS：AAS盐分和氨基酸，MS维生素，100mol/L乙酰丁香酮，pH 5.2。

NBD2C：NBD2，10g/L葡萄糖，100mol/L乙酰丁香酮，pH 5.2。

分化培养基：MS盐分和维生素，300mg/L水解酪蛋白，50mg/L潮霉素，3mg/L6-BA，2.5mg/L KT，0.2mg/L ZT，pH 5.8

生根壮苗培养基：1/4MS盐分，MS维生素，1mg/L多效唑，0.5mg/L NAA，6.5g/L琼脂粉，pH 5.8。

以下实施例中的基因表达量检测结果，如无特殊说明，均是以野生型植株的目的基因表达量为1，其它植株的目的基因表达量与野生型植株的目的基因表达量进行比较。

实施例1、OsILI1的发现

一、突变体植株ili1-D的获得和形态观察

1、突变体植株ili1-D的获得

构建日本晴水稻T-DNA插入突变体库，从中发现了一个叶夹角明显增大的突变体植株ili1-D。

2、突变体植株ili1-D的形态观察

对突变体植株ili1-D进行如下形态观察。

(1)叶夹角

ili1-D最重要的表型是在其各个生长时期，均表现为叶夹角明显增大。在幼苗期，突变体萌发后生长5天左右，在第二叶发育完全后就可观察到第二叶叶夹角弯曲已超过90度(见图1)。在分蘖期，突变体的每个新生分蘖都表现为叶夹角明显增大(见图2)。

对种植于大田的扬花期的日本晴及ili1-D的旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角进行测量，统计结果表明野生型旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角大小主要集中在0-30°之间，而突变体的叶夹角则主要分布于90-150°之间(见图3)。

(2)种子长度

分别检测100粒日本晴种子和100粒ili1-D种子的长度。ili1-D种子的平均长度为5.3±0.1，日本晴种子的平均长度为4.8±0.2，差异显著，有统计学意义。这表明，与日本晴相比，ili1-D种子变长。

(3)叶枕部位细胞的伸长

用扫描电镜的方法对幼苗期的日本晴及ili1-D突变体叶枕部位近轴面的细胞形态进行观察，见图4。结果表明，ili1-D突变体叶枕部位近轴面的细胞比野生型日本晴相同部位细胞的伸长更为明显。

3、突变体植株ili1-D的子代的形态观察

将ili1-D种子繁殖后，后代持续出现叶夹角增大的表型。这些结果表明ili1-D叶夹角增大的表型在各个生长时期中都是稳定的，并且表型是可稳定遗传的。

4、突变体植株ili1-D对油菜素内脂(BRs)敏感性的分析

选取在黑暗下萌发一致的野生型及突变体植株ili1-D的种子继续在黑暗下培养8天，然后剪取第二叶夹角上下各一厘米左右的区段，分别浸泡在含有0、1、10、100、1000、10000nM 24-epiBL(表油菜素内脂，振泰园艺公司)的水溶液中，48小时后对叶夹角弯曲的度数进行统计。结果表明在24-epiBL浓度1-100nM之间，突变体对于BR处理叶夹角增大的幅度要比野生型强(见图5A)；进一步将野生型和ili1-D突变体的种子灭菌并在24小时持续光照下萌发48小时后，选取萌发一致的种子分别移入含有0、1、10、100、1000、10000nM 24-epiBL的1/2ms培养基中，培养5天后对胚芽鞘的长度进行统计。结果表明，突变体在24-epiBL处理下胚芽鞘的相对伸长程度要比野生型大，尤其在1000-10000nM的高浓度反应更为明显(见图5B)。以上两项生理试验均表明ili1-D突变体对24-epiBL的敏感性增强。

