CN101432431A

CN101432431A - 用于增加植物对高群体密度的耐受性的组合物和方法

Info

Publication number: CN101432431A
Application number: CNA200780015492XA
Authority: CN
Inventors: N·J·贝特; M·J·奥克曼
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2009-05-13
Also published as: WO2007103956A3; EP1991685B1; US20110078824A1; ZA200807658B; US20080235827A1; AU2007223053A2; MX2008011467A; US7868224B2; EP1991685A2; AR059775A1; CA2646509A1; WO2007103956A2; AU2007223053A1; BRPI0708660A2

Abstract

提供了用于抑制植物的避荫反应和提高植物产量的组合物和方法。本发明的组合物包括早期开花3(ELF3)玉米基因，该基因的启动子，拟南芥碱性螺旋－环－螺旋转录因子(bHLH－041)，和其片段和变体。ELF3启动子序列可用于驱动目标多核苷酸在植物中的表达。本发明的ELF3和bHLH－041序列或其变体和片段，提供在用于操作ELF3和bHLH－041基因的表达的表达盒中。通过增加ELF3的表达和/或抑制bHLH－041的表达，本发明的方法提供了植物对光质量的改变的反应和高密度引起的生存发育模式的抑制。本发明因而提供了为了提高产量以高群体密度种植作物植物的方法。也提供了具有本发明的改变的避荫表型的转化植物和所述植物的种子。

Description

用于增加植物对高群体密度的耐受性的组合物和方法

发明领域

本发明涉及植物的遗传操作，具体地涉及操作植物来增加对高群体密度的耐受性。

发明背景

光在植物生长和发育中起关键作用。植物使用许多光感受器系统来感知环境中的光，所述光感受器系统控制发芽、光形态发生、开花和衰老等发育过程，以及光合作用等代谢过程。植物细胞不仅从光子获得能量和化学干扰，它们也获得信息。可见光对叶绿素分子的激发，为CO₂还原和代谢活动的保持提供能量。

在具有高初级生产力的环境中，植物经历的光照气候的单一最重要的决定因素最常见地是它的相邻环境。植物会在形态上和生化上适应它们附近的光环境。它们使用一组信息光感受器，搜索三维树荫空间中的光。植物光敏素代表一个吸收红光的光感受器家族，它们可以以生理上无活性的Pr形式和有活性的Pfr形式存在。Pr和Pfr可分别被红光或远红(FR)光互变。该吸收谱对于检测邻近植物的遮荫或存在是非常有用的。在遮荫条件下或在密集植物群体中在高比例的FR辐射下，光平衡向无活性的Pr形式偏移。在这些条件下，绿色植物表现出不同的避荫反应症状，例如茎和叶柄伸长的促进，减小的叶厚度，减少的叶绿素合成，和增加的顶端优势。避荫反应会减少用于贮藏和繁殖的资源的可用性。

植物反应于拥挤而调节它们的形态的能力，几乎确定地是单个植物在高初级生产力环境中成功的一个关键要素。在最近的数十年中产量的增加，已经很大程度上归因于增加的密度耐受性。需要转基因策略来将植物的生产力进一步增加至超过使用常规育种可达到的生产力。因而，需要提高植物对密度种植的反应的基因和方法。

发明概述

提供了用于抑制植物的避荫反应和改进植物生长和产量的组合物和方法。更具体地，本发明的组合物和方法会改变植物对光质量的反应，增加植物对有限光条件的耐受性，包括由高群体密度造成的有限光条件。本发明的组合物包括早期开花3(ELF3)玉米基因以及拟南芥碱性螺旋-环-螺旋转录因子(bHLH-041)，和其片段和变体。bHLH-041是参与大量植物反应的一类转录因子的成员，包括有些与参与光感的植物光敏素直接相互作用的成员。本发明的方法包含，操作ELF3和bHLH-041基因的表达，以改变植物对光质量的反应，和抑制高密度引起的生存发育模式。更具体地，所述方法包含植物中ELF3基因的表达或超量表达和bHLH-041基因或编码类似转录因子的基因的减量调节，以抑制避荫反应。这样改良的植物会耐受低光条件，例如在室内、在遮荫景观和在高群体密度条件中产生的低光条件。在作物情况下，所述改良会导致相对于对照植物在高植物密度下更高的产量。本发明的多核苷酸可以单独使用、组合使用或与用于增加植物产量的其它基因和机理一起使用。本发明提供了为了提高产量以高群体密度种植作物植物的方法。

另外，提供了启动子序列。玉米ELF3启动子序列可用于驱动目标多核苷酸在植物中的表达。

附图简述

图1显示了玉米ELF3蛋白序列(SEQ ID NO：3)与拟南芥ELF3序列(At2g25930；GenBank登记号NM_128153；SEQ ID NO：7)和稻ELF3序列(GenBank登记号BAA83571；SEQ ID NO：8)的比对。在共有序列(SEQID NO：10)中指示了保守残基。

图2A和2B显示了ZM-ELF3的超量表达对高密度生长的转基因拟南芥的叶长度(图2A)和开花期叶数目(图2B)的影响。

图3A显示了与许多昼夜节律钟相关基因中存在的“夜晚元件”类似的ZM-ELF3启动子内的元件。核苷酸位置是相对于SEQ ID NO：4中所述的核苷酸序列。显示了用于对比的拟南芥夜晚元件(SEQ ID NO：9)。图3B显示了含有粗体下划线的推定夜晚元件的ZM-ELF3基因的上游序列。推定的CAAT盒为斜体，转录起始位点为斜体且标有双下划线。核苷酸1-459如SEQ ID NO：4所示；核苷酸460-625与SEQ ID NO：1的核苷酸1-166相对应。

图4显示了拟南芥中植物密度的影响。在一定范围的密度下种植野生型(哥伦比亚)植物(1：一株植物占4cm²；2：一株植物占3cm²；3一株植物占2cm²；4：一株植物占1cm²)。在开花期以cm计的总苔(bolt)高度(图A)，在开花期苔的数目(B)，最长叶长度(C)和长角果长度(D)。

图5显示了密度对拟南芥开花时间的影响。从左向右增加密度会减少开花时间和在开花期的植物大小。从每种处理测量10株植物。

图6描述了ELF3突变体的激活标记。图A提供了在ELF3周围的基因组序列的图谱，并显示了35S激活标记的位置。图B显示了3株阳性和1株阴性植物的分析，证实了激活标记的系中ELF3的超量表达(144-1至3)。图C显示了从3个ELF3激活标记的系分离的DNA的PstI-消化的DNA印迹，暗示着存在单个T-DNA拷贝。

图7显示了间作实验中密度对激活标记的系的影响。激活标记的系50-1(bHLH-041蛋白)和144-1(ELF3)对高植物密度具有不同的反应，如叶长度(上图)和苔高度(下图)所指示的。在第二最高密度(一株植物占2cm²)，将激活标记的种子与野生型植物间作，在开花中期(阶段6.5)测量。间作包含在对照植物之间播种实验植物，其中每个第5株植物是实验植物。

发明详述

提供了用于增加植物或作物的产量的组合物和方法。更具体地，本发明的组合物和方法通过改变植物对光质量的反应和增加植物对密度的耐受性，抑制植物的避荫反应。以此方式，所述植物可以不牺牲产量地生长在高密度环境，从而增加作物的总产量。本发明的组合物包括来自玉米的早期开花3(ELF3)启动子和编码序列，来自拟南芥的碱性螺旋-环-螺旋转录因子(bHLH-041)的编码序列，和其变体和片段，以及用于抑制bHLH-041基因和类似转录因子的基因在植物中的表达的多核苷酸和构建体。玉米ELF3基因的编码序列如SEQ ID NO：1的核苷酸167-2444和SEQ ID NO：2所述，编码的ELF3多肽的氨基酸序列如SEQID NO：3所述。ELF3启动子序列如SEQ ID NO：4所述。拟南芥bHLH-041基因的编码序列如SEQ ID NO：5所述，编码的bHLH-041多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所述。

更具体地，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：3和6所示氨基酸序列的核苷酸序列。另外提供了具有本文所述多核苷酸编码的氨基酸序列的多肽，所述多核苷酸例如SEQ ID NO：1、2和5所述的那些，和其片段和变体。本发明也提供了分离的多核苷酸，其包含如SEQ ID NO：4所述的来自玉米的ELF3基因的启动子序列。也提供了包含这些核苷酸序列的互补序列的核酸分子。认识到bHLH-041基因的编码序列(参见，SEQ ID NO：5)可以在植物中表达，以超量表达bHLH-041转录因子。但是，为了抑制植物的避荫反应的目的，将使用编码序列来设计用于抑制bHLH-041转录因子的表达的构建体。因而，在抑制避荫反应的上下文中，多核苷酸是指ELF3编码序列和在表达时抑制bHLH-041基因的表达的多核苷酸，例如，通过本文下面指出的直接或间接的抑制。

本发明的多核苷酸在植物中的表达，会预防那些植物在有限光条件下经历它们的形态发育的广泛重新编程，尤其在被它们的相邻植物遮荫时或高密度生长时。植物使用许多种光感觉系统搜索植物树荫中的光。相邻植物反射的远红辐射是引起预料的避荫反应的早期竞争信号。避荫反应包括茎和叶柄伸长的促进、减小的叶厚度、减少的叶绿素合成、加速的开花、和增加的顶端优势等症状。避荫反应会减少用于贮藏和繁殖的资源的可用性。避荫是一种机制，其中非常接近地生长的植物通过以叶、果实和贮藏器官发育为代价显著增加它们的茎长度而反应于从邻近植物的叶反射的远红(FR)辐射，不利地影响可收获组分的产量。避荫反应也可能对室内或景观的有限光区域生长的观赏植物具有有害作用。

图4显示了增加群体密度对拟南芥的营养和繁殖发育的影响。在一定密度下种植野生型(哥伦比亚)植物(1：一株植物占4cm²；2：一株植物占3cm²；3一株植物占2cm²；4：一株植物占1cm²)。在增加的密度下，开花期的总苔高度降低(图A)，开花期苔的数目减少(B)，叶长度减少(C)和长角果长度减少(D)。

植物密度或群体密度随作物和生长区域以及年份而变化。术语“高密度”或“高群体密度”定义为比给定生长区域中给定作物的平均流行植物密度高至少约10％的植物密度。在有些实施方案中，所述高群体密度是比给定生长区域中给定作物的平均普遍密度高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％或高至少100％。“平均普遍密度”定义为一个区域的大多数农民使用的平均植物密度。例如，根据美国农业部国家农业统计服务(National Agricultural Statistics Service of the United States Departmentof Agriculture)，2004年10个中西部州的玉米的平均普遍密度是每英亩26,200株植物(ppa)。因而对于该区域，高群体密度优选地是每英亩至少约28,800、至少30,000、至少32,000、至少34,000、至少36,000、至少38,000或至少40,000株植物。认识到种植密度，即种植的种子数将超过希望的目标植物群体。例如，2004年北美玉米的平均种植密度是每英亩28,590株植物。

在美国，选择的作物植物的平均普遍密度包括，每英亩20,000-29,000株玉米植物，每英亩1,000,000-1,500,000株小麦植物，每英亩650,000-900,000株稻植物，每英亩150,000-200,000株大豆植物，每英亩260,000-350,000株芸苔植物，每英亩17,000-23,00株向日葵植物。以相同的方式，可以确定任意生长区域的任意作物的平均密度。

产量是指植物或作物产生的输出或数量。产量可以以收获的果实、种子或其它组织的数量和/或大小的方式来测量。通常在蒲式耳/英亩基础上测量作物植物的产量。通常在蒲式耳/英亩或公斤/公顷基础上测量农作物的谷粒产量。

以前在拟南芥中鉴别出了早期开花3(elf3)突变。已经提出，ELF3介导光和昼夜节律钟之间的相互作用。ELF3功能的缺陷导致光依赖性的节律失常。参见，Covington，等人，(2001)Plant Cell 13：1305-1315，在本文中引作参考。ELF3似乎是向昼夜节律钟输入光的整体组分，可能通过限制这些途径在夜晚的光敏度，门控向时钟的光输入和昼夜节律输出的急性诱导。ELF3蛋白的超量表达导致对重新设置的刺激的敏感性降低，这暗示着在夜间ELF3会拮抗向昼夜节律钟的光输入。ELF3可能代表振荡器调控光重新设置的机制。另外，ELF3蛋白可能负责光感受器活性的昼夜节律调节。

本发明提供了玉米ELF3核苷酸序列(SEQ ID NO：1和2)和其编码的ELF3蛋白(SEQ ID NO：3)。玉米ELF3蛋白(也称作ZM-ELF3)与指定为At2g25930的拟南芥ELF3蛋白(SEQ ID NO：7；GenBank登记号NM_128153；也参见，美国专利号6,903,192的SEQ ID NO：2)具有19.4％同一性，这2个序列之间具有4个保守区(参见，图1中的比对；区域I，对应着SEQ ID NO：3的残基20-57；区域II，对应着SEQ ID NO：3的残基362-410；区域III，对应着SEQ ID NO：3的残基516-535；和区域IV，对应着SEQ ID NO：3的残基728-754)，它们是以前鉴别的ELF3蛋白所共有的(参见，Liu，等人，(2001)Plant Cell 13：1293-1304，在本文中引作参考)。PFAM分析揭示了与核糖体-结合因子A(InterPRO PS01319IPR000238)具有相似性的区域II内的结构域，这暗示着ELF3可以执行与控制蛋白合成有关的功能。

