MX2008011467A

MX2008011467A - Composiciones y metodos para incrementar la tolerancia de plantas a una gran densidad de poblacion.

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Publication number: MX2008011467A
Application number: MX2008011467A
Authority: MX
Inventors: Nicholas J Bate; Milo J Aukerman
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2008-09-24
Also published as: US20080235827A1; US7868224B2; AU2007223053A2; CN101432431A; AR059775A1; EP1991685A2; WO2007103956A2; AU2007223053A1; EP1991685B1; US20110078824A1; ZA200807658B; WO2007103956A3; CA2646509A1; BRPI0708660A2

Abstract

Composiciones y métodos para suprimir la respuesta de evitación de sombra de plantas y para mejorar el rendimiento de las mismas. Las composiciones de la invención incluyen un gen de floración temprana 3 (ELF3) de maíz, el promotor de este gen y fragmentos y variantes de los mismos. La secuencia promotora del ELF3 es de utilidad para dirigir la expresión de los polinucleótidos de interés en una planta. Las secuencias ELF3 y bHLH-041 de la invención, o variantes y fragmentos de las mismas, se proveen en casetes de expresión para poder manipular la expresión de los genes ELF3 y bHLH-041. Al incrementar la expresión de ELF3 y/o suprimir la expresión de bHLH-041, los métodos de la invención proporcionan una respuesta alterada en plantas a la calidad de la luz y la supresión de la modalidad de desarrollo producida por una gran densidad. De esta manera, la invención provee métodos para cultivar plantas de cultivo con grandes densidades de población a fin de mejorar el rendimiento de las mismas. Se proveen también plantas transformadas con el fenotipo de evitación de sombra alterado de la invención, y las semillas de dichas plantas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INCREMENTAR LA TOLERANCIA DE PLANTAS A UNA GRAN DENSIDAD DE POBLACIÓN REFERENCIAS Esta solicitud de utilidad reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de los EE.UU. N° 60/779.720, presentada el 7 de marzo, 2006, que se incorpora en la presente a modo de referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a la manipulación genética de plantas, en particular a la manipulación de plantas para incrementar la tolerancia a una gran densidad de población. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La luz cumple una función vital en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Las plantas perciben la luz en de su entorno empleando numerosos sistemas fotorreceptores que controlan procesos del desarrollo, tales como la germinación, fotomorfogénesis, floración y senescencia, así como procesos metabólicos, tal como la fotosíntesis. Las células vegetales no solo obtienen energía y perturbación química de los fotones, sino que también obtienen información. La excitación de las moléculas de clorofila por la luz visible provee la energía necesaria para la reducción de CO2 y para el mantenimiento de las actividades metabólicas. En los ambientes con una gran productividad primaria, el determinante individual más importante del clima de luz experimentado por una planta comprende muy a menudo sus vecinos. Las plantas se adaptan morfológica y bioquímicamente al ambiente de luz de su entorno. Buscan la luz en el espacio tridimensional del dosel usando una batería de fotorreceptores informantes. Los fitocromos representan una familia de fotorreceptores que absorben luz roja y que pueden existir en la forma fisiológicamente inactiva Pr y en la forma activa Pfr. Las formas Pr y Pfr son interconvertibles por la luz roja o roja lejana (FR), respectivamente. Este perfil de absorción es extremadamente útil para la detección de sombra o la presencia de plantas vecinas. A proporciones altas de radiación FR bajo condiciones de sombra o en poblaciones vegetales densas, el fotoequilibrio se desplaza hacia la forma inactiva Pr. Bajo estas condiciones, las plantas verdes exhiben diversos síntomas de la respuesta de evitación de sombra, tal como promoción de la elongación de tallos y pecíolos, espesor foliar reducido, síntesis de clorofila reducida y un incremento en la dominancia apical. La respuesta de evitación de sombra reduce la disponibilidad de los recursos para almacenamiento y reproducción. La capacidad de las plantas para ajustar su morfología como respuesta al amontonamiento constituye casi con certeza un elemento clave para el éxito de una planta individual en ambientes de gran productividad primaria. Los incrementos en el rendimiento durante las décadas pasadas se han atribuido en gran parte a una mayor tolerancia a la densidad. Se necesitarán estrategias transgénicas para poder incrementar la productividad de las plantas más allá de las posibilidades que ofrece una cría convencional. Por lo tanto, se necesitan genes y métodos para mejorar la respuesta de las plantas a una siembra con mayor densidad. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para suprimir la respuesta de evitación de sombra de las plantas y mejorar el crecimiento y rendimiento de las mismas. En particular, las composiciones y los métodos de la invención alteran la respuesta de las plantas a la calidad de la luz e incrementan la tolerancia de las plantas a condiciones de luz limitada, incluso cuando son causadas por una gran densidad de población. Las composiciones de la invención incluyen un gen de floración temprana 3 (ELF3) de maíz así como un factor de transcripción en hélice-bucle-hélice básico de Arabidopsis (bHLH-041), y fragmentos y variantes de los mismos. El bHLH-041 es un miembro de una clase de factores de transcripción relacionada con un gran número de respuestas de las plantas, incluyendo algunos miembros que interactúan directamente con los fitocromos relacionados con la percepción de luz. Los métodos de la invención comprenden manipular la expresión de los genes de ELF3 y bHLH-041 para alterar la respuesta de una planta a la calidad de la luz y suprimir la modalidad de desarrollo de supervivencia producida por una gran densidad. En particular, los métodos comprenden la expresión o sobreexpresión del gen ELF3 en las plantas y la disminución de la regulación del gen bHLH-041 , o de un gen que codifica un factor de transcripción similar, para suprimir la respuesta de evitación de sombra. Las plantas modificadas de esa manera pueden tolerar condiciones de poca luz, tales como las que se observan en los interiores, en paisajes con sombra y en condiciones de gran densidad de población. En el caso de los cultivos, la modificación dará como resultado mayores rendimientos con una gran densidad de plantas, con relación a una planta control. Los polinucleótidos de la invención se pueden usar solos, combinados o con otros genes y mecanismos para incrementar el rendimiento de las plantas. La invención provee métodos para cultivar plantas de cultivo con grandes densidades de población y obtener mejoras en el rendimiento. Además, se provee una secuencia promotora. La secuencia promotora de ELF3 de maíz es de utilidad para dirigir la expresión de los polinucleótidos de interés en una planta. DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS En la Figura 1 se muestra una alineación de la secuencia proteica de ELF3 de maíz (SEQ ID N°: 3) con la secuencia de ELF3 de Arabidopsis thaliana (At2g25930; GenBank, N° Acceso NM_128153; SEQ ID N°: 7) y la secuencia de ELF3 de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso BAA83571; SEQ ID N°: 8). Los residuos conservados están indicados en la secuencia consenso (SEQ ID N°: 10). En las Figuras 2A y 2B se muestran los efectos de la sobreexpresión de ZM-ELF3 sobre la longitud de las hojas (Figura 2A) y sobre el número de hojas en el momento de la floración (Figura 2B) en Arabidopsis transgénica cultivada a una gran densidad. En la Figura 3A se muestran los elementos dentro del promotor ZM-ELF3 que asemejan el elemento "evening" presente en numerosos genes asociados con el ciclo circadiano. Las posiciones de los nucleótidos son relativas a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4. Se muestra el elemento evening de Arabidopsis thaliana (SEQ ID N°: 9) a efectos comparativos. En la Figura 3B se muestra la secuencia 5' del gen ZM-ELF3 con los elementos evening putativos subrayados y resaltados con negrita. Hay un motivo CAAT putativo indicado con cursiva y el sitio de inicio de la transcripción está indicado con cursiva y subrayado doble. Los nucleótidos 1-459 se muestran en la SEQ ID N°: 4; los nucleótidos 460-625 corresponden a los nucleótidos 1-166 de la SEQ ID N°: 1. En la Figura 4 se muestran los efectos de la densidad de plantas en Arabidopsis. Se cultivaron plantas de tipo salvaje (Columbia) bajo un rango de densidades (1 : una planta en 4 cm2; 2: una planta en 3 cm2; 3 una planta en 2 cm2; 4: una planta en 1 cm2). Altura general de los brotes en cm en el momento de la floración (panel A), número de brotes en el momento de la floración (B), longitud máxima de las hojas (C) y longitud de las vainas (D). En la Figura 5 se muestra el efecto de la densidad sobre el tiempo de floración en Arabidopsis. El incremento de la densidad de izquierda a derecha disminuye el tiempo hasta la floración y el tamaño de la planta en el momento de la floración. Se midieron diez plantas por tratamiento. En la Figura 6 se describe la marcación de la activación del mutante ELF3. El Panel A es un mapa de la secuencia genómica que rodea a ELF3 y se muestra la ubicación de la marca de activación 35S. El Panel B es un análisis de tres plantas positivas y una negativa que demuestra la sobreexpresión de ELF3 en las líneas con activación marcada (144-1 a 3). El Panel C es una transferencia Southern con digestión con Pstl de ADN aislado de tres líneas con activación marcada de ELF3, indicativo de la presencia de una sola copia de ADN-T. En la Figura 7 se muestra el efecto de la densidad sobre las líneas de activación marcada en un experimento de cultivo intercalado. Las líneas con activación marcada 50-1 (proteína bHLH-041) y 144-1 (ELF3) tienen respuestas diferentes a la gran densidad de plantas como lo indica la longitud de las hojas (panel superior) y la altura de los brotes (panel inferior). Las semillas de activación marcada se sembraron de forma intercalada con las plantas de tipo salvaje a la segunda densidad más alta (una planta en 2 cm2) y las mediciones se efectuaron durante la mitad de la floración (etapa 6,5). La siembra intercalada comprendió sembrar plantas experimentales entre plantas control, donde cada quinta planta era experimental.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para incrementar el rendimiento de una planta o de un cultivo. En particular, las composiciones y los métodos de la invención suprimen la respuesta de evitación de sombra de la planta por alteración de la respuesta de las plantas a la calidad de la luz y aumento de la tolerancia de las plantas a la densidad. De esta manera, la planta se puede cultivar en un entorno de gran densidad sin sacrificar el rendimiento, incrementando así el rendimiento global del cultivo. Las composiciones de la invención incluyen el promotor y la secuencia codificante de floración temprana 3 {ELF3) de maíz, la secuencia codificante para el factor de transcripción en hélice-bucle-hélice básico (bHLH-041) de Arabidopsis, y variantes y fragmentos de los mismos, así como polinucleótidos y construcciones para suprimir la expresión del gen bHLH-041 y de los genes de factores de transcripción similares en plantas. La secuencia codificante del gen ELF3 de maíz comprende los nucleótidos 167 a 2444 de la SEQ ID N°: 1 y de la SEQ ID N°: 2, y la secuencia de aminoácidos para el polipéptido ELF3 codificado se muestra en la SEQ ID N°: 3. La secuencia promotora ELF3 se muestra en la SEQ ID N°: 4. La secuencia codificante para el gen bHLH-041 de Arabidopsis se muestra en la SEQ ID N°: 5 y la secuencia de aminoácidos para el polipéptido bHLH-041 codificado se muestra en la SEQ ID N°: En particular, la presente invención provee polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID N°: 3 y 6. Además se proveen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por uno de los polinucleótidos descritos en la presente, por ejemplo los que se muestran en las SEQ ID N°: 1, 2 y 5, y fragmentos y variantes de los mismos. La invención también provee polinucleótidos aislados que comprenden la secuencia promotora para el gen ELF3 de maíz que se muestra en la SEQ ID N°: 4. Se proveen asimismo moléculas de ácido nucleico que comprenden los complementos de estas secuencias de nucleótidos. Se considera que la secuencia codificante del gen bHLH-041 (véase, la SEQ ID N°: 5) puede expresarse en una planta para sobreexpresar el factor de transcripción bHLH-041. Sin embargo, a los efectos de suprimir la respuesta de evitación de sombra de una planta, la secuencia codificante se usará para diseñar construcciones para suprimir la expresión del factor de transcripción bHLH-041. Por lo tanto, los polinucleótidos, en el contexto de suprimir la respuesta de evitación de sombra, se refieren a secuencias codificantes ELF3 y a polinucleótidos que cuando se expresan suprimen la expresión del gen bHLH-041 , por ejemplo, mediante una supresión directa o indirecta como se indica más adelante en la presente. La expresión de los polinucleótidos de la invención en plantas impide que dichas plantas sufran una reprogramación extensiva de su desarrollo morfológico bajo condiciones de luz limitada, en particular cuando son afectadas por la sombra de sus vecinos o cuando se cultivan con gran densidad. Las plantas buscan la luz en los doseles de las plantas usando una variedad de sistemas fotosensores. La radiación de rojo lejano reflejada por los vecinos constituye una señal temprana de competencia que genera respuestas de evitación de sombra anticipatorias. Las respuestas de evitación de sombras incluyen síntomas tales como promoción de la elongación de tallos y pecíolos, espesor foliar reducido, síntesis de clorofila reducida, floración acelerada y un incremento en la dominancia apical. La respuesta de evitación de sombra reduce la disponibilidad de recursos para almacenamiento y reproducción. La evitación de sombra es un mecanismo por el cual las plantas que crecen en estrecha proximidad responden a la radiación de rojo lejano (FR) reflejada por las hojas de las plantas vecinas, incrementando significativamente la longitud de sus tallos a expensas del desarrollo de hojas, frutas y órganos de almacenamiento, afectando adversamente el rendimiento de los componentes cosechables. La respuesta de evitación de sombra también puede tener efectos nocivos sobre el crecimiento de las plantas ornamentales de interior o en áreas de luz limitada del paisaje. En la Figura 4 se muestra el efecto de incrementar la densidad de población sobre el desarrollo vegetativo y reproductor en Arabidopsis. Se cultivaron plantas de tipo salvaje (Columbia) bajo un rango de densidades (1: una planta en 4 cm2; 2: una planta en 3 cm2; 3 una planta en 2 cm2; 4: una planta en 1 cm2). Con la mayor densidad, se redujo la altura de brotes global en el momento de la floración (panel A), se redujo el número de brotes en el momento de la floración (B), se redujo la longitud de las hojas (C) y se redujo la longitud de las vainas (D). La densidad de las plantas o la densidad de la población varía entre cultivos, así como de una región de crecimiento a otra y de un año a otro. El término "gran densidad" o "gran densidad de población" se define como una densidad de plantas que es al menos un 10% aproximadamente mayor que la densidad promedio prevaleciente de las plantas de un cultivo dado en una región de crecimiento dada. En algunas realizaciones, la gran densidad de población es al menos un 20% mayor, al menos un 30% mayor, al menos un 40% mayor, al menos un 50% mayor, al menos un 60% mayor, al menos un 70% mayor, al menos un 80% mayor, al menos un 90% mayor o al menos un 100% mayor que la densidad promedio prevaleciente para el cultivo dado en el área de crecimiento dada. La "densidad promedio prevaleciente" se define como la densidad promedio de plantas usada por la mayoría de los granjeros en una región. Por ejemplo, de acuerdo con el National Agricultural Statistics Service del Departamento de Agricultura de los EE.UU., la densidad promedio prevaleciente para maíz en diez estados del medio oeste de EE.UU. en 2004 era de 26.200 plantas por acre (ppa). Por consiguiente, para dicha región, la gran densidad de población es preferentemente de al menos 28.800, al menos 30.000, al menos 32.000, al menos 34.000, al menos 36.000, al menos 38.000 o al menos 40.000 plantas por acre aproximadamente. Se considera que la densidad de siembra, es decir, el número de semillas plantadas, excederá la población de plantas blanco deseada. Por ejemplo, la densidad promedio de siembra para el maíz en los EE.UU. en 2004 fue de 28.590 plantas por acre. Las densidades promedio prevalecientes de determinadas plantas de cultivo en los EE.UU. incluyen maíz a 20.000-29.000 plantas por acre, trigo a 1.000.000-1.500.000 plantas por acre, arroz a 650.000-900.000 plantas por acre, soja a 150.000-200.000 plantas por acre, cañóla a 260.000-350.000 plantas por acre y girasol a 17.000-23.00 plantas por acre. De la misma manera, se pueden determinar las densidades promedio de cualquier cultivo para cualquier región de crecimiento. El rendimiento se refiere al producto o a la cantidad producida por una planta o cultivo. El rendimiento se puede medir en términos del número y/o tamaño de frutos, semillas u otros tejidos cosechados. Típicamente, el rendimiento de las plantas de cultivo se mide en base a bushels por acre. El rendimiento de los granos en los cultivos agronómicos se mide típicamente en base a bushels por acre o kilogramos por hectárea.

