CN102421912A - 通过调节玉蜀黍转录辅激活物p15(pc4)蛋白提高植物的产量 - Google Patents
通过调节玉蜀黍转录辅激活物p15(pc4)蛋白提高植物的产量 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于调节植物发育和用于提高植物中的产量的方法。所述组合物包含PC4序列。本发明的组合物包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列和核苷酸序列以及它们的变体和片段。编码PC4分子的核苷酸序列在DNA构建体中提供以便在所关注的植物中表达，以调节植物或植物部分中的PC4序列的水平。所述方法包括将包含本发明PC4序列的异源多核苷酸引入到植物或植物部分中。PC4多肽的水平可被提高或降低。这种方法可用来提高植物中的产量；在一个实施方案中，所述方法可用来提高谷类植物中的谷粒产量。
Description
技术领域
本发明涉及遗传学和分子生物学领域。更具体而言，本发明组合物和方法涉及在植物中调节转录和改进产量。
发明背景
通过常规育种改进谷粒产量，在玉蜀黍(maize)方面几乎是达到停滞不前的状态了。因此自然要探索一些能用来获得进一步的产量提升的替代性非常规方法。由于在过去一百年左右对谷粒产量的选择过程中，玉蜀黍的收获指数基本上保持不变，因此产量的改进是从提高每单位土地面积的总生物量产出来实现的(Sinclair等人，(1998)CropScience 38：638-643；Duvick等人，(1999)Crop Science 39：1622-1630和Tollenaar等人，(1999)Crop Science 39：1597-1604)。该提高的总生物量是通过增加种植密度实现的，这导致了适应性表型改变，如叶角和穗大小的降低，而叶角能减少下方叶子受遮蔽程度，穗大小或许能提高收获指数(Duvick等人，(1999)Crop Science 39：1622-1630)。
玉蜀黍转录辅激活物p15(PC4)与水稻、大豆和拟南芥(Arabidopsis)的转录辅激活物p15同源。已证实PC4涉及在TFIIA-TFIID-启动子复合物的形成过程中引发转录激活。
我们的数据显示，组成型表达的PC4基因能赋予对玉蜀黍的产量性状的强烈积极效果。
本领域需要能采用这种序列以调节植物组织生长和改进植物中的产量的方法和组合物。
发明内容
本发明提供用于调节花器官发育、叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育、发根和用于提高植物中的产量的组合物和方法。所述组合物包含PC4序列。本发明的组合物包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列和核苷酸序列以及它们的变体和片段。
编码PC4的核苷酸序列在DNA构建体中提供以便在目标植物中表达。还提供了包含本发明的序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施方案中，该多核苷酸可操作性连接到组成型启动子。
提供了用于调节植物或植物部分中的PC4序列的水平的方法。所述方法包括将包含PC4序列的异源多核苷酸引入到植物或植物部分中。PC4多肽的水平可被提高或降低。这种方法可用来提高植物中的产量；在一个实施方案中，该方法用来提高谷类中的谷粒产量。
附图说明
图1提供几种PC4序列的比对，这些序列来自玉米(Zea mays)(SEQ ID NO：2)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(SEQ ID NO：4)、水稻(Oryza sativa)(SEQ ID NO：12)、大豆(Glycine max)(SEQ ID NO：6和8)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(SEQ ID NO：10)、毛果杨(Populustrichocarpa)(SEQ ID NO：14)和高粱(Sorghum bicolor)(SEQ ID NOS：16)。PC4共有区域以高亮标出。黄颜色代表各蛋白质之间具有100％同一性的氨基酸，蓝颜色代表具有75％同一性的氨基酸，而绿颜色代表具有50％同一性的氨基酸。对共有序列(SEQ ID NO：17)进行了标识，而保守PC4区域(SEQ ID NO：18)以下划线标出。
具体实施方式
下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施方案，而非全部实施方案。确实，这些发明方案可以以许多不同的形式来体现，不应被认为局限于本文给出的实施方案；提供这些实施方案是为了使本公开内容能满足适用的法律要求。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施方案。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并旨在将修改形式和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。
I.概论
本发明提供了方法和组合物，用来促进花器官发育、发根和产量，并用来调节植物中的叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育等。本发明的组合物和方法通过调节植物中至少一种PC4多肽或者具有本发明PC4多肽的生物活性变体或片段的多肽的水平，来导致植物或作物产量的提高。
II.组合物
本发明的组合物包含参与调节转录的PC4多核苷酸和多肽以及它们的变体和片段。
还包含在不同植物物种中在PC4中高度保守的特定多核苷酸和多肽以及它们的变体和片段(SEQ ID NO：18)。该保守区具有21个氨基酸。
表1
| 序列名称 | 序列标识号 |
| PC4玉米多核苷酸 | SEQ ID NO：1 |
| PC4玉米多肽 | SEQ ID NO：2 |
| 拟南芥多核苷酸 | SEQ ID NO：3 |
| 拟南芥多肽 | SEQ ID NO：4 |
| 大豆多核苷酸 | SEQ ID NO：5 |
| 大豆多肽 | SEQ ID NO：6 |
| 大豆多核苷酸 | SEQ ID NO：7 |
| 大豆多肽 | SEQ ID NO：8 |
| 苜蓿(Medicago)多核苷酸 | SEQ ID NO：9 |
| 苜蓿多肽 | SEQ ID NO：10 |
| 水稻多核苷酸 | SEQ ID NO：11 |
| 水稻多肽 | SEQ ID NO：12 |
| 杨(Populus)多核苷酸 | SEQ ID NO：13 |
| 杨多肽 | SEQ ID NO：14 |
| 高粱多核苷酸 | SEQ ID NO：15 |
| 高粱多肽 | SEQ ID NO：16 |
| 共有序列多肽 | SEQ ID NO：17 |
| 保守区多肽 | SEQ ID NO：18 |
所谓“对应于”意指对每个结构域所述及的氨基酸位置与所述及的序列标识号的氨基酸位置相关联，且包含这些结构域的多肽可通过用标准的比对方法将多肽与所述及的序列标识号进行比对来找到。
本发明的PC4序列已被鉴定为推定的耐盐蛋白的同源物。PC4在植物发育的整个过程中在营养组织中表达。
本文所用的“PC4”或“玉蜀黍转录辅激活物p15”序列包含编码PC4多肽或者具有PC4的生物活性变体或片段的多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的分离的PC4多肽以及它们的片段和变体。还提供了包含SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的多核苷酸和包含编码PC4保守区的多核苷酸的序列。
本发明涵盖分离的或实质上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分，实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或蛋白质的天然环境中存在的、与该多核苷酸或蛋白质相伴随或相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当通过重组技术生产时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最优的是，“分离的”多核苷酸不含在得到该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳的是蛋白质编码序列)。例如，在各个实施方案中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在得到该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。实质上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染性蛋白质的蛋白质的制品。当本发明的蛋白质或其生物活性部分用重组法生产时，最佳的是，培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白的化学品。
PC4保守区或PC4多核苷酸的片段和变体以及由此编码的蛋白质，也被本发明的方法和组合物所涵盖。所谓“片段”意指多核苷酸的部分或者氨基酸序列的部分。多核苷酸的片段可编码保留该天然蛋白的生物活性从而能调节转录的蛋白质片段。例如，多肽片段将包含PC4保守区。或者，用来抑制或沉默PC4序列(即降低其表达水平)的片段不需要编码蛋白质片段，但要保留抑制目标序列的表达的能力。另外，可用作杂交探针的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可在至少约18个核苷酸、约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码本发明蛋白质的全长多核苷酸的范围。
多核苷酸的编码PC4保守区或PC4多肽的片段，将编码至少15、25、30、50、100个连续氨基酸或者直至全长PC4保守区或PC4蛋白(即SEQ ID NO：2)中存在的氨基酸的总数。PC4保守区或PC4多核苷酸的可用作杂交探针、PCR引物或用作抑制构建体的片段，通常不需要编码PC4蛋白或PC4保守区的生物活性部分。
多肽的包含PC4保守区或PC4蛋白的生物活性部分，可通过分离PC4多核苷酸的部分、表达PC4蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)并评估PC4蛋白的编码部分的活性来制备。作为PC4核苷酸序列或包含PC4保守区的多核苷酸序列的片段的那些多核苷酸，包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350个连续核苷酸或者直至PC4保守区编码多核苷酸中或PC4多核苷酸中存在的核苷酸的数目(即SEQ ID NO：1，642个核苷酸)。
“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸当中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括因为遗传密码的简并性而编码PC4多肽之一或PC4保守区的氨基酸序列的那些序列。天然等位基因变体(如这些)可用公知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成法得到的多核苷酸，如例如通过使用定点诱变产生、但仍编码包含能够调节转录或者能够降低PC4多核苷酸表达水平(即抑制或沉默PC4多核苷酸)的PC4保守区或PC4多肽的多肽的那些多核苷酸。通常，通过本文别处所述的序列比对程序和参数测定，本发明的特定多核苷酸的变体将具有与该特定多核苷酸至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