ZM-ELF3蛋白也与其它蛋白具有同源性，例如，来自稻的推定早期开花3蛋白，其包含在图1所示的比对中(SEQ ID NO：8；也参见，GenBank登记号BAA83571；GenBank登记号AP000399所示的编码序列)；来自稻的推定早期开花3蛋白(源自BAA83571；参见，GenBank登记号XP_493738；GenBank登记号XM_493738所示的编码序列)；来自稻的指定为P0697C12.15的假定蛋白(GenBank登记号NP_918455；GenBank登记号NM_193566.1所示的编码序列)；来自稻的线虫反应蛋白样蛋白(GenBank号BAD45081；GenBank登记号AP003296所示的编码序列)；来自冰花(Mesembryanthemum crystallinum)的早期开花3蛋白(GenBank登记号AAQ73529；GenBank登记号AY371292所示的编码序列)；来自拟南芥的未知蛋白的序列(GenBank登记号AAM15042；GenBank登记号AC005395所示的编码序列)；来自拟南芥的假定蛋白At3g21320(GenBank登记号AAX23847；GenBank登记号AY924772所示的编码序列)；来自拟南芥的假定蛋白AT3G21320(GenBank登记号AAV68859；GenBank登记号AY800623所示的编码序列)；来自拟南芥的线虫反应蛋白(GenBank登记号CAA72719；GenBank登记号Y11994所示的编码序列)；来自浮萍(Lemna gibba)的ELF3同源物(GenBank登记号BAD97872；GenBank登记号AB210851所示的编码序列)；和来自拟南芥的未命名的蛋白产物(GenBank登记号BAB01726；GenBank登记号AB023045所示的编码序列)。

本发明的方法包括在目标植物中表达本发明的ELF3序列。在不受任意作用机理约束的同时，ELF3序列的表达/超量表达会抑制或阻抑植物避荫反应。以此方式，可以用包含启动子的DNA构建体转化植物，所述启动子可操作地连接至包含ELF3编码序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1的核苷酸167-2443，如SEQ ID NO：2所述)或其片段或变体，增加ELF3多肽的水平或活性。可以选择启动子，以在选择的组织中在选择的时间表达序列，或组成型表达。

反应于遮荫，水平蓝色光梯度引导植物枝条至杂凑植物的树荫间隙。这些B光信号由特异性的光感受器感知。植物具有至少2类光感受器，它们的主要生理功能是获取信息。其中之一，即植物光敏素，最大吸收光谱的红(R)和远红(FR)区域。植物光敏素是控制反应于光的植物基因表达的调节蛋白。最近的工作已经证实了跨趋异进化边界的光感受器功能的保守。

植物光敏素是控制几种适应性发育策略的植物光感受器蛋白家族。例如，植物光敏素感知从附近植物的叶反射或散射的远红光(波长700-800nm)。这会提供潜在遮荫的预警，并触发一系列避荫反应，通过这些反应，植物试图生长得超过它的邻居。昼夜节律钟门控该快速避荫反应(参见，例如，Blazquez，等人，(2000)J.Cell.Sci.113：3547)。快速反应基因之一编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白。与避荫反应有关的加速生长需要该基因产物。

碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白是转录因子超家族，所述转录因子作为二聚体结合特异性的DNA靶位点。该家族由bHLH特征结构域定义，该特征结构域由含有2个功能不同的区域的约60个氨基酸组成。碱性区域位于该结构域的N-末端，且参与DNA结合。碱性区域由约15个氨基酸组成，包括大量碱性残基。HLH区域位于C-末端，起二聚化结构域的功能。HLH区域主要由疏水残基组成，所述疏水残基形成被可变序列的环区域和长度分开的2个两亲的α-螺旋。除了保守的bHLH特征结构域以外，所述蛋白表现出显著的序列趋异性。

已经在拟南芥中研究了bHLH基因，且已经鉴别了超过140个基因，它们构成拟南芥的最大转录因子家族之一。参见，Toledo-Ortiz，等人，(2003)Plant Cell 15：1749-1770，在本文中引作参考。已经鉴别了21个亚家族，其具有在DNA结合域外的保守氨基酸序列基序。预测该转录因子家族在植物细胞和组织发育以及植物代谢中具有不同范围的作用。有些bHLH蛋白(例如，PIF3和有关的bHLH蛋白；参见，例如，Ni，等人，(1998)Cell 95(5)：657-667)与植物光敏素物理地相互作用。另外，一种有关的bHLH，称作PIL1，参与昼夜节律钟(参见，例如，Makino，等人，(2002)Plant Cell Physiol.43(1)：58-69和Salter，等人，(2003)Nature426(6967)：680-683)。

本发明提供了拟南芥bHLH-041核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和由其编码的bHLH-041蛋白(SEQ ID NO：6)。bHLH-041蛋白与许多bHLH蛋白具有同源性，包括，例如，来自稻的bHLH样蛋白(GenBank登记号BAD61929；GenBank登记号AP005460所示的编码序列)；来自稻的指定为B1112D09.4的蛋白(GenBank登记号NP_918505；GenBank登记号NM_193616所示的编码序列)；来自稻的另一种bHLH样蛋白(GenBank登记号BAD72434；GenBank登记号AP003417所示的编码序列)；来自稻的指定为P0498B01.27的蛋白(GenBank登记号NP_913134；GenBank登记号NM_188245所示的编码序列)；来自稻的另一种bHLH样蛋白(GenBank登记号BAD72431；GenBank登记号AP003417所示的编码序列)；来自稻的指定为P0498B01.20的蛋白(GenBank登记号NP_913129；GenBank登记号NM_188240所示的编码序列)；来自稻的另一种bHLH样蛋白(GenBank登记号BAD72430；GenBank登记号AP003417所示的编码序列)；来自稻的指定为P0498B01.17的蛋白(GenBank登记号NP_913126；GenBank登记号NM_188237所示的编码序列)；来自稻的bHLH蛋白家族样蛋白(GenBank登记号XP_464694；GenBank登记号XM_464694所示的编码序列)；和来自拟南芥的未知蛋白的序列(GenBank登记号AAM63723；GenBank登记号AY086666所示的编码序列)。

尽管不受作用理论或机理约束，认为本发明的bHLH转录因子，即bHLH-041(SEQ ID NO：6所示)与参与光感知的植物光敏素相互作用。因此，抑制bHLH-041基因或该转录因子类别的其它成员的基因的表达会阻止与植物光敏素的相互作用，并抑制植物避荫反应。以此方式，本发明提供了抑制bHLH-041基因或以相同方式起作用的类似转录因子的基因的表达。因此，为了抑制避荫反应的目的，bHLH-041多核苷酸包括在植物中表达时会抑制bHLH-041基因或作用于植物光敏素的类似转录因子的基因的表达的那些多核苷酸。多核苷酸的表达会降低或消除植物中bHLH-041的水平或活性。所述表达可以以任意方式降低或消除bHLH-041的水平；例如，通过影响bHLH-041RNA转录物的水平；通过影响翻译，并从而影响编码的bHLH-041多肽的水平；或通过干扰编码的bHLH-041多肽的功能，例如通过竞争结合DNA靶序列。

认识到可以将下面讨论的RNA抑制序列设计成特异性地靶向bHLH-041基因表达或者靶向与bHLH-041具有同源性的那些转录因子的基因。以此方式，对于bHLH-041蛋白的选择性抑制，将基于在该蛋白的保守bHLH特征结构域(它在SEQ ID NO：6的残基287-339)之外的序列，设计抑制序列。bHLH是一种螺旋-环-螺旋转录因子，因此具有决定与靶基因的调节区相互作用的特异性的碱性区域(PFAM：PF00010；IPR001092)。在bHLH-041的情况下，碱性区域(SERKRREKLN；SEQ ID NO：6的残基293-302)是最保守的，且是该组转录因子的特征。

本发明的ELF3和bHLH-041多核苷酸可以单独地或组合地使用，用于减少或降低植物的植物避荫反应，和增加植物的产量。也就是说，本发明的方法会预防植物的避荫反应和平衡对光的不对称竞争效应。所述方法与植物的产量-密度和生产力-密度关系具有重要关联。本发明的植物表现出改变的光形态发生和改进的产量，但是没有表现出在高密度环境生长的典型植物的特征。

本发明包括分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白或它们的生物活性部分实质上或基本上不含存在于其天然环境中的通常与多核苷酸或蛋白相随或相互作用的组分。因此，由重组技术制备时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白基本上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。最优地，“分离的”多核苷酸不含有在获取该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸的序列(即位于多核苷酸5’和3’端的序列)(最优地，蛋白编码序列)。例如，在多种实施方案中，分离的多核苷酸可包含在获取该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的蛋白包括含有小于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当重组制备本发明的蛋白或其生物活性部分时，最优地，培养基代表化学前体或非目标蛋白的化学物质的小于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)。

本发明也包括公开的多核苷酸的片段和变体和其编码的蛋白。“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分和其编码的蛋白。多核苷酸片段可以编码保留天然蛋白的生物活性并从而具有ELF3蛋白或bHLH-041蛋白活性的蛋白片段。在本文别处描述了bHLH-041蛋白活性的测量。或者，用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列片段的范围可以是至少约20个核苷酸，约50个核苷酸，约100个核苷酸和最高达编码本发明蛋白的全长多核苷酸。

编码本发明ELF3蛋白的生物活性部分的ELF3多核苷酸片段将编码至少15，25，30，50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750个连续氨基酸或最高达在本发明的全长ELF3蛋白中存在的氨基酸总数(例如，对于SEQ ID NO：3，759个氨基酸)。在有些实施方案中，编码本发明ELF3蛋白的生物活性部分的ELF3多核苷酸片段将编码包含下述区域的ELF3多肽片段：至少区域I，对应着SEQ ID NO：3的残基20-57，至少区域II，对应着SEQ ID NO：3的残基362-410，至少区域III，对应着SEQ ID NO：3的残基516-535，至少区域IV，对应着SEQ ID NO：3的残基728-754)，或SEQ ID NO：3的区域I、II、III和IV的任意组合，其中这些区域中的每一个由SEQ ID NO：2所述的对应密码子或替代密码子(由于遗传密码的简并性)编码。因而，例如，编码的ELF3多肽片段可以包含与SEQ ID NO：3的区域I和II、SEQ ID NO：3的区域I和III、SEQ ID NO：3的区域I和IV、SEQ ID NO：3的区域I、II、和III、SEQ ID NO：3的区域I、III、和IV、SEQ ID NO：3的区域I、II、III、和IV、SEQ ID NO：3的区域II和III、SEQ ID NO：3的区域II和IV、SEQ ID NO：3的区域II、III、和IV、或SEQ ID NO：3的区域III和IV相对应的残基，其中这些区域中的每一个由SEQ ID NO：2所述的对应密码子或替代密码子(由于遗传密码的简并性)编码。但是，用作杂交探针或PCR引物的本发明的多核苷酸片段通常不需要编码ELF3蛋白的生物活性部分。

编码本发明bHLH-041蛋白的生物活性部分的bHLH-041多核苷酸片段将编码至少15，25，30，50，100，150，200，250，300，350，400，450个连续氨基酸或最高达在本发明的全长bHLH-041蛋白中存在的氨基酸总数(例如，对于SEQ ID NO：6，466个氨基酸)。在有些实施方案中，编码本发明bHLH-041蛋白的生物活性部分的bHLH-041多核苷酸片段将编码包含下述区域的bHLH-041多肽片段：至少bHLH特征结构域的碱性区域，其中所述碱性区域对应着SEQ ID NO：6的残基293-302，至少bHLH特征结构域的HLH区域，其中所述bHLH特征结构域对应着SEQID NO：6的残基287-339，或这些区域二者，其中这些区域中的每一个由SEQ ID NO：5所述的对应密码子或替代密码子(由于遗传密码的简并性)编码。在其它实施方案中，编码本发明bHLH-041蛋白的生物活性部分的bHLH-041多核苷酸片段将编码包含bHLH特征结构域的多肽，所述bHLH特征结构域对应着SEQ ID NO：6的残基287-339，其中该区域由SEQ ID NO：5所述的对应密码子或替代密码子(由于遗传密码的简并性)编码。但是，用作杂交探针或PCR引物的本发明的多核苷酸片段通常不需要编码bHLH-041蛋白的生物活性部分。

因而，ELF3或bHLH-041多核苷酸的片段可以分别编码ELF3或bHLH-041蛋白的生物活性部分，或它可以是可用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。通过分别分离本发明的ELF3或bHLH-041多核苷酸之一的一部分，表达编码的ELF3或bHLH-041蛋白的部分(例如，通过体外重组表达)，和评估编码的ELF3或bHLH-041多肽的部分的活性，可以制备ELF3或bHLH-041蛋白的生物活性部分。作为ELF3或bHLH-041核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，800，900，1,000，1,100，1,200，1,300或1,400个连续核苷酸或最高达本文公开的全长ELF3或bHLH-041多核苷酸中存在的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID NO：1，2和5，分别是2496，2277，和1401个核苷酸)。

“变体”意在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一或多个位点的一或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸的一或多个位点的一或多个核苷酸的取代。本文使用的“天然的”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性，编码本发明的ELF3或bHLH-041多肽之一的氨基酸序列的那些序列。可使用公知的分子生物学技术，例如下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术，鉴定诸如这些的天然存在的等位变体。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，例如通过采用例如定点诱变产生、但仍然编码本发明的ELF3或bHLH-041蛋白的多核苷酸。一般而言，本发明的特定多核苷酸(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：5)的变体与该特定多核苷酸将具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或或更高的序列同一性，如通过本文其它地方说明的序列比对程序和参数所确定的。

也可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比，对本发明的特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体进行评价。因此，例如，公开了编码分别与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6的ELF3或bHLH-041多肽具有给定的序列同一性百分比的多肽的分离的多核苷酸。任何两条多肽之间的序列同一性百分比可以使用在本文其它地方说明的序列比对程序和参数计算得出。在通过比较多核苷酸编码的两条多肽之间的序列同一性百分比来对本发明的任何给定的多核苷酸对进行评价时，两条被编码的多肽之间的序列同一性百分比是至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