Previamente se había identificado una mutación de floración temprana 3 (elf3) en Arabidopsis. Se propuso que ELF3 interviene en la interacción entre la luz y el ciclo circadiano. Los defectos en la función de ELF3 conducen a una arritmia dependiente de la luz. Véase, Covington, et al., (2001) Plant Cell 13:1305-1315, incorporada en la presente a modo de referencia. Parece que ELF3 es un componente integral de la entrada de luz en el reloj circadiano y probablemente controla tanto la entrada de luz en el reloj como la inducción aguda de las salidas circadianas por restricción de la sensibilidad de la luz de estas vías por la tarde. La sobreexpresión de la proteína ELF3 da como resultado una menor sensibilidad a los estímulos de restablecimiento, lo cual sugiere que ELF3 antagoniza la entrada de luz al reloj circadiano durante la noche. ELF3 puede representar un mecanismo por el cual el oscilador modula el restablecimiento de la luz. Además, las proteínas ELF3 podrían ser responsables de la regulación circadiana de la actividad fotorreceptora. La invención provee secuencias de nucleótidos ELF3 de maíz (SEQ ID N°: 1 y 2) y una proteína ELF3 codificada por la mismas (SEQ ID N°: 3). La proteína ELF3 de maíz (también conocida como ZM-ELF3) comparte un 19,4% de identidad con la proteína ELF3 de Arabadopsis thaliana denominada At2g25930 (SEQ ID N°: 7; GenBank, N° Acceso NM_128153; véase también, la SEQ ID N°: 2 de la Patente de los EE.UU. N°: 6.903.192), con cuatro regiones conservadas en estas dos secuencias (véase, la alineación en la Figura 1; región I, correspondiente a los residuos 20-57 de la SEQ ID N°: 3; región II, correspondiente a los residuos 362 a 410 de la SEQ ID N°: 3; región III, correspondiente a los residuos 516-535 de la SEQ ID N°: 3; y región IV, correspondiente a los residuos 728-754 de la SEQ ID N°: 3) que son compartidas por las proteínas ELF3 identificadas previamente (véase, Liu, et al., (2001) Plant Cell 3: 293-1304, incorporada en la presente a modo de referencia). El análisis PFAM revela un dominio dentro de la región II que presenta similitud con el factor A de unión a ribosomas (InterPRO PS01319 IPR000238) lo cual sugiere que ELF3 puede cumplir funciones relacionadas con el control de la síntesis de proteínas. La proteína ZM-ELF3 también comparte homología con otras proteínas, por ejemplo, la proteína de la floración temprana 3 putativa de Oryza sativa, incluida en la alineación que se muestra en la Figura 1 (SEQ ID N°: 8; véase también, GenBank, N° Acceso BAA83571; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AP000399); la proteína de floración temprana 3 putativa de Oryza sativa (derivada de BAA83571; véase, GenBank, N° Acceso XP_493738; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso XM_493738); la proteína hipotética denominada P0697C12.15 de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso NP 918455; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso N M_193566.1 ); la proteína de tipo proteína que responde a nematodos de Oryza sativa (GenBank, N° BAD45081; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AP003296); la proteína de floración temprana 3 de Mesembryanthemum crystallinum (GenBank, N° Acceso AAQ73529; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AY371292; la secuencia de una proteína desconocida de Arabidopsis thaliana (GenBank, N° Acceso AAM15042; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AC005395); la proteina hipotética At3g21320 de Arabidopsis thaliana (GenBank, N° Acceso AAX23847; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AY924772; la proteína hipotética AT3G21320 de Arabidopsis thaliana (GenBank, N° Acceso AAV68859; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AY800623); la proteína de tipo proteína que responde a nematodos de Arabidopsis thaliana (GenBank, N° Acceso CAA72719; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso Y11994; el homólogo de ELF3 de Lemna gibba (GenBank, N° Acceso BAD97872; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AB210851; y un producto proteico sin nombre de Arabidopsis thaliana (GenBank, N° Acceso BAB01726; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AB023045). Los métodos de la invención incluyen la expresión de la secuencia de ELF3 de la invención en una planta de interés. Sin tener en cuenta ningún mecanismo de acción particular, la expresión/sobreexpresión de la secuencia de ELF3 inhibe o suprime la respuesta de evitación de sombra de las plantas. De esta manera, se puede transformar una planta con una construcción de ADN que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante de ELF3 (por ejemplo, los nucleótidos 167-2443 de la SEQ ID N°: 1, que se muestra como la SEQ ID N°: 2) o un fragmento o variante de la misma, incrementando el nivel o la actividad del polipéptido ELF3. Se puede elegir un promotor para expresar la secuencia en determinados tejidos, en determinados momentos o por una expresión constitutiva. Como respuesta a la sombra, los gradientes de luz azul horizontales guían a los brotes de las plantas hacia huecos en el dosel de una vegetación irregular. Estas señales de luz B son percibidas por fotorreceptores específicos. Las plantas poseen al menos dos tipos de fotorreceptores cuya principal función fisiológica es la adquisición de información. Uno de ellos, los fitocromos, presentan una absorción máxima en las regiones del rojo (R) y del rojo lejano (FR) del espectro. Los fitocromos son proteínas reguladoras que controlan la expresión genética en plantas como respuesta a la luz. Trabajos recientes han demostrado la conservación de la función del fotorreceptor a lo largo de límites evolutivos divergentes. Los fitocromos son una familia de proteínas de fotorreceptores vegetales que controlan diversas estrategias de adaptación del desarrollo. Por ejemplo, los fitocromos perciben el rojo lejano (longitudes de onda entre 700 y 800 nm) reflejado o dispersado por las hojas de la vegetación cercana. Esto provee una alerta temprana de sombra potencial y desencadena una serie de respuestas de evitación de sombra por las cuales la planta intenta crecer más que sus vecinos. El ciclo circadiano controla esta respuesta rápida de evitación de sombra. (Véase, por ejemplo, Blazquez, et al., (2000) J. Cell. Sci. 113:3547). Uno de los genes de respuesta rápida codifica una proteína en hélice-bucle-hélice básica. El producto del gen es necesario para el crecimiento acelerado asociado con la respuesta de evitación de sombra. Las proteínas en hélice-bucle-hélice básica (bHLH) constituyen una superfamilia de factores de transcripción que se unen como dímeros a sitios blanco específicos del ADN. La familia está definida por el dominio de signatura bHLH, que consiste de aproximadamente 60 aminoácidos con dos regiones funcionalmente distintas. La región básica está ubicada en el extremo N-terminal del dominio y está relacionada con la unión al ADN. Dicha región básica consiste de aproximadamente 15 aminoácidos incluyendo gran número de residuos básicos. La región HLH está ubicada en el extremo C-terminal y funciona como un dominio de dimerización . Dicha región HLH consiste principalmente de residuos hidrofóbicos que forman dos a- hélices antipáticas separadas por una región en bucle de secuencia y longitud variables. Fuera del dominio de signatura conservado bHLH, las proteínas exhiben una considerable divergencia de secuencia. Se han estudiado los genes bHLH en Arabidopsis y se han identificado más de 140 genes, constituyendo una de las familias de factores de transcripción más grandes en Arabidopsis. Véase, Toledo-Ortiz, et al., (2003) Plant Cell 5:1749- 770, incorporada en la presente a modo de referencia. Se han identificado 21 subfamilias que tienen motivos de secuencias de aminoácidos conservados fuera del dominio de unión a ADN. Se prevé que esta familia de factores de transcripción presenta un rango diverso de roles en el desarrollo de tejidos y células vegetales, así como en el metabolismo de las plantas. Algunas proteínas bHLH (por ejemplo, PIF3 y proteínas bHLH relacionadas; véase, por ejemplo, Ni, et al., (1998) Cell 95(5):657-667) interactúan físicamente con los fitocromos. Además, una bHLH relacionada, denominada PIL1, está relacionada con el ciclo circadiano (véase, por ejemplo, Makino, et al., (2002) Plant Cell Physiol. 43(1):58-69 y Salter, et al., (2003) Nature 426(6967):680-683). La invención provee la secuencia de nucleótidos de bHLH- 041 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID N°: 5) y la proteína bHLH- 041 codificada por la misma (SEQ ID N°: 6). La proteína bHLH- 041 comparte homología con un número de proteínas bHLH, incluyendo, por ejemplo, una proteína tipo bHLH de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso BAD61929; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AP005460); la proteína denominada B1112D09.4 de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso NP_918505; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso NM_193616); otra proteína tipo bHLH de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso BAD72434; la secuencia codificante que se muestra en el informe para GenBank, N° Acceso AP003417); la proteína denominada P0498B01.27 de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso NP 9 3134; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso NM_ 88245); otra proteína tipo bHLH de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso BAD72431; la secuencia codificante que se muestra en el informe para GenBank, N° Acceso AP003417); la proteína denominada P0498B01.20 de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso NP_913129; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso N M_ 88240); otra proteína tipo bHLH de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso BAD72430; secuencia codificante que se muestra en el informe para GenBank, N° Acceso AP003417); la proteína denominada P0498B01.17 de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso NP_913126; la secuencia codificante que se muestra como GenBank, N° Acceso NM_188237); la proteína tipo la familia de proteínas bHLH de Oryza sativa (GenBank, N° Acceso XP_464694; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso XM_464694); y la secuencia de una proteína desconocida de Arabidopsis thaliana (GenBank, N° Acceso AAM63723; la secuencia codificante que se muestra en GenBank, N° Acceso AY086666).

Sin tener en cuenta una teoría o mecanismo de acción, se cree que el factor de transcripción bHLH de la invención, bHLH-041 (que se muestra en la SEQ ID N°: 6), interactúa con los fitocromos relacionados con la percepción de luz. Por ello, la supresión de la expresión del gen bHLH-041 , o de genes de otros miembros de la clase de factores de transcripción, podría prevenir la interacción con los fitocromos y suprimir la respuesta de evitación de sombra de las plantas. De esta manera, la invención permite suprimir la expresión del gen bHLH-041 o de genes de factores de transcripción similares que actúan de la misma manera. Por ello, a efectos de suprimir la respuesta de evitación de sombra, los polinucleótidos bHLH-041 incluyen aquellos polinucleótidos que, cuando se expresan en una planta, suprimen la expresión del gen bHLH-041 o de los genes de factores de transcripción similares que actúan sobre fitocromos. La expresión del polinucleótido reduce o elimina el nivel o la actividad de bHLH-041 en una planta. La expresión puede reducir o eliminar el nivel de bHLH-041 en cualquiera de numerosas maneras; por ejemplo, afectando el nivel de transcripto de ARN de bHLH-041; afectando la traducción y de esa manera el nivel del polipéptido bHLH-041 codificado; o interfiriendo con la función del polipéptido bHLH-041 codificado, tal como por unión competitiva con una secuencia de ADN blanco. Se considera que se puede diseñar las secuencias de supresión de ARN, como se describirá más adelante, para dirigirlas específicamente a la expresión del gen bHLH-041 o, como alternativa, a genes de los factores de transcripción que comparten homología con bHLH-041. De esta manera, para una supresión selectiva de la proteína bHLH-041, el diseño de las secuencias de supresión se basará en las secuencias fuera del dominio de signatura bHLH conservado de esta proteína, que se encuentra en los residuos 287-339 de la SEQ ID N°: 6. El factor bHLH es un factor de transcripción en hélice-bucle-hélice y como tal contiene una región básica (PFA : PF00010; IPR001092) que determina la especificidad de interacción con las regiones reguladoras de los genes blanco. En el caso de bHLH-041, la región básica (SERKRREKLN; residuos 293-302 de la SEQ ID N°: 6) es la más conservada y es de diagnóstico para este grupo de factores de transcripción. Los polinucleótidos de ELF3 y bHLH-041 de la invención se pueden usar solos o combinados para disminuir o reducir la respuesta de evitación de sombra de las plantas e incrementar el rendimiento de las mismas. Es decir, los métodos de la invención impiden la respuesta de evitación de sombra en las plantas y contrarrestan los efectos de una competencia asimétrica por la luz. Los métodos tienen implicancias importantes para las relaciones de rendimiento-densidad y productividad-densidad en plantas. Las plantas de la invención exhiben una fotomorfogénesis alterada y un mayor rendimiento pero no presentan las características típicas de plantas cultivadas en entornos de gran densidad.