本发明的特定多核苷酸(即参比多核苷酸)的变体，还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该参比多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评估。因此，例如，公开了编码具有与SEQID NO.1或SEQ ID NO：2的多肽的给定序列同一性百分数的多肽的分离多核苷酸。任何两个多肽之间的序列同一性百分数，可用本文别处描述的序列比对程序和参数来计算。在任何给定的本发明多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽所共享序列同一性百分数进行评估的情况中，两个被编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
“变体”蛋白旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从该天然蛋白质衍生的蛋白质。本发明所涵盖的变体蛋白质是生物活性的，也就是说它们继续拥有该天然蛋白质的所需生物活性，即如本文所述调节转录。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所测定，本发明的PC4蛋白或PC4保守区的生物活性变体将具有与该PC4蛋白或该PC4保守区的氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本发明的PC4蛋白的生物活性变体或PC4保守区的生物活性变体与该蛋白可相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个(如6-10个)、少至5个、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
本发明的多核苷酸可通过多种方式进行变更，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，PC4蛋白或PC4保守区的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；第4,873,192号美国专利；Walker和Gaastra(编辑)(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中所引用的参考文献。有关不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可在Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found，Washington，D.C.)的模型中找到，将该文献通过引用并入本文。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是优选的。
因此，本发明的基因和多核苷酸既包括天然序列也包括突变形式。同样，本发明的蛋白质既涵盖天然蛋白质也涵盖其变种和修饰形式。这种变体将继续拥有所需的活性(即调节转录或降低目标PC4序列的表达水平的能力)。在具体的实施方案中，将在编码该变体的DNA中作出的突变不会使序列位于阅读框之外，且不会产生可能会导致二级mRNA结构的互补区域。参见第75,444号欧洲专利申请公开。
预期本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和置换不会造成该蛋白质特性的根本变化。但是，当在进行缺失、插入和置换之前难以预测缺失、插入和置换的准确效应时，本领域技术人员应认识到该效应将通过常规的筛选测定进行评估。例如，PC4多肽的活性可通过测定该多肽调节转录的能力来进行评估。有多种方法可用来测定此活性，包括在核苷酸或多肽水平上直接监测目标基因的表达水平。用于这种分析的方法是已知的，包括例如RNA印迹、S1保护测定、蛋白质印迹、酶测定或比色测定。或者，测定转录活性的调节的方法可包括监测植物的表型的改变。例如，如在本文别处更详细地讨论，调节PC4多肽的水平可导致花形成、发根和产量改变方面的调节。测定这些变化的方法在本文别处更详细地讨论。
变体多核苷酸和蛋白质还涵盖由诱变和重组工程程序(如DNA改组)得到的序列和蛋白质。用这种程序，可操纵一个或多个不同的PC4编码序列以产生拥有所需性质的新的PC4序列或PC4保守区。按这种方式，从包含具有实质序列同一性的序列区域的相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸的文库，并可将文库在体外或体内进行同源重组。例如，使用该方法，可将编码目的结构域的序列基序在本发明的PC4基因和其他已知的PC4基因之间进行改组，以获得编码具有改进的目标性质(如在酶的情况中为提高的Km)的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer，(1994)Nature370：389-391；Crameri等人，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人，(1998)Nature 391：288-291以及第5,605,793号和第5,837,458号美国专利。
本发明的多核苷酸可用来从其他生物，特别是其他植物，更具体而言其他单子叶植物分离相应的序列。按此方式，可使用诸如PCR、杂交等之类的方法，对这类序列基于其与本文给出的序列的序列同一性来进行鉴定。基于其与本文给出的本发明的完整PC4序列或PC4保守区或者与它们的变体和片段的序列同一性而分离的序列，被本发明所涵盖。这类序列包括作为所公开的序列的直系同源物的序列。“直系同源物”旨在意指衍自共同的祖先基因并由于物种形成而存在于不同物种中的基因。存在于不同物种中的基因，当它们的核苷酸序列和/或它们的编码蛋白质序列共享至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性时，被认为是直系同源物。直系同源物的功能在各种物种中常常是高度保守的。因此，可沉默或抑制编码PC4蛋白的PC4序列或多核苷酸的表达且在严格条件下与本文所公开的PC4序列或者与其变体或片段杂交的分离的多核苷酸，被本发明所涵盖。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应来从提取自任何所关注的植物的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物或PCR克隆的方法是本领域公知的，在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中有公开。另参见Innis等人(编辑)(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand(编辑)(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)以及Innis和Gelfand(编辑)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，将已知的多核苷酸的全部或部分用作探针，该探针选择性地杂交至来自选定生物体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即基因组文库或cDNA文库)中存在的其他相应多核苷酸。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，且可用可检测基团(如32P)或任何其他可检测标志物进行标记。因此，例如，杂交用探针可通过基于本发明的PC4多核苷酸对合成的寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交探针和构造cDNA文库和基因组文库的方法是本领域已知的，在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)中有公开。
例如，本文公开的完整PC4多核苷酸或编码PC4保守区的多核苷酸，或者它们的一个或多个部分，可用作能够与相应的PC4多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括在各个PC4多核苷酸序列当中独特的序列，且优选长为至少约10个核苷酸，最优选长为至少约20个核苷酸。这类探针可用来通过PCR从选定的植物扩增相应的PC4多核苷酸。该技术可用于从所需植物分离出另外的编码序列或用作诊断测定法以确定编码序列在植物中的存在。杂交技术包括涂布的DNA文库(噬菌斑或菌落)的杂交筛选；参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
这类序列的杂交可在严格条件下进行。所谓“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度将可检测地大于与其他序列杂交的程度(例如比背景大至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中严格条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃下杂交，并在0.5X-1X SSC中于55-60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃下杂交，并在0.1X SSC中于60-65℃下洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，往往约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可从Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem 138：267-284的方程来估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中的鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中的甲酰胺的百分数，L为杂交物的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％错配，Tm减少约1℃，因而，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13或14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需程度的错配导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选的是增加SSC浓度以便可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)和Ausubel等人(编辑)(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，New York)。