5、ili1-D突变体中内源油菜素甾醇含量的测定

取生长2个月的野生型及突变体植株ili1-D地上部分通过气相色谱-质谱分析法(gas chromatography-mass spectrometry)测量了水稻内源BRs各中间产物的含量。结果显示虽然晚期C-6氧化途径中的几个中间产物如6-DeoxoCT、6-Deoxo3DT、6-DeoxoTY和6-DeoxoCS的含量在突变体中略有上升，但上升的幅度都不大，基本可以认为是没有显著变化，而且水稻BRs合成途径的终产物CS的含量并没有发生变化(见图6)，因此从这个结果可以看出ili1-D突变体的表型并不是由于体内内源BRs的含量改变而造成的，这个突变体并非是一个BRs合成相关突变体。

二、OsILI1的发现

根据插入的T-DNA载体序列设计引物，进行Tail-PCR扩增，然后将PCR产物回收，送至公司测序，再将测序结果在NCBI数据库中进行BLASTn比对。结果表明T-DNA插入于水稻4号染色体BAC克隆OsJNBa0063C所对应的序列上。

用Real-time PCR的方法对T-DNA插入两侧各10kb的DNA片段在日本晴及ili1-D中的表达进行分析，结果表明其中一段DNA(序列2所示的DNA)在ili1-D突变体中上调了近20倍，因此推测可能是由于T-DNA上的35S启动子插入在序列2所示的DNA附近，造成了序列2所示的DNA的过量表达，从而造成了iii1-D突变体的表型。

将序列2自5′端第116位至第297位核苷酸构建入RNAi载体中，转化ili1-D，以期用RNA干涉的方法降低突变体中序列2所示的DNA的表达量。共获得了11个株系，大部分转基因阳性植株都恢复了野生型表型。随机选择转基因阳性植株中的几个株系进行进一步的鉴定，两个株系R2和R5明显恢复到了野生型的表型，经检测，序列2所示的DNA的在植株中表达量相对于ili1-D突变体明显降低(见图7)。结果表明，序列2所示的DNA与转基因植株恢复野生型的程度密切相关。

以上结果表明：ili1-D突变体的表型是由于T-DNA插入在序列2所示的DNA附近，T-DNA上的35S启动子驱动序列2所示的DNA过量表达造成的。序列表的序列2所示的DNA编码序列表的序列1所示的蛋白质，根据表型将序列1所示的蛋白质命名为OsILI1(Oraza sativa increased leaf inclination-1)，将OsILI1的编码基因命名为OsILI1。

三、OsILI1的功能鉴定

1、植物激素对OsILI1基因表达的调节

将水稻野生型日本晴幼苗分别浸泡在含有终浓度为10μM的24-epiBL(24-表油菜素内脂，BR，购于振泰园艺公司)、10μM的2，4-D、100μM的KT及100μM的GA₃水溶液中(水处理作为对照)，处理3小时后，提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析OsILI1的表达情况，结果表明OsILI1在用2，4-D和GA₃处理后表达量都没有明显的变化，用KT处理后，表达量略有下调，而用BR处理后表达量明显增强，这表明OsILI1基因表达上对BR的反应是比较特异的(见图8)。

进一步用24-epiBL终浓度为1μM的水溶液分别处理水稻日本晴幼苗15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，120分钟，360分钟，提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析OsILI1的表达情况，结果表明OsILI1在45分钟至60分钟表达量到达了一个峰值，在120分钟后它的表达量逐渐下降，这表明OsILI1在短时间内转录水平受BR诱导(见图9)。

2、OsILI1基因表达模式的分析

分别取野生型水稻日本晴的种子、穗、根、茎干、叶片、叶枕及叶鞘部位提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析OsILI1的表达情况(以在种子中的表达量为1)，结果表明OsILI1在水稻根，叶片部位中表达量相对较低，而叶枕及叶鞘的表达量相对较高，其中以叶枕的相对表达量为最高。这表明OsILI1可能主要作用于水稻的叶枕部位，通过调节叶枕部位近轴向的细胞伸长来调节水稻的株型(见图10)。