La invención abarca composiciones de polinucleótidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o una proteína "aislada" o "purificada", o una porción con actividad biológica de ésta, está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que habitualmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o la proteína, tal como se los halla en su entorno natural. Por consiguiente, un polinucleótido o una proteína aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando es sintetizada con medios químicos. Preferentemente, un polinucleótido "aislado" está libre de las secuencias (preferentemente las secuencias que codifican proteínas) que habitualmente rodean los polinucleótidos (es decir, las secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que habitualmente rodean el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el polinucleótido. La proteína que está substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas que poseen menos que 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de proteínas contaminantes. Cuando la proteína de la invención, o una porción con actividad biológica de la misma, es producida de forma recombinante, el medio de cultivo preferentemente representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de precursores químicos, o de sustancias químicas que no son las proteínas de interés. Los fragmentos y las variantes de los polinucleótidos descritos, y las proteínas codificadas por los mismos, también están comprendidos en la presente invención. El término "fragmento" denota una porción de la secuencia del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos, y por ende, de la proteína codificada por la misma. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y por ende pueden exhibir actividad de la proteína ELF3 o de la proteína bHLH-041. La medición de la actividad de la proteína bHLH-041 se describe en otra parte en la presente. Como alternativa, los fragmentos de polinucleótido que son de utilidad como sondas de hibridación en general no codifican fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica. Los fragmentos de la secuencia de nucleótidos pueden variar en un rango entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica las proteínas de la invención. Un fragmento de polinucleótido ELF3, que codifica una porción biológicamente activa de una proteína ELF3 de la invención, codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en la proteína ELF3 de longitud completa de la invención (por ejemplo, 759 aminoácidos para la SEQ ID N°: 3). En algunas realizaciones, un fragmento de un polinucleótido ELF3 que codifica una porción biológicamente activa de una proteína ELF3 de la invención codificará un fragmento de un polipéptido ELF3 que comprende al menos la región I, correspondiente a los residuos 20-57 de la SEQ ID N°: 3, al menos la región II, correspondiente a los residuos 362 a 410 de la SEQ ID N°: 3, al menos la región III, correspondiente a los residuos 516-535 de la SEQ ID N°: 3, al menos la región IV, correspondiente a los residuos 728-754 de la SEQ ID N°: 3), o cualquier combinación de las regiones I, II, III y IV de la SEQ ID N°: 3, donde cada una de estas regiones está codificada por los correspondientes codones que se muestran en la SEQ ID N°: 2 o codones alternativos debido a la degeneración del código genético. Entonces, por ejemplo, el fragmento de polipéptido ELF3 codificado podría comprender los residuos correspondientes a las regiones I y II de la SEQ ID N°: 3, a las regiones I y III de la SEQ ID N°:3, a las regiones I y IV de la SEQ ID N°:3, a las regiones I, II y III de la SEQ ID N°: 3, a las regiones I, III y IV de la SEQ ID N°: 3, a las regiones I, II, III y IV de la SEQ ID N°: 3, a las regiones II y III de la SEQ ID N°: 3, a las regiones II y IV de la SEQ ID N°: 3, a las regiones II, III y IV de la SEQ ID N°: 3 o a las regiones III y IV de la SEQ ID N°: 3, donde cada una de estas regiones está codificada por los correspondientes codones que se muestran en la SEQ ID N°: 2 o codones alternativos debido a la degeneración del código genético. Sin embargo, en general no es necesario que los fragmentos de un polinucleótido de la invención de utilidad como sondas de hibridación o cebadores para PCR codifiquen una porción biológicamente activa de una proteína ELF3. Un fragmento de polinucleótido bHLH-041 , que codifica una porción biológicamente activa de una proteína bHLH-041 de la invención, codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en la proteína bHLH-041 de longitud completa de la invención (por ejemplo, 466 aminoácidos para la SEQ ID N°: 6). En algunas realizaciones, un fragmento de un polinucleótido bHLH-041 que codifica una porción biológicamente activa de una proteína bHLH-041 de la invención codificará un fragmento de un polipéptido bHLH-041 que comprende al menos la región básica del dominio de signatura de bHLH, donde la región básica corresponde a los residuos 293-302 de la SEQ ID N°: 6, al menos la región HLH del dominio de signatura de bHLH, donde dicho dominio de signatura de bHLH corresponde a los residuos 287-339 de la SEQ ID N°: 6, o ambas regiones, donde cada una de estas regiones está codificada por los correspondientes codones que se muestran en la SEQ ID N°: 5 o codones alternativos debido a la degeneración del código genético. En otras realizaciones, un fragmento de un polinucleótido bHLH-041 que codifica una porción biológicamente activa de una proteína bHLH-041 de la invención codificará un polipéptido que comprende al dominio de signatura de bHLH, correspondiente a los residuos 287-339 de la SEQ ID N°: 6, donde esta región está codificada por los correspondientes codones que se muestran en la SEQ ID N°: 5 o codones alternativos debido a la degeneración del código genético. Sin embargo, en general no es necesario que los fragmentos de un polinucleótido de la invención de utilidad como sondas de hibridación o cebadores para PCR codifiquen una porción biológicamente activa de una proteína bHLH-041. Por consiguiente, un fragmento de un polinucleótido ELF3 o bHLH-041 puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína ELF3 o bHLH-041 , respectivamente, o puede ser un fragmento que se pueda utilizar como una sonda de hibridación o un cebador para PCR usando los métodos que se describirán más adelante. Una porción biológicamente activa de una proteína ELF3 o bHLH-041 se puede preparar aislando una porción de uno de los polinucleótidos ELF3 o bHLH-041 de la invención, respectivamente, expresando la porción codificada de la proteína ELF3 o bHLH-041 (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada del polipéptido ELF3 o bHLH-041. Los polinucleótidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de ELF3 o bHLH-041 comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ó 1.400 nucleótidos contiguos o hasta el número total de nucleótidos presente en el polinucleótido ELF3 o bHLH-041 de longitud completa descrito en la presente (por ejemplo, 2496, 2277 y 1401 nucleótidos para las SEQ ID N0:. 1, 2 y 5, respectivamente). El término "variantes" denota secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende la supresión y/o la adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o la sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en dicho polinucleótido nativo. Tal como se lo utiliza en la presente, un polinucleótido o un polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos natural, respectivamente. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos ELF3 o bHLH-041 de la invención. Las variantes alélicas naturales como las recién mencionadas pueden ser identificadas utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación que se describirán más adelante. Las variantes de polinucleótidos también incluyen secuencias de polinucleótidos derivadas sintéticamente, tal como las que se generan, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifican una proteína ELF3 o bHLH-041 de la invención. En general, las variantes de un polinucleótido particular de la invención (por ejemplo, de la SEQ ID N°: 1 , de la SEQ ID N°: 2 o de la SEQ ID N°: 5) tienen al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más de identidad de secuencia con dicho polinucleótido particular, determinada con los programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también pueden evaluarse mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, por ejemplo, se describe un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con el polipéptido ELF3 o bHLH-41 de la SEQ ID N°: 3 o de la SEQ ID N°: 6, respectivamente. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos puede calcularse usando los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte de la presente documentación. Cuando se evalúa cualquier par de polinucleótidos dado de la invención por medio de comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos codificados, dicho porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia. El término "variante" de una proteína denota una proteína derivada de la proteína nativa a través de la supresión o la adición de uno o varios aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa, y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de proteína comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad del factor de transcripción de bHLH-41 y la regulación de la actividad fotorreceptora de ELF3, según se describe en la presente. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de polimorfismos genéticos o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de la proteína ELF3 o bHLH-041 nativa de la invención tendrán al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa determinada con los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variante con actividad biológica de una proteína de la invención puede diferir de dicha proteína en tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2, o aún 1 residuo de aminoácido. Las proteínas de la invención pueden alterarse de varias maneras, incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para realizar dichas manipulaciones son conocidos en general en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes y fragmentos de las proteínas ELF3 y bHLH-041 realizando mutaciones en el ADN. Los métodos para llevar a cabo la mutagénesis y las alteraciones de los polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Métodos in Enzymol. 154: 367-382; Patente de los EE.UU. N° 4873192; Walquer y Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), y las referencias citadas en dichas publicaciones. Los lineamientos sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden consultar en el modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure {Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada en la presente a modo de referencia. Las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido por otro con propiedades similares, son óptimas.

Por consiguiente, los genes y polinucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias naturales como las formas mutantes. De la misma manera, las proteínas de la invención abarcan tanto las proteínas naturales como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continúan presentando la actividad deseada. Evidentemente, las mutaciones que se efectuarán en el ADN que codifica las variantes no deben desplazar la secuencia fuera del marco de lectura, y preferentemente, no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Véase, la Publicación de la Solicitud de Patente EP N°:75.444 No se espera que las supresiones, las inserciones y las sustituciones en las secuencias de proteínas abarcadas en la presente produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, la supresión o la inserción antes de producirla, el especialista en la técnica comprenderá que el efecto será evaluado por medio de ensayos de monitoreo de rutina. Es decir, la actividad puede evaluarse mediante un análisis de plantas transgénicas de rutina, observada por una interrupción en la respuesta de densidad de las plantas o por la aparición de un cambio fenotípico deseado, tal como la inhibición de la respuesta de evitación de sombra y una mayor tolerancia a la densidad de plantas.

Las variantes de polinucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como recombinación de ADN. Con dicho procedimiento se pueden manipular una o más secuencias codificantes diferentes para crear una nueva proteína de ELF3 o bHLH-041 que posea las propiedades deseadas. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias polinucleotídicas relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial, y éstas pueden recombinarse en forma homologa in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, se pueden entremezclar los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre el gen ELF3 o bHLH-041 de la invención y otros genes conocidos de ELF3 o del factor de transcripción bHLH, respectivamente, para obtener un nuevo gen que codifique una proteína con la propiedad de interés mejorada. En la técnica se conocen estrategias para este entremezclado de ADN. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391 :288-291; y las Patentes de los EE.UU. N°: 5.605.793 y 5.837.458.

Las composiciones de la invención también incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden al promotor ELF3 de maíz (también conocido como promotor ZM-ELF3) cuya secuencia de nucleótidos se muestra en la SEQ ID N°: 4. Un "promotor" se refiere a una región de ADN reguladora que habitualmente comprende una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Además, un promotor puede comprender otras secuencias de reconocimiento localizadas generalmente 5' con respecto a la caja TATA, conocidas como elementos promotores 5', que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Dichos elementos incluyen un elemento CAAT putativo presente en los nucleótidos 402-405 de la SEQ ID N°: 4. Además hay seis motivos de secuencia con un 50% de identidad aproximadamente con el "motivo del elemento evening", que se correlaciona con el control circadiano de los genes vegetales, dentro de la secuencia 5' de ZM-ELF3. Véase la Figura 3. Si se considera que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos para la región promotora que se describe aquí, es propio del estado del arte el aislamiento y la identificación de otros elementos reguladores en la región no traducida 5' ubicada en posición 5' con respecto a la región promotora particular identificada en la presente. Así, por ejemplo, la región promotora descrita en la presente puede comprender además elementos reguladores 5' que confieren una expresión con preferencia por tejidos de las secuencias de nucleótidos heterólogas ligadas operativamente a la secuencia promotora descrita. Véase en particular, la Patente de Australia N° AU-A-77751/94 y las Patentes de EE.UU. N°: 5.466.785 y 5.635.618. Los fragmentos y las variantes de la secuencia de nucleótidos del promotor de ZM-ELF3 que se describe también están comprendidos por la presente invención. Un "fragmento" es una porción de la secuencia de nucleótidos. Los fragmentos de la secuencia de nucleótidos del promotor pueden retener la actividad biológica y por ende retener su actividad reguladora de la transcripción. Por consiguiente, por ejemplo, puede utilizarse menos que la secuencia promotora completa descrita en la presente para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés ligada operativamente, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga. Como alternativa, los fragmentos de la secuencia de nucleótidos del promotor que son de utilidad como sondas de hibridación en general no retienen la actividad biológica. Por consiguiente, los fragmentos de la secuencia de nucleótidos pueden variar entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la extensión completa de la secuencia de nucleótidos de longitud completa de la invención. Por lo tanto, un fragmento de una secuencia de nucleótidos promotora ELF3 puede codificar una porción del promotor ELF3 con actividad biológica, o puede ser un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridación o un cebador de PCR, de acuerdo con los métodos que se describen más adelante. Se puede preparar una porción biológicamente activa de un promotor ELF3 aislando una porción de una de las secuencias de nucleótidos del promotor ELF3 de la invención y evaluando la actividad de dicha porción del promotor ELF3. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de la secuencia de nucleótidos del promotor ELF3 comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 nucleótidos o hasta el número de nucleótidos presente en la secuencia de nucleótidos de longitud completa del promotor ELF3 que se describe en la presente (por ejemplo, 459 nucleótidos para el promotor ZM-ELF3 que se muestra en la SEQ ID N°: 4). Los ensayos para determinar la actividad de la secuencia promotora son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el fragmento o la variante del promotor de ELF3 puede estar ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica cualquier proteina informante, tal como la proteína ß- glucuronidasa (informante GUS) o la proteína luciferasa. La construcción de ADN se inserta en el genoma de una planta o célula vegetal, y se determina el nivel de ARNm o proteína de la secuencia informante. Véase, por ejemplo, Eulgem, et al., (1999) EMBO Journal 18:4689-4699. Se pueden usar los polinucleótidos de la invención para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, en particular de otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación y semejantes para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias que se describen en la presente. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias completas de ELF3 o de bHLH-041 descritas en la presente o con variantes y fragmentos de las mismas, están abarcadas por la presente invención. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descritas. El término "ortólogos" hace referencia a genes derivados de un gen ancestral común que se encuentra en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes presentes en diferentes especies son considerados ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos, y/o las secuencias de proteínas codificadas por ellas, comparten al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia o más. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies. Por lo tanto, los polinucleótidos aislados que codifican una proteína ELF3 o bHLH-041 o los polinucleótidos aislados que confieren actividad promotora y que se hibridizan bajo condiciones severas con las respectivas secuencias de nucleótidos ELF3 o bHLH-041 descritas en la presente, o con variantes o fragmentos de las mismas, están comprendidas por la presente invención.

En un enfoque basado en PCR, se pueden diseñar oligonucleótidos cebadores para usar en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y realizar una clonación por PCR son conocidos en general en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véanse también Innis et al., edsitores (1990) PCR Protocols: A Guide to Mehods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, sin. limitaciones, métodos para usar cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos para genes, cebadores específicos para vectores, cebadores con faltas de coincidencia parciales y semejantes En las técnicas de hibridación, se utiliza la totalidad o una parte de un polinucleótido conocido como una sonda, que hibridizará selectivamente con otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas de ADN genómico o ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como 32P, o con cualquier otro marcador de detección. Así, por ejemplo, las sondas de hibridación pueden prepararse mediante el marcado de oligonucleótidos sintéticos basados en los polinucleótidos de ELF3 o bHLH-041 de la invención. Los métodos para preparar sondas de hibridación y construir de bibliotecas de ADNc y genómicas son conocidos en general en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Por ejemplo, se puede usar un polinucleótido ELF3 o bHLH-041 completo que se describe en la presente, o una o más porciones del mismo, como una sonda capaz de hibridizarse específicamente con los polinucleótidos y los ARN mensajeros elf3 o bHLH-041 correspondientes. Para obtener una hibridación específica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótidos ELF3 o bHLH-041 , y que preferentemente tienen al menos aproximadamente 10 nucleotidos de longitud, y más preferentemente tienen al menos aproximadamente 20 nucleotidos de longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar los correspondientes polinucleótidos a partir de la planta seleccionada por PCR. Este procedimiento puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en una planta. Los procedimientos de hibridación incluyen el análisis de hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" hacen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará con su secuencia blanco hasta un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, es posible identificar secuencias blanco que son 100% complementarias con la sonda (análisis de homólogos). Como alternativa, es posible ajustar las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis de heterólogos). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, a menudo menos de 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas son aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1,0 M de iones Na (o de otras sales), a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden obtenerse condiciones severas agregando agentes desestabilizadores, tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen la hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30-35%, NaCI 1 M , SDS al 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC 1X-2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen la hibridación en formamida al 50-45%, NaCI 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en SSC 0,5X-1X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCI 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en SSC 0,1X a 60-65°C. Opcionalmente, las soluciones amortiguadoras de lavado pueden comprender SDS entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 1%. La duración de la hibridación generalmente es menor que aproximadamente 24 horas, comúnmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio.