以下术语用来描述两个或更多个核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分比”。
(a)本文所用的“参比序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参比序列可为指定的序列的子集或全部；例如作为全长cDNA或基因序列的区段或者该完全cDNA或基因序列。
(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参比序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参比序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，对任何两个序列之间的序列同一性百分数的确定，可使用数学算法来完成。这类数学算法的非限制性例子有Myers和Miller，(1988)CABIOS4：11-17的算法；Smith等人，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的搜索局部(search-for-local)比对方法；Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，其在Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中作了修正。
可利用这些数学算法的计算机执行进行序列的比较，从而确定序列同一性。这类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可获自Intelligenetics，美国加州Mountain View)中的CLUSTAL；GCGWisconsin Genetics Software Package
版本10(可获自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，美国加州圣迭哥)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可用默认参数来进行。CLUSTAL程序在以下文献中得到很好的描述：Higgins等人，(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人，(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人，(1992)CABIOS 8：155-65和Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller，(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul，(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝100、wordlength(字长)＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述利用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)来进行迭代搜索，该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul等人，(1997)(出处同上)。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。
除非另有规定，否则本文提供的序列同一性/相似性数值是指使用GAP版本10用以下参数获得的数值：使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数；使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62打分矩阵或其任何等同程序，获得氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software Package
的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0-200的整数来表示。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出最好的比对的群体中的一个成员。这个群体可能存在许多成员，但其他成员没有更好的质量。GAP显示关于比对的四个品质因素：品质(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。质量是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。GCG Wisconsin Genetics Software Package
的版本10中使用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
(c)在两个多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所执行那样进行计算。
(d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参比序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
B.植物
在具体的实施方案中，本发明提供具有改变了的水平(即提高或降低)的PC4序列的植物、植物细胞和植物部分。在一些实施方案中，所述植物和植物部分在其基因组中稳定掺入了至少一种编码包含SEQ ID NO：3所示PC4保守区的PC4多肽的异源多核苷酸或其生物活性变体或片段。在一个实施方案中，编码PC4多肽的多核苷酸为SEQ ID NO：1所示或其生物活性变体或片段。
在另外其他的实施方案中，提供这样的植物和植物部分，其中稳定掺入到该植物或植物部分的基因组中的异源多核苷酸包含这样的多核苷酸，该多核苷酸当在植物中表达时能提高包含PC4保守区的PC4多肽或其活性变体或片段的水平。可用来提高PC4多肽的表达的序列包括但不限于SEQ ID NO：1所示的序列或其变体或片段。
如本文别处更详细讨论的，这种植物、植物细胞、植物部分和种子可具有改变了的表型，包括例如改变了的花器官发育、叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育、发根和提高了的产量。
本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒旨在表示商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些部分包含本文所公开的引入的或异源的多核苷酸。
本发明可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。所关注的植物物种的实例包括但不限于玉米(Zeamays)；芸苔属物种(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))；向日葵(Helianthus annuus)；红花(Carthamustinctorius)；小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))；甘薯(Ipomoea batatus)；木薯(Manihot esculenta)；咖啡(Coffea spp.)；椰子(Cocos nucifera)；菠萝(Ananas comosus)；柑橘(Citrus spp.)；可可(Theobroma cacao)；茶(Camellia sinensis)；香蕉(Musa spp.)；鳄梨(Persea americana)；无花果(Ficus casica)；番石榴(Psidium guajava)；芒果(Mangifera indica)；橄榄(Olea europaea)；木瓜(Carica papaya)；腰果(Anacardium occidentale)；澳洲坚果(Macadamia integrifolia)；杏树(Prunus amygdalus)；糖用甜菜(Beta vulgaris)；甘蔗(Saccharum spp.)；燕麦；大麦；蔬菜；观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树包括例如：松树如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、美国黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesii)；加拿大铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉如银枞(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；和雪松如西岸红雪松(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草等等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是优选的，在另外其他实施方案中，玉米植物是优选的。
所关注的其他植物包括提供所关注的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等等。油料植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等等。豆科植物包括荚果类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
“受试植物或植物细胞”是其中出现了变更(如多肽的转化或引入)的植物或植物细胞，或者是遗传自经如此变更的植物或细胞而包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。
对照植物或植物细胞可包含例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于进行变更得到受试植物或细胞的原始材料有相同的基因型；(b)与原始材料有相同的基因型、但已转化了无效(null)构建体(即转化了对目的性状已知没有作用的构建体，如包含标志物基因的构建体)的植物或植物细胞；(c)属受试植物或植物细胞的后代中非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同、但不被暴露于会诱导目的基因的表达的条件或刺激的植物或植物细胞或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
C.多核苷酸构建体
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
应用于本发明方法和组合物中的各种多核苷酸可在表达盒中提供以便在目的植物中表达。表达盒将包括可操作性连接到本发明的多核苷酸的5′和3′调控序列。“可操作性连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能连接。例如，所关注的多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的可操作性连接是可使该所关注多核苷酸得以表达的功能连接。可操作性连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓可操作性连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。作为另外一种选择，可在多个表达盒上提供额外的基因。这种表达盒设有多个限制性位点和/或重组位点，以使PC4多核苷酸的插入处于调控区域的转录调节之下。表达盒可另外含有选择性标志物基因。