3、酵母双杂交技术筛选与OsILI1相互作用的蛋白

将OsILI1的编码序列(序列2)从cDNA文库中扩增后，连入pBD-GAL4载体，然后将构建好的载体转入酵母AH109，制作成感受态细胞后，共转化水稻三叶期酵母双杂交文库。筛库的效率为3×10⁵克隆/g DNA，总的筛库量为3×10⁶克隆，能在-His/-Trp/-Leu SD培养基上生长的克隆数为22个，而最后能在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培养基上生长的克隆数为10个。对这10个克隆进行测序分析，发现其中有5个属于bHLH转录因子，其中的克隆16在筛选中出现了3次，对这个克隆所对应的蛋白序列进行保守域分析，发现它是一个典型的含有basicdomain的bHLH转录因子，将它命名为IBP1(OsILI1-binding bHLH protein 1)。

实施例2、OsIBP1的发现

一、OsIBP1的发现

通过对OsILI1蛋白序列进行分析可知，OsILI1属于bHLH类转录因子家族，但它并没有典型的basic结构域。此类bHLH蛋白被归类为D类bHLH蛋白，它们不能直接结合DNA，主要通过与典型的bHLH转录因子形成异源二聚体以调节它们的功能。以OsILI1全长蛋白作为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选与OsILI1相互作用的蛋白。将OsILI1的编码序列从cDNA文库中扩增后，连入pBD-GAL4载体，然后将构建好的载体转入酵母AH109，制作成感受态细胞后，共转化水稻三叶期酵母双杂交文库。筛库的效率为3×10⁵克隆/g DNA，总的筛库量为3×10⁶克隆，能在-His/-Trp/-Leu SD培养基上生长的克隆数为22个，最后能在-His/-Trp/-Leu/-AdeSD培养基上生长的克隆数为10个。对这10个克隆进行测序分析，发现其中有5个属于bHLH转录因子，其中的克隆16在筛选中出现了3次，对这个克隆所对应的蛋白序列进行保守域分析，发现它是一个典型的含有basic domain的bHLH转录因子，因此选取这一蛋白进行下一步的研究，在此将它命名为OsIBP1(OsILI1-bindingbHLH protein 1)。

OsIBP1含有202个氨基酸残基，如序列表的序列3所示。OsIBP1的编码基因OsIBP1位于4号染色体，编码序列如序列表的序列4所示，全序列如序列表的序列5所示。将OsIBP1的全长编码序列从cDNA文库中扩增出来后构建到pAD-GAL4载体中，与pBD-OsILI1共转化酵母感受态细胞，涂布-Trp/-Leu SD平板，然后将长出的菌落转入-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培养基上培养，结果表明含pBD-OsILI1和pAD-OsIBP1的酵母菌落可以在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD平板上很好地生长，而对照则不能生长，这说明OsILI1和OsIBP1在酵母中确实存在着相互作用(图11A)。

为了进一步检测OsILI1和OsIBP1在体内的相互作用，将OsIBP1的全长编码序列cDNA文库中扩增出来后构建到35S启动子驱动的带有myc标签的载体中，得到OsIBP1-myc载体。然后将OsIBP1-myc和OsILI1-YFP以等量的比例在烟草中瞬时表达。在注射菌液后的烟草培养48小时后，选取生长状态良好的烟草叶片在荧光显微镜下观察YFP荧光信号，并取少量组织分别用anti-GFP和anti-myc抗体做western杂交检测组织内融合蛋白的含量，anti-GFP和anti-myc杂交信号均一的用于下一步的免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)，单打了OsIBP1-myc的叶片作为负对照。

结果表明在共沉淀之后，只有共转化了OsIBP1-myc和OsILI1-YFP的洗脱样品用anti-myc杂交才有信号，而单转了OsIBP1-myc的样品在洗脱后则杂不出信号，这说明OsIBP1-myc和OsILI1-YFP在体内也有着相互作用(图11B)。

二、OsIBP1的功能鉴定

1、BR对OsIBP1基因表达的调节

用24-epiBL终浓度为1μM的水溶液分别处理水稻日本晴幼苗15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟、360分钟，提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析OsIBP1的表达情况。结果表明，随着时间的延长OsIBP1的表达量逐渐降低，这说明OsIBP1的表达是受BR抑制的(图12)。