La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridación, donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, puede estimarse el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 738:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. El Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de falta de coincidencia; por consiguiente, pueden ajustarse el Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado para efectuar una hibridación con secuencias con una identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, puede reducirse el Tm en 10°C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 ó 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridación y lavado deseadas, y el Tm deseado, los especialistas en la técnica comprenderán que pueden efectuarse variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se puede consultar una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocois in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Véase, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Tal como se la utiliza en la presente, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o el gen. (b) Tal como se la utiliza en la presente, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia o huecos) al compararla con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para una alineación óptima de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Los especialistas en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias. Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines comparativos son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualquiera puede realizarse usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos comprenden el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda-dealineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 872264, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877. Se pueden usar implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para comparar secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, sin limitaciones: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el conjunto de Software Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE.UU.). Las alineaciones se pueden preparar usando estos programas con los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito en Higgins, et al., (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins, et al., (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Cuando se comparan secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de ponderación de residuos PAM120, una longitud de penalidad de falta de coincidencia de 12 y una falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa BLASTN, con una calificación = 100, una longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden efectuarse con el programa BLASTX, con una calificación = 50, una longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de la invención. Con el fin de obtener alineaciones con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, puede emplearse Gapped BLAST (en BLAST 2.0), como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede utilizarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecte interrelaciones distantes entre moléculas. Véase, Altschul, eí al., (1997) supra. Cuando se emplea BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase, www.ncbi.nlm.nih.gov. Las alineaciones también pueden realizarse en forma manual por inspección. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente hacen referencia a los valores obtenidos utilizando GAP versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando una ponderación de falta de coincidencia de 50 y una ponderación de longitud de 3, y la matriz de calificación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para secuencias de aminoácidos usando una ponderación de falta de coincidencia de 8 y una ponderación de longitud de 2, y la matriz de calificación BLOSUM62. GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencias. GAP considera todas las alineaciones posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea la alineación con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad de creación de faltas de coincidencia y una penalidad de extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad de extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe crear además una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad de extensión de falta de coincidencia. Los valores predeterminados para la penalidad por creación de faltas de coincidencia y la penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias en las secuencias de proteínas en la versión 10 del paquete de software GCG Wisconsin Genetics son de 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, el límite de creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto que el límite de falta de coincidencia predeterminado es de 3. Los límites de creación de faltas de coincidencia y extensión de las faltas de coincidencia pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Entonces, por ejemplo, los valores de los límites de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro tiene mejor calidad. GAP presenta cuatro cifras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para la alineación de las secuencias. La Relación es la Calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Los símbolos que están a lo largo de las faltas de coincidencia son ignorados. Se evalúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del conjunto de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915). (c) Tal como se la utiliza en la presente, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se las alinea para hallar una correspondencia máxima en la ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad), y por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, puede incrementarse el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras poseen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por consiguiente, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservadora se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservadora se le asigna un valor entre cero y 1. El valor de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se detalla en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Tal como se lo utiliza en la presente, el "porcentaje de identidad de secuencia" denota el valor determinado mediante la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, donde la porción de una secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con una secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para obtener una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El uso del término "polinucleótido" no pretende limitar la presente invención a los polinucleótidos que comprenden ADN. Los especialistas en la técnica comprenderán que los polinucleótidos pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas naturales como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de la invención también abarcan todas las formas de secuencias, incluyendo, a modo de ejemplo, formas de cadena simple, formas de cadena doble, horquillas, estructuras de tallo y bucle, y semejantes. Los polinucleótidos de ELF3 y bHLH-041 se pueden proveer en casetes de expresión para su expresión en la planta de interés. Como se indicara precedentemente, para suprimir la respuesta de evitación de sombra, para manipular los niveles de ELF3, los casetes proveerán expresión del polipéptido ELF3, en tanto para manipular los niveles de bHLH-041, las construcciones se prepararán para suprimir la expresión del polipéptido bHLH-041 en plantas transgénicas. El cásete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operativamente a una secuencia codificante de ELF3 o un polinucleótido que, cuando se expresa, pueda reducir o eliminar la expresión del polipéptido bHLH de la invención o de factores de transcripción bHLH relacionados. El término "ligado operativamente" hace referencia a una unión funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, una unión operativa entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos ligados operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se lo usa con referencia a la unión de dos regiones que codifican proteínas, el término ligado operativamente denota que las regiones codificantes están en el mismo marco de lectura. Además, el cásete puede contener al menos un gen adicional que será cotransformado en el organismo. Como alternativa, el o los genes adicionales pueden introducirse en múltiples casetes de expresión. Dicho cásete de expresión se provee con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para que la inserción del polinucleótido se encuentre bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras. Además, el cásete de expresión puede contener genes marcadores de selección. En general, el cásete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5'-3', una región de inicio de la transcripción y traducción (es decir, un promotor), un polinucleótido de la invención y una región de terminación de la transcripción y traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones de regulación de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de la invención pueden ser nativos/análogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de la invención pueden ser heterólogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Tal como se utiliza en la presente, el término "heterólogas" con referencia a una secuencia es una secuencia originaria de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificada sustancialmente con respecto a su forma nativa en cuanto a composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterologo es de una especie diferente de la especie de la que deriva el polinucleótido, o, si es de una especie igual/análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma y/o su locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo del polinucleótido ligado operativamente. Tal como se lo utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga respecto de la secuencia codificante. Aunque puede ser óptimo expresar las secuencias usando promotores heterólogos, se pueden usar las secuencias del promotor nativo. Dichas construcciones pueden cambiar los niveles de expresión de ELF3 o bHLH-041 en la planta o célula vegetal. Por consiguiente, se altera el fenotipo de la planta o célula vegetal.

La región de terminación puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto del polinucleótido de interés ligado operativamente, puede ser nativa respecto de la planta huésped, o puede derivar de otra fuente (es decir, puede ser extraña o heteróloga) respecto del promotor, el polinucleótido de interés, el huésped vegetal o cualquier combinación de los mismos. Se pueden usar regiones de terminación convenientes disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y la nopalina sintetasa. Véase también, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Bailas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi, et al., (1987) Nucleic Acids Res. 5:9627-9639. Cuando corresponda, los polinucleótidos pueden optimizarse para obtener una mayor expresión en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando los codones vegetales preferidos para una mejor expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 , para hallar una descripción del uso de codones preferidos por el huésped. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar genes con preferencia por plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N° 5.380.831 y 5.436.391, y Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados en la presente a modo de referencia. En la técnica se conocen otras modificaciones de secuencia para potenciar la expresión genética en una célula huésped. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de separación de exones-intrones, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que puedan ser perjudiciales para la expresión genética. El contenido de G-C de la secuencia puede ser ajustado en niveles promedio para una célula huésped dada, y puede ser calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia será modificada con el fin de evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Además, los casetes de expresión pueden contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden servir para potenciar la traducción. Las directrices de la traducción son conocidas en la técnica e incluyen las siguientes: directrices de picornavirus, por ejemplo, la directriz del EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:6126-6130); directrices de potivirus, por ejemplo, la directriz del TEV (virus etch de tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), la directriz del MDMV (virus en mosaico enano de maíz) (Virology 154:9-20), y la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); la directriz no traducida del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus en mosaico de alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); la directriz del virus en mosaico de tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y directriz del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Cuando se prepara el cásete de expresión, se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN con el fin de proveer las secuencias de ADN en la orientación apropiada, y según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN, o pueden utilizarse otras manipulaciones para proveer sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o semejantes. Con este propósito, puede utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, alineación, resustituciones, por ejemplo transiciones y transversiones. En la práctica de la invención puede emplearse una cantidad de promotores, incluyendo el promotor nativo de la secuencia de polinucleótidos de interés. Los promotores pueden seleccionarse sobre la base del resultado deseado. Es decir, los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, promotores con preferencia por tejidos, incluyendo pero en un sentido no limitativo promotores con preferencia por hojas, promotores regulados por luz o inducibles por luz, promotores regulados por el ciclo circadiano u otros promotores para la expresión en plantas. Se prefieren los promotores constitutivos o con preferencia por tejidos vegetales. Dichos promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en WO 99/43838 y en la Patente de los EE.UU. N°: 6.072.050; el promotor nuclear 35S CaMV (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); de actina de arroz (McEIroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); de ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, ef al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); el promotor ALS (Patente de los EE.UU. N°: 5.659.026) y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142; 6.177.611, 6.670.467 y 6.505.083. Se pueden utilizar promotores con preferencia por tejidos para dirigir la expresión dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores con preferencia por tejidos incluyen los que se describen en Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331 -1341 ; Van Camp, et al., (1996) Plañí Physiol. 112(2):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90(20):9586-9590; y Guevara-García, ef al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. Dichos promotores se pueden modificar, si fuera necesario, para lograr una expresión débil. Los promotores con preferencia por hojas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Yamamoto, ef al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, ef al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, ef al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, ef al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; y Matsuoka, ef al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90(20):9586-9590. Los promotores regulados por luz o inducibles por luz proveen expresión de las secuencias de nucleótidos ligadas operativamente como respuesta a la cantidad y/o calidad de las luz en el entorno de la planta. Los promotores regulados por luz son conocidos en la técnica, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, los promotores del gen de la subunidad pequeña (rbcS) de la ribulosa bifosfato carboxilasa (Rubisco) de una variedad de especies (véase, por ejemplo, Kyozuka, ef al., (1993) Plant Physiol. 102:991-1000 que describe los promotores rbcS de arroz y tomate; Bansal, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. 89:3654-3658, y Schaffner y Sheen (1991) Plant Cell 3(9):997-1012, que describen ambas el promotor rbcS de maíz; y Timko, et al., (1985) Nature 318:579-582, y Coruzzi, et al., (1984) EMBO J. 3(8): 1671 - 1679 , que describen ambas el promotor rbcS de arveja); los promotores del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) (véase, por ejemplo, Matsuoka, et al., (1994) Plant J. 6(3):311-319 que describe al promotor PEPC de maíz); los promotores del gen de la proteína de unión a clorofila a/b (véase, por ejemplo, Bansal, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. 89:3654-3658 que describe la secuencia del promotor cab-m1 de maíz); y semejantes. Otros promotores de interés incluyen, pero en un sentido no limitativo, los promotores que responden a los ritmos circadianos, denominados promotores regulados por el ciclo circadiano en la presente. Los ejemplos incluyen, pero en un sentido no limitativo, promotores de genes del complejo secuestrante de luz (LHC) (véase, por ejemplo, Piechulla (1998) Chronobiol. Int. 16(2):15-128 y Piechulla, ef al., (1998) Plant Mol. Biol. 38(4):655-662); promotores chalcona sintasa (CHS) (véase, por ejemplo, Thain, et al., (2002) Plant Physiol. 130(1 ): 102-110); promotores de genes de fitocromos y criptocromos (véase, por ejemplo, Tóth, ef al., (2001) Plant Physiol. 127:1607-1616; y semejantes. En general, el cásete de expresión comprenderá un gen marcador de selección para seleccionar las células transformadas. Los genes marcadores de selección se utilizan para la selección de las células o los tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como aquellos que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), asi como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Otros marcadores seleccionables incluyen marcadores fenotípicos tales como las proteínas ?-galactosidasa y fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su, ef al., (2004) Biotechnol. Bioeng. 85:610-9 y Fetter, et al., (2004) Plant Cell 16:215-28), la proteína cianofluorescente (CYP) (Bolte, et al., (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato, et al., (2002) Plant Physiol 129:913-42), y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, véase, Bolte, ef al., (2004) J. Cell Science 117:943-54). Por otros marcadores seleccionables, véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506- 511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71 :63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, ef al., (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu, ef al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, ef al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, ef al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90:1917-1921; Labow, eí al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, eí al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Tesis de Ph.D., Universidad de Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:5547-5551; Oliva, eí al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí, eí al., (1988) Nature 334:721-724. El contenido de dichas citas se incorpora en la presente a modo de referencia. La lista anterior de genes marcadores de selección no se ofreció en un sentido limitante. En la presente invención es posible utilizar cualquier gen marcador de selección. Los métodos de la invención comprenden la introducción de un polipéptido o un polinucleótido en una planta. El término "Introducir" denota presentar a la planta el polinucleótido o el polipéptido, de modo que la secuencia logra acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir la secuencia en una planta, sino solamente de que el polinucleótido o el polipéptido pueda acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitaciones, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. Una "transformación estable" denota que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y que puede ser heredada por la progenie de la misma. Una "transformación transitoria" denota que se introduce un polinucleótido en la planta, y que dicho polinucleótido no se integra en el genoma de la planta, o que se introduce un polipéptido en una planta. Los protocolos de transformación, y también los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal que se desea transformar, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas. Los métodos adecuados para introducir polipéptidos y polinucleótidos en células vegetales incluyen microinyección (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320- 334), electroporación (Riggs, et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Patente de los EE.UU. N°: 5.563.055 y Patente de los EE.UU. N°: 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 4.945.050; Patente de los EE.UU. N°: 5.879.918; Patente de los EE.UU. N°: 5.886.244; y 5.932.782; Tomes, eí al., (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6;923-926); y transformación con Lec1 (WO 00/28058). Véase también, Weissinger eí al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou eí al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe, eí al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P.175-182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, er al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 85:4305-4309 (maíz); Klein, er al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de los EE.UU. N°: 5.240.855; 5.322.783; y 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren et al., (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Patente de los EE.UU. N°: 5.736.369 (cereales); Bytebier et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet eí al., (1985) En The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman ef al., (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler, eí al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler, eí al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560- 566 (transformación mediada por fibras); D'Halluin, eí al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz con Agrobacterium tumefaciens); todos los cuales se incorporan en la presente a modo de referencia. En otras realizaciones, el polinucleótido de la invención puede ser introducido en las plantas poniendo en contacto dichas plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, dichos métodos comprenden la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención en una molécula de ADN o ARN viral. Se considera que una proteina ELF3 o bHLH-041 de la invención puede sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína viral, que luego se puede procesar por proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. Además, se considera que los promotores de la invención también abarcan los promotores utilizados para la transcripción por las ARN polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en éstos, que comprenden moléculas de ADN o ARN virales, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N° 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367; 5.316.931 y Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221 ; incorporadas en la presente a modo de referencia.

En la técnica son conocidos los métodos para una inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En una realización, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véase, por ejemplo, WO 99/25821 , WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 y WO 99/25853, todas las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede estar contenido en un cásete de transferencia rodeado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos. El cásete de transferencia se introduce en una planta, que tiene incorporado en forma estable en su genoma un sitio blanco que está rodeado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos, que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se provee una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia se integra en el sitio blanco. De este modo, el polinucleótido de interés se integra en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que han sido transformadas pueden cultivarse para obtener plantas de acuerdo con medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Después, estas plantas pueden cultivarse y polinizarse, ya sea con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y luego puede identificarse la progenie resultante que presenta la expresión de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica se mantenga y se herede en forma estable, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya obtenido la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, en la presente invención se proveen semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que contienen un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma. Tal como se utiliza en la presente, el término célula vegetal incluye protoplastos vegetales, así como células en cultivos de tejidos vegetales a partir de las cuales se pueden regenerar plantas, incluyendo callos de plantas y masas vegetales. Las células vegetales pueden estar intactas en las plantas o en partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, mazorcas, marlos, chalas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras y semejantes. Los granos hacen referencia a las semillas maduras producidas en los cultivos comerciales, con propósitos distintos del desarrollo o la reproducción de la especie. La progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan los polinucleótídos introducidos.

La presente invención puede usarse para transformar cualquier especie de planta, incluyendo, sin limitaciones, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies vegetales de interés incluyen, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceites de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo ahusado (Eleusine coracana)) , girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana) , higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardio (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coniferas.

Las verduras incluyen tomate (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judias verdes {Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.)> y miembros de los géneros Cucumis, tales como el pepino (C. sativus), el melón (C. cantalupensis) y el melón musk (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.). hidrangea (Macrophylla hidrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyilus), pastora roja (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos, tales como el pino loblolly, (Pinus taeda), el pino de incienso (Pinus elliotii), el pino ponderosa (Pinus ponderosa), el pino lodgepole (Pinus contorta) y el pino de Monterrey (Pinus radiata); el abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); la Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); el abeto Sitka (Picea glauca); la secuoya (Sequoia sempervirens); los abetos verdaderos, tales como el abeto de oro (Abies amabilis) y el abeto balsámico (Abies balsamea); y los cedros, tales como el cedro rojo del Oeste (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etcétera). En otras realizaciones, se prefieren las plantas de maíz y soja, y en otras realizaciones, las plantas preferidas son de maíz. Una "planta sujeto" o "célula vegetal sujeto" es uno en que se ha efectuado una alteración genética, tal como una transformación, como en un gen de interés, o es una planta o célula vegetal que desciende de una planta o célula vegetal alterada de esa forma y que comprende dicha alteración. Un "control" o una "planta control" o una "célula vegetal control" provee un punto de referencia para medir los cambios en dicha planta o célula vegetal sujeto. Una planta control o una célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula vegetal de tipo salvaje, es decir, del mismo genotipo que el material inicial para la alteración genética que dio como resultado la planta sujeto o célula vegetal sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial pero que ha sido transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto sobre la característica de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de dicha planta sujeto o célula vegetal sujeto; (d) una planta o célula vegetal idéntica genéticamente a la planta sujeto o célula vegetal sujeto pero que no fue expuesto a las condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la propia planta sujeto o célula vegetal sujeto, bajo condiciones en las cuales el gen de interés no se expresa.