表达盒在5′-3′转录方向上可包括在植物中起作用的转录和翻译起始区(即启动子)、PC4多核苷酸及转录和翻译终止区(即终止区)。调控区域(即启动子、转录调控区域和翻译终止区)和/或PC4多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是天然的/同功的。或者，所述调控区域和/或PC4多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是异源的。本文所用的针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，可操作性连接到异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者实质上从它们的原始形式和/或基因座修饰而得，或者该启动子不是该被可操作性连接的多核苷酸的天然启动子。本文所用的嵌合基因包含编码序列和与其可操作性连接的转录起始区，该转录起始区与该编码序列异源。
虽然可优选使用异源启动子来表达序列，但可以使用天然的启动子序列。这种构建体能改变PC4转录物或蛋白质在植物或植物细胞中的表达水平。因此，植物或植物细胞的表型可得到改变。
终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于可操作性连接的所关注的PC4多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自对于该启动子、该所关注PC4多核苷酸、该植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903和Joshi等人，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。
如适当的话，可对多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11。本领域有用来合成植物偏好的基因的方法。参见例如第5,380,831号和第5,436,391号美国专利以及Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(通过引用并入本文)。
已知有另外的序列修饰可增强在细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括消除编码假的聚腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子重复序列和其他此类得到很好表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，对序列进行修饰以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可另外含有5′前导序列。这种前导序列可起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Gallie等人，(1995)Gene165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology154：9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人，(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)Molecular Biologyof RNA，编辑Cech(Liss，New York)，第237-256页)和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，(1991)Virology 81：382-385)。另参见Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.84：965-968。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和易位)。
有许多启动子可用于实施本发明，包括所关注的多核苷酸序列的天然启动子。启动子可基于所需的结果来选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏好的启动子或其他启动子组合以便在植物中表达。
这种组成型启动子包括例如WO 99/43838和第6,072,050号美国专利中所公开的Rsyn7启动子的核心启动子及其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(第5,659,026号美国专利)，GOS2启动子(dePater等人，(1992)Plant J.2：837-44)等。其他组成型启动子包括例如第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,121号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；第5,608,142号和第6,177,611号美国专利。
表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因被利用于转化细胞或组织的选择。选择性标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标志物包括表型标志物，如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su等人，(2004)Biotechnol Bioeng85：610-9和Fetter等人，(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人，(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人，(2002)Plant Physiol 129：913-42)和黄色荧光蛋白(Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte等人，(2004)J.Cell Science 117：943-54)。对于另外的选择性标志物，主要参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人，(1980)The Operon，第177-220页；Hu等人，(1987)Cell 48：555-566；Brown等人，(1987)Cell 49：603-612；Figge等人，(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-483；Gossen，(1993)博士论文，海德尔堡大学；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin，(1993)博士论文，海德尔堡大学；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人，(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature 334：721-724。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标志物基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标志物基因均可用于本发明。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸可与所关注的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠，以产生具有所需性状的植物。本文所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。生成的组合也可包括所关注多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明的多核苷酸还可与病害或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(例如伏马毒素解毒基因(第5,792,931号美国专利)；无毒性和病害抗性基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，如膦丝菌素或basta(例如bar基因)和草甘磷抗性(EPSPS基因))，以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油脂(例如第6,232,529号美国专利)；经修饰的油脂(例如脂肪酸去饱和酶基因(第5,952,544号美国专利；WO 94/11516))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如第5.602,321号美国专利；促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达的β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与提供农艺性状或转化技术性状的多核苷酸进行组合，所述农艺性状如雄性不育(例如参见第5,583,210号美国专利)、茎秆强度、开花时间，所述转化技术性状如细胞周期调控或基因靶向(例如WO 99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821)，这些专利的公开内容以引用方式并入本文。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果序列通过遗传转化植物来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动序列表达。在某些情况中，可能期望引入将会抑制所关注多核苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或超表达盒的任何组合组合使用以在植物中生成期望特性组合。进一步认识到可使用位点特异性重组体系在期望基因组位点堆叠多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，它们都以引用方式并入本文。
D.引入方法
本发明的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物中。“引入”旨在意指以使得序列能够进入植物细胞的内部的方式将多核苷酸或多肽给予植物。本发明的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。
“稳定转化”旨在意指被引入到植物中的核苷酸构建体整合到了植物的基因组中，并能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入到植物中但没有整合到植物的基因组中，或者多肽被引入到植物中。