“变体”蛋白意在表示：通过在天然蛋白的一或多个位点的一或多个氨基酸的缺失或添加和/或在天然蛋白的一或多个位点的一或多个氨基酸的取代，从天然蛋白衍生的蛋白。本发明包含的变体蛋白是有生物活性的，也就是说它们仍然具有想要的天然蛋白的生物活性，即本文所述的转录因子活性(对于bHLH-041而言)和光感受器活性的调节(对于ELF3而言)。这些变体可因为例如遗传多态性或或因为人为操作而产生。如通过在本文其它地方说明的序列比对程序和参数所确定的，本发明的天然ELF3或bHLH-041蛋白的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的区别可以在于少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个例如6-10个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或甚至少至1个氨基酸残基。

本发明的蛋白可以通过多种方式被改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这些操作的方法是本领域普遍已知的。例如，可以通过DNA中的突变，制备ELF3和bHLH-041蛋白的氨基酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域公知的。见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)以及其中引用的参考文献。关于不影响目标蛋白的生物活性的合适的氨基酸取代的指导，可见Dayhoff等人(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型，该文献在本文中引作参考。保守取代，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸交换，可能是最优的。

因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列和突变体形式。同样地，本发明的蛋白包括天然存在的蛋白及其变体和经修饰形式。这些变体仍然具有希望的活性。显而易见，将在编码变体的DNA中进行的突变不必将序列置于可读框之外，且任选地不会产生能够形成二级mRNA结构的互补区域。参见，EP专利申请公开号75,444。

本文中包含的蛋白序列的缺失、插入以及取代预期不对蛋白特征产生根本变化。但是，当在进行取代、缺失或插入前难以预计这么做的准确效果时，本领域技术人员会知道：可以通过常规筛选实验对该效果加以评估。也就是说，可以通过常规转基因植物分析来评价活性，观察为植物密度反应的破坏或希望的表型改变的出现，例如避荫反应的抑制和对植物密度的增加的耐受性。

变体多核苷酸和蛋白还包含通过诱变和重组步骤(例如DNA重排)获得的序列和蛋白。使用这样的步骤，可操作一种或多种不同的ELF3或bHLH-041编码序列，以制造出具有理想性质的新的ELF3或bHLH-041蛋白。以此方式，从一组相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸文库，这些多核苷酸包含具有显著的序列同一性且能够在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用该方法，编码目标结构域的序列基序可以在本发明的ELF3或bHLH-041基因和其它已知的ELF3或bHLH转录因子基因之间重排，以获得编码具有改良的目标性质的蛋白的新基因。这些DNA重排的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri，等人，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore，等人，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang，等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri，等人，(1998)Nature 391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

本发明的组合物也包括分离的核酸分子，后者包含SEQ ID NO：4所述的玉米ELF3启动子(也称作ZM-ELF3启动子)核苷酸序列。“启动子”是指通常包含TATA盒的DNA调节区，所述TATA盒能指导RNA聚合酶II在对于特定编码序列而言适当的转录起始位点启动RNA合成。启动子可以额外包含通常位于TATA盒的上游或5′的其它识别序列，它们称作上游启动子元件，影响转录起始速率。这样的元件包括存在于SEQ ID NO：4的核苷酸402-405处的推定的CAAT元件。另外，在上游ZM-ELF3序列内存在与“夜晚元件基序”具有约50％同一性的6个序列基序，所述“夜晚元件基序”与植物基因的昼夜节律控制相关。参见，图3。

认识到已经鉴别出本文公开的启动子区域的核苷酸序列，在本文定义的特定启动子区域上游的5′非翻译区域中分离和鉴别额外调节元件属于现有技术。因而，例如，本文公开的启动子区域可以进一步包含赋予可操作地连接至公开的启动子序列上的异源核苷酸序列的组织优选表达的上游调节元件。更具体地参见，澳大利亚专利号AU-A-77751/94和美国专利号5,466,785和5,635,618。

本发明也包括公开的ZM-ELF3启动子核苷酸序列的片段和变体。“片段”是指核苷酸序列的一部分。启动子核苷酸序列的片段可以保留生物活性，因而保留它们的转录调节活性。因而，例如，小于本文公开的完整启动子序列可以用于驱动可操作地连接的目标核苷酸序列，例如编码异源蛋白的核苷酸序列的表达。或者，可用作杂交探针的启动子核苷酸序列的片段通常不保留生物活性。因而，启动子核苷酸序列的片段的范围可以是至少约20个核苷酸，约50个核苷酸，约100个核苷酸，和最高达本发明的全长启动子核苷酸序列。

因而，ELF3启动子核苷酸序列的片段可以编码ELF3启动子的生物活性部分，或它可以是可用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。通过分离本发明的ELF3启动子核苷酸序列的一部分，和评估ELF3启动子的该部分的活性，可以制备ELF3启动子的生物活性部分。作为ELF3启动子核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少16，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450个核苷酸或最高达本文公开的全长ELF3启动子核苷酸序列中存在的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID NO：4所示的ZM-ELF3启动子，459个核苷酸)。测定启动子序列的活性的实验是本领域众所周知的。例如，ELF3启动子片段或变体可以可操作地连接至编码任意报道蛋白(例如β-葡糖醛酸糖苷酶蛋白(GUS报道物)或萤光素酶蛋白)的核苷酸序列。将DNA构建体插入植物或植物细胞的基因组，测定报道序列的mRNA或蛋白水平。参见，例如，Eulgem，等人，(1999)EMBO Journal 18：4689-4699。

本发明的多核苷酸可以用于从其它生物体、尤其其它植物、更具体地其它单子叶植物分离对应序列。以此方式，基于与本文所述序列的序列同源性，PCR、杂交等方法可以用于鉴别这样的序列。本发明包括基于与本文所述完整ELF3或bHLH-041序列或其变体和片段的序列同一性分离的序列。这样的序列包括，作为公开的序列的直向同源物的序列。“直向同源物”意在表示下述基因，它们来自共同的祖先基因，且由于物种形成(speciation)在不同的物种中被发现。当它们的核苷酸序列和/或它们所编码的蛋白序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直向同源物。直向同源物的功能在物种间常常是高度保守的。因而，本发明包括编码ELF3或bHLH-041蛋白的分离的多核苷酸，或赋予启动子活性且在严格条件下与本文公开的各个ELF3或bHLH-041核苷酸序列或其变体或片段杂交的分离的多核苷酸。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何目标植物中提取的cDNA或基因组DNA扩增相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域普遍已知的，且公开在Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。也见Innis，等人，编.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，编.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；和Innis和Gelfand，编.(1999)PCR MethodsManual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，已知多核苷酸的全部或部分被用作探针，该探针能与来自选定生物体的经克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组或cDNA文库)中存在的其它相应的多核苷酸选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，且可用可检测基团例如³²P或任何其它可检测标记对其进行标记。因此，例如，可通过对基于本发明ELF3或bHLH-041多核苷酸的合成寡核苷酸进行标记，来制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的，且在Sambrook，等人，(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，New York)中公开。

例如，本文公开的完整ELF3或bHLH-041多核苷酸或其一个或多个部分，可用作能与相应的elf3或bHLH-041多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了在各种条件下实现特异性杂交，此类探针包含在ELF3或bHLH-041多核苷酸序列中特有的、且优选地长度为至少约10个核苷酸、最优选地长度为至少约20个核苷酸的序列。这样的探针可用于通过PCR从选定的植物扩增相应的多核苷酸。该技术可用于从需要的植物分离其它编码序列，或用作诊断实验以确定编码序列在植物中的存在。杂交技术包括铺板DNA文库(plated DNA library)的杂交筛选(噬菌斑或菌落；见例如，Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

这些序列的杂交可在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意在表示下述条件：在该条件下探针将和其靶序列以相比于其它序列可检测的更高的程度杂交(例如，至少高于背景2倍)。严格条件是序列依赖性的且在不同环境下将不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件从而允许序列的一些错配由此检测到更低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是这样的条件，其中盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH7.0至8.3，且温度对于短探针(例如10至50个多核苷酸)为至少约30℃，对长探针(例如大于50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。示例性的低严格条件包括于37℃在30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，并于50至55℃在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸钠)中洗涤。示例性的中严格条件包括于37℃在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃在0.5×至1×SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并于60至65℃在0.1×SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％ SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4至约12小时。洗涤持续时间将至少为足够达到平衡的时间长度。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体而言，T_m可从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程：T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/l来估算；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞苷的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对的长度。T_m是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，T_m降低约1℃；因此，T_m、杂交和/或洗涤条件可被调节以与具有需要的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90％同一性的序列，T_m可被降低10℃。一般地，在确定的离子强度和pH下对于特定序列及其互补序列而言，严格条件被选定为比热解链温度(T_m)低约5℃。但是，非常严格的条件可在比热解链温度(T_m)低1、2、3、4℃时使用杂交和/或洗涤；中严格条件可在比热解链温度(T_m)低6、7、8、9或10℃时使用杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热解链温度(T_m)低11、12、13、14、15或20℃时使用杂交和/或洗涤。使用方程、杂交和洗涤组合物、以及需要的T_m，普通技术人员将理解：杂交和/或洗涤溶液的严格性的改变是被内在描述的。如果希望的错配程度导致了小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，最优地提高SSC浓度，使得更高的温度可被使用。关于核酸序列杂交的大量指导可在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization withNucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel，等人，编.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)中找到。参见，Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

以下的术语被用于说明两条或多条核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参照序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分比”。

(a)本文使用的“参照序列”是作为序列比较的基础被使用的确定序列。参照序列可以是特定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因片段。

(b)本文使用的“比较窗”指多核苷酸序列的连续和特定的片段，其中，为进行对两条多核苷酸的最优比对，在比较窗中的多核苷酸序列与参照序列(该序列不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)。通常，比较窗的长度为至少20个连续核苷酸，任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域的技术人员明白：为了避免由于在多核苷酸中包括缺口造成的与参照序列的高度相似性，典型地，引入缺口罚分，其从配对数目中减除。

用于比较的序列比对法是本领域公知的。因此，任何两条序列之间的序列同一性百分比的确定可以使用数学算法完成。这些数学算法的非限定性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局(global)比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的检索局部比对(search-for-local alignment)法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中对其进行了改进。

这些数学算法的计算机实现可用于序列的比较以确定序列同一性。这样的实现包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(获自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(2.0版)和GCG Wisconsin Genetics软件包，版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(获自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA)。使用这些程序的比对可使用默认参数进行。CLUSTAL程序由Higgins等人(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331详细描述。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。当比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表(weight residuetable)、缺口长度罚分12以及缺口罚分4可以用于ALIGN程序。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。BLAST核苷酸检索可使用BLASTN程序，分值(score)＝100，字长(wordlength)＝12进行以获得与编码本发明的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可使用BLASTX程序，分值＝50，字长＝3进行以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了实现带缺口的比对，用于比较目的，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述，Gapped BLAST(在BLAST2.0中)可被使用。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可用于进行迭代检索，该检索检测到分子间的远关联。见Altschul等人(1997)同上。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，相应程序的默认参数(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)可被使用。见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对也可以通过人工观察进行。

除非另外声明，在此提供的序列同一性/相似性数值指使用GAP版本10使用以下参数获得的数值：使用缺口权重(GAP Weight)50和长度权重(Length Weight)3以及nwsgapdna.cmp计分矩阵获得的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用缺口权重8和长度权重2以及BLOSUM62计分矩阵获得的氨基酸序列的％同一性和％相似性。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法以找出对两条完整序列的下述比对，所述比对将配对数量最大化且将缺口数量最小化。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，且产生具有最大数量配对碱基和最少缺口的比对。它可以提供以配对碱基为单位的缺口制造罚分(gap creation penalty)和缺口延伸罚分(gap extensionpenalty)。针对其插入的每个缺口，GAP必须获得缺口制造罚分数量的配对利益。如果选择大于零的缺口延伸罚分，GAP还必须针对每个插入的缺口获得缺口长度乘以缺口延伸罚分的利益。在GCG Wisconsin遗传学软件包(Accelrys，Inc.，San Diego，California)的版本10中对于蛋白序列的默认的缺口制造罚分值和缺口延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认的缺口制造罚分是50而默认的缺口延伸罚分是3。缺口制造和缺口延伸罚分可被表示为：选自由0至200组成的整数组中的整数。因此，例如，缺口制造和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。

GAP是最佳比对家族中的一员。该家族还可能有很多成员，但没有其它成员具有更好的质量。对于比对，GAP呈现了四个优良数据：质量、比率、同一性和相似性。质量是为了比对序列而最大化的衡量标准。比率是质量除以更短片段中的碱基数目。同一性百分比是真正匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。越过缺口的符号被忽略。当一对符号的计分矩阵值大于或等于0.50，即相似性阈值时，相似性被计分。在GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中使用的计分矩阵是BLOSUM62(见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)本文使用的关于两条多核苷酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”指：当在特定比较窗中以最大对应性进行比对时，两序列中相同的残基。当关于蛋白的序列同一性百分比被使用时，将理解：不相同的残基位点常常是由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基由其它具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。当序列由于保守取代不同时，序列同一性百分比可被上调，以针对取代的保守性质进行校正。由于此类保守取代而不同的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。进行这样的调节的方法是本领域技术人员公知的。典型地，调节方法包括将保守取代计分为部分而非完全错配，由此增加了序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸被给予1分且非保守取代被给予0分时，保守取代被给予0至1之间的分数。计算保守取代的得分，例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中实现。