En determinadas especies, tal como maíz, las plantas control y de referencia pueden representar dos híbridos, donde el primer híbrido se obtiene de dos líneas progenitoras endogámicas y el segundo híbrido se obtiene de las mismas dos líneas progenitoras endogámicas excepto que una de dichas líneas progenitoras endogámicas contiene una construcción de ADN recombinante. El rendimiento del segundo híbrido se podría medir típicamente con relación al primer híbrido. Además, cuando se evalúa o mide una planta que comprende una construcción de ADN recombinante con relación a una planta control que no comprende al ADN recombinante, pero que por lo demás tiene un antecedente genético comparable al de la planta, dicha planta control y de referencia puede compartir al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia en cuanto al material genético nuclear. Existen muchas técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, la comparación y caracterización de antecedentes genéticos de plantas; entre ellas se pueden mencionar: electroforesis de isozímas, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios (AP- PCR), determinación de huellas dactilares por amplificación de ADN (DAF), regiones amplificadas caracterizada por una secuencia (SCAR), polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y repeticiones simples de secuencias (SSR) también conocidas como microsatélites. En el presente caso, por ejemplo, en diversas realizaciones, se podrían medir los cambios en la actividad de ZmELF3 o bHLH-041 y/o cambios en uno o más rasgos, tal como el tamaño o la forma de las hojas, la producción de semillas, elongación de tallos o pecíolos, síntesis de clorofila o la ramificación, por comparación de la planta sujeto o célula vegetal sujeto con una planta control o una célula vegetal control. Se provee un método para modular la concentración y/o actividad del polipéptido ELF3 de la presente invención, es decir actividad de la proteína ZmELF3, en una planta. En general, la concentración y/o actividad es incrementada en al menos un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a la planta, parte de planta o célula vegetal control nativa que no contiene a la secuencia de la invención introducida. En la presente invención, la modulación puede tener lugar según un patrón temporal o del desarrollo. En realizaciones específicas, los polipéptidos de la presente invención están incrementados en plantas de cultivo. El nivel de expresión del polipéptido ELF3 se puede medir directamente, por ejemplo, evaluando el nivel del polipéptido ELF3 en la planta o célula vegetal, o indirectamente, por ejemplo, determinando el efecto en una planta transgénica a nivel fenotípico, es decir, mediante análisis de plantas transgénicas, observado como una interrupción de la respuesta de densidad de plantas o la aparición de un cambio fenotípico deseado, tal como inhibición de la respuesta de evitación de sombra y mayor tolerancia a la densidad de plantas. En realizaciones específicas, el polipéptido o el polinucleótido de la invención es introducido en la célula vegetal. Posteriormente, la célula de planta que contiene la secuencia introducida de la invención se selecciona usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, tales como, a modo de ejemplo, análisis de Southern, secuenciación de ADN, análisis con PCR o análisis fenotípico. Una planta o una parte de una planta alterada o modificada de acuerdo con las realizaciones anteriores se cultiva bajo condiciones de formación de plantas, por un tiempo suficiente como para modular la concentración y/o la actividad de los polipéptidos de la presente invención en la planta. Las condiciones formadoras de plantas son bien conocidas en la técnica, y se describen brevemente en otra parte de la presente. En algunas realizaciones, se reduce o elimina la actividad del polipéptido bHLH-041 de la invención, o de su ortólogo, por transformación de una célula vegetal con un cásete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión de bHLH-041. El polinucleótido puede inhibir la expresión de bHLH-041 de forma directa, impidiendo la transcripción o traducción del ARN mensajero de bHLH-041, o de forma indirecta, codificando un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen que codifica bHLH-041 o codificando un polipéptido que interfiera con la función de la proteína bHLH-041 endógena. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica, y se puede emplear cualquiera de estos métodos en la presente invención para inhibir la expresión de bHLH-041, alterando de esa manera la actividad de la proteína bHLH-041. De acuerdo con la presente invención, la expresión de un gen bHLH-041 es inhibida si el nivel de proteína de bHLH-041 es estadísticamente inferior al nivel de la proteína del mismo bHLH-041 en una planta que no ha sido modificada o mutada genéticamente para inhibir la expresión de dicho bHLH-041. En realizaciones particulares de la invención, el nivel de proteína del bHLH-041 en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que un 95%, menor que un 90%, menor que un 80%, menor que un 70%, menor que un 60%, menor que un 50%, menor que un 40%, menor que un 30%, menor que un 20%, menor que un 10% o menor que un 5% del nivel de proteína del mismo bHLH-041 en una planta que no es un muíante o que no ha sido modificado genéticamente para inhibir la expresión de dicho bHLH-041. El nivel de expresión del bHLH-041 se puede medir directamente, por ejemplo, evaluando el nivel de bHLH-041 expresado en la célula vegetal o planta, o indirectamente, por ejemplo, observando el efecto en una planta transgénica a nivel fenotípico, es decir, mediante análisis de la planta transgénica, observado como una interrupción en la respuesta de densidad de plantas o la aparición del cambio fenotípico deseado, tal como una inhibición de la respuesta de evitación de sombra y una mayor tolerancia a la densidad de plantas. Además, o como alternativa, se puede medir el nivel de expresión de bHLH-041 de forma indirecta monitoreando el nivel de expresión de aquellos genes cuya expresión es modulada por la expresión de bHLH-041. De esta manera, los cambios en el nivel de expresión de estos genes relacionados serían indicativos de los cambios en nivel de expresión de bHLH-041, y por consiguiente estos genes relacionados podrían servir como marcadores de la actividad bHLH-041. Sin tener en cuenta la teoría, los ejemplos de tales genes relacionados podrían incluir al propio ELF3 o los genes del ritmo circadiano y luz (por ejemplo, fitocromos, catalasa, nitrato reductasa). En otras realizaciones de la invención, se reduce o elimina la actividad de bHLH-041 por transformación de una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de bHLH-041. La actividad de un bHLH-041 se considera inhibida, de acuerdo con la presente invención, si la actividad de bHLH-041 es estadísticamente menor que la actividad del mismo bHLH-041 en una planta que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la actividad de dicho bHLH-041. En realizaciones particulares de la invención, la actividad del bHLH-041 en una planta modificada de acuerdo con la invención s menor que un 95%, menor que un 90%, menor que un 80%, menor que un 70%, menor que un 60%, menor que un 50%, menor que un 40%, menor que un 30%, menor que un 20%, menor que un 10% o menor que un 5% de la actividad del mismo bHLH-041 en una planta que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de dicho bHLH-041. La actividad de un bHLH-041 es "eliminada", de acuerdo con la invención, cuando no es detectable con los métodos de ensayo descritos en otra parte en la presente. En otras realizaciones, se puede reducir o eliminar la actividad de un bHLH-041 interrumpiendo al gen que codifica a la proteína bHLH-041. La invención abarca plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes bHLH-041, donde las mutaciones reducen la expresión del gen bHLH-041 o inhiben la actividad de la bHLH-041 codificada. Por consiguiente, se pueden usar muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un bHLH-041. Se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo bHLH- 041 vegetal. Los ejemplos no limitativos de métodos para reducir o eliminar la expresión de un bHLH-041 vegetal se ofrecen a continuación. En algunas realizaciones de la presente invención, se transforma una célula vegetal con un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de bHLH- 041. El término "expresión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la biosíntesis de un producto genético, incluyendo la transcripción y/o traducción de dicho producto genético. Por ejemplo, a los efectos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un bHLH-041 es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un bHLH-041. La "expresión" o "producción" de una proteína o de un polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia codificante para producir dicha proteína o polipéptido, en tanto la "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia codificante de ARN para producir la proteína o el polipéptido. A continuación se proporcionan ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de bHLH-041. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de bHLH-041 se puede obtener mediante supresión o cosupresión en el sentido del marco de lectura. Para la cosupresión, se diseña un cásete de expresión para expresar una molécula de ARN que corresponde a la totalidad o una parte de un ARN mensajero que codifica bHLH-041 orientada en el sentido del marco de lectura. La sobreexpresión de la molécula de ARN puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresión para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión de bHLH-041. El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a todo o una parte de la secuencia que codifica al bHLH-041, a todo o parte de la región no traducida 5' y/o 3' de un transcripto de bHLH-041 o a todo o parte de la secuencia codificante y de las regiones no traducidas de un transcripto que codifica bHLH-041. En algunas realizaciones donde el polinucleótido comprende todo o parte de la región codificante de la proteína bHLH-041, el cásete de expresión se diseña para que elimine el codón de inicio del polinucleótido de modo tal que no se transcribirá ningún producto proteico. Es posible recurrir a la cosupresión para inhibir la expresión de genes vegetales y producir plantas con niveles indetectables de proteínas para las proteínas codificadas por estos genes. Véase, por ejemplo Broin et al (2002) Plant Cell 14:1417-1432. También puede usarse la cosupresión para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 5.942.657. Los métodos para usar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell, et al., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91:3490-3496; Jorgensen, eí al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen y Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, eí al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, eí al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, eí al., (2003) Phytochemistry 63:753-763; y las Patentes de los EE.UU. N°: 5034323, 5283184 y 5942657; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Puede incrementarse la eficiencia de la cosupresión incluyendo una región de poli-dT en el cásete de expresión, en una posición 3' de la secuencia en el sentido del marco de lectura y 5' de la señal de poliadenilación . Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los EE.UU. N° 2002/0048814, incorporada en la presente a modo de referencia. Típicamente, una secuencia de nucleótidos como esta tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, en términos óptimos más que aproximadamente 65% de identidad de secuencia, en términos más óptimos más que aproximadamente 85% de identidad de secuencia, en términos más óptimos más que aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Véanse las Patentes de los EE.UU. N° 5283184 y 5034323; incorporadas en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de bHLH-041 se puede lograr mediante supresión antisentido. Para la supresión antisentido, el cásete de expresión se diseña para que exprese una molécula de ARN complementaria de todo o parte del ARN mensajero que codifica al polipéptido bHLH-041. La sobreexpresión de la molécula de ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresión para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión de bHLH-041. El polinucleótido de utilidad en una supresión antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica al bHLH-041, a todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto bHLH-041 o todo o parte del complemento de la secuencia codificante y de las regiones no traducidas de un transcripto que codifica al bHLH-041. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, un 100% idéntico al complemento de la secuencia blanco) o parcialmente complementario (es decir, menos que un 100% idéntico al complemento de la secuencia blanco) con respecto a la secuencia blanco. Puede usarse la supresión antisentido para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N° 5942657. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Se describen métodos para usar la supresión antisentido con el objeto de inhibir genes endógenos en plantas, por ejemplo, en Liu et al (2002) Plant Physiol. 1732-1743, y en las Patentes de los EE.UU. N° 5759829 y 5942657, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Es posible incrementar la eficacia de la supresión antisentido incluyendo una región de poli-dT en el cásete de expresión, en una posición 3' de la secuencia antisentido y 5' de la señal de poliadenilación. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los EE.UU. N° 2002/0048814, incorporada en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de bHLH-041 se puede lograr por medio de interferencia con ARN de cadena doble (dsARN). Para la interferencia con dsARN, en la misma célula se expresa una molécula de ARN en el sentido del marco de lectura, como aquella descrita previamente para la cosupresión, y una molécula de ARN antisentido, que es completa o parcialmente complementaria con la molécula de ARN en el sentido del marco de lectura, lo que resulta en la inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente. Se puede obtener expresión de las moléculas en el sentido del marco de lectura y antisentido diseñando el cásete de expresión de modo que comprenda una secuencia en el sentido del marco de lectura y una secuencia antisentido. Como alternativa, se pueden usar casetes de expresión separados para las secuencias en el sentido del marco de lectura y antisentido. Se pueden examinar múltiples líneas de plantas transformadas con el o los casetes de expresión para interferencia con ARNcd con el fin de identificar las líneas de plantas que muestran la mayor inhibición de la expresión de bHLH-041. Se describen métodos para usar interferencia de dsARN para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos en Waterhouse et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y WO 00/49035; cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de bHLH-041 se puede lograr por interferencia con ARN en horquilla (hpARN) o interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones (ihpARN). Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38, y las referencias citadas en dicha publicación. Para realizar la interferencia de hpARN, se diseña un cásete de expresión que puede expresar una molécula de ARN que hibridiza consigo misma para formar una estructura en horquilla, la cual comprende un bucle de cadena simple y un tallo de bases apareadas. En algunas realizaciones, la región de tallo con bases apareadas comprende una secuencia en el sentido del marco de lectura que corresponde a la totalidad o una parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión se desea inhibir, y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria con la secuencia en el sentido del marco de lectura. Por consiguiente, la región de tallo con bases apareadas de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia del ARN. Las moléculas de hpARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por las generaciones de plantas subsiguientes. Véanse, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723- 731; y Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Se describen métodos para usar interferencia de hpARN para inhibir o silenciar la expresión de genes, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723- 731; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al., BMC Biotechnology , 3:7, y la Publicación de Patente de los EE.UU. N°: 20030175965, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. En Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporado en la presente a modo de referencia, se describe un ensayo transitorio para la eficacia de construcciones de ARNh para silenciar la expresión genética in vivo. Para el ihpARN, las moléculas de interferencia tienen la misma estructura general que para el hpARN, pero la molécula de ARN comprende además un intrón que se puede procesar en la célula donde se expresa el ihpARN. El uso de un intrón minimiza el tamaño del bucle en la molécula en horquilla después del corte, y esto incrementa la eficiencia de la interferencia. Véase, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith et al. demostraron un 100% de supresión de la expresión del gen endógeno usando interferencia mediada por iARNhp. Los métodos para usar la interferencia con ARNhi para inhibir la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001) Plant J. 27:581-590; Wang y Waterhouse (2001) Curr. Opin. Planta Biol. 5:146-150; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, y la Publicación de Patente de los EE.UU. N° 2003/0180945, cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. El cásete de expresión para efectuar la interferencia con hpARN puede estar diseñado de modo tal que la secuencia en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido no correspondan a ARN endógeno. En esta realización, las secuencias en el sentido del marco de lectura y antisentido rodean una secuencia de bucle que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la totalidad o una parte del ARN mensajero endógeno del gen blanco. Por consiguiente, la región del bucle es la que determina la especificidad de la interferencia de ARN. Véase, por ejemplo, WO 02/00904, incorporada en la presente a modo de referencia. El silenciamiento de la transcripción de genes (TGS) se puede llevar a cabo mediante el uso de construcciones de hpARN, en donde la repetición invertida de la horquilla comparte identidad de secuencia con la región promotora del gen a silenciar. El procesamiento del hpARN en extensiones cortas de ARN que pueden interactuar con la región promotora homologa puede desencadenar una degradación o metilación que dará como resultado el silenciamiento (Aufsatz, et al., (2002) PNAS 99 (Supl. 4): 16499-16506; Mette, eí al., (2000) EMBO J 19(19):5194-5201). Los casetes de expresión de amplicones comprenden una secuencia derivada de un virus vegetal que contiene la totalidad o una parte del gen blanco, pero generalmente no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permiten que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden estar orientados en el sentido del marco de lectura o antisentido respecto de la secuencia blanco (es decir, el ARN mensajero para bHLH-041). Se describen métodos para usar amplicones para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí y Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, y la Patente de los EE.UU. N° 6646805, cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la invención es ARN catalítico o tiene actividad ribozima específica para el ARN mensajero de bHLH- 041. Por consiguiente, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, dando como resultado una expresión reducida del bHLH-041. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N°: 4.987.071, incorporada en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de bHLH-041 se puede lograr mediante interferencia con ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (ARNmi). Los ARNmi son agentes reguladores que consisten de 22 ribonucleótidos aproximadamente. Los ARNmi son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos. Véase, por ejemplo Javier et al., (2003) Nature 425: 257-263, incorporada en la presente a modo de referencia.