转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入到植物细胞中的合适方法包括微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(第5,563,055号美国专利和第5,981,840号美国专利)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道粒子加速(ballistic particle acceleration)(参见例如第4,945,050号美国专利；第5,879,918号美国专利；第5,886,244号美国专利和第5,932,782号美国专利；Tomes等人，(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips(编辑)(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)和Lec1转化(WO 00/28058)。另参见Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology6：559-563(玉蜀黍)；第5,240,855号；第5,322,783号和第5,324,646号美国专利；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature(伦敦)311：763-764；第5,736,369号美国专利(谷类植物)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科)；De Wet等人，(1985)The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，编辑Chapman等人，(Longman，NewYork)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports9：415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉蜀黍通过根瘤农杆菌)，所有这些文献都以引用方式并入本文。
在具体的实施方案中，PC4序列或其变体和片段可用多种瞬时转化方法来提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于将PC4蛋白或其变体和片段直接引入到植物中，或者将PC4转录物引入到植物中。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush等人，(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784，所有这些文献都以引用方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将PC4多核苷酸瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，从粒子结合的DNA可发生转录，但它释放出来而整合到基因组中的频率则大大降低。这类方法包括使用包被有聚乙基亚胺(polyethylimine)的粒子(PEI；Sigma#P3143)。
在其他实施方案中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入在病毒DNA或RNA分子内。应认识到，PC4序列或其变体或片段可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白质。此外，应认识到，本发明的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行的转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的将多核苷酸引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法，是本领域已知的。参见例如第5,889,191号、第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号、第5,316,931号美国专利和Porta等人，(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221，它们以引用方式并入本文。
用于将多核苷酸定向插入在植物基因组中的特定位置的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，将多核苷酸插入所需的基因组位置是用位点特异性重组系统来实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利都以引用方式并入本文。简单而言，可将本发明的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒两侧带有两个非重组工程的(non-recombinogenic)重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点两侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的非重组工程的重组位点。提供适当的重组酶，将该转移盒整合在该靶标位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。
可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些可栽培这些植株，并用同一转化株或不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得子代。可培养两代或更多代以确保所需表型特性的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实现。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。
III.使用方法
A.调节植物或植物部分中至少一种PC4序列或其变体或片段的
表达的方法
在本发明方法的语境中，“经调节的多肽水平”或“调节多肽的水平”是指基因产物的表达、浓度或活性的任何提高或降低，包括表达、浓度或活性的任何相对增加。任何在转录或翻译水平上调节靶标基因产物的表达方法或组合物，或者任何调节靶标基因产物的活性的方法或组合物，都可用来实现靶标基因产物的经调节的表达、浓度、活性。一般而言，相对于适当的对照植物、植物部分或细胞，该水平提高或降低达至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。本发明的调节可在植物生长过程中发生，和/或可在植物生长至所需的发育阶段后发生。在具体的实施方案中，本发明的多肽在单子叶植物特别是谷物植物(如水稻、小麦、玉蜀黍等)中得到调节。
具有PC4保守区的多肽或其生物活性变体或片段的表达水平可直接测量，例如通过测定PC4多肽在植物中的水平来直接测量，或者可间接测量，例如通过测量编码该蛋白质的多核苷酸的水平或者通过测量该PC4多肽在植物中的活性来间接测量。测定PC4多肽的活性的方法在本文别处描述。
在具体的实施方案中，将本发明的多肽或多核苷酸引入到植物细胞中。随后，用本领域技术人员已知的方法选出具有引入的本发明序列的植物细胞，所述方法如但不限于DNA印迹分析、DNA序列测定、PCR分析或表型分析。将经前述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下培育一段时间，该时间足以调节本发明多肽在该植物中的浓度和/或活性。形成植物的条件是本领域公知的，在本文别处有简要介绍。
还应认识到，可通过采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸，来调节所述多肽的水平和/或活性。例如，本发明的多核苷酸可用来设计可在用于改变或突变生物体中的基因组核苷酸序列的方法中应用的多核苷酸构建体。这类多核苷酸构建体包括但不限于RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链体寡核苷酸、自身互补RNA:DNA寡核苷酸和重组工程寡核苷酸。这类核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见第5,565,350号美国专利；第5,731,181号美国专利；第5,756,325号美国专利；第5,760,012号美国专利；第5,795,972号美国专利和第5,871,984号美国专利，所有这些专利都以引用方式并入本文。另参见WO98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778，它们以引用方式并入本文。
因此应认识到，本发明的方法并不依赖于将完整多核苷酸掺入到基因组中，只要将多核苷酸引入到细胞中而使植物或其细胞被改变即可。在本发明的一个实施方案中，基因组可在将多核苷酸引入到细胞中之后被改变。例如，可将多核苷酸或其任何部分掺入到植物的基因组中。本发明的基因组的变更包括但不限于基因组中核苷酸的添加、缺失和置换。虽然本发明的方法并不依赖于任何具体数目的核苷酸的添加、缺失和置换，但应认识到这种添加、缺失或置换包含至少一个核苷酸。
在一个实施方案中，PC4多肽的活性和/或水平被提高。可通过将PC4多肽或其生物活性变体或片段提供给植物，来实现PC4多肽的水平和/或活性的提高。如本文别处所讨论，有许多用来将多肽提供给植物的方法是本领域已知的，包括但不限于将PC4多肽直接引入到植物中，或者将编码具有PC4活性的多肽的多核苷酸构建体引入到植物中(瞬时引入或稳定引入)。还应认识到，本发明的方法可采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因此，可通过变更编码PC4多肽的基因或其启动子来提高PC4多肽的水平和/或活性。参见例如Kmiec，第5,565,350号美国专利；Zarling等人，PCT/US93/03868。因此，提供了携带PC4基因的突变的诱变植物，其中所述突变能提高PC4基因的表达或者提高编码的PC4多肽的活性。
在其他实施方案中，通过将能抑制多肽的水平或活性的多核苷酸引入到植物中，来降低或消除本发明的PC4多肽的活性和/或水平。该多核苷酸可通过防止PC4信使RNA的翻译来直接抑制PC4基因的表达，或者通过编码能抑制编码PC4蛋白的PC4基因的转录或翻译的多肽来间接抑制PC4基因的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于本发明以抑制至少一种PC4序列在植物中的表达。在本发明的其他实施方案中，通过用编码能抑制PC4多肽的活性的多肽的序列转化植物细胞，来降低或消除PC4多肽的活性。在其他实施方案中，可通过破坏编码PC4多肽的基因来降低或消除PC4多肽的活性。本发明涵盖携带有PC4基因的突变的诱变植物，其中所述突变能降低PC4基因的表达或者抑制所编码的PC4多肽的PC4活性。