(d)本文使用的“序列同一性百分比”指：通过在比较窗中比较两条最优比对的序列从而确定的数值，其中对于两序列的最优比对而言，比较窗中的多核苷酸序列的部分与参照序列(该序列不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)。通过确定在两序列中发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位点的数量，产生配对位点的数量，将配对位点的数量除以在比较窗中的位点的总数量，并将结果乘以100，产生序列同一性的百分比，从而计算百分比。

术语“多核苷酸”的使用无意将本发明限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明的多核苷酸也包括序列的所有形式，包括、但不限于，单链形式，双链形式，发夹，茎-和-环结构等。

ELF3和bHLH-041多核苷酸可以提供在用于在目标植物中表达的表达盒中。如上所述，对于避荫反应的抑制，对于ELF3水平的操作，该盒将提供ELF3多肽的表达，同时提供bHLH-041水平的操作，制备该构建体来抑制bHLH-041多肽在转基因植物中的表达。该盒包括可操作地连接至ELF3编码序列或当表达时能减少或消除本发明的bHLH多肽或有关的bHLH转录因子的表达的多核苷酸上的5′和3′调节序列。“可操作地连接”意在指2个或多个元件之间的功能连接。例如，目标多核苷酸和调节序列(即，启动子)之间的可操作连接是允许表达目标多核苷酸的功能连接。可操作地连接的元件可以是相邻的或非相邻的。当用于指2个蛋白编码区的连接时，“可操作地连接”意指所述编码区在同一个可读框中。表达盒可以另外含有至少一个要共转化到生物体中的其它基因。或者，所述其它基因可以提供在多个表达盒上。这样的表达盒被提供了多个限制位点和/或重组位点，用于插入将在调节区的转录调节下的多核苷酸。表达盒可以另外含有选择标记基因。

按照5′-3′转录方向，表达盒通常包括，转录和翻译起始区(即，启动子)，本发明的多核苷酸，和在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。调节区(即，启动子，转录调节区，和翻译终止区)和/或本发明的多核苷酸可以对于宿主细胞或彼此是天然的/类似的。或者，调节区和/或本发明的多核苷酸可以对于宿主细胞或彼此是异源的。本文使用的“异源的”序列是源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，通过故意的人工干预，在组成和/或基因组基因座上基本上从它的天然形式修饰。例如，可操作地连接到异源多核苷酸上的启动子是来自不同于多核苷酸来源物种的物种，或者，如果来自相同/类似物种，一个或二者基本上从它们的最初形式和/或基因组基因座修饰，或启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。本文使用的嵌合基因包含可操作地连接到转录起始区上的编码序列，所述转录起始区与所述编码序列异源。

尽管使用异源启动子来表达序列可能是最佳的，但可以使用天然启动子序列。这样的构建体可以改变植物或植物细胞中ELF3或bHLH-041的表达水平。因而，可以改变植物或植物细胞的表型。

终止区可以是转录起始区天然的，可以是可操作地连接的目标多核苷酸天然的，可以是植物宿主天然的，或可以源自与启动子、目标多核苷酸、植物宿主或它们的任意组合不同的另一来源(即，外来的或异源的)。方便的终止区可以从根癌土壤杆菌的Ti-质粒得到，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见，Guerineau，等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon，等人，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen，等人，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe，等人，(1990)Gene 91：151-158；Ballas，等人，(1989)NucleicAcids Res.17：7891-7903；和Joshi，等人，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。

在适当时，可以优化多核苷酸，以增强在转化的植物中的表达。也就是说，可以使用植物优选的密码子合成多核苷酸，用于提高表达。关于宿主优选的密码子选择的讨论，参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。本领域可以得到合成植物优选的基因的方法。参见，例如，美国专利号5,380,831，和5,436,391，和Murray，等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，它们在本文中引作参考。

已知其它序列修饰能提高在细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括将编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列和其它此类可能对基因表达有害的充分表征的序列去除。可将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，该水平通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得出。在可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可额外包含5’前导序列。这些前导序列可以增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯丫病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人(1995)Gene165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)(Virology 154：9-20)、和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的包膜蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。也见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。

在制备表达盒的过程中，可以对多种DNA片段加以操作，由此提供正确定向的DNA序列，以及适用的话，在正确可读框内的DNA序列。为了这个目标，可以使用衔接子或接头连接DNA片段，或可以包含其它的操作以提供方便的限制性位点，实现多余DNA的去除、限制性位点的去除等。为了这个目的，可包含体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、重取代(例如转换和颠换)等。

许多启动子可用于实践本发明，包括目标多核苷酸序列的天然启动子。可根据希望的结果对启动子加以选择。也就是说，所述核酸可以与组成型启动子、组织优选的启动子，包括但不限于叶优选的启动子、光调节的或光诱导型启动子、昼夜节律钟调节的启动子、或用于在植物中表达的其它启动子相组合。组成型或营养组织优选的启动子是优选的。

这些组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如在美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；6,177,611；6,670,467；和6,504,083中公开的那些启动子。

组织优选的启动子可用于靶向特定植物组织中的表达。组织优选的启动子包括Yamamoto，等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata，等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen，等人，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell，等人，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart，等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp，等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini，等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto，等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco，等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka，等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia，等人，(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，此类启动子可以经修饰以用于弱表达。

叶优选的启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto，等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon，等人，(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto，等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor，等人，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco，等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka，等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。

光调节的或光诱导型启动子会提供反应于植物环境中光的数量和/或质量的可操作地连接的核苷酸序列的表达。光调节的启动子是本领域已知的，包括、但不限于，来自多个物种的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基(rbcS)基因启动子(参见，例如，Kyozuka，等人，(1993)PlantPhysiol.102：991-1000讨论了稻和番茄rbcS启动子；Bansal，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：3654-3658，和Schaffner和Sheen(1991)PlantCell 3(9)：997-1012，二者讨论了玉米rbcS启动子；和Timko，等人，(1985)Nature 318：579-582，和Coruzzi，等人，(1984)EMBO J.3(8)：1671-1679，二者讨论了豌豆rbcS启动子)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因启动子(参见，例如，Matsuoka，等人，(1994)Plant J.6(3)：311-319，它讨论了来自玉米的PEPC启动子)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(参见，例如，Bansal，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：3654-3658，它讨论了玉米cab-ml启动子序列)；等。

其它目标启动子包括、但不限于，反应于昼夜节律的启动子，在本文中称作昼夜节律钟调节的启动子。实例包括、但不限于，捕获光的复合体(LHC)的基因的启动子(参见，例如，Piechulla(1998)Chronobiol.Int.16(2)：15-128和Piechulla，等人，(1998)Plant Mol.Biol.38(4)：655-662)；查耳酮合酶(CHS)启动子(参见，例如，Thain，等人，(2002)PlantPhysiol.130(1)：102-110)；植物光敏素和隐花色素基因启动子(参见，例如，Tóth，等人，(2001)Plant Physiol.127：1607-1616；等。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因被用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物，例如草铵膦(glufosinate ammonium)、溴草腈(bromoxynil)、咪唑啉酮、和2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D)的抗性的基因。其它选择标记包括表型标记例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol129：913-42)、以及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，见Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54)。关于其它选择标记，一般地见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao，等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley，等人，(1980)The Operon，pp.177-220；Hu，等人，(1987)Cell 48：555-566；Brown，等人，(1987)Cell 49：603-612；Figge，等人，(1988)Cell52：713-722；Deuschle，等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404；Fuerst，等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle，等人，(1990)Science248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines，等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow，等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Baim，等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076；Wyborski，等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb，等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt，等人，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551；Oliva，等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka，等人，(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill，等人，(1988)Nature 334：721-724。这些公开物在本文中引作参考。

选择标记基因的以上列表并不意味着限定。任何选择标记基因可用于本发明。

本发明的方法包括将多肽或多核苷酸引入植物。“引入”意在表示将多核苷酸或多肽提供给植物，其提供方式使得序列能够进入植物细胞的内部。本发明的方法不依赖于特定的将序列引入植物的方法，只要多核苷酸或多肽能够进入至少一个植物细胞内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

“稳定转化”意在表示引入植物的核苷酸构建体整合进植物基因组，并能够由其后代遗传。“瞬时转化”意在表示多核苷酸被引入植物且不整合进植物的基因组，或多肽被引入植物。

转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案可根据被靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶或双子叶)而变化。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、土壤杆菌-介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)以及生物射弹粒子加速(见例如Sanford等人，美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和，5,932,782；Tomes等人(1995)in Plant Cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lecl转化(WO 00/28058)。也参见，Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利号5,736,369(荞麦)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker-介导的转化)；D’Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports 12：250-255以及Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(通过根癌土壤杆菌的玉米)；它们在本文中引作参考。

在其它实施方案中，通过将植物与病毒或病毒核酸接触，本发明的多核苷酸可被引入植物。通常，这样的方法包括将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子。认识到本发明的ELF3或bHLH-041蛋白可首先作为病毒多蛋白的一部分被合成，随后可通过体内或体外的蛋白水解对该多蛋白进行加工，产生想要的重组蛋白。进一步地，认识到本发明的启动子也包含用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。将多核苷酸引入植物并在其中表达由其编码的蛋白(涉及病毒DNA或RNA分子)的方法是本领域已知的。见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，和Porta等人(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；它们在本文中引作参考。

用于在植物基因组的特定位点将多核苷酸靶向插入的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在想要的基因组位点的插入通过使用位点特异性重组系统实现。见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些文献在本文中引作参考。简言之，本发明的多核苷酸可被包含在转移盒中，该盒由两个不引起重组的重组位点侧接。转移盒被引入下述植物，所述植物具有被稳定引入其基因组的靶位点，该位点由两个不引起重组的重组位点侧接，这些重组位点对应于转移盒的位点。提供合适的重组酶，转移盒被整合进靶位点。目标多核苷酸由此被整合进植物基因组中的特定染色体位点。

可根据常规方法将已转化的细胞培养为植物。见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可生长，并由相同转化株或不同株授粉，得到的具有想要的表型特征的表达的后代被鉴定出来。可培养两代或更多代，以确保想要的表型特征的表达被稳定维持且被遗传，随后收获种子以确保想要的表型特征的表达已被实现。以这种方式，本发明提供了经转化的种子(也被称作“转基因种子”)，所述种子具有稳定掺入它们的基因组的本发明的多核苷酸，例如本发明的表达盒。

本文使用的术语植物细胞包括植物原生质体，以及可以再生植物的植物组织培养物中的细胞，包括植物愈伤组织和植物团块。植物细胞可以在植物或植物部分中是完整的，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等。

谷粒意在指商业种植者为了生长或繁殖物种以外的目的生产的成熟种子。

再生植物的后代、变体和突变体也包含在本发明的范围内，前提是这些部分包含引入的多核苷酸。

本发明可以用于转化任意植物物种，包括、但不限于，单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物物种的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、白菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))，特别是那些用作种子油来源的芸苔种，苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、黍(例如珍珠黍(Pennisetumglaucum)、稷(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔树(Citrus spp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica))、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松类。

蔬菜包括西红柿(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、绿豆(Phaseolus vulgaris)、青豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、以及甜瓜属(Cucumis)的成员例如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissusspp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可用于实现本发明的松类包括：例如松树，如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、小杆松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；白云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；真杉例如银冷杉(Abies amabilis)和冷杉(Abiesbalsamea)；以及雪松例如北美乔柏(Thuja plicata)和阿拉斯加桧柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施方案中，本发明的植物是农作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高梁、小麦、黍、烟草等)。在其它一些实施方案中，玉米和大豆植物是最优的，在另一些实施方案中，玉米植物是最优的。

“主题植物”或“主题植物细胞”是这样的，其中目标基因已经发生了遗传改变例如转化，或是作为这样改变的植物或植物细胞的后代、且包含该改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了测量主题植物或植物细胞的变化的参照点。

对照植物或对照植物细胞可以包含，例如：(a)野生型植物或植物细胞，即，具有与产生主题植物或主题植物细胞的遗传改变的原料相同的基因型；(b)具有与原料相同的基因型、但是已经用无效构建体(即，对目标性状没有已知作用的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)作为主题植物或主题植物细胞的后代中的未转化分离体的植物或植物细胞；(d)在遗传上与主题植物或主题植物细胞相同、但是没有暴露于诱导目标基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)在不表达目标基因的条件下的主题植物或主题植物细胞本身。

在某些物种例如玉米中，对照和参照植物可以代表2个杂种，其中第一个杂种从2个亲本近交系产生，第二个杂种从相同的2个亲本近交系产生，例外是亲本近交系之一含有重组DNA构建体。通常相对于第一个杂种测量第二个杂种的性能。

另外，在相对于不包含重组DNA、但是其它方面具有与植物相当的遗传背景的对照植物评价或测量包含重组DNA构建体的植物时，对照和参照植物的核遗传物质可以具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。有许多基于实验室的技术可用于分析、对比和表征植物遗传背景；它们包括同工酶电泳，限制片段长度多态性(RFLPs)，随机扩增的多态性DNA(RAPDs)，任意引发的聚合酶链反应(AP-PCR)，DNA扩增指纹(DAF)，序列表征的扩增区域(SCARs)，扩增的片段长度多态性(AFLPs)，和也称作微卫星的简单序列重复(SSRs)。

在本发明情况下，例如，在不同实施方案中，通过对比主题植物或主题植物细胞与对照植物或对照植物细胞，可以测量ZmELF3或bHLH-041活性的变化和/或一个或多个性状(例如叶大小或形状，种子产生，茎或叶柄伸长，叶绿素合成，或分枝)的变化。