2、OsIBP1基因表达模式的分析

分别取野生型水稻日本晴的种子、穗、根、茎干、叶片、叶枕及叶鞘部位提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析OsIBP1的表达情况(以在种子中的表达量为1)，结果表明OsIBP1在水稻根中表达量相对最高，而叶枕及叶鞘，叶片的表达量也相对较高，这表明OsIBP1与OsILI1在水稻的这些器官共表达，协同调节植物的生长发育(图13)。

3、转录因子OsBZR1对OsIBP1的调节

OsBZR1是BR信号途径中的重要转录因子，它通过DNA结合结构域直接结合到BRs合成基因启动子上的CGTG(T/C)G保守序列，即BR反应元件(BR response element，BRRE)，调节这些基因的表达。通过对OsIBP1启动子序列进行分析，找到了若干OsBZR1可能的作用位点CGTG(T/C)G。为了确认OsBZR1蛋白和OsILI1、OsIBP1的启动子区域有着直接的相互作用，用35S：OsBZR1：GFP的转基因水稻来做染色质免疫共沉淀的实验(chromatin immunoprecipitation，ChIP)。将35S：OsBZR1：GFP的转基因水稻在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法用anti-GFP抗体沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，再用根据OsIBP1启动子上BRs响应元件富集区设计的引物进行PCR扩增。结果表明在免疫共沉淀后的OsBZR1：GFP样品中，OsIBP1的启动子选定区域相对于在对照中有明显的富集。这表明OsBZR1与OsIBP1启动子在体内有直接相互作用(图14)。

实施例3、OsIBP1过表达水稻的获得

一、重组表达载体的构建

1、35S启动子片段的获得

用限制性内切酶HindIII和BamHI对质粒载体pBI221(Clontech)进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后回收长度约为0.8kb的35S启动子片段。

2、用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI221(Clontech)上切下，连接到载体pUC19(TaKaRa公司)的相应位点中，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与步骤1获得的35S启动子片段相连，得到重组载体。

3、用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从步骤2构建的重组载体切下包含35S和Noster的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)多克隆位点的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pSN1301。

4、提取日本晴水稻的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增制备OsIBP1的编码序列(序列4所示DNA)。PCR扩增的引物如下：5’-CCGAGATCT

(BglII)-3’；5’-CCGGGTACCGAAGTAGAACAGAAGCAGCAACAGC(KpnI)-3’。将OsIBP1的编码序列连入pSN1301的BglII和KpnI酶切位点，得到含有OsIBP1的重组表达载体。重组表达载体经过测序检验正确。

二、OsIBP1过表达水稻的获得

将步骤一构建的重组表达载体转入农杆菌EHA105，用于转化日本晴水稻，具体步骤如下：

1、幼胚愈伤组织的诱导

水稻种子去壳后，浸泡在70％的乙醇中1分钟，用力振摇后转入无菌三角瓶，倒出废液，再加入2％的次氯酸钠溶液振荡消毒60分钟以上，倒出废液，用无菌水冲洗2-3遍，然后用无菌滤纸吸干水分。在无菌条件下用手术刀和镊子解剖幼胚，将幼胚直接转入NBD2(2，4-D浓度为2mg/L)培养基平板中，于28℃暗培养，每2周继代一次。

2、根癌农杆菌的培养

从YEB固体培养基上挑取含有重组表达载体的农杆菌单克隆接种到20ml含抗生素(50mg/L卡纳霉素)的YEB液体培养基中，28℃摇菌培养至OD600为0.6-0.8。