Para efectuar la interferencia con miARN, el cásete de expresión se diseña de modo que exprese una molécula de ARN modelada en un ARNm de un gen endógeno. El gen de miARN codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria con otro gen endógeno (secuencia blanco). Para suprimir la expresión de bHLH-041 , la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona entre una secuencia de un transcripto bHLH-041 y contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia bHLH- 041 en la orientación del marco de lectura y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria de la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura. Las moléculas de miARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por generaciones subsiguientes de las plantas. En una realización, el polinucleótido codifica una proteína en dedo de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido bHLH-041, dando como resultado una expresión menor del gen. En realizaciones particulares, la proteína en dedo de zinc se une a una región reguladora de un gen bHLH-041. En otras realizaciones, la proteína en dedo de zinc se une a un ARN mensajero que codifica una bHLH-041 e impide su traducción. Se han descritos métodos para seleccionar sitios para dirigir proteínas en dedo de cinc, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N°: 6.453.242, y métodos para usar proteínas de dedos de cinc en la inhibición de la expresión de genes en plantas, por ejemplo, en la publicación de Patente de los EE.UU. N°: 2003/0037355; cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une a por lo menos un bHLH-041 y reduce la actividad del bHLH-041. En otra realización, la unión del anticuerpo da como resultado un mayor recambio del complejo de anticuerpo-bHLH-041 mediante mecanismos de control de calidad celular. La expresión de anticuerpos en células vegetales, y la inhibición de vías moleculares mediante la expresión y la unión de anticuerpos a proteínas en células vegetales son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Conrad y Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporado en la presente a modo de referencia. En otras realizaciones, se emplea un enfoque dominante negativo para disminuir la regulación, en donde la planta es transformada con un polinucleótido que codifica un factor de transcripción bHLH-041 parcial. El factor de transcripción parcial codificado, al que le puede faltar el dominio de unión a ADN o el dominio transactivante, compite por sitios de unión, reduciendo así el efecto funcional del factor de transcripción nativo. Véase, por ejemplo, Kuhlmann, et a/., (2003) J. Biol. Chem. 278(10):8786-8794; Heinekamp, et al., (2004) Plant J. 38:298-309; King, et al., (1999) Internan. Immun. 11(8):1203-1215. En algunas realizaciones de la presente invención, la actividad de bHLH-041 es reducida o eliminada por interrupción del gen que codifica al bHLH-041. El gen que codifica al bHLH-041 se puede interrumpir mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una realización, el gen se interrumpe usando marcación con transposones. En otra realización, el gen es interrumpido por mutaciones en las plantas usando mutagénesis aleatoria o dirigida, y seleccionando las plantas que presentan una menor actividad bHLH-041. En una realización de la invención, se usa marcación con transposones para reducir o eliminar la actividad de bHLH-041. La marcación con transposones comprende insertar un transposón dentro de un gen bHLH-041 endógeno para reducir o eliminar la expresión de bHLH-041. Un "gen bHLH-041" significa un gen que codifica un bHLH-041 acorde con la invención . En esta realización, la expresión de bHLH-041 se reduce o elimina por inserción de un transposón dentro de la región reguladora o la región codificante del gen que codifica al bHLH-041. Se puede usar un transposón dentro de un exón, un intrón, una secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora de un gen bHLH-041 para reducir o eliminar la expresión y/o la actividad del bHLH-041 codificado. Los métodos para efectuar la marcación con transposones de genes específicos en plantas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; y Gai, et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999) Genetics 153:1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu en determinados genes se describe en Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al., (1996) Science 274:1537-1540; y en la Patente de los EE.UU. N°: 5.962.764; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. En la técnica también se conocen otros métodos para disminuir o eliminar le expresión de genes endógenos en plantas, y puede aplicárselos de forma similar en la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como la mutagénesis inducida por metansulfonato de etilo, la mutagénesis por supresión y la mutagénesis por supresión con neutrones rápidos, usada en un sentido de genética inversa (con PCR) para identificar lineas de plantas en las que se ha eliminado el gen endógeno. Por ejemplos de estos métodos véase Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481 ; Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; y Quesada, et al., (2000) Genetics 154:421-436; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Además, en la presente invención también puede aplicarse un método rápido y automatizado para efectuar mutaciones inducidas por sustancias químicas, TILLING (direccionamiento de lesiones locales inducidas en genomas), el uso de HPLC desnaturalizante o digestión selectiva con endonucleasas de productos de PCR seleccionados. Véase McCallum et al (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457, incorporado en la presente a modo de referencia. En otra realización de esta invención, pueden usarse mutantes dominantes para efectuar el silenciamiento de ARN debido a la inversión genética y la recombinación del locus de un gen duplicado. Véase, por ejemplo, Kusaba, et al., (2003) Plant Cell 15:1455-1467. La invención abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de bHLH-041. Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta son conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, el uso de vectores de ARN.ADN, vectores de mutación de ARN:ADN, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicos. Dichos vectores y métodos de uso son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N° 5565350, 5731181 , 5756325, 5760012, 5795972 y 5871984, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, y Beetham, et al., (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 96:8774-8778; cada una incorporada en la presente a modo de referencia. En determinadas realizaciones, se pueden agrupar los polinucleótidos de la presente invención con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés, con el fin de crear plantas con una característica deseada. Un carácter, como se lo usa en la presente, hace referencia al fenotipo derivado de una secuencia o un grupo de secuencias en particular. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier otro polinucleótido que codifica polipéptidos con actividad pesticida y/o insecticida, tal como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensís (descritas en las Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723, .756; 5.593.881; y Geiser, eí al., (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme, eí al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita en la Patente de los EE.UU. N°: 5.981.722) y semejantes. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden combinar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de caracteres, incluyendo, sin limitaciones, caracteres deseables para alimentos para animales, tales genes que confieren un contenido elevado de aceite (por ejemplo, Patente de los EE.UU. N° 6.232.529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes de los EE.UU. N° 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; y 5.703.409); cebada con alto contenido de Usina (Williamson, eí al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas ricas en metionina (Pedersen, eí al., (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, eí al., (1988) Gene 71:359; y usumura, eí al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); mayor digestibilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (Solicitud de Patente de los EE.UU. N° Acta: 10/053.410, presentada el 7 de noviembre, 2001); y tiorredoxinas (Solicitud de Patente de los EE.UU. N° Acta: 10/005.429, presentada el 3 de diciembre, 2001)); cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con rasgos deseables para resistencia a enfermedades o herbicidas (por ejemplo, genes de detoxificación de fumonisina (Patente de los EE.UU. N°: 5.792.931); genes de avirulencia y resistencia a enfermedades (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintetasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintetasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); y resistencia a glifosato (el gen EPSPS); y rasgos deseables para productos de procesamiento o proceso, tal como alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente de los EE.UU. N°: 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (Patente de los EE.UU. N°: 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintetasas (SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 5.602.321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert, et al., (1988) J. Bacterio!. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)); cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. También pueden combinarse los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que proveen caracteres agronómicos, tales como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente de los EE.UU. N° 5583210), fuerza del tallo, cronograma de florecimiento, o caracteres de tecnología de transformación, tales como la regulación del ciclo celular o el direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), cuyas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia. Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas mediante cualquier método, incluyendo por ejemplo, cruzamiento de plantas con cualquier metodología convencional o TopCross o transformación genética. Si las secuencias se combinan mediante la transformación genética de las plantas, es posible combinar las secuencias de polinucleótidos de interés en cualquier momento y cualquier orden. Por ejemplo, se puede usar una planta transgénica que comprende una o más de las características deseadas como blanco para introducir otras características mediante una posterior transformación. Las características se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes transformación separadas (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cásete de transformación (cis). La expresión de las secuencias de interés puede ser dirigida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede acompañar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de características en la planta. Además, se reconoce que las secuencias de los polinucleótidos pueden combinarse en cualquier localización genómica deseada, usando un sistema de recombinación específica para sitios determinados. Véanse, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia. La secuencia de nucleótidos del promotor ELF3 que se describe en la presente invención, así como variantes y fragmentos de la misma, son de utilidad en la manipulación genética de cualquier planta cuando es ensamblada dentro de una construcción de ADN de modo tal que la secuencia promotora está ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga de interés. De esta manera, la secuencia de nucleótidos del promotor ELF3 de la invención se provee en casetes de expresión junto con secuencias de nucleótidos heterólogas para su expresión en la planta de interés. El promotor del gen ELF3 puede regular la expresión de las secuencias de nucleótidos ligadas operativamente de una manera inducible. Es decir, la expresión de las secuencias de nucleótidos ligadas operativamente en una célula vegetal puede ser inducida como respuesta a un estímulo. Un "estímulo" se refiere a una sustancia química, que se puede aplicar externamente o se puede acumular como respuesta a otro estímulo externo; u otro factor tal como elementos del entorno, incluyendo pero en un sentido no limitativo, la calidad de la luz y la cantidad de luz. Las regiones promotoras híbridas sintéticas son conocidas en la técnica. Dichas regiones comprenden elementos promotores 5' de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente al elemento promotor de otra secuencia de nucleótidos. En una realización de la invención, la expresión del gen heterólogo es controlada por un promotor híbrido sintético que comprende las secuencias promotoras ELF3 de la invención, o una variante o un fragmento de las mismas, ligadas operativamente a elementos promotores 5' de un promotor heterólogo. Se han identificado elementos promotores 5' y se pueden usar para generar un promotor sintético. Véase, por ejemplo, Rushton, et al., (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:311- 315. Como alternativa, una secuencia sintética del promotor ELF3 puede comprender duplicaciones de los elementos promotores 5' presentes dentro de la secuencia promotora ELF3. Dichos elementos incluyen los seis motivos de secuencia que presentan aproximadamente 50% de identidad con el "elemento evening" que se encuentran dentro de la secuencia 5' de ZM-ELF3 como se indicara previamente en la presente (Figura 3). Se considera que la secuencia promotora de la invención se puede usar con sus secuencias codificantes ELF3 nativas. La construcción de ADN que comprende al promotor ZM-ELF3 ligado operativamente a la secuencia de ELF3 nativa se puede usar para transformar cualquier planta de interés a fin de obtener el cambio fenotípico deseado, tal como inhibición de la respuesta de evitación de sombra y mayor tolerancia a la densidad de plantas. Cuando el promotor y su gen nativo son naturales en la planta, es decir, en maíz, la transformación de la planta con estas secuencias ligadas operativamente también da como resultado ya sea un cambio en el fenotipo, tal como inhibición de la respuesta de evitación de sombra y una mayor tolerancia a la densidad de plantas o la inserción de secuencias ligadas operativamente en una región diferente del cromosoma, con lo cual se altera el genoma de la planta. En otra realización de la invención, los casetes de expresión comprenderán una región de inicio de la transcripción que comprende a la secuencia de nucleótidos del promotor ZM-ELF3 descrita en la presente, o una variante o un fragmento de la misma, ligada operativamente a la secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión será controlada por el promotor ZM- ELF3 de la invención. La secuencia de nucleótidos promotora y los métodos descritos en la presente son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped, con el objeto de alterar el fenotipo de una planta. Son de interés varios cambios en el fenotipo, incluyendo la modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de ácidos grasos de una planta, la alteración del mecanismo de defensa a patógenos de la planta, y semejantes. Estos resultados se pueden obtener con la expresión de productos heterólogos o con la expresión de productos endógenos en plantas. Como alternativa, dichos resultados pueden obtenerse provocando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores, en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada. SECCIÓN EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Identificación y clonación de los genes ZM-ELF3 y bHLH-041 Se puede usar marcación de activación para identificar a los genes que tienen capacidad para afectar una característica de interés. Las inserciones de elementos potenciadores de la transcripción pueden activar y/o elevar de forma dominante la expresión de los genes endógenos cercanos. Al obtener una población grande con estos elementos potenciadores insertados aleatoriamente en todo el genoma, es posible evaluar la capacidad prácticamente de cada gen para modificar el rasgo de interés. Este enfoque se ha usado con éxito en el modelo de especies vegetales, Arabidopsis thaliana. (Weigel, et al., 2000 Plant Physiol. 122:1003-1013). El aislamiento de los genes asociados con la respuesta a la densidad se realizó usando los protocolos establecidos para una marcación de activación (Aukerman y Sakai (2003) Plant Cell 15(11 ):2730-2741 ). Se usó una construcción binaria basada en ADN-T de 18,4kb, pHSbarENDs, que contiene cuatro elementos potenciadores multimerizados derivados del promotor 35S del virus en mosaico de coliflor, correspondiente a los nucleótidos -341 a -64, según la definición de Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812. La construcción también contiene secuencias de vector (pUC9) para permitir el rescate del plásmido, secuencias de transposón (Ds) para removilizar el ADN-T y al gen bar para poder efectuar una selección con glufosinato de las plantas transgénicas. En principio, solamente se va a transferir el segmento de 10,8 kb del borde derecho (RB) al borde izquierdo (LB) inclusive dentro del genoma de la planta huésped. Dado que los elementos potenciadores están ubicados cerca del RB, pueden inducir activación en cis de los loci genómicos después de la integración del ADN-T. Se crearon dos poblaciones de Arabidopsis de activación marcada por transformación de plantas completas de Agrobacterium: Población 1 y Población 2. Para la Población 1, la construcción pHSbarENDs se transformó en la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, cultivado en LB a 25°C hasta una D06oo~1,0. A continuación, las células se agruparon en pelets por centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de sacarosa 5%/Silwet L-77 0,05% (OSI Specialties, Inc.). Cuando se encontraban en la etapa de brotación temprana, las plantas del ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana cultivadas en tierra recibieron un riego por arriba con la suspensión de Agrobacterium . Una semana después, las mismas plantas se volvieron a regar por arriba con la misma cepa de Agrobacterium en sacarosa/Silwet. Luego se dejó que las plantas establecieran semillas normalmente. Las semillas ?? resultantes se cultivaron sobre tierra y se seleccionaron las plántulas transgénicas ?? por rociado con glufosinato (Finale®; Agrevo; Bayer Environmental Science). Se recolectaron semillas T2 de aproximadamente 35.000 plantas Ti resistentes a glufosinato individuales. Se cultivaron plantas T2 y se agruparon volúmenes iguales de semillas T3 de 96 líneas separadas T2, creando 360 subpoblaciones. Para la Población 2, el plásmido se alteró ligeramente para agregar sitios de restricción y se cambió su nombre por pHSbarENDs2. La transformación de la cepa de Agrobacterium y plantas de Arabidopsis se realizó como se describió para la Población . Se seleccionó un total de 100.000 plántulas T-i resistentes a glufosinato. Las semillas T2 de cada línea se mantuvieron separadas. Se realizó una prueba de marcación de la activación con una población de Arabidopsis que contenía insertos transgénicos diseñados para activar los genes proximales, con el fin de comprender la respuesta de las plantas a poblaciones de gran densidad, así como para aislar los genes que confieren un fenotipo que no es sensible a la densidad. Se examinó en la población con activación marcada la presencia de variantes en la respuesta a la densidad sembrando semillas en tierra a una densidad de aproximadamente una planta por centímetro. Las plantas individuales que diferían significativamente de sus vecinos en términos de morfología global y fenotipo fueron seleccionadas en la etapa de floración. Se volvieron a examinar las semillas de estas plantas en un segundo experimento de densidad bajo condiciones similares. La secuencia flanqueadora contigua de la marca de activación se aisló por rescate del plásmido. Se utilizó transferencia Southern, transferencia Northern y PCR para verificar si la línea de la variante con activación marcada contenía una sola marca y sí se había activado el gel flanqueador más cercano. Se aislaron varias líneas con activación marcada, la mayoría de las cuales eran de floración tardía. Véase Aukerman y Sakai (2003) Plant Cell 15(11 ):2730-2741. Se caracterizaron dos genes de las plantas con el fenotipo alterado cuando eran cultivadas bajo una gran densidad de plantas. Un gen correspondía a un gen del ciclo circadíano, ELF3, lo que indica que la manipulación de los genes relacionados con el ritmo circadíano constituye un medio para mejorar transgénicamente el rendimiento de las plantas cultivadas a una gran densidad. Véase la Figura 6. Se ha clonado el homólogo ELF3 de maíz y se describe en la presente (secuencia codificante que se muestra en la SEQ ID N°: 1, el polipéptído que se muestra en las SEQ ID N°: 2 y 3, la secuencia reguladora 5' que se muestra en la SEQ ID N°: 4). La secuencia de la proteína ELF3 de Arabidopsis (At-ELF3) se usó para identificar homólogos de maíz usando tBLASTn (Gish y States (1993) Nature Genet. 3:266-272) para examinar bibliotecas de EST comerciales. Se identificó una secuencia parcial de maíz que presentaba homología con At-ELF3 y se clonó Zm-ELF3 de longitud completa diseñando cebadores de oligonucleótidos para los extremos N y C terminales de la proteína y amplificando la secuencia codificante completa. A continuación, se clonó el gen Zm-ELF3 en un vector de transformación de plantas y luego fue transferido a Arabidopsis utilizando el método de inmersión floral (Clough y Bent (1998) Plant Journal 16(6):735-743). La segunda línea con activación marcada presentaba una respuesta hipersensible a la densidad: las plantas eran menos vigorosas bajo una gran densidad, pero permanecían prácticamente sin cambios en condiciones de baja densidad. La clonación del gen de esta línea con activación marcada permitió aislar un factor de transcripción en hélice-bucle-hélice básico no caracterizado, bHLH-041 (secuencia codificante que se muestra en la SEQ ID N°: 5 o el polipéptido de la SEQ ID N°: 6; véase también GenBank, N° Acceso BAA97026). Esta clase de factores de transcripción está relacionada con un gran número de respuestas de las plantas, incluyendo algunos miembros que interactúan directamente con los fitocromos, que están relacionados con la percepción de luz. Se clonó la secuencia de Arabidopsis contigua de la marca de activación por rescate del plásmido y el análisis de secuencia reveló que la marca se había insertado 807 bp desde el inicio de la traducción de bHLH-041. Se confirmó la activación en esta línea por RT-PCR. Ejemplo 2: La sobreexpresión de ZM-ELF3 en Arabidopsis tránsqénico confiere tolerancia a la densidad Se sobreexpresó una ZM-ELF3 de longitud completa en Arabidopsis transgénico usando el promotor SCP (Patente de los EE.UU. N°: 6.555.673). Las plantas fueron transformadas usando el método de inmersión floral (Clough y Bent (1998) Plant Journal 16(6):735-743). De esta manera, las plantas fueron sumergidas en un cultivo de Agrobacterium transformado con una vector co-integrado que contenía al gen ZM-ELF3. Las plantas transgénicas fueron identificads por su resistencia a glufosinato y se cultivaron hasta la generación subsiguiente, en la cual se recolectaron las semillas. Se evaluaron varias líneas de plantas transgénicas y de tipo salvaje (WT) por su tolerancia a la densidad determinando su rendimiento y el comportamiento de las plantas bajo condiciones de siembra de gran densidad. En esta prueba se consideró como gran densidad a una planta por cm2, que es aproximadamente cuatro veces la densidad del crecimiento óptimo de Arabidopsis. Las plantas transgénicas eran menos susceptibles a las disminuciones en la longitud de las hojas (Figura 2A) y en el número de hojas en el momento de la floración (Figura 2B) inducidas por una gran densidad de plantas. Los transgénicos ZmELF-3 también fueron evaluados en un experimento de siembra tardía en el cual se sembró una cuadrícula de plantas control a gran densidad. Después de diez días, el material experimental se plantó entre las plantas control como una evaluación de cuán bien competían las plantas con plantas vecinas de desarrollo más avanzado. La línea con activación marcada que sobreexpresaba ZmELF3 produjo plantas que eran más grandes y que tenían un fenotipo más vigoroso que el tipo salvaje. Ejemplo 3: Transformación y regeneración de plantas transqénicas de maíz que sobreexpresan la proteina ZM-ELF3 Se bombardean embriones de maíz inmaduros de plantas donantes de invernadero con un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 ó 2 ligada operativamente al promotor de ubiquitina- de maíz (UBI1) y al gene marcador seleccionable PAT (Wohlleben, et al., (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialafos. Como alternativa, el gen marcador de selección se provee en un plásmido separado. La transformación se llevó a cabo como se indica a continuación. Más adelante se proporcionan las recetas de los medios. Preparación del Tejido Blanco Las mazorcas son despinochadas y se esterilizan las superficies de las mismas con blanqueador Chlorox al 30%, más 0,5% de detergente Micro durante 20 minutos, y se lavan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se recortan y se colocan con el eje embrionario hacia abajo (el escutelo hacia arriba), a razón de 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas, y luego se alinean dentro de la zona blanco de 2,5 cm como preparación para el bombardeo. Se elaboró un vector de plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 o 2 ligada operativamente al promotor de ubiquitina- (UBM) de maíz. Este ADN de plásmido, más el ADN de plásmido que codifica un marcador de selección PAT, es precipitado sobre pelets de tungsteno de 1,1 pm (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación con CaCI2, como se indica a continuación: 100 pl de un preparado de partículas de tungsteno en agua; 10 pl (1 pg) de ADN en solución amortiguadora Tris EDTA (1 pg total de ADN); 100 µ? de CaCI2 2,5 M; y 10 pl de espermidina 0,1 M. Cada reactivo se agrega en forma consecutiva a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene esta última en un agitador para tubos múltiples. Las mezcla final se sónica brevemente y se incuba bajo agitación constante durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se elimina el liquido, se lava con 500 mi de etanol al 100% y se centrifuga durante 30 segundos. Se elimina el líquido nuevamente y se agregan 105 µ? de etanol al 100% a los precipitados finales de partículas de tungsteno. Para realizar el bombardeo con cañón de partículas, se sonican brevemente las partículas de tungsteno/ADN , se introducen 10 µ? en el centro de cada macrotransportador y se deja secar por aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestras se bombardean en el nivel N° 4 en una pistola de partículas. Todas las muestras reciben un único disparo a 650 PSI con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/ADN . Luego del bombardeo, los embriones se mantienen en un medio 560Y durante 2 días, y luego se transfieren a un medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialafos, y se subcultivan cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 días de selección, los clones de los cayos resistentes a la selección se transfieren a un medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Una vez completada la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren a un medio para germinación y se ubican en una cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días mas tarde, las plántulas desarrolladas se transfieren a un medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días, hasta que las plántulas se establecen correctamente. Luego se transfieren las plantas a injertos en bastidores (equivalentes a macetas de 2,5") que contienen tierra para macetas, y se las deja crecer por una semana en una recámara de cultivo, luego se desarrollan otras 1-2 semanas en un invernadero, y después se las transfiere a macetas clásicas de 600 (1,6 galones) y se las deja crecer hasta la madurez. Las plantas fueron monitoreadas por su tolerancia a la densidad determinando su rendimiento y el comportamiento de las plantas bajo condiciones de siembra de gran densidad. El medio de bombardeo (560Y) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-14 6), mezcla de vitaminas de Eriksson 1,0 ml/l (1000X SIGMA-1511 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 120,0 g/l, 2,4-D 1 ,0 mg/l y L-prolina 2,88 g/l (llevada a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); de Gelrite 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y nitrato de plata 8,5 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1,0 ml/l (1000X SIGMA- 511), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y nitrato de plata 0,85 mg/l y Bialafos 3,0 mg/l (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de regeneración de plantas (288J) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0,100 g de ácido nicotínico, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l, llevado a volumen con H20 D-l pulida) (Murashige' y Skoog (1962) Physiol. Planta. 75:473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60 g/l y ácido abscísico 1,0 ml/l 0,1 mM (llevado a volumen con H20 D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); Gelrite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y ácido indolacético 1,0 mg/l y Bialafos 3,0 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C). El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0,100 g/l, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l, llevado a volumen con H20 D-l pulida), mio-inositol 0,1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con H20 D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); y bacto-agar 6 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l pulida), esterilizado y enfriado a 60°C. Ejemplo 4: Sobreexpresión de ZM-ELF3 en maíz transgénico Se sobreexpresó una ZM-ELF3 de longitud completa en maíz transgénico. Para la transformación mediada por Agrobacterium de maíz con la secuencia de nucleótidos ZM- ELF3 (SEQ ID N°: 1 ó 2), se empleó el método de Zhao (Patente de los EE.UU. N°: 5.981.840 y publicación de Patente PCT W098/32326; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia). Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium , donde las bacterias pueden transferir la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 ó 2 a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (paso 1: el paso de infección). Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Luego de este período de co-cultivo, se contempla una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico del que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium , sin la adición de un agente de selección para las plantas transformantes (etapa 3: etapa de reposo). Luego, los embriones inoculados fueron cultivados en un medio que contenía un agente de selección y se hicieron crecer y se recuperaron los callos transformados (etapa 4: etapa de selección). Luego se regeneran los callos para obtener plantas (etapa 5: el paso de regeneración) y los callos que crecen sobre el medio selectivo se cultivan sobre medio sólido para regenerar las plantas. El efecto de la sobreexpresión de la proteína ZM-ELF3 sobre la respuesta de densidad de plantas se evaluó determinando el rendimiento y el comportamiento de las plantas transgénicas bajo siembra de gran densidad. Ejemplo 5: Transformación de embriones de soja para la sobreexpresión de ZM-ELF3 Condiciones de cultivo Se mantienen cultivos embriogénicos de soja en suspensión (cv Jack) en 35 mi de medio líquido SB196 (véase las recetas más adelante) sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, 26 °C con luz fluorescente blanca fría con un fotoperíodo de luz/oscuridad de 16:8 hs con una intensidad lumínica de 60-85 //E/m2/s. Los cultivos se subcultivan cada 7 días a dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de líquido SB196 fresco (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 días). Se transforman cultivos embriogénicos de soja en suspensión con los plásmidos y fragmentos de ADN que se describen en los siguientes ejemplos con el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein et al., (1987) Nature, 327:70). Inicio de los cultivos embriogénicos de soja en suspensión Los cultivos de soja se inician dos veces por mes con 5-7 días entre cada inicio. Se toman vainas con semillas inmaduras de plantas de soja disponibles 45-55 días después de plantarlas, se retiran de sus recubrimientos y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soja se esterilizan agitándolas durante 15 minutos en una solución de Clorox al 5% con 1 gota de jabón blanco (95 mi de agua destilada esterilizada en autoclave más 5 mi de Clorox y 1 gota de jabón). Mezclar bien. Las semillas se lavan usando 2 botellas de 1 litro de agua destilada estéril y las que son de menos de 4 mm se colocan sobre portaobjetos para microscopio individuales. Se corta el extremo pequeño de la semilla y los cotiledones son presionados fuera del recubrimiento de la semilla. Los cotiledones se transfieren a placas que contienen medio SB1 (25-30 cotiledones por placa). Las placas se envuelven con cinta y se guardan durante 8 semanas. Una vez transcurrido este tiempo se recortan los embriones secundarios y se colocan en medio líquido SB196 durante 7 días. Preparación del ADN para el bombardeo Se usó el plásmido intacto o un fragmento de plásmido de ADN que contenía la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 o 2, ligado operativamente al promotor de interés, y gen del marcador seleccionable para el bombardeo. El ADN de plásmido para el bombardeo se prepara de forma rutinaria y se purifica usando el método descrito en la Guía de Protocolos y Aplicaciones de Promega™, Segunda Edición (página 106). Los fragmentos de los plásmidos que contienen la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 que se muestra en la SEQ ID N°: 1 ó 2, ligada operativamente al promotor de interés y el gen marcador seleccionable se obtienen por aislamiento de gel de los plásmidos digeridos dos veces. En cada caso, se digieren 100 pg de ADN de plásmido en 0,5 mi de la mezcla de enzimas específica que sea apropiada para el plásmido de interés. Los fragmentos de ADN resultantes se separan mediante electroforesis sobre gel con agarosa GTG SeaPlaque 1% (BioWhitaker Molecular Applications) y los fragmentos de ADN que contienen la secuencia de nucleótidos de ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 ó 2, ligada operativamente al promotor de interés, y el gen marcador seleccionable se recortan del gel de agarosa. El ADN se purifica de la agarosa usando la enzima de digestión GELasa según el protocolo del proveedor.