对于植物中遗传工程的几个方面而言，降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)是合乎需要的。许多用于基因沉默的技术是本领域技术人员公知的，包括但不限于反义技术(参见例如Sheehy等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8805-8809和第5,107,065号；第5,453,566号和第5,759,829号美国专利)；共抑制(例如Taylor，(1997)Plant Cell 9：1245；Jorgensen，(1990)Trends Biotech.8(12)：340-344；Flavell，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Finnegan等人，(1994)Bio/Technology 12：883-888和Neuhuber等人，(1994)Mol.Gen.Genet.244：230-241)；RNA干扰(Napoli等人，(1990)Plant Cell 2：279-289；第5,034,323号美国专利；Sharp，(1999)Genes Dev.13：139-141；Zamore等人，(2000)Cell 101：25-33和Montgomery等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15502-15507)；病毒诱导的基因沉默(Burton等人，(2000)Plant Cell 12：691-705和Baulcombe，(1999)Curr.Op.Plant Bio.2：109-113)；靶标RNA特异性核酶(Haseloff等人，(1988)Nature 334：585-591)；发夹结构(Smith等人，(2000)Nature407：319-320；WO 99/53050；WO 02/00904；WO 98/53083；Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人BMCBiotechnology 3：7；第2003/0175965号美国专利申请公开；Panstruga等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140；Wesley等人，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；第2003/0180945号美国专利申请公开和WO 02/00904，所有这些文献和专利都以引用方式并入本文)；核酶(Steinecke等人，(1992)EMBO J.11：1525和Perriman等人，(1993)Antisense Res.Dev.3：253)；寡核苷酸介导的定向修饰(例如WO 03/076574和WO99/25853)；锌指靶向分子(例如WO 01/52620；WO 03/048345和WO 00/42219)；转座子标签法(Maes等人，(1999)Thends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等人，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等人，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等人，(1999)Genetics153：1919-1928；Bensen等人，(1995)Plant Cell 7：75-84；Mena等人，(1996)Science 274：1537-1540以及第5,962,764号美国专利)(这些文献和专利的每一个都以引用方式并入本文)，以及本领域技术人员知道的其他方法或者上述方法的组合。
应认识到，用本发明的多核苷酸，可构建出与PC4序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义构建体。构建反义核苷酸以与相应的mRNA杂交。可对反义序列作出修饰，只要序列能杂交相应的mRNA并干扰其表达。以此方式，可使用与相应的被反义处理的(antisensed)序列具有70％、优选80％、更优选85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。
本发明的多核苷酸还以以有义取向使用以抑制植物中内源基因的表达。用多核苷酸以有义取向抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。所述方法通常涉及用包含这样的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子可操作性连接到对应于该内源基因的转录物的多核苷酸的至少一部分，能驱动植物中的表达。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有相当大的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见第5,283,184号和第5,034,323号美国专利，将它们以引用的方式并入本文。
因此，有许多方法可用来降低或消除PC4多肽或其生物活性变体或片段的活性。另外，可采用各种方法的组合来降低或消除至少一种PC4多肽的活性。还应认识到，可调节单种PC4序列的水平以产生所需的表型。或者，可能需要调节(提高和/或降低)多种具有PC4保守区的序列或其生物活性变体或片段的表达水平。
如上所讨论，有多种启动子可用来调节PC4序列的水平。在一个实施方案中，可通过组织偏好的启动子，特别是叶子偏好的启动子(即叶肉偏好的启动子或维管束鞘偏好的启动子)和/或种子偏好的启动子(即胚乳偏好的启动子或胚偏好的启动子)，来调控可调节至少一种PC4多肽的水平的异源多核苷酸的表达。
B.调节植物中的花器官发育和产量的方法
本发明提供了调节PC4和PC4多肽从而调节植物中的花器官发育、发根和产量的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物可用来提高谷类植物中的谷粒产量。在这个实施方案中，将PC4编码序列在所关注的谷类植物中表达以提高PC4转录因子的表达。
以此方式，所述方法和组合物可用于提高植物中的产量。本文所用的术语“改进的产量”是指任何所测量的植物产物的产量的任何改进。产量的改进可包含所测量的植物产物的0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的提高。或者，提高的植物产量可包含所测量的植物产物的约0.5倍、1倍、2倍、4倍、8倍、16倍或32倍的提高。例如，相比于在相同条件下栽培的未经处理的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量，衍自具有本发明的处理的作物的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量的提高，将被认为是改进的产量。所谓提高的产量还意指种子总数的提高、种子总重量的提高、根生物量的提高和收获指数的提高中的至少一者。收获指数定义为收获时产出生物量与总累积生物量之比。
因此，提供了各种提高植物的产量的方法。在一个实施方案中，提高植物或植物部分的产量包括将异源多核苷酸引入到植物或植物部分中，并在该植物或植物部分中表达该异源多核苷酸。在这个方法中，异源多核苷酸的表达能调节至少一种PC4多肽在该植物或植物部分中的水平，其中该PC4多肽包含具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的PC4保守区(PC4结构域)或者该结构域的变体或片段。
在具体的实施方案中，PC4多肽的水平的调节包括至少一种PC4多肽的水平的提高。在这种方法中，引入到植物中的异源多核苷酸编码具有PC4结构域的多肽或其生物活性变体或片段。在具体的实施方案中，异源多核苷酸包含至少一个SEQ ID NO：1所示的序列和/或其生物活性变体或片段。
在其他实施方案中，调节至少一种PC4多肽的水平包括降低至少一种PC4多肽的水平。在这种方法中，引入到植物中的异源多核苷酸不需要编码功能PC4多肽，而是该多核苷酸的表达导致包含PC4保守区的生物活性变体或片段的PC4多肽的表达降低。在具体的实施方案中，具有降低了的水平的PC4多肽为SEQ ID NO：2或其生物活性变体或片段中的至少一者所示。
以下实施例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实验
实施例1：玉蜀黍PC4基因的克隆
使用BLAST 2.0(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403)针对NCBI DNA序列数据库，通过序列同源性从产生自玉蜀黍cDNA文库的一批EST鉴定了编码玉蜀黍的PC4多肽的cDNA。从EST质粒，通过PCR扩增了SEQ ID NO：1的玉蜀黍PC4 cDNA片段核苷酸#394至#1533，该PCR是在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶和玉蜀黍PC4特异性引物进行，所述引物包括AttB位点以便进行GATEWAY
重组克隆。用如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)所述的标准方法，扩增和纯化了预期长度的PCR片段。然后进行GATEWAY
程序的第一步即BP反应，在此过程中PCR片段在体内与pDONR201质粒重组以产生“进入克隆(entryclone)”。质粒pDONR201购自Invitrogen，作为GATEWAY技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)的一部分。
实施例2：PC4序列在玉蜀黍中的过表达
将来自温室供体植物的未成熟玉蜀黍胚用含有在UBI启动子控制下的PC4序列和选择性标志物基因PAT(Wohlleben等人，(1988)Gene70：25-37)的质粒(如Zm-PC4/SEQ ID NO：1)进行转化，该选择性标志物基因能赋予对除草剂双丙氨膦的抗性。或者，该选择性标志物基因在单独的质粒上提供。如下进行转化。培养基配方见下文。
靶标组织的制备
将穗去壳并在30％Clorox
漂白剂加0.5％Micro去污剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水清洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。
制备出包含可操作性连接到泛素启动子的PC4序列的质粒载体。用如下的CaCl2沉淀程序，将此质粒DNA加上含有PAT选择性标志物的质粒DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨小球上：100μl制备的钨粒子于水中；10μl(1μg)DNA于Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)中；100μl 2.5M CaCl2和10μl 0.1M亚精胺。
将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在复式管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml 100％乙醇洗涤，离心30秒。再次除去液体，将105μl 100％乙醇加到最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