提供了调控植物中本发明的ELF3多肽的浓度和/或活性(即ZmELF3蛋白活性)的方法。一般而言，与不具有导入的本发明序列的天然对照植物、植物部分或植物细胞相比，浓度和/或活性增加了至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明的调控可以以暂时或发育模式发生。在具体实施方案中，本发明的多肽在作物植物中增加。

可以直接测量ELF3多肽的表达水平，例如，通过测定植物或植物细胞中ELF3多肽的水平，或间接测量，例如，通过在表型水平测定在转基因植物中的效应，即，通过转基因植物分析，观察为植物密度反应的破坏或希望的表型改变的出现，例如避荫反应的抑制和增加的对植物密度的耐受性。

在具体实施方案中，将本发明的多肽或多核苷酸引入植物细胞。随后，使用本领域技术人员已知的方法，例如但不限于，DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析，选择具有引入的本发明序列的植物细胞。使通过前述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在植物形成条件下生长足以调节植物中本发明多肽的浓度和/或活性的时间。植物形成条件是本领域众所周知的，且在本文其它地方简单讨论。

在有些实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞，所述表达盒表达抑制bHLH-041的表达的多核苷酸，降低或消除本发明的bHLH-041多肽或它的直向同源物的活性。所述多核苷酸可以通过阻止bHLH-041信使RNA的转录或翻译，直接抑制bHLH-041的表达，或通过编码抑制编码bHLH-041的基因的转录或翻译的多肽，或通过编码干扰内源bHLH-041蛋白的功能的多肽，间接抑制。抑制或消除基因在植物中表达的方法是本领域众所周知的，任意这样的方法可以用于本发明中抑制bHLH-041的表达，从而改变bHLH-041蛋白活性。

根据本发明，如果bHLH-041的蛋白水平在统计上低于未经遗传修饰或诱变来抑制该bHLH-041的表达的植物中相同bHLH-041的蛋白水平，则bHLH-041基因的表达被抑制。在本发明的具体实施方案中，根据本发明的修饰的植物中bHLH-041的蛋白水平少于不是突变体或未经遗传修饰来抑制该bHLH-041的表达的植物中相同bHLH-041的蛋白水平的95％、少于所述水平的90％、少于所述水平的80％、少于所述水平的70％、少于所述水平的60％、少于所述水平的50％、少于所述水平的40％、少于所述水平的30％、少于所述水平的20％、少于所述水平的10％或少于所述水平的5％。可以直接测量bHLH-041的表达水平，例如，通过测定植物细胞或植物中表达的bHLH-041的水平，或间接测量，例如，通过在表型水平观察在转基因植物中的效应，即，通过转基因植物分析，观察为植物密度反应的破坏或希望的表型改变的出现，例如避荫反应的抑制和增加的对植物密度的耐受性。

另外，或替代地，通过监视其表达受bHLH-041表达调控的基因的表达水平，可以直接测量bHLH-041的表达水平。以此方式，这些相关的基因的表达水平的变化将指示着bHLH-041的表达水平的变化，因而这些相关的基因可以用作bHLH-041活性的标志。不受理论的约束，这样的相关基因的实例包括ELF3本身或光和昼夜节律基因(例如，植物光敏素，过氧化氢酶，硝酸还原酶)。

在本发明的其它实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含编码抑制bHLH-041的活性的多肽的多核苷酸，降低或消除bHLH-041的活性。如果bHLH-041的活性在统计上低于已经遗传地修饰来抑制该bHLH-041的活性的植物中相同bHLH-041的活性，则根据本发明抑制bHLH-041的活性。在本发明的具体实施方案中，根据本发明的修饰的植物中bHLH-041的活性少于没有遗传地修饰来抑制该bHLH-041的表达的植物中相同bHLH-041的活性的95％、少于所述水平的90、少于所述水平的80％、少于所述水平的70％、少于所述水平的60％、少于所述水平的50％、少于所述水平的40％、少于所述水平的30％、少于所述水平的20％、少于所述水平的10％或少于所述水平的5％。当通过本文别处所述的测定方法不可检测时，根据本发明“消除”了bHLH-041的活性。

在其它实施方案中，通过破坏编码bHLH-041蛋白的基因，可以降低或消除bHLH-041的活性。本发明包括携带bHLH-041基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变降低bHLH-041基因的表达或抑制编码的bHLH-041的活性。

因而，许多方法可以用于降低或消除bHLH-041的活性。超过一种方法可以用于降低单一植物bHLH-041的活性。下面给出了降低或消除植物bHLH-041的表达的方法的非限制性实例。

在本发明的有些实施方案中，用能表达抑制bHLH-041的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞。本文使用的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，为了本发明的目的，能表达抑制至少一种bHLH-041的表达的多核苷酸的表达盒是能产生抑制至少一种bHLH-041的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白或多肽从DNA分子“表达”或“产生”是指编码序列的转录和翻译以产生蛋白或多肽，而蛋白或多肽从RNA分子“表达”或“产生”是指RNA编码序列的翻译以产生蛋白或多肽。

下面给出了抑制bHLH-041的表达的多核苷酸的实例。

在本发明的有些实施方案中，通过有义抑制或共抑制，可以抑制bHLH-041的表达。对于共抑制，设计表达盒来以“有义”方向表达与编码bHLH-041的信使RNA的全部或一部分相对应的RNA分子。RNA分子的超量表达可以导致天然基因的表达减少。因此，筛选用共抑制表达盒转化的多个植物系，以鉴别表现出bHLH-041表达的最大抑制的那些植物系。

用于共抑制的多核苷酸可以与编码bHLH-041的序列的全部或一部分、bHLH-041转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或一部分、或编码bHLH-041的转录物的编码序列和非翻译区的全部或一部分相对应。在所述多核苷酸包含bHLH-041蛋白的编码区的全部或一部分的有些实施方案中，设计表达盒来消除多核苷酸的起始密码子，所以将不转录蛋白产物。

共抑制可以用于抑制植物基因的表达，以产生具有不可检测的蛋白水平(对于这些基因编码的蛋白)的植物。参见，例如，Broin，等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432。共抑制也可以用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参见，例如，美国专利号5,942,657。使用共抑制来抑制植物中内源基因的表达的方法，描述在Flavell，等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen，等人，(1996)Plant Mol.Biol. 31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin，等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk，等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu，等人，(2003)Phytochemistry 63：753-763；和美国专利号5,034,323，5,283,184，和5,942,657；它们各自在本文中引作参考。通过在表达盒中在有义序列的3′位置和聚腺苷酸化信号的5′包含聚-dT区域，可以增加共抑制效率。参见，美国专利公开号2002/0048814，在本文中引作参考。通常，这样的核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有显著的序列同一性，优选大于约65％序列同一性，更优选大于约85％序列同一性，最优选大于约95％序列同一性。参见，美国专利号5,283,184和5,034,323；在本文中引作参考。

在本发明的有些实施方案中，可以通过反义抑制来抑制bHLH-041的表达。对于反义抑制，设计表达盒来表达与编码bHLH-041多肽的信使RNA的全部或一部分互补的RNA分子。反义RNA分子的超量表达可以导致天然基因的表达减少。因此，筛选用反义抑制表达盒转化的多个植物系，以鉴别表现出bHLH-041表达的最大抑制的那些植物系。

用于反义抑制的多核苷酸可以与编码bHLH-041的序列的互补序列的全部或一部分、bHLH-041转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或一部分、或编码bHLH-041的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或一部分相对应。另外，所述反义多核苷酸可以与靶序列完全互补(即，与靶序列的互补序列的同一性是100％)或部分互补(即，与靶序列的互补序列的同一性小于100％)。反义抑制可以用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参见，例如，美国专利号5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可以用于破坏靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中内源基因的表达的方法描述在，例如，Liu，等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利号5,759,829和5,942,657，它们各自在本文中引作参考。通过在表达盒中在反义序列的3′位置和聚腺苷酸化信号的5′包含聚-dT区域，可以增加反义抑制效率。参见，美国专利公开号2002/0048814，在本文中引作参考。

在本发明的有些实施方案中，通过双链RNA(dsRNA)干扰，可以抑制bHLH-041的表达。对于dsRNA干扰，在同一细胞中表达有义RNA分子(如上面关于共抑制所述的有义RNA分子)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子，导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。

通过设计表达盒来包含有义序列和反义序列这两者，可以实现有义和反义分子的表达。或者，可以为有义和反义序列使用分开的表达盒。然后筛选用dsRNA干扰表达盒转化的多个植物系，以鉴别表现出bHLH-041表达的最大抑制的植物系。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法，描述在Waterhouse，等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964，Liu，等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743，和WO 99/49029，WO 99/53050，WO 99/61631，和WO 00/49035；它们各自在本文中引作参考。

在本发明的有些实施方案中，通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰，可以得到bHLH-041表达的抑制。这些方法可以非常有效地抑制内源基因的表达。参见，Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38和其中引用的参考文献。

对于hpRNA干扰，设计表达盒来表达RNA分子，该RNA分子与它自身杂交形成包含单链环区域和碱基配对的茎的发夹结构。所述碱基配对的茎区域包含与编码要抑制其表达的基因的内源信使RNA的全部或一部分相对应的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。因而，所述分子的碱基配对的茎区域通常决定RNA干扰的特异性。hpRNA分子可以非常有效地抑制内源基因的表达，且它们诱导的RNA干扰被植物的后代所继承。参见，例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk，等人，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731；和Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法，描述在例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk，等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini，等人，BMCBiotechnology 3：7，和美国专利公开号20030175965；它们各自在本文中引作参考。hpRNA构建体在体内使基因表达沉默的效率的瞬时测定已经描述在Panstruga，等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140，在本文中引作参考。

对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的一般结构，但是该RNA分子额外包含能在表达ihpRNA的细胞中剪接的内含子。内含子的使用会使剪接后发夹RNA分子中的环的大小最小化，这会增加干扰的效率。参见，例如，Smith，等人，(2000)Nature 407：319-320。实际上，Smith等人使用ihpRNA-介导的干扰，证实了内源基因表达的100％抑制。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法，描述在，例如，Smith，等人，(2000)Nature 407：319-320；Wesley，等人，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)Methods 30：289-295，和美国专利公开号2003/0180945，它们各自在本文中引作参考。

也可以设计用于hpRNA干扰的表达盒，使得有义序列和反义序列不与内源RNA对应。在该实施方案中，有义和反义序列侧接环序列，后者包含与靶基因的内源信使RNA的全部或一部分相对应的核苷酸序列。因而，环区域决定RNA干扰的特异性。参见，例如，WO 02/00904，在本文中引作参考。

转录基因沉默(TGS)可以通过hpRNA构建体的应用来实现，其中发夹的反向重复序列与要沉默的基因的启动子区域具有序列同一性。将hpRNA加工成可以与同源启动子区域相互作用的短RNA，可以触发降解或甲基化，以导致沉默(Aufsatz，等人，(2002)PNAS 99(Suppl.4)：16499-16506；Mette，等人，(2000)EMBO J 19(19)：5194-5201)。

扩增子表达盒包含植物病毒来源的序列，后者含有靶基因的全部或一部分，但是通常不含有天然病毒的全部基因。在表达盒的转录产物中存在的病毒序列允许转录产物指导它自身的复制。由扩增子产生的转录物可以相对于靶序列(即bHLH-041的信使RNA)是有义的或反义的。使用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法，描述在，例如，Angell和Baulcombe(1997)EMBO J.16：3675-3684，Angell和Baulcombe(1999)Plant J.20：357-362，和美国专利号6,646,805，它们各自在本文中引作参考。

在有些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化性RNA，或具有对bHLH-041的信使RNA特异性的核酶活性。因而，所述多核苷酸会造成内源信使RNA的降解，导致bHLH-041的表达减少。该方法描述在，例如，美国专利号4,987,071，在本文中引作参考。

在本发明的有些实施方案中，通过表达编码微RNA(miRNA)的基因，通过RNA干扰可以得到bHLH-041表达的抑制。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA可以非常有效地抑制内源基因的表达。参见，例如，Javier等人，(2003)Nature 425：257-263，在本文中引作参考。

对于miRNA干扰，设计表达盒来表达在内源miRNA基因上建模的RNA分子。所述miRNA基因编码形成发夹结构的RNA，所述发夹结构含有与另一个内源基因(靶序列)互补的22个核苷酸的序列。对于bHLH-041表达的抑制，从bHLH-041转录物序列选择22个核苷酸的序列，且含有有义方向的所述bHLH-041序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的对应反义序列的21个核苷酸。miRNA分子可以非常有效地抑制内源基因的表达，且它们诱导的RNA干扰被植物的后代所继承。

在一个实施方案中，所述多核苷酸编码锌指蛋白，后者结合编码bHLH-041的基因，导致该基因的表达减少。在具体实施方案中，所述锌指蛋白结合bHLH-041基因的调节区。在其它实施方案中，所述锌指蛋白结合编码bHLH-041的信使RNA并阻止它的翻译。选择由锌指蛋白靶向的位点的方法，已经描述在，例如，美国专利号6,453,242，使用锌指蛋白来抑制植物中基因的表达的方法，描述在，例如，美国专利公开号2003/0037355；它们各自在本文中引作参考。

在本发明的有些实施方案中，所述多核苷酸编码抗体，后者结合至少一种bHLH-041，并降低bHLH-041的活性。在另一个实施方案中，抗体的结合导致抗体-bHLH-041复合物通过细胞质量控制机制的更新增加。植物细胞中抗体的表达和通过抗体的表达及与植物细胞中蛋白的结合对分子途径的抑制，是本领域众所周知的。参见，例如，Conrad和Sonnewald(2003)Nature Biotech.21：35-36，在本文中引作参考。