Se toma una alícuota de 50 µ\ de agua destilada estéril que contiene 3 mg de partículas de oro y se agrega a 5 µ\ de una solución de ADN 1 y g/v I (ya sea el plásmido intacto o fragmentos de ADN preparados como se describió previamente), 50 µ\ de CaCl2 2,5 M y 20 µ\ de espermidina 0,1 M. La mezcla se agita durante 3 min en el nivel 3 de un agitador con vortexeo y se centrifuga durante 10 seg en una microcentrífuga de mesada. Después de un lavado con 400 µ\ de etanol 100% el pelet se suspende por sonicación en 40 µ\ de etanol 100%. Se disponen cinco µ\ de suspensión de ADN en cada disco volador de los discos del instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada 5 µ\ de alícuota contiene aproximadamente 0,375 mg de oro por bombardeo (es decir por disco). Preparación del tejido y bombardeo con el ADN Se colocan aproximadamente 150-200 mg de cultivos embrionarios en suspensión de 7 días en una caja de Petri de 60 x 15 mm vacía, estéril, y la caja se cubre con una malla de plástico. El tejido es bombardeado con 1 o 2 disparos por placa con la presión de ruptura de membrana definida en 1100 psi y la cámara evacuada hasta un vacío de 27-28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de la malla de retención/detención. Selección de los embriones transformados Los embriones transformados fueron seleccionados usando ya sea higromicina (cuando se usaba el gen de la higromicina fosfotransferasa, HPT, como marcador seleccionable) o clorsulfurón (cuando se usaba el gen de la acetolactato sintetasa, ALS, como marcador seleccionable). Selección con hiqromicina (HPT) Después del bombardeo, el tejido se coloca en medio SB196 fresco y se cultiva como se describió previamente. Seis días después del bombardeo, se cambio el medio SB196 por medio SB196 fresco que contiene al agente de selección higromicina 30 mg/l. El medio de selección se cambia una vez por semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, se puede observar tejido verde, transformado creciendo desde las masas embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples cavidades para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Selección sobre clorsulfurón (ALS) Después del bombardeo, el tejido se divide en 2 frascos con medio SB196 fresco y se cultiva como se describió previamente. Seis a siete días después del bombardeo, se cambia el medio SB196 por medio SB196 fresco que contiene al agente de selección clorsulfurón 100 ng/ml. El medio de selección se cambia una vez por semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, se puede observar tejido verde, transformado creciendo desde las masas embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples cavidades que contienen medio SB196 para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Regeneración de embriones somáticos de soja en plantas de soja Con el fin de obtener plantas completas a partir de los cultivos embriogénicos en suspensión, es necesario regenerar el tejido. Maduración de los embriones Los embriones se cultivan durante 4-6 semanas a 26 °C en SB196 bajo luz fluorescente blanca fría (Phillips Cool White Econowatt F40/CW/RS/EW) y bulbos Agro (Phillips F40 Agro) (40 vatios) con un fotoperíodo de 16:8 hs con una intensidad lumínica de 90-120 uE/m2.s. Una vez transcurrido este período, las masas de embriones se llevan a un medio de agar sólido, SB166, durante 1-2 semanas. Las masas se subcultivan luego en medio SB103 durante 3 semanas. Durante este período, se pueden retirar embriones individuales de las masas y examinarlos por la expresión de ZM-ELF3. Se debe tener en cuenta que cualquier fenotipo detectable, que sea el resultado de la expresión de los genes de interés, puede ser examinado en esta etapa. Disección y germinación de los embriones Se disecan embriones individuales maduros colocándolos en una pequeña caja de Petri vacía (35 x 10 mm) durante aproximadamente 4-7 días. Las placas se sellan con cinta (creando así una pequeña cámara húmeda). Los embriones disecados se plantan en medio SB71-4 donde se dejan para que germinen bajo las mismas condiciones de cultivo que se describieron previamente. Las plántulas germinadas se retiran del medio de germinación y se enjuagan exhaustivamente con agua y luego se plantan en tierra Redi-Earth en una bandeja de 24 celdas, cubierta con un domo de plástico traslúcido. Después de 2 semanas, se retira el domo y se deja que las plantas maduren durante otra semana más. Si las plántulas tenían un aspecto maduro eran transplantadas y posteriormente se evaluaba el efecto de la sobreexpresión de la proteína ZM-ELF3 sobre la respuesta de densidad de plantas determinando el rendimiento y el comportamiento de las plantas transgénicas bajo una gran densidad de siembra. Recetas de los medios Medio de proliferación líquido SB 196 - FN Lite (por litro): MS FeEDTA: Solución madre 1 100x 10 mi MS Sulfato: Solución madre 2 100x 10 mi Haluros FN Lite: Solución madre 3 100x 10 mi FN Lite ?,?,??: Solución madre 4 100x 10 mi Vitaminas B5 ( 1 ml/l) 1 ,0 mi 2,4-D (concentración final 10 mg/l) 1 ,0 mi KN03 2,83 g (NH4 )2so4 0,463 g Asparagina 1 ,0 g Sacarosa (1 %) 10 g PH 5,8 Soluciones madre FN Lite Agregar primero, disolver en botella oscura bajo agitación 2 Solución madre de MS Sulfato 100x MgS04 - 7H20 37,0 g 18,5 g M S04 - H20 1,69 g 0,845 g ZnS04 - 7H20 0,86 g 0,43 g CuS04 - 5H2O 0,0025 g 0,00125 g 3 Solución madre de haluros FN Lite 100x CaCI2 - 2H20 30,0 g 15,0 g Kl 0,083 g 0.0715 g CoCI2 - 6H20 0.0025 g 0,00125 g 4 Solución madre FN Lite ?,?,?? 100x KH2P04 18,5 g 9,25 g Na2Mo04 - 2H20 0,025 g 0,0125 g El medio sólido SB1 comprende (por litro): 1 paquete de sales MS (GIBCO/BRL: N° Cat. 11117-066); 1 mi de solución madre de vitaminas B5 1000X; 31,5 g sacarosa; 2 mi de 2,4-D (concentración final 20 mg/l); pH 5,7; y 8 g de agar TC. El medio sólido SB 166 comprende (por litro): 1 paquete de sales MS (GIBCO/BRL: N° Cat. 11117-066); 1 mi de solución madre de vitaminas B5 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgC hexahidrato; 5 g de carbón activado; pH 5,7; y 2 g de Gelrite. El medio sólido SB 103 comprende (por litro): 1 paquete de sales MS (GIBCO/BRL, N° Cat. 11117-066); 1 mi de solución madre de vitaminas B5 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgCI2 hexahidrato; pH 5,7; y 2 g de Gelrite. El medio sólido SB 71-4 comprende (por litro): 1 botella de sales B5 de Gamborg el sacarosa (Gibco/BRL - N° Cat. 21153-036); pH 5,7; y 5 g de agar TC. La solución madre de 2,4-D se obtiene lista para usar de Phytotech N° Cat. D 295; la concentración es de 1 mg/ml. La solución madre de vitaminas B5 (por cada 100 mi) que se guarda en alícuotas a -20 °C comprende: 10 g de mio-inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCI; y 1 g de tiamina. Si la solución no se disuelve con suficiente rapidez, se puede aplicar un bajo nivel de calor con la placa de agitación caliente. La solución madre de clorsulfurón comprende 1 mg/ml en hidróxido de amonio 0,01 N Ejemplo 6: Transformación de girasol Se transforman tejidos de meristema de girasol con un cásete de expresión que contiene a la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 o 2 ligada operativamente al promotor de interés de la siguiente manera (véase también, Patente de Europa N° EP 0 486233, incorporada en la presente a modo de referencia, y Malone-Schoneberg, et al., (1994) Plant Science 103:199-207). Se eliminan las cáscaras de semillas de girasol maduras (Helianthus annuus L.) usando una trilladora con cabeza individual para trigo. Se esterilizan en forma superficial las semillas por 30 minutos en una solución de decolorante Clorox al 20%, con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 mi de solución. Se lavan las semillas dos veces con agua destilada estéril. Se preparan ejes embrionarios partidos usando una modificación del procedimiento descrito por Schrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al., (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Se embeben las semillas en agua destilada por 60 minutos, después de un procedimiento de esterilización superficial. Luego se separan los cotiledones de cada semilla para obtener una fractura clara en el plano del eje del embrión. Después de separar el extremo de la raíz, se disecan los explantes en forma longitudinal entre las hojas primordiales. Se colocan las dos mitades, con la superficie cortada hacia arriba, en un medio GBA que consiste en elementos minerales Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497), vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St.Paul, Minnesota), 40 mg/l de sulfato de adenina, 30 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-bencil-aminopurina (BAP), 0,25 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA), 0,1 mg/l de ácido giberélico (GA3), pH 5,6, y 8 g/l de Phytagar.