将样品板在粒子枪中以水平#4进行轰击(第5,240,855号美国专利)。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行分培。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的inserts in flats(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1星期，随后在温室中再生长1-2个星期，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。监测植株，对氮利用效率的提高、产量的提高或胁迫耐受性的提高进行评分。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l Gelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l Gelrite
(在用去离子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调至pH 5.6后用精炼去离子水定容)；3.0g/l Gelrite
(在用去离子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素原液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH 5.6后用精炼去离子水定容)和6g/l bactoTM琼脂(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
实施例3：农杆菌介导的转化
对于用PC4多核苷酸对玉蜀黍进行农杆菌介导的转化，采用Zhao的方法(第5,981,840号美国专利和PCT专利公布WO 98/32326，它们的内容以引用方式并入本文)。简单而言，从玉蜀黍分离出未成熟胚并使胚接触农杆菌的悬浮液，其中该细菌能够将PC4多核苷酸转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中以引发接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化子的选择剂(步骤3：静息步骤)。将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，这为了消除农杆菌并为了受感染细胞的静息期。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植物。
实施例4：大豆胚转化
培养条件
将大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)在150rpm、26℃旋转摇荡器上维持在35ml液体培养基SB196(参见下文配方)中，该旋转摇荡器具有冷白色荧光灯，光周期为16∶8小时白天/黑夜，光强度为60-85μE/m2/s。每7天至两个星期，通过将大约35mg的组织接种到35ml的新鲜液体SB196中，对培养物进行分培(优选的分培间隔为每7天)。
通过粒子枪轰击方法(Klein等人，(1987)Nature，327：70)，用以下实施例中所述的质粒和DNA片段转化大豆胚发生悬浮培养物。
大豆胚发生悬浮培养物的引发
每月两次对大豆培养物进行引发，每次引发之间间隔5-7天。
在种植45-55天后从可用的大豆植株挑取带有不成熟种子的豆荚，剥壳并放入无菌绛红色盒子中。将大豆种子在含有1滴象牙皂的5％Clorox
溶液(95ml的高压灭菌蒸馏水加5ml Clorox和1滴皂)中振摇15分钟，对它们进行灭菌。充分混合。用2个1升瓶子的无菌蒸馏水清洗种子，将小于4mM的种子各自放在单独的显微镜载玻片上。切开种子的小的一端，将子叶挤出种皮。将子叶转移到含有SB1培养基的板(每板25-30个子叶)。将各板用纤维带包住，存放8个星期。这个时间后，切取次生胚并放入SB196液体培养基中7天。
用于轰击的DNA的制备
将含有所关注基因和选择性标志物基因的完整质粒或DNA质粒片段用于轰击。用于轰击的质粒DNA用PromegaTM Protocols andApplications Guide(第二版第106页)中所述的方法按常规进行制备和纯化。通过凝胶分离经双酶切的质粒，获得携带PC4多核苷酸的质粒的片段。在每种情况中，将100μg的质粒DNA在0.5ml的适于所关注的质粒的特异性酶混合物中进行消化。通过在1％SeaPlaque GTG琼脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)上进行凝胶电泳分离所得的DNA片段，并将含有PC4多核苷酸的DNA片段从琼脂糖凝胶上切下来。用GELase消化酶按生产商的方案从琼脂糖纯化DNA。
将含有3mg金粒子(3mg金)的50μl无菌蒸馏水等分试样加到5μl1μg/μl DNA溶液(如上所述制备的完整质粒或DNA片段)、50μl 2.5MCaCl2和20μl 0.1M亚精胺。将混合物在涡旋摇荡器的水平3上振摇3分钟，然后在台式微量离心机中离心10秒钟。用400μl 100％乙醇洗涤后，通过在40μl 100％乙醇中进行超声处理使沉淀悬浮。向BiolisticPDS1000/HE仪碟的每个飞碟(flying disk)分配5μl的DNA悬浮液。每个5μl等分试样含有大约0.375mg金/次轰击(即每碟)。
组织制备和用DNA轰击
将大约150-200mg的7天龄胚悬浮培养物放在空的无菌60×15mM平皿中，用塑料网盖住平皿。每板的组织轰击1或2次，膜破裂压力设定为1100PSI，腔室抽真空至27-28英寸汞柱。将组织放在离阻滞网/停止网大约3.5英寸处。
转化胚的选择
用潮霉素(当使用磷酸转移酶HPT基因作为选择性标志物时)或氯磺隆(当使用乙酰乳酸合酶ALS基因作为选择性标志物时)选择转化胚。
潮霉素(HPT)选择
在轰击后，将组织放入新鲜的SB196培养基中，如上所述进行培养。轰击后6天，将该SB196用含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196更换。每周更新选择培养基。在选择后四至六个星期，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿色组织，接种到多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。
氯磺隆(ALS)选择
在轰击后，将组织在2个含有新鲜SB196培养基的烧瓶之间分配，如上所述进行培养。轰击后六至七天，将该SB196用含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196更换。每周更新选择培养基。在选择后四至六个星期，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿色组织，接种到含有SB196的多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。
大豆体细胞胚再生成植株
为了从胚发生悬浮培养物获得整株植物，组织必须进行再生。
胚成熟
将胚在SB196中在冷白色荧光灯泡(Phillips cool white EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro)灯泡(40瓦)下于26℃培养4-6个星期，光周期为16∶8小时，光强度为90-120uE/m2s。这个时间后，将胚簇移取到固体琼脂培养基SB166达1-2个星期。然后将胚簇分培到培养基SB103持续3个星期。在这个期间，可从胚簇移取各个单个胚，并筛选PC4表达和/或活性的水平。
胚干燥和萌发
将各个成熟的胚放入空的小平皿(35×10mM)中大约4-7天，对它们进行干燥。将各板用纤维带密封(产生小的湿度腔室)。将经干燥的胚种植到SB71-4培养基中，让它们在与如上所述相同的培养条件下萌发。从萌发培养基移取萌发的小植株，用水彻底清洗，然后种植在24孔托盘(pack tray)中的Redi-Earth中，用透明塑料罩盖住。2个星期后，将罩移开，使植物强壮一个星期。如果小植株看起来强壮，将它们移植到10英寸Redi-Earth盘，每盘最多3株小植株。10至16个星期后，收获成熟的种子，破成碎片并分析蛋白质。
培养基配方
FN Lite原液
SB1固体培养基(每升)包含：1包MS盐(GIBCO/BRL-目录号为11117-066)；1ml B5维生素1000X原液；31.5g蔗糖；2ml 2，4-D(20mg/L终浓度)；pH 5.7和8g TC琼脂。
SB 166固体培养基(每升)包含：1包MS盐(GIBCO/BRL-目录号为11117-066)；1ml B5维生素1000X原液；60g麦芽糖；750mgMgCl2六水合物；5g活性炭；pH 5.7和2g gelrite
。
SB 103固体培养基(每升)包含：1包MS盐(GIBCO/BRL-目录号为11117-066)；1ml B5维生素1000X原液；60g麦芽糖；750mgMgCl2六水合物；pH 5.7和2g gelrite
。
SB 71-4固体培养基(每升)包含：1瓶Gamborg B5盐带蔗糖(GIBCO/BRL-目录号为21153-036)；pH 5.7和5g TC琼脂。
2，4-D原液为预制备的，获自Phytotech目录号D 295，浓度为1mg/ml。
在-20℃下以等分试样保藏的B5维生素原液(每100ml)包含：10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸吡哆辛和1g硫胺。如果溶液没有足够快地溶解，通过热搅拌板施加低水平的热量。
氯磺隆原液包含：1mg/ml于0.01N氢氧化铵中。
实施例5：水稻愈伤组织转化
通过获得全基因序列分析来自其他作物物种的PC4同源物。一种本领域技术人员可用的将DNA转化至高等植物细胞中的方法，是使用包被有所关注核酸构建体的金属粒子进行的高速弹道轰击(参见Klein等人，(1987)Nature(伦敦)327：70-73和参见第4,945,050号美国专利)。将Biolistic PDS-1000/He(BioRAD Laboratories，Hercules，CA)用于这些互补实验。使用粒子轰击技术，用以下两种基因组DNA片段转化PC4突变体和野生型水稻：
1)来自野生型的10.0kb MunI片段，其包括PC4基因的4.5kb上游区和3.8kb下游区，
2)来自野生型的5.1kb EcoRI片段，其包括PC4基因的1.7kb上游区和1.7kb下游区。
使用来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的能赋予对抗生素的抗性的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因，作为水稻转化的选择性标志物。在载体pML18中，Hpt II基因被工程连接上来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根瘤农杆菌的章鱼氨酸合酶基因的终止信号和聚腺苷酸化信号。pML18在1997年12月18日公布的WO97/47731中有描述，该专利的公开内容以引用方式并入本文。