在其它实施方案中，采用减量调节的显性失活方案，其中用编码部分bHLH-041转录因子的多核苷酸转化植物。编码的部分转录因子(它们可能缺少DNA结合域或反式激活域)竞争结合位点，降低天然转录因子的功能作用。参见，例如，Kuhlmann，等人，(2003)J.Biol.Chem.278(10)：8786-8794；Heinekamp，等人，(2004)Plant J.38：298-309；King，等人，(1999)Internat’l.Immun.11(8)：1203-1215。

在本发明的有些实施方案中，通过破坏编码bHLH-041的基因，降低或消除bHLH-041的活性。编码bHLH-041的基因可以通过本领域已知的任意方法来破坏。例如，在一个实施方案中，通过转座子标记技术破坏基因。在另一个实施方案中，通过使用随机的或靶向的诱变来诱变植物，并选择具有降低的bHLH-041活性的植物，从而破坏基因。

在本发明的一个实施方案中，转座子标记技术用于降低或消除bHLH-041的活性。转座子标记技术包含，将转座子插入内源bHLH-041基因内，以降低或消除bHLH-041的表达。“bHLH-041基因”意在表示编码根据本发明的bHLH-041的基因。

在该实施方案中，通过将转座子插入编码bHLH-041的基因的调节区或编码区，降低或消除bHLH-041的表达。在bHLH-041基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任意其它调节序列内的转座子，可以用于降低或消除编码的bHLH-041的表达和/或活性。

植物中特定基因的转座子标记的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Maes，等人，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbioll.Lett.179：53-59；Meissner，等人，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat，等人，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai，等人，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice，等人，(1999)Genetics 153：1919-1928)。另外，选择选定的基因中Mu插入的TUSC方法，已经描述在Bensen，等人，(1995)Plant Cell7：75-84；Mena，等人，(1996)Science 274：1537-1540；和美国专利号5,962,764；它们各自在本文中引作参考。

降低或消除植物中内源基因的表达的其它方法也是本领域已知的，可以类似地应用于本发明。这些方法包括其它形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变，缺失诱变，和以反求遗传学含义(利用PCR)使用，用于鉴别已经缺失内源基因的植物系的快中子缺失诱变。关于这些方法的实例，参见Ohshima，等人，(1998)Virology 243：472-481；Okubara，等人，(1994)Genetics 137：867-874；和Quesada，等人，(2000)Genetics154：421-436；它们各自在本文中引作参考。另外，快速且可自动化的筛选化学诱导的突变的方法，即TILLING(靶向诱导的基因组中的局部损害)，其中使用变性HPLC或选择的PCR产物的选择性内切核酸酶消化，也适用于本发明。参见，McCallum，等人，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，在本文中引作参考。

在本发明的另一个实施方案中，由于基因反转和复制的基因座的重组，显性的突变体可以用于触发RNA沉默。参见，例如，Kusaba，等人，(2003)Plant Cell 15：1455-1467。

本发明包括降低或消除bHLH-041的活性的其它方法。改变或突变植物的基因组核苷酸序列的其它方法的实例是本领域已知的，包括、但不限于，RNA:DNA载体的应用，RNA:DNA突变载体，RNA:DNA修复载体，混合双链体寡核苷酸，自互补的RNA:DNA寡核苷酸，和致重组的寡核苷酸碱基(recombinogenic oligonucleobases)。这样的载体和使用方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972；和5,871,984；它们各自在本文中引作参考。也参见，WO 98/49350，WO 99/07865，WO 99/25821，和Beetham，等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；它们各自在本文中引作参考。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸可以与目标多核苷酸序列的任意组合相堆叠，以便建立具有希望的性状的植物。本文使用的性状是指由特定序列或序列组产生的表型。例如，本发明的多核苷酸可以与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任意其它多核苷酸相堆叠，所述多肽例如其它苏芸金芽胞杆菌毒蛋白(描述在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser，等人，(1986)Gene48：109)，凝集素(Van Damme，等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：825，pentin(描述在美国专利号5,981,722)，等。产生的组合也可以包括任一个目标多核苷酸的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可以与任意其它基因或基因的组合相堆叠，以产生具有多种希望的性状组合的植物，所述性状包括、但不限于，动物饲料需要的性状，例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)和高蛋氨酸蛋白(Pedersen，等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara，等人，(1988)Gene 71：359；和Musumura，等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的消化性(例如，改良的贮藏蛋白(美国申请系列号10/053,410，2001年11月7日提交)；和硫氧还蛋白(美国申请系列号10/005,429，2001年12月3提交))；它们的公开内容在本文中引作参考。

本发明的多核苷酸也可以与下述项目需要的性状相堆叠：疾病或除草剂抗性(例如，伏马毒素(fumonisin)解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒力和疾病抗性基因(Jones，等人，(1994)Science 266：789；Martin，等人，(1993)Science 262：1432；Mindrinos，等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如膦丝菌素或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和加工或加工产物需要的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改良油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)，和淀粉去分支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶，多羟基丁酸合酶，和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert，等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)；它们的公开内容在本文中引作参考。也可以将本发明的多核苷酸与提供雄性不育(例如，参见，美国专利号5,583,210)、茎强度、开花时间等农学性状或细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619，WO 00/17364，和WO99/25821)等转化技术性状的多核苷酸相组合；它们的公开内容在本文中引作参考。

这些堆叠的组合可以通过任意方法来建立，包括、但不限于，通过任意常规方法或TopCross方法或遗传转化来杂交育种植物。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，目标多核苷酸序列可以在任意时间以任意次序组合。例如，包含一个或多个希望的性状的转基因植物可以用作靶，以通过后续转化导入其它性状。性状可以在共转化方法中与由转化盒的任意组合提供的目标多核苷酸同时导入。例如，如果要导入2个序列，这2个序列可以包含在分开的转化盒中(反式)或包含在同一个转化盒中(顺式)。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望导入将抑制目标多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或超量表达盒的任意组合相组合，以在植物中产生希望的性状组合。还认识到，使用位点特异性的重组系统，可以在希望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855，和WO99/25853，它们都在本文中引作参考。

在本发明中公开的ELF3启动子的核苷酸序列以及其变体和片段，当与DNA构建体相组合、使得启动子序列可操作地连接至编码异源目标蛋白的核苷酸序列时，可以用于任意植物的遗传操作。以此方式，本发明的ELF3启动子的核苷酸序列与用于在目标植物中表达的异源核苷酸序列一起提供在表达盒中。

ELF3基因的启动子可以以可诱导方式调节可操作地连接的核苷酸序列的表达。也就是说，植物细胞中可操作地连接的核苷酸序列的表达可以反应于刺激而被诱导。“刺激”是指可以外部应用的或可以反应于另一种外部刺激而积累的化学物质；或其它因子，例如环境信号，包括但不限于，光质量和光数量。

合成的杂合启动子区域是本领域已知的。这样的区域包含可操作地连接至另一个核苷酸序列的启动子元件的一个核苷酸序列的上游启动子元件。在本发明的一个实施方案中，异源基因表达受包含本发明的ELF3启动子序列或其变体或片段的合成杂合启动子控制，所述ELF3启动子序列或其变体或片段可操作地连接至来自异源启动子的上游启动子元件。已经鉴别出上游启动子元件，且可以用于制备合成的启动子。参见，例如，Rushton，等人，(1998)Curr.Opin.Plant Biol.1：311-315。或者，合成的ELF3启动子序列可以包含在ELF3启动子序列内发现的上游启动子元件的副本。这样的元件包括6个序列基序，后者与在本文上面指出的上游ZM-ELF3序列内存在的“夜晚元件”具有约50％同一性(图3)。认识到本发明的启动子序列可以与它的天然ELF3编码序列一起使用。包含与它的天然ELF3序列可操作地连接的ZM-ELF3启动子的DNA构建体可以用于转化任意目标植物，以实现希望的表型变化，例如避荫反应的抑制和增加的对植物密度的耐受性。在启动子和它的天然基因在植物(即玉米)内天然存在的情况下，这些可操作地连接的序列对植物的转化，也导致表型的变化，例如避荫反应的抑制和增加的对植物密度的耐受性，或可操作地连接的序列在染色体的不同区域内的插入，由此改变植物的基因组。

在本发明的另一个实施方案中，表达盒包含可操作地连接至要用本发明的ZM-ELF3启动子控制表达的异源核苷酸序列上的转录起始区，后者包含本文公开的ZM-ELF3启动子核苷酸序列或其变体或片段。

本文公开的启动子核苷酸序列和方法可以用于调节宿主植物中任意异源核苷酸序列的表达，以便改变植物的表型。表型的不同变化是令人感兴趣的，包括改良植物中的脂肪酸组成，改变植物中的氨基酸含量，改变植物的病原体防御机制，等。这些结果可以通过提供异源产物的表达或内源产物在植物中增强的表达来实现。或者，所述结果可以通过提供一种或多种内源产物(尤其酶或辅因子)在植物中的表达的降低来实现。这些变化导致转化的植物的表型的变化。

实施例

实施例1：ZM-ELF3和bHLH-041基因的鉴别和克隆

激活标记技术可以用于鉴别具有影响目标性状的能力的基因。转录增强子元件的插入可以显性地激活和/或升高附近的内源基因的表达。通过用随机插入整个基因组中的这些增强子元件制备大群体，可以评价几乎每个基因改变目标性状的能力。该方案已经成功地用于模型植物物种拟南芥中。(Weigel，等人，2000 Plant Physiol.122：1003-1013)。与密度反应有关的基因的分离遵循确定的激活标记方案(Aukerman和Sakai(2003)Plant Cell 15(11)：2730-2741)。

18.4kb的基于T-DNA的二元构建体pHSbarEND含有4个多聚化的源自花椰菜花叶病毒35S启动子的增强子元件，对应着如Odell，等人，(1985)Nature 313：810-812所定义的核苷酸-341至-64。所述构建体也含有载体序列(pUC9)以允许质粒挽救、用于重新动员T-DNA的转座子序列(Ds)、和用于实现转基因植物的草铵膦(glufosinate)选择的bar基因。原则上，从右边界(RB)至左边界(LB)(包含端点)仅10.8kb的区段将转入宿主植物基因组中。因为增强子元件位于RB附近，它们可以在T-DNA整合后诱导基因组基因座的顺式激活。

通过完整植物土壤杆菌转化，制备了2个拟南芥激活标记的群体：群体1和群体2。

对于群体1，将pHSbarENDs构建体转化进在25℃在LB中生长至OD600约1.0的根癌土壤杆菌菌株C58。然后离心沉淀细胞，重新悬浮于等体积的5％蔗糖/0.05％ Silwet L-77(OSI Specialties，Inc.)。在早期抽苔时，给土壤生长的拟南芥生态型Col-0植物从上面浇土壤杆菌悬浮液。一周后，给相同植物再次从上面浇蔗糖/Silwet中的相同土壤杆菌菌株。然后将植物正常地产生种子。得到的T₁种子种在土壤中，通过喷洒草铵膦(

；Agrevo；Bayer Environmental Science)，选择转基因的T₁幼苗。从约35,000株单个的草铵膦-抗性的T₁植物收集T₂种子。种植T₂植物，并收集等体积的来自96个分开的T₂系的T₃种子，制备360个亚群。

对于群体2，轻微改变质粒以加入限制位点，并重命名为pHSbarENDs2。如关于群体1所述，进行土壤杆菌菌株和拟南芥植物的转化。

选择共100,000株草铵膦抗性的T₁幼苗。将来自每个系的T₂种子保持分开。

用含有设计用于激活邻近基因的转基因插入物的拟南芥群体进行激活标记筛选，以便理解植物对高密度群体的反应以及分离赋予密度不敏感表型的基因。通过以每厘米约一株植物的密度将种子种在土壤中，筛选激活标记的群体中有密度反应的变体。在开花期选择在总体植物形态学和肉眼观察到的表型方面显著不同于它们的相邻植物的各个植物。在类似条件下，在第二个密度实验中再次筛选来自这些植物的种子。通过质粒挽救，分离与激活标记邻近的侧接序列。使用DNA印迹、RNA印迹和PCR来证实变体激活标记的系含有单个标记，且激活了最近的侧接基因。分离几个激活标记的系，其中的大多数是晚期开花。参见Aukerman和Sakai(2003)Plant Cell 15(11)：2730-2741。

当生长在高植物密度下时，从具有改变的表型的植物表征2个基因。一个基因对应着昼夜节律钟基因ELF3，表明参与昼夜节律的基因的操作是转基因地增强在高密度生长的植物的产量的一种方式。参见图6。

已经克隆了玉米ELF3同源物，且在本文中公开(在SEQ ID NO：1中所示的编码序列，在SEQ ID NO：2和3中所示的多肽，在SEQ ID NO：4中所示的上游调节序列)。使用拟南芥ELF3(At-ELF3)蛋白序列来鉴别玉米同源物，其中使用tBLASTn(Gish和States(1993)Nature Genet.3：266-272)来筛选专有的EST文库。将部分玉米序列鉴别为与At-ELF3具有同源性，通过设计寡核苷酸引物到蛋白的N-和C-末端，并扩增完整编码序列，克隆全长Zm-ELF3。随后将Zm-ELF3基因克隆进植物转化载体，并通过植物浸入方法(floral dip method)转入拟南芥(Clough和Bent(1998)Plant Journal 16(6)：735-743)。

第二个激活标记的系具有对密度过度敏感的反应：植物在高密度下活力更低，但是在低密度下在很大程度上不变。从该激活标记的系克隆基因，分离出未表征的碱性螺旋-环-螺旋转录因子bHLH-041(在SEQ IDNO：5中所示的编码序列，在SEQ ID NO：6中所示的多肽；也参见GenBank登记号BAA97026)。这类转录因子参与大量植物反应，包括参与光感的与植物光敏素直接相互作用的有些成员。通过质粒挽救克隆与激活标记邻近的拟南芥序列，序列分析揭示插入离bHLH-041翻译起点807bp的标记。通过RT-PCR，证实该系中的激活。