3、共培养及筛选、分化

1)步骤2的农杆菌菌液5000rpm离心10分钟，在AAM-AS(AS浓度200M/L)液体培养基中重悬沉淀至浓度OD600为0.6-0.8。

2)挑选新鲜的胚性愈伤浸泡在步骤1)的农杆菌菌悬液中20分钟，用无菌滤纸吸干后转移至NBD2C培养基上(在培养基表面铺一张无菌滤纸)，25℃暗培养3天。

3)将共培养后的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至NBD2-S1培养基上，筛选一代。

4)两周后，转移至NBD2-S2培养基上筛选二代(2周/代)。

5)取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。

6)再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗。

7)待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培。

得到转基因植株共16个株系。

用pSN1301代替重组表达载体，制备转空载体T₀代植株，方法同上。

对转基因植株的12号和14号株系的T₀代植株进行进一步的分析(用日本晴和转空载体T₀代植株作为对照)。

图15为生长12周的植株，图15中的对照为日本晴，转空载体T₀代植株与日本晴表型相同。如图所示：两个转基因株系均呈现半矮化，叶片狭窄直立(图15A)，叶片夹角明显变小(图15B)；对对照以及转基因植株的叶夹角进行统计，阴性对照的叶夹角度数平均在15度左右，而转基因植株的叶夹角则平均在0到5度之间(图15D)；用Real-time PCR的方法检测日本晴和转基因植株中OsIBP1的表达情况(引物：GCGCCGGCATGGAGTACT；GACGAGGCCTTGCATCAGCT)，结果证明表型是与OsIBP1的高表达相对应的(图15C)；对叶片最宽处进行测量和统计，结果表明，对照的叶宽平均值在0.65厘米左右，而转基因的植株的叶宽平均在0.35厘米左右，t-test计算的结果p值小于0.001，为显著差异(图15E)。

通过显微镜仪器，检测分蘖期的日本晴和12号植株的叶枕部位的细胞，照片见图16。结果表明，12号植株细胞显著短于日本晴细胞。

实施例4、转基因拟南芥的获得

一、重组表达载体的构建

提取日本晴水稻的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增制备OsIBP1的编码序列(序列4所示DNA)。PCR扩增的引物如下：5’-CCGAGATCT

(BglII)-3’；5’-CCGGGTACCGAAGTAGAACAGAAGCAGCAACAGC(KpnI)-3’。将OsIBP1的编码序列连入实施例3构建的质粒pSN1301的BglII和KpnI酶切位点间，得到含有IBP1的重组表达载体。重组表达载体经过测序检验正确。

二、转基因拟南芥的获得

将步骤一构建的重组表达载体转入农杆菌GV3101，用于转化Columbia拟南芥(拟南芥Co1)，具体步骤如下：

1)在YEB平板上挑取含有表达载体的农杆菌单克隆，接种于10ml含抗生素(50mg/L卡纳霉素)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至对数生长晚期。

2)按1∶50的比例转接到50ml YEB培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至OD600为0.6左右。

3)5,000rpm，离心15分钟，收集菌体，重悬于渗透缓冲液(5％蔗糖，0.02％silwetL-77)，调OD600至0.6左右。

4)取正在开花的拟南芥，剪去转化前形成的果荚，然后将整个花序浸泡在步骤3)的菌悬液中15秒，使得农杆菌很好的粘附在花序中进行转化。

5)农杆菌侵染后的拟南芥放于阴暗处保湿培养24小时，然后将拟南芥移到培养室中继续正常培养，7-10天后再浸泡转化一次。

6)收获成熟的拟南芥种子，充分晾干后用10％次氯酸钠消毒后，铺在含有相应抗生素的1/2MS培养基上，筛选得到的抗性苗(T₁代)移入土中继续培养。

用pSN1301代替重组表达载体，制备转空载体T₁代植株，方法同上。

对转基因植株的2号、4号和5号株系的T₁代植株进行进一步的分析(用拟南芥Co1和转空载体T₁代植株作为对照)。

拟南芥Co1、2号株系、4号株系和5号株系植株的照片如图17所示。转空载体T₀代植株与拟南芥Co1表型相同。生长三周的拟南芥的照片见图17A和图17B，成熟期(抽苔后)的照片见图17C。由图17A和图17B可见，转基因植株变小、紧凑、叶柄缩短、叶片变小变圆、叶色深绿，其中以2号的表型为最明显。在成熟期，2号开花明显比其他株系及野生型要晚，主苔也非常矮小。对这些转基因植株中OsIBP1的表达量进行检测(引物：GCGCCGGCATGGAGTACT；GACGAGGCCTTGCATCAGCT)，发现转基因植株的表型是与OsIBP1的表达量相对应的，在表型最强的2号中，OsIBP1的表达量为最多(图17D)。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