Los explantes son sometidos a bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney, eí al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Para este tratamiento se colocan entre treinta y cuarenta explantes en un círculo en el centro de una placa de 60 x 20 mm. Se suspenden nuevamente aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1 ,8 mm en 25 mi de amortiguador TE estéril (Tris HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), y se usan alícuotas de 1,5 mi para cada bombardeo. Se bombardea cada placa dos veces a través de una pantalla de nytex de 150 mm, colocada a una altura de 2 cm de las muestras, en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®. Se usa la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens EHA105 en todos los experimentos de transformación. Se introduce un vector plásmido binario que comprende al cásete de expresión que contiene a la secuencia de nucleótidos ZM-ELF3 de la SEQ ID N°: 1 o 2 ligada operativamente al promotor de interés en la cepa EHA105 de Agrobacterium utilizando congelamiento-descongelamiento como describen Holsters, et a/., (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Este plásmido comprende además un gen marcador seleccionable con kanamicina (es decir, nptll). Las bacterias para los experimentos de transformación de plantas se cultivan durante la noche (a 28°C y con agitación continua a 100 rpm) en medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona y 5 g/l de NaCI, pH 7,0), con los antibióticos apropiados necesarios para mantener la cepa bacteriana y los plásmidos binarios. La suspensión se usa cuando alcanza una DO600 entre 0,4 y 0,8 aproximadamente. Las células de Agrobacterium se agrupan en pelets y se resuspenden a una ??ß?? final de 0,5 en medio de inoculación compuesto por MES 12,5 mM, pH 5,7, NH4CI 1 gm/l y MgS04 0,3 gm/l. Los explantes recién bombardeados se colocan en una suspensión de Agrobacterium , se mezcla y se deja reposar por 30 minutos. Luego se transfieren los explantes a un medio GBA y se los co-cultiva, con la superficie cortada hacia abajo, a 26°C y con días de 18 horas. Después de tres días de co-cultivo, los explantes se transfieren a un medio 374B (un medio GBA sin reguladores del crecimiento y con un nivel de sacarosa reducido de 1%) suplido con 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de sulfato de kanamicina. Los explantes se cultivan por entre dos y cinco semanas en medio de selección, y luego se transfieren a un medio 374B fresco que carece de kanamicina, para que se desarrollen en forma continua por una o dos semanas. Los explantes con áreas de crecimiento diferenciadas, resistentes a antibióticos, que no han producido brotes apropiados para la escisión, se transfieren a un medio GBA que contiene 250 mg/l de cefotaxima, para efectuar un segundo tratamiento con fitohormonas de 3 días. Se evaluaron muestras de hoja de brotes verdes, resistentes a kanamicina por la presencia de NPTII con un ELISA y por la presencia de expresión transgénica evaluando la actividad de ZM-ELF3.

Los brotes positivos para NPTII se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer® 6440 de girasol cultivados in vitro. Se hacen germinar las semillas esterilizadas en forma superficial en medio 48-0 (sales Murashige y Skoog con media fuerza, 0,5% de sacarosa, 0,3% de Gelrite™, pH 5,6), y se las cultiva bajo las condiciones descritas para el cultivo de explantes. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical de 1 cm en el hipocótile y se inserta el brote transformado en el corte. Se envuelve el área entera con parafilm para asegurar la raíz. Las plantas injertadas pueden transferirse a la tierra después de una semana de cultivo in vitro. Los injertos en la tierra se mantienen bajo condiciones de humedad elevada, después de una aclimatación lenta al ambiente del invernadero. Los sectores transformados de las plantas T0 (generación progenitora) que maduran en el invernadero se identifican por NPTII ELISA y/o mediante análisis de actividad de ZM-ELF3, al tiempo que las semillas transgénicas cosechadas de plantas T0 positivas para NPTII se identifican por medio de análisis de actividad de ZM-ELF3 de porciones pequeñas de cotiledones de semillas secas. Un protocolo de transformación de girasoles alternativo permite recuperar la progenie transgénica sin usar una presión de selección química. Se eliminan las cascaras de las semillas y se las esteriliza en forma superficial por 20 minutos en una solución de decolorante Chlorox al 20%, con la adición de dos o tres gotas de Tween 20 por cada 100 mi de solución, luego se lava tres veces con agua destilada. Se embeben las semillas esterilizadas en la oscuridad a 26°C por 20 horas en papel de filtro humedecido con agua. Se retiran los cotiledones y los extremos de las raíces, y se cultivan los explantes de meristemas en medio 374E (un medio GBA que consiste en sales M S , vitaminas de Shepard, 40 mg/l de sulfato de adenina, 3% de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-BAP, 0,25 mg/l de IAA, 0,1 mg/l de GA y 0,8% de Phytagar a pH 5,6) por 24 horas en la oscuridad. Se eliminan las hojas primarias para exponer el meristema apical, se colocan aproximadamente 40 explantes, con el domo apical hacia arriba, en un círculo de 2 cm en el centro de una placa con medio 374M (un medio GBA con 1 ,2% de Phytagar), y luego se cultiva en el medio por 24 horas en la oscuridad. Se suspenden nuevamente aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungsteno de 1,8 pm en 150 µ? de etanol absoluto. Después de la sonícación, se vierten 8 µ? de éstas en el centro de la superficie del disco macrotransportador. Se bombardea cada placa dos veces con discos de ruptura a 650 psi en el primer nivel, con un cañón de helio con un vacío de 26 mm de Hg. Se introduce el plásmido de interés en la cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 por congelamiento- descongelamiento, como se describió previamente. Se suspende nuevamente el precipitado de bacterias, cultivadas durante la noche a 28°C en un medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona y 5 g/l NaCI, pH 7,0) en presencia de 50 pg/l de kanamicina, en un medio de inoculación (ácido 2-(N-morfolin) etansulfónico 12,5 mM, MES 2 mM, 1 g/l de NH CI y 0,3 g/l de MgS04 a pH 5,7) hasta alcanzar una concentración final de 4,0 a una OD 600. Los explantes sometidos al bombardeo de partículas se transfieren a un medio GBA (374E), y se coloca una gota de suspensión de bacterias directamente en la parte superior del meristema. Se co-cultivan los explantes en el medio por 4 días, después de lo cual se transfieren los explantes a un medio 374C (GBA con 1% de sacarosa y son BAP, IAA o GA3, y suplido con 250 pg/ml de cefotaxima). Se cultivan las plántulas en el medio por aproximadamente dos semanas con días de 16 horas, bajo condiciones de incubación a 26°C. Se examinó en explantes (de alrededor de 2 cm de longitud) de cultivos de dos semanas en medio 374C la actividad de ZM-ELF3 usando ensayos conocidos en la técnica. Una vez identificados los explantes positivos (es decir, con expresión de ZM-ELF3), se descartan los brotes que no presentan actividad ZM-ELF3 y se subdivide cada explante positivo en explantes nodales. Un explante nodal contiene al menos un nodo potencial. Se cultivan los segmentos nodales en medio GBA por tres o cuatro días para promover la formación de retoños auxiliares en cada nodo. Luego se los transfiere a un medio 374C y se los deja crecer por otras cuatros emanas. Se separan los retoños en desarrollo y se los cultiva otras cuatro semanas en medio 374C. Se analizan muestras de hojas agrupadas de cada brote recién recuperado empleando los ensayos de actividad proteica apropiados. En este momento, los brotes positivos recuperados de un único nodo generalmente estarán enriquecidos en el sector transgénico detectado en el ensayo inicial antes del cultivo nodal. Los brotes recuperados positivos para la expresión de ZM-ELF3 se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer 6440 de girasol cultivados in vitro. Se preparan las plantas del siguiente modo. Se elimina la cáscara de las semillas y se las esteriliza superficialmente por 20 minutos en una solución de decolorante Chlorox al 20%, con la adición de dos o tres gotas de Tween 20 por cada 100 mi de solución, luego se lava tres veces con agua destilada. Se hacen germinar las semillas esterilizadas en superficie en medio 48 (sales MS con media fuerza, 0,5% de sacarosa, 0,3% de Gelrite, pH 5,0), y se cultiva a 26°C en la oscuridad por tres días, bajo condiciones de cultivo con días de 16 horas. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical en cada hipocótilo y se inserta un brote transformado en un corte en V. El área del corte se envuelve con parafilm. Después de una semana de cultivo en el medio, se transfieren las plantas injertadas a la tierra. Durante las primeras dos semanas, se las mantiene bajo condiciones de humedad elevada para aclimatarlas al ambiente del invernadero. El artículo "un" y "una" se usan en la presente para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en la técnica a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente se incorporan en la presente a modo de referencia, en la misma extensión en que se indicó que se incorporaba cada publicación o solicitud de patente individual especifica e individualmente en la presente a modo de referencia. Aunque la invención precedente ha sido descrita con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo, con el fin de facilitar la compresión, será obvio que podrán practicarse determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES: 1. Un método para mejorar el rendimiento de una planta cultivada bajo condiciones de gran densidad de población, que comprende: a) transformar una célula vegetal con una construcción que comprende un polinucleótido ELF3; y b) regenerar una planta a partir de dicha célula transformada en donde la expresión del polipéptido codificado por el polinucleótido ELF3 es mayor en la planta regenerada, o su progenie transformado, con relación a la expresión en una planta control.
2. El método de la cláusula 1, en donde dicho mayor rendimiento se mide en términos de un mayor rendimiento de granos o una mayor producción de biomasa, con relación a una planta control.
3. El método de la cláusula 1, en donde el polinucleótido ELF3 se selecciona del grupo formado por: (a) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 o de la SEQ ID N°: 2; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 3; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 o en la SEQ ID N°: 2, en donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de la proteína ELF3; y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID N°: 3, en donde dicho polipéptido codificado tiene actividad de la proteína ELF3.
4. El método de la cláusula 1, en donde dicho polinucleótido está ligado operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor con preferencia por hojas, un promotor regulado por luz y un promotor regulado por el reloj circadiano.
5. A método para mejorar el rendimiento de una planta cultivada bajo condiciones de gran densidad de población, que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un cásete de expresión que reduce el nivel o la actividad de un polinucleótido bHLH-041 nativo o el polipéptido codificado por el mismo; y (b) regenerar una planta a partir de dicha célula transformada, en donde el nivel o la actividad del polipéptido codificado por el polinucleótido bHLH-041 nativo está reducido en la planta regenerada, o en la progenie transformada de la misma, con relación a la expresión en la planta control.
6. El método de la cláusula 5, en donde dicho rendimiento mejorado se mide en términos de un mayor rendimiento de granos o una mayor producción de biomasa, con relación a una planta control.
7. El método de la cláusula 5, en donde dicho cásete de expresión comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por: (a) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 5, o su complemento; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 6; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 5, o su complemento; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia de (a), (b) o (c); y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de una secuencia de (a), (b) o (c), y los nucleótidos complementarios de los mismos.
8. El método de la cláusula 5, en donde dicho polinucleótido está ligado operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor con preferencia por hojas, un promotor regulado por luz y un promotor regulado por el reloj circadiano.
9. El método de la cláusula 5, que además comprende incrementar el nivel o la actividad de un polipéptido ELF3 en dicha planta.
10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 o de la SEQ ID N°: 2; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 3 (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 o en la SEQ ID N°: 2, en donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de la proteína ELF3; y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID N°: 3, en donde dicho polinucleótido codificado tiene actividad de la proteína ELF3.
11. Un cásete de expresión que comprende el polinucleótido de la cláusula 10 ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal.
12. Una planta que comprende al cásete de expresión de la cláusula 11.
13. La planta de la cláusula 12, en donde dicha planta es una monocotiledónea.
14. La planta de la cláusula 13, en donde dicha monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
15. La planta de la cláusula 12, en donde dicha planta es una dicotiledónea.
16. La planta de la cláusula 15, en donde dicha dicotiledónea es soja, Brassica, girasol, algodón o alfalfa.
17. Una semilla de la planta de la cláusula 12, donde dicha semilla comprende dicho cásete de expresión.
18. Un polinucleótido de la SEQ ID N°: 4.
19. Un polinucleótido que comprende un fragmento de la SEQ ID NO: 4 que dirige la expresión de un polinucleótido de interés ligado operativamente en una célula vegetal de manera similar a la expresión nativa de la SEQ ID NO: 2.
20. Un método para modular la expresión de un polinucleótido de interés en una planta, que comprende (a) transformar una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende al polinucleótido de interés ligado operativamente a un polinucleótido de la SEQ ID N°: 4 o un fragmento funcional del mismo; y (b) regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal transformada, en donde la expresión del polinucleótido de interés está modulada.