实施例2：转基因的拟南芥中ZM-ELF3的超量表达赋予密度耐受性

使用SCP启动子(美国专利号6,555,673)，在转基因的拟南芥中超量表达全长ZM-ELF3。使用植物浸入方法(Clough和Bent(1998)PlantJournal 16(6)：735-743)转化植物。以此方式，将植物浸入用含有ZM-ELF3基因的共整合载体转化的土壤杆菌培养物中。通过草铵膦抗性鉴别转基因植物，并生长至后代，这时收集种子。通过测定在高密度种植下它们的产量和植物性能，测定几个转基因系和野生型(WT)植物的密度耐受性。在该筛选中的高密度是每cm²一株植物，它是最佳拟南芥生长密度的约4倍。

转基因植物对高植物密度诱导的叶长度(图2A)和开花期叶数目(图2B)的降低的敏感度更低。

也在延迟种植实验中评价ZmELF-3转基因，其中以高密度种植对照植物方格。10天后，将实验材料种植在对照植物之间，作为植物与邻近植物竞争在发育上如何进一步超前的评价。超量表达ZmELF3的激活标记的系产生比野生型更大且具有更高活力表型的植物。

实施例3：超量表达ZM-ELF3蛋白的转基因玉米植物的转化和再生

用含有可操作地连接至玉米泛素-1(UBI1)启动子上的SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列和选择标记基因PAT的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟的玉米胚(Wohlleben，等人，(1988)Gene 70：25-37)，所述选择标记基因PAT会赋予对除草剂双丙氨磷(Bialaphos)的抗性。或者，将选择标记基因提供在分开的质粒上。如下进行转化。培养基配方如下。

靶组织的制备

将穗去壳，在30％ Clorox漂白剂+0.5％ Micro去污剂中表面灭菌20分钟，用无菌水漂洗两次。切割未成熟胚，将胚轴一侧向下(盾片一侧向上)放置，每个平板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区域内排列，为轰击做准备。

制备含有可操作地连接至玉米泛素-1(UBI1)启动子上的SEQ IDNO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列的质粒载体。使用如下的CaCl₂沉淀方法，将该质粒DNA和含有PAT选择标记的质粒DNA沉淀至1.1μm(平均直径)的钨沉淀物上：100μl水中制备好的钨粒子；10μl(1μg)Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaCl₂；和，10μl 0.1M亚精胺。

将各试剂顺序加入钨粒子悬浮液中，同时保持在多管振荡器上。对最终的混合物简单地进行超声处理，在恒定的涡旋下温育10分钟。在沉淀阶段后，将试管简单离心，去除液体，用500ml 100％乙醇洗涤，并离心30秒。再一次将液体去除，并将105μl 100％乙醇加入最终的钨粒子沉淀物中。为进行粒子枪轰击，对钨/DNA粒子进行简单的超声处理，并取10μl点样于各个大载体(macrocarrier)的中心，且允许其在轰击前干燥约2分钟。

在粒子枪中以#4水平轰击样品平板。所有样品在650 PSI下接受单次轰击，从每试管制备的粒子/DNA中取出总计10等份。

在轰击后，将胚放置在560Y培养基上2天，随后转移至含有3mg/l双丙氨磷的560R选择培养基中，且每2周进行继代培养。在选择约10周后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基上，以起始植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)后，将发育良好的体细胞胚转移至用于萌发的培养基上，转移至光照培养室中。约7-10天后，将发育中的植物幼苗转移至试管中的272V不含激素的培养基中7-10天，直至幼苗充分形成。随后将植物转移插入含有盆栽土的平板(等同于2.5”盆)，并在生长箱中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，随后转移至经典的600罐(1.6加仑)中，培养至成熟。通过测定在高密度种植下的产量和植物性能，监控植物的密度耐受性。

轰击培养基(560Y)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson氏维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l维生素B1、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调节至pH5.8后用D-I H₂O调节体积)；2.0g/l水晶洋菜(Gelrite)(在用D-I H₂O调节体积后加入)；以及8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l维生素B1、30.0g/l蔗糖、和2.0mg/l 2，4-D(在用KOH调节至pH 5.8后用D-IH₂O调节体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I H₂O调节体积后加入)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(二者均在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储备液(0.100g烟酸、0.02g/l维生素B1、0.10g/l维生素B6、和0.40g/l甘氨酸，用处理后的D-I H₂O调节体积)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调节至pH 5.6后用处理后的D-I H₂O调节体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I调节体积后加入)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(在将培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。不含激素的培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/l MS维生素(0.100g烟酸、0.02g/l维生素B1、0.10g/l维生素B6、和0.40g/l甘氨酸，用处理后的D-I H₂O调节体积)、0.1g/l肌醇、和40.0g/l蔗糖(在调节至pH5.6后用处理后的D-I H₂O调节体积)；以及6g/l细菌琼脂(在用处理后的D-I H₂O调节体积后加入)，灭菌并冷却至60℃。

实施例4：转基因玉米中ZM-ELF3的超量表达

在转基因玉米中超量表达全长ZM-ELF3。对于土壤杆菌-介导的ZM-ELF3核苷酸序列(SEQ ID NO：1或2)对玉米的转化，采用Zhao的方法(美国专利号5,981,840，和PCT专利公开WO98/32326；它们的内容特此引作参考)。简而言之，从玉米分离未成熟的胚，使胚接触土壤杆菌悬浮液，其中所述细菌能将SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列转移进至少一个未成熟的胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。将胚与土壤杆菌共同培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该共培养阶段后，进行任选的“静止”步骤。在该静止步骤中，在至少一种抗生素的存在下培养胚，已知该抗生素在不加入植物转化株的选择剂时能抑制土壤杆菌的生长(步骤3：静止步骤)。接着，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，回收生长中的经转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。愈伤组织随后再生为植物(步骤5：再生步骤)，且在固体培养基上对在选择培养基上生长的愈伤组织加以培养，以再生植物。通过测定在高密度种植下转基因植物产量和植物性能，评价ZM-ELF3蛋白的超量表达对植物密度反应的影响。

实施例5：大豆胚转化用于ZM-ELF3的超量表达培养条件

在26℃在150rpm旋转摇床上的35ml液体培养基SB196(参见，下面的配方)中维持大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)，冷白荧光的昼/夜光周期是16:8小时，光强度是60-85μE/m²/s。通过将约35mg组织接种进35ml新鲜液体SB196，每隔7天至2周对培养物传代培养(优选的传代间隔是每隔7天)。

通过基因枪轰击方法(Klein，等人，(1987)Nature 327：70)，使用在下述实施例中描述的质粒和DNA片段转化大豆胚发生悬浮培养物。

大豆胚发生悬浮培养起始

每个月起始大豆培养2次，每次起始之间间隔5-7天。

挑选来自种植后45-55天可得到的大豆植物的含有未成熟种子的豆荚，去除它们的壳，置于已灭菌的洋红盒中。通过在含有1滴象牙皂的5％ Clorox溶液(95ml高压灭菌的蒸馏水+5ml Clorox和1滴肥皂)中将它们振荡15分钟，灭菌大豆种子。混合均匀。使用2个1-升瓶的无菌蒸馏水冲洗种子，将小于4mm的那些置于单个载玻片上。切掉种子的小末端，将子叶压出种皮。将子叶转至含有SB1培养基的平板(每个平板25-30个子叶)。用纤维胶带缠绕平板，储存8周。该时间后，切掉次生胚，置于SB196液体培养基中7天。

用于轰击的DNA的制备

含有可操作地连接至目标启动子上的SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列和选择标记基因的完整质粒或DNA质粒片段用于轰击。使用在Promega^TM手册和使用指南第2版(第106页)中描述的方法，常规制备和纯化用于轰击的质粒DNA。通过凝胶分离双重消化的质粒，得到携带可操作地连接至目标启动子上的SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列和选择标记基因的质粒片段。在每种情况下，在0.5ml适合目标质粒的特异性的酶混合物中消化100μg质粒DNA。通过在1％ SeaPlaque GTG琼脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)上的凝胶电泳，分离得到的DNA片段，从琼脂糖凝胶切离含有可操作地连接至目标启动子上的SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列和选择标记基因的DNA片段。按照生产商的手册，使用GELase消化酶，从琼脂糖纯化DNA。

将含有3mg金颗粒的50μl无菌蒸馏水等分试样加入5μl 1μg/μlDNA溶液(如上所述制备的完整质粒或DNA片段)，50μl 2.5M CaCl₂和20μl 0.1M亚精胺。在涡旋振荡器的水平3振荡混合物3分钟，在台式离心机中旋转10秒。用400μl 100％乙醇洗涤后，通过在40μl 100％乙醇中声处理来悬浮沉淀。将5μl DNA悬浮液分配给BiolisticPDS1000/HE仪器盘的每个飞盘中。每次轰击(即，每个盘)每个5μl等分试样含有约0.375mg金。

组织制备和DNA轰击

将约150-200mg 7日龄胚悬浮培养物置于空的、无菌的60 x 15mm培养皿中，用塑料网盖住培养皿。每个平板轰击组织1或2枪，膜破裂压力设定在1100 PSI，腔抽真空至27-28英寸汞柱的真空。将组织置于离保留/终止屏约3.5英寸。

转化的胚的选择

使用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶HPT基因用作选择标记时)或氯磺隆(Chlorsulfuron)(当乙酰乳酸合酶ALS基因用作选择标记时)，选择转化的胚。

潮霉素(HPT)选择

轰击后，将组织置于新鲜的SB196培养基中，如上所述进行培养。轰击后6天，将SB196替换为含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196。每周更新选择培养基。选择后4-6周，可以观察到绿色的转化的组织从未转化的、坏死的胚发生簇生长出来。取出分离的绿色组织，接种进多孔平板，以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。

氯磺隆(ALS)选择

轰击后，将组织分入2个含有新鲜的SB196培养基的烧瓶中，如上所述进行培养。轰击后6-7天，将SB196替换为含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196。每周更新选择培养基。选择后4-6周，可以观察到绿色的转化的组织从未转化的、坏死的胚发生簇生长出来。取出分离的绿色组织，接种进含有SB196的多孔平板，以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。

大豆体细胞胚再生为植物

为了从胚发生悬浮培养物得到完整植物，必须使组织再生。

胚成熟

在冷白荧光(Phillips冷白Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro)灯泡(40瓦)下，在26℃在SB196中培养胚4-6周，光周期为16:8小时，光强度为90-120μE/m²s。该时间后，将胚簇移至固体琼脂培养基SB166，持续1-2周。然后将簇在SB103培养基中传代培养3周。在该阶段期间，可以从簇取出单个胚，并筛选ZM-ELF3表达。应当指出，在该阶段可以筛选由目标基因的表达产生的任意可检测的表型。

胚干燥和发芽

通过将成熟的单个胚置于空的小培养皿(35 x 10mm)中约4-7天，干燥成熟的单个胚。用纤维胶带密封平板(建立小湿度室)。将干燥的胚种入SB71-4培养基，使它们在如上所述的相同培养条件下，在这里发芽。从发芽培养基取出发芽的幼苗，用水彻底冲洗，然后种入在24-格包盘(pack tray)中的Redi土，覆盖干净的塑料穹顶。2周后，去掉穹顶，再使植物硬化一周。如果幼苗看起来强壮，将它们移植，通过测定在高密度种植下转基因植物产量和植物性能，评价ZM-ELF3蛋白的超量表达对植物密度反应的影响。

培养基配方

SB 196-FN低盐液体增殖培养基(每升)-

MS feEDTA-100x原液1 10ml

MS 硫酸盐-100x原液2 10ml

FN 低盐卤化物-100x原液3 10ml

FN 低盐P，B，Mo-100x原液4 10ml

B5 维生素(1ml/L) 1.0ml

2，4-D(10mg/L终浓度) 1.0ml

KNO₃ 2.83克

(NH₄)₂SO₄ 0.463克

天冬酰胺 1.0克

蔗糖(1％) 10克

pH 5.8

FN低盐原液

原液编号 1000ml 500ml

1 MS Fe EDTA 100x原液

Na₂EDTA^* 3.724g 1.862g

FeSO₄-7H₂O 2.784g 1.392g

^*首先加入，在搅拌的同时溶于深色瓶中

2 MS硫酸盐100x原液

MgSO₄-7H₂O 37.0g 18.5g

MnSO₄-H₂O 1.69g 0.845g

ZnSO₄-7H₂O 0.86g 0.43g

CuSO₄-5H₂O 0.0025g 0.00125g

3 FN低盐卤化物100x原液

CaCl₂-2H₂O 30.0g 15.0g

KI 0.083g 0.0715g

CoCl₂-6H₂O 0.0025g 0.00125g

4 FN低盐P，B，Mo 100x原液

KH₂PO₄ 18.5g 9.25g

H₃BO₃ 0.62g 0.31g

Na₂MoO₄-2H₂O 0.025g 0.0125g

SB1固体培养基(每升)包含：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)；1ml维生素B5 1000X原液；31.5g蔗糖；2ml 2，4-D(20mg/L终浓度)；pH 5.7；和，8g TC琼脂。

SB 166固体培养基(每升)包含：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)；1ml维生素B5 1000X原液；60g麦芽糖；750mg MgCl₂六水合物；5g活性炭；pH 5.7；和，2g水晶洋菜。

SB 103固体培养基(每升)包含：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)；1ml维生素B5 1000X原液；60g麦芽糖；750mg MgCl₂六水合物；pH 5.7；和，2g水晶洋菜。

SB 71-4固体培养基(每升)包含：1瓶Gamborg B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-目录号21153-036)；pH 5.7；和，5g TC琼脂。