中国农业科学院生物技术研究所

华盛顿卡内基研究院

<120>植物发育相关蛋白及其编码基因和应用

<130>CGGNARY92643

<160>5

<210>1

<211>104

<212>PRT

<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)

<400>1

Met Ser Ser Ser Arg Arg Ser Arg Ser Arg Arg Ala Gly Ser Ser Val

1 5 10 15

Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Glu Asp Gln Ile

20 25 30

Ala Glu Leu Leu Ser Lys Leu Gln Ala Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ala

35 40 45

Arg Asn Gly Ala His Arg Gly Ser Ala Ala Arg Val Leu Gln Glu Thr

50 55 60

Cys Ser Tyr Ile Arg Ser Leu His Gln Glu Val Asp Asn Leu Ser Glu

65 70 75 80

Thr Leu Ala Gln Leu Leu Ala Ser Pro Asp Val Thr Ser Asp Gln Ala

85 90 95

Ala Val Ile Arg Ser Leu Leu Met

100

<210>2

<211>315

<212>DNA

<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)

<400>2

atgtcgagca gccggaggtc gcgctcacgg cgagccggga gctcggtgcc gtcgtcgtcg 60

tcgtcgtcga ggacgtcgat ctcggaggac cagatcgccg agcttctctc caagcttcag 120

gccctgctcc cggagtctca ggctcgcaat ggcgcccata ggggctcggc ggcgagggtt 180

ttgcaggaga cgtgcagcta catcaggagc ctgcaccagg aggtggacaa cctcagcgag 240

acgctcgctc agctgctcgc ctcccccgac gtcaccagcg accaggcggc cgtcatcagg 300

agcctcctca tgtga 315

<210>3

<211>202

<212>PRT

<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)

<400>3

Met Asp Ala Lys Arg Thr Pro Pro Pro Pro Thr Pro Pro Asn Pro Asn

1 5 10 15

Pro Ser Val Ile Gly Ser Gly Ala Ala Ala Asp Gly Gly Gly Phe Gly

20 25 30

Arg Gly Glu Ala Ala Ala Ala Thr Lys His Met Leu Ala Phe His Phe

35 40 45

Leu Arg Ala Leu Ser Arg Ile His Arg Ala Thr Pro Val Thr Arg Arg

50 55 60

Thr Arg Thr Ile Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Ser Met Ala Arg Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Arg Arg Ala Trp Ser Arg Ala Leu Leu Gly Gln Val Arg Ala

85 90 95

Arg Arg Ser Arg Thr Leu Met Arg Arg Ala Ala Val Leu Val Arg Arg

100 105 110

Arg Val Val Ala Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala Ser Ala Arg Gly Val

115 120 125

Arg Ile Ile Ala Ala Gly Glu Thr Ser Ala Ala Ala Arg Ala Val Pro

130 135 140

Pro Pro Pro Arg Gln Gln Gly Glu Pro Pro Arg Ala Glu Ala Leu Arg

145 150 155 160

Arg Leu Val Pro Gly Gly Ala Gly Met Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Glu

165 170 175

Glu Thr Ala Asp Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Ala Gln Val Gln Leu Met

180 185 190

Gln Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Tyr Gln

195 200

<210>4

<211>609

<212>DNA

<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)

<400>4

atggacgcga agaggacgcc gccgccgccg acgccgccga accctaaccc tagcgtaatt 60

ggcagcggcg ccgccgcgga cggcggcgga tttgggaggg gggaagcggc ggcggcgacg 120

aagcacatgc tggccttcca cttcctgcgc gcgctgtcgc ggatccaccg ggcgacaccc 180

gtgacgcggc gcacgcggac catccgccgg gcggcctact cctccatggc gcgggcggcg 240

agcccgcgcc gcgcgtggag ccgggcgctg ctcggccagg tccgcgcgcg gaggtccagg 300

acgctgatga ggcgcgccgc cgtgctggtg cggaggcgcg tcgtagccgc tcctgcgcct 360

tctcccgcct ccgccagagg cgtcaggatt attgctgccg gagagacgtc ggcggcggct 420

cgggctgttc cgccgcctcc gcggcagcag ggcgagccgc cgagggccga agcgctccgg 480

cgcctggtcc ccggcggcgc cggcatggag tactccagcc tcctggagga gaccgccgac 540

tacctccgct cgcttcgcgc gcaggtgcag ctgatgcaag gcctcgtcga cctcttctcc 600

taccaatga 609

<210>5

<211>897

<212>DNA

<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)

<400>5

gtgtcagagc cgtgttcctc gctctcttcc ctttcctttt tttctctctc taaaatcgca 60

acccacaaat ccttctgatc cgtttgtgtc agagccaaat cttcttcttc ttctccatct 120

ctctcctctc ctcttctctt ctctcgttgg aaggtgagga ggtgaggtga ggttgggggc 180

gccgtttgat ggacgcgaag aggacgccgc cgccgccgac gccgccgaac cctaacccta 240

gcgtaattgg cagcggcgcc gccgcggacg gcggcggatt tgggaggggg gaagcggcgg 300

cggcgacgaa gcacatgctg gccttccact tcctgcgcgc gctgtcgcgg atccaccggg 360

cgacacccgt gacgcggcgc acgcggacca tccgccgggc ggcctactcc tccatggcgc 420

gggcggcgag cccgcgccgc gcgtggagcc gggcgctgct cggccaggtc cgcgcgcgga 480

ggtccaggac gctgatgagg cgcgccgccg tgctggtgcg gaggcgcgtc gtagccgctc 540

ctgcgccttc tcccgcctcc gccagaggcg tcaggattat tgctgccgga gagacgtcgg 600

cggcggctcg ggctgttccg ccgcctccgc ggcagcaggg cgagccgccg agggccgaag 660

cgctccggcg cctggtcccc ggcggcgccg gcatggagta ctccagcctc ctggaggaga 720

ccgccgacta cctccgctcg cttcgcgcgc aggtgcagct gatgcaaggc ctcgtcgacc 780

tcttctccta ccaatgatcc atccatcgag taattaacat atgcatcata tggttaatta 840

tttattcgtt cgtcttgcac gcatcacatg ctgctgttgc tgcttctgtt ctacttc 897

Claims

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调节植物发育中的应用；所述植物发育体现在成株的株高和/或叶夹角大小和/或成株的育性和/或叶片大小上；所述植物为水稻或拟南芥。

2.一种培育转基因植物的方法，是将由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物为与所述目的植物相比成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或叶片变小的转基因植物；所述植物为水稻或拟南芥。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

2)序列表中序列5所示的DNA分子。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述蛋白质的编码基因通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述蛋白质的编码基因插入质粒pSN1301的多克隆位点得到的重组表达载体；

所述质粒pSN1301是将质粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位点间插入35S-Noster序列得到的；

所述35S-Noster序列是用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切质粒pUC19-35S-Noster得到的；

所述质粒pUC19-35S-Noster是将质粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位点间插入35S启动子片段得到的；

所述35S启动子片段是用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切质粒pBI221得到的；

所述质粒pUC19-Noster是将质粒pUC19的Sac I和EcoR I酶切位点间插入Nosterpoly A终止序列得到的；所述Noster poly A终止序列是用限制性内切酶Sac I和EcoRI双酶切质粒pBI 221得到的。

6.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述水稻为日本晴水稻；所述拟南芥为Columbia拟南芥。