从Phytotech目录号D 295得到预制备的2，4-D原液-浓度是1mg/ml。

在-20℃以等分试样储存的维生素B5原液(每100ml)包含：10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸吡哆醇；和1g硫胺。如果该溶液不能足够迅速地溶解，通过热搅拌板施加低水平的热。氯磺隆原液包含在0.01N氨水中的1mg/ml。

实施例6：向日葵转化

如下用含有可操作地连接至目标启动子的SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列的表达盒转化向日葵分生组织(也参见，欧洲专利号EP 0 486233，在本文中引作参考，和Malone-Schoneberg，等人，(1994)Plant Science 103：199-207)。使用单个小麦头脱粒机，将成熟的向日葵种子(Helianthus annuus L.)脱壳。将种子在20％ Clorox漂白剂溶液(每50ml溶液加入2滴吐温20)中表面消毒30分钟。用无菌蒸馏水冲洗种子2次。

通过改进的Schrammeijer等人所述的操作(Schrammeijer，等人，(1990)Plant Cell Rep.9：55-60)，制备分离胚轴外植体。在表面消毒操作后，将种子浸入蒸馏水中60分钟。然后折断每个种子的子叶，产生在胚轴平面处的清楚折断面。切除根尖后，在原叶之间纵向切断外植体。将2半切面朝上地置于由Murashige和Skoog矿质元素(Murashige，等人，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)、Shepard氏维生素添加剂(Shepard(1980)Emergent Techniques for the Genetic Improvement of CropsUniversity of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-苄基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-醋酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA₃)、pH 5.6和8g/l植物琼脂组成的GBA培养基上。

在土壤杆菌处理之前，对外植体进行微粒轰击(Bidney，等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。将30-40个外植体置于在60 X 20mm平板中心的圆圈中，进行该处理。将约4.7mg 1.8mm钨微粒重新悬浮于25ml无菌的TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，每次轰击使用1.5ml等分试样。通过置于PDS

粒子加速装置中样品以上2cm的150mm nytex筛，对每个平板轰击2次。

解除武装的(disarmed)根癌土壤杆菌菌株EHA105用于所有转化实验。通过Holsters，等人，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187所述的冻融，将包含表达盒的二元质粒载体导入土壤杆菌菌株EHA105，所述表达盒含有可操作地连接至目标启动子上的SEQ ID NO：1或2的ZM-ELF3核苷酸序列。该质粒另外包含卡那霉素选择标记基因(即，nptII)。使用于植物转化实验的细菌在含有菌株和二元质粒维持所需的适当抗生素的液体YEP培养基(10克/l酵母提取液，10克/l细菌用蛋白胨，和5克/l NaCl，pH 7.0)中生长过夜(28℃和100RPM连续搅拌)。使用达到OD₆₀₀约0.4-0.8的悬浮液。沉淀土壤杆菌细胞，并以0.5的终OD₆₀₀重新悬浮于包含12.5mM MES pH 5.7、1克/l NH₄Cl和0.3克/l MgSO₄的接种培养基。

将新鲜轰击的外植体置于土壤杆菌悬浮液中，混合，并静置30分钟。然后将外植体转入GBA培养基，在26℃和18小时的光照，切面向下共培养。共培养3天后，将外植体转入添加了250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(缺少生长调节剂且含有1％低蔗糖水平的GBA培养基)。在选择培养基上培养外植体2-5周，然后转入缺少卡那霉素的新鲜374B培养基，继续发育1-2周。将具有分化的、抗生素抗性的生长区域的外植体(其没有产生适合切离的枝条)转入含有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基，用于第2个持续3天的植物激素处理。通过ELISA测定来自绿色的卡那霉素抗性的枝条的叶样品中NPTII的存在，通过测定ZM-ELF3活性，测定转基因表达的存在。

将NPTII-阳性的枝条嫁接给

杂种6440体外生长的向日葵幼苗根状茎。表面灭菌的种子在48-0培养基(半浓度Murashige和Skoog盐，0.5％蔗糖，0.3％水晶洋菜，pH5.6)中发芽，在关于外植体培养所述的条件下生长。去除幼苗的上部，在下胚轴制备1cm垂直切口，将转化的枝条插入切口。用石蜡包裹整个区域，以固定枝条。在体外培养1周后，将嫁接的植物转入土壤。将在土壤中的嫁接物维持在高湿度条件下，然后缓慢适应温室环境。通过NPTII ELISA和/或通过叶提取物的ZM-ELF3活性分析，鉴别在温室中成熟的T₀植物(亲本代)的转化区，同时通过干燥的种子子叶的小部分的ZM-ELF3活性分析，鉴别从NPTII-阳性的T₀植物收获的转基因种子。

一个替代性的向日葵转化方法允许不使用化学选择压力来回收转基因后代。将种子脱壳，在20％ Clorox漂白剂溶液(每100ml溶液加入2-3滴吐温20)中表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水冲洗3次。将灭菌的种子在26℃在黑暗中在水浸湿的滤纸上浸渗20小时。去除子叶和根，在黑暗中在374E(由MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l 6-BAP、0.25mg/l IAA、0.1mg/l GA和0.8％植物琼脂组成的GBA培养基，pH 5.6)上培养分生组织外植体24小时。去除初生叶以暴露顶端分生组织，顶端穹顶朝上地，将约40个外植体置于在374M(含有1.2％植物琼脂的GBA培养基)中心的2cm圆圈中，然后在黑暗中在培养基上培养24小时。

将约18.8mg 1.8μm钨粒子重新悬浮于150μl无水乙醇。超声处理后，将8μl滴到微载体表面的中心。在26mm Hg氦枪真空，用第一个架中的650psi破裂盘轰击每个平板2次。

通过如前所述的冻融，将目标质粒导入根癌土壤杆菌菌株EHA105。在有50μg/l卡那霉素存在下，将在28℃在液体YEP培养基(10g/l酵母提取液，10g/l细菌用蛋白胨，和5g/l NaCl，pH 7.0)中过夜生长的细菌沉淀重新悬浮于接种培养基(12.5mM 2-mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，MES，1g/l NH₄Cl和0.3g/l MgSO₄pH 5.7)，达到在OD 600为4.0的终浓度。将粒子轰击的外植体转入GBA培养基(374E)，将细菌悬浮液的微滴直接置于分生组织的顶部。在培养基上共培养外植体4天，然后将外植体转入374C培养基(含有1％蔗糖，没有BAP，IAA，GA3，添加了250μg/ml头孢噻肟的GBA)。在16-小时光照和26℃温育条件，在培养基上培养幼苗约2周。

使用本领域已知的实验，筛选在374C培养基中培养2周的外植体(约2cm长)的ZM-ELF3活性。鉴别出阳性的(即，对于ZM-ELF3表达)外植体后，抛弃不能表现出ZM-ELF3活性的那些枝条，将每个阳性的外植体细分成结节外植体。一个结节外植体含有至少一个潜在结节。在GBA培养基上培养结节段3-4天，以促进附属芽从每个结节的形成。然后，将它们转入374C培养基，并允许发育另外4周。分离发育中的芽，在374C培养基上培养另外4周。通过适当的蛋白活性实验，再次筛选从每个新回收的芽合并的叶样品。在这时，从单个结节回收的阳性枝条通常已经在结节培养之前的初步实验中检测的转基因段中富集。

将回收的ZM-ELF3表达阳性的枝条嫁接给Pioneer杂种6440体外生长的向日葵幼苗根状茎。以下述方式制备根状茎。将种子脱壳，在20％Clorox漂白剂溶液(每100ml溶液加入2-3滴吐温20)中表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水冲洗3次。将灭菌的种子在水浸湿的滤纸上发芽3天，然后将它们转入48培养基(半浓度MS盐，0.5％蔗糖，0.3％水晶洋菜pH 5.0)，在黑暗中在26℃生长3天，然后在16-小时光照培养条件温育。去除选择的幼苗的上部，在每个下胚轴制备垂直切口，将转化的枝条插入V-切口。用石蜡包裹切口区域。在培养基上培养1周后，将嫁接的植物转入土壤。在前2周，将它们维持在高湿度条件下，以适应温室环境。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)的冠词语法对象。作为实例，“一个元件”是指一个或多个元件。

在说明书中提及的所有公开物和专利申请对本发明所属的技术领域的技术人员的水平是说明性的。所有的公开物和专利申请在本文中引作参考，与各公开物或专利申请被特别地、各个地在本文中引作参考一样。

尽管为了清楚理解的目的，通过图解和实施例对前文所述的发明进行了一些细节描述，显而易见，某些改变和变化可在所附权利要求书的范围内得到实现。

序列表

<110>PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL，INC.

E.I.DUPONT DE NEMOURS AND COMPANY

<120>用于增加植物对高群体密度的耐受性的组合物和方法

<130>1905-PCT

<150>US 60/779,720

<151>2007-03-07

<160>10

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>2496

<212>DNA

>213>玉米

<220>

<221>CDS

<222>(167)...(2444)

<223>Zm-ELF3

<400>1

<210>2

<211>2277

<212>DNA

<213>玉米

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(2277)

<223>ZmELF3

<400>2

<210>3

<211>759

<212>PRT

<213>玉米

<400>3

<210>4

<211>459

<212>DNA

<213>玉米

<220>

<221>启动子

<222>(1)...(459)

<223>ZmELF3上游调节区

<400>4

<210>5

<211>1401

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1401)

<223>bHLH041

<400>5

<210>6

<211>466

<212>PRT

<213>拟南芥

<220>

<221>DOMAIN

<222>(287)...(339)

<223>bHLH结构域

<400>6

<210>7

<211>695

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>7

<210>8

<211>760

<212>PRT

<213>稻

<400>8

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>misc_信号

<222>(0)...(0)

<223>夜晚元件

<400>9

<210>10

<211>473

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列

<400>10

Claims

1.改进在高群体密度条件下生长的植物的性能的方法，其包含：

a)用包含ELF3多核苷酸的构建体转化植物细胞；和

b)从所述转化的细胞再生植物

其中相对于对照植物中的表达，ELF3多核苷酸编码的多肽的表达在再生的植物或它的转化的后代中增加。

2.权利要求1的方法，其中以相对于对照植物增加的谷粒产量而测量到改进的性能。

3.权利要求1的方法，其中以相对于对照植物增加的生物量产生而测量到改进的性能。

4.权利要求1的方法，其中所述ELF3多核苷酸选自：

(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列；

(b)编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述序列的至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有ELF3蛋白活性的多肽；和

(d)编码氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述编码的多肽具有ELF3蛋白活性。

5.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸可操作地连接至选自下述的启动子：组成型启动子，叶优选的启动子，光调节的启动子，和昼夜节律钟调节的启动子。

6.改进在高群体密度条件下生长的植物的性能的方法，其包含：

a)用降低天然bHLH-041多核苷酸或它编码的多肽的水平或活性的表达盒转化植物细胞；和

b)从所述转化的细胞再生植物，

其中相对于在对照植物中的表达，天然bHLH-041多核苷酸编码的多肽的水平或活性在再生的植物或它的转化的后代中降低。

7.权利要求6的方法，其中以相对于对照植物增加的谷粒产量而测量到改进的性能。

8.权利要求6的方法，其中以相对于对照植物增加的生物量产生而测量到改进的性能。

9.权利要求6的方法，其中所述表达盒包含选自下述的序列：

(a)SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列，或它的互补序列；

(b)编码包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO：5所述序列的至少90％序列同一性的核苷酸序列，或它的互补序列；

(d)包含(a)、(b)或(c)的序列的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列；和

(e)包含(a)、(b)或(c)的序列的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列，和其互补核苷酸。

10.权利要求6的方法，其中所述多核苷酸可操作地连接至选自下述的启动子：组成型启动子，叶优选的启动子，光调节的启动子，和昼夜节律钟调节的启动子。

11.权利要求6的方法，其中所述表达盒包含：

(a)包含与编码所述bHLH-041多肽的mRNA相对应的至少19个核苷酸的有义序列；

(b)与(a)的有义序列的互补序列具有至少94％同一性的序列；和

(c)驱动在植物细胞中的表达的可操作地连接的启动子。

12.权利要求6的方法，其中所述表达盒包含编码具有不完整bHLH结构域的多肽的多核苷酸。

13.权利要求12的方法，其中保留了bHLH结构域的碱性区域。

14.权利要求6的方法，另外包含增加所述植物中ELF3多肽的水平或活性。

15.分离的多核苷酸，其包含选自下述的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列；

(b)SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列；

(c)编码包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(d)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述序列的至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有ELF3蛋白活性的多肽；

(e)包含与SEQ ID NO：5所述序列的至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有bHLH-041蛋白活性的多肽；

(f)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的至少15个连续核苷酸或其互补序列的核苷酸序列；

(g)编码氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述编码的多肽具有ELF3蛋白活性；和

(h)编码氨基酸序列与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有bHLH-041蛋白活性。

16.表达盒，其包含可操作地连接至驱动在植物细胞中的表达的启动子上的权利要求15的多核苷酸。

17.包含权利要求16的表达盒的植物。

18.权利要求17的植物，其中所述植物是单子叶植物。

19.权利要求18的植物，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、高梁或黑麦。

20.权利要求17的植物，其中所述植物是双子叶植物。

21.权利要求20的植物，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。

22.权利要求17的植物的种子，其中所述种子包含所述表达盒。

23.SEQ ID NO：4的多核苷酸。

24.调控目标多核苷酸在植物中的表达的方法，其包含

(a)用包含可操作地连接至SEQ ID NO：4的多核苷酸或其可操作片段的目标多核苷酸的表达盒转化植物细胞；和

(b)从所述转化的植物细胞再生植物，

其中调控目标多核苷酸的表达。