衍自萌发的水稻种子的盾片的胚发生愈伤组织培养物用作转化实验的原始材料。该材料是通过使无菌水稻种子在愈伤组织引发培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1.0mg/l 2，4-D和10μM AgNO3)中于暗处27-28℃下萌发来产生的。将从胚的盾片增殖的胚性愈伤组织转移到CM培养基(N6盐、Nitsch和Nitsch维生素、1mg/l 2，4-D，Chu等人，(1985)Sci.Sinica 18：659-668)。将愈伤组织培养物通过以两个星期时间间隔进行常规分培维持在CM上，并在引发的10个星期内用于转化。
愈伤组织是通过分培0.5-1.0mm的块来进行制备以供转化的，这些块相隔大约1mm，布置在Whatman
#541纸圆圈中央中的约4cm直径的圆形区域中，该纸放置在CM培养基上。将具有愈伤组织的板在暗处于27-28℃下温育3-5天。在轰击之前，将具有愈伤组织的过滤器转移到补加有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM，置于暗处3小时。然后在无菌罩中将平皿盖保持微开20-45分钟，以让组织上的水分散发。
将每个基因组DNA片段与含有用于水稻转化的选择性标志物的pML18一起共沉淀到金粒子的表面上。为实现这一点，将总共10μg的DNA以性状DNA∶选择性标志物DNA为2∶1的比例加到以60mgml-1的浓度重悬的50μl金粒子等分试样。然后将氯化钙(50μl 2.5M溶液)和亚精胺(20μl 0.1M溶液)加到该金-DNA悬浮液，同时将管漩涡混合3分钟。将金粒子在微量离心机中离心1秒钟，除去上清液。然后将金粒子用1ml无水乙醇洗涤两次，接着重悬于50μl无水乙醇中，超声处理(浴超声器)1秒钟以使金粒子分散。将金分散液在-70℃下温育五分钟，如果需要的话进行超声处理(浴超声器)以使粒子分散。然后将6μl的包被DNA的金粒子装载到聚酯薄膜巨载体碟(mylarmacrocarrier disk)上，让乙醇蒸发。
在干燥时间结束时，将含有组织的平皿放在PDS-1000/He的腔室中。然后将腔室中的空气抽真空成28-29英寸Hg。使用防爆膜以氦冲击波将该巨载体进行加速，该膜在冲击管中的氦压力达到1080-1100psi时破裂。将组织放置在离停止网大约8cm处，将愈伤组织轰击两次。用包被DNA的金粒子以此方式轰击两个至四个板的组织。在轰击之后，将愈伤组织转移到没有补加山梨醇或甘露醇的CM培养基。
在轰击后3-5天内，将愈伤组织转移到SM培养基(含有50mg/l潮霉素的CM培养基)。为实现这一点，将愈伤组织从各板转移到无菌的50ml圆锥形管并称重。加入40℃熔化的顶层琼脂，采用2.5ml顶层琼脂/100mg愈伤组织。将愈伤组织团块通过反复分配穿过10ml移液管来破碎成小于2mM直径的碎块。将3ml的愈伤组织悬浮液等分试样接种到新鲜SM培养基上，将各板在暗处于27-28℃下温育4个星期。4个星期后，鉴定转基因愈伤组织事件，转移到新鲜的SM板，在暗处于27-28℃下再生长2个星期。
将生长的愈伤组织转移到RM1培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、2％蔗糖、3％山梨醇、0.4％gelrite
+50ppm潮霉素B)在暗处于25℃下放2个星期。2个星期后，将愈伤组织转移到RM2培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、3％蔗糖、0.4％gelrite+50ppm潮霉素B)，并放置冷白色灯(约40μEm-2s-1)下，12小时光周期，温度25℃，湿度30-40％。在光中2-4个星期后，愈伤组织开始器官化并形成芽。将芽从周围的愈伤组织/培养基中取出，轻轻转移到phytatraysTM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中的RM3培养基(1/2×MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，用前一步骤中所述的相同条件继续进行温育。
在2-3个星期后当出现充分的根和芽生长时，将植株从RM3转移到含有Metro mix 350的4英寸盘。对获自转基因植株的种子检查PC4突变与含有PC4基因的野生型基因组DNA的遗传互补情况。
实施例6：PC4的过表达增加了FAST玉米中每植株的种仁数目 和种仁总重量。
从转Ubi-PC4的T0玉米转基因植株收集的数据表明，PC4在玉蜀黍中的过表达能提高每植株的种仁总重量。10株含有ubi-PC4的转基因植株中有5株其种仁总重量大于所有被评估的转基因事件的平均值。
在所有进行了定量RT-PCR的事件中都确认了转基因表达。对来自3个事件的T1植株在T1产量测定中进行了评估，且与由来自相同事件的非转基因分离子组成的参比群体相比较，对来自每个事件的15株转基因阳性植株进行了评估。表2描述了所评估的三个事件并详细给出了植物数据。转基因植株与它们的非转基因分离子相比显示出显著更长的穗和多得多的穗丝。
表2
实施例7：转基因优良玉米杂种的表型改进。
将含有转基因的单拷贝纯合转基因纯系玉米植株与试验株系进行杂交，以产生杂种种子。使所得的种子增进(advance)以在多个位置产生试验(trial)。所增进的转基因事件只含有一个拷贝的转基因。将对照和转基因事件以相同的种植密度进行种植。将得自转基因地块的产量数据与对照地块的产量数据进行比较。在任何位置中都没有观察到消极影响。含有转基因的杂种显示产量比对照高出最多达5％。
实施例8：PC4序列的变体
A.PC4的不改变所编码的氨基酸序列的变体核苷酸序列
用PC4核苷酸序列产生具有开放阅读框的核苷酸序列的变体核苷酸序列，其与相应的SEQ ID NO：1的起始未改变的开放阅读框核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。用标准密码子表产生这些功能变体。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。
B.PC4多肽的变体氨基酸序列
产生了PC4多肽的变体氨基酸序列。在这个实施例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。要改变的氨基酸的选择是通过参考蛋白质比对(与其他直向同源物和来自不同物种的其他基因家族成员的比对)进行的。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。使用图1中所示的蛋白质比对，可改变适当的氨基酸。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。
C.PC4多肽的另外的变体氨基酸序列
在该实施例中，产生出相对于参比蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一尝试要求从图1所示的比对鉴定保守区和可变区域，然后明智地应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
主要地，基于PC4蛋白之间或其他PC4多肽之间的保守区作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。基于序列比对，PC4多肽的很可能被改变的各个区域以小写字母表示，而保守区以大写字母表示。应认识到，可在以下保守区中作出保守置换而又不改变功能。另外，技术人员会理解，本发明的PC4序列的功能变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变更。
然后产生出与原始蛋白质序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表3中提供。
表3.置换表
首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与SEQ ID NO：1的起始未改变的开放阅读框核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的PC4多肽的变体。
D.PC4多肽的目标结构域或序列的破坏
产生了PC4多肽的经破坏的氨基酸序列。在该实施例中，将特定的结构域从最终的多肽破坏或排除。如果破坏N末端结构域或基序，则通过插入、缺失或碱基置换改变起始ATG的DNA密码子，以防止第一个甲硫氨酸翻译。通常，下一个可用的甲硫氨酸将支配翻译的起始，从而跳过该多肽的N末端部分。对于PC4基因，可将第一个ATG进行变更，以有效地防止翻译在该ATG开始并在SEQ ID NO：1的核苷酸位置105处向下游引发，从而消除SEQ ID NO：2的所有氨基酸的翻译。如果破坏C末端结构域，则通过插入、缺失或碱基置换或者更普通地如下所述通过PCR在所需的位点产生终止密码子。过早的终止可导致缺少C末端结构域的多肽的翻译。
另选的用于将目标保守区选择性隔离以进行表达的方法，是设计引物以PCR扩增在克隆的5′末端具有天然的或经工程改造的ATG序列和在克隆的3′末端具有天然的或经工程改造的终止密码子的所需保守区。所得的片段将具有待克隆到表达载体中的所需保守区。所得的PCR片段将具有待克隆到表达载体中的所需保守区。用这些方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％序列同一性的分离的多肽保守区的变体。
本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该冠词的语法对象。举例说，“一个要素”是指一个或多个要素。
说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。
虽然为了清楚理解的目的已通过例证和实例的方式详细地描述的前述发明，但一些变化和修改可在所附权利要求的范围内实施。
Claims (27)
1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有PC4蛋白活性的多肽；
(d)包含SEQ ID NO：1的至少40个连续核苷酸或其互补序列的核苷酸序列；和
(e)编码与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有PC4蛋白活性的多肽。
2.一种表达盒，所述表达盒包含根据权利要求1所述的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述多核苷酸可操作性连接到驱动在植物中的表达的启动子。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述多核苷酸可操作性连接到组成型启动子。
5.一种植物，所述植物包含根据权利要求3或权利要求4所述的表达盒。
6.根据权利要求5所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
7.根据权利要求6所述的植物，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
8.根据权利要求7所述的植物，其中所述单子叶植物是水稻。
9.根据权利要求7所述的植物，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。
10.根据权利要求5所述的植物，其中所述植物具有提高的水平的选自以下的多肽：
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；
(b)与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述多肽具有PC4蛋白活性；和
(c)包含SEQ ID NO：3所示的PC4保守区的多肽。
11.根据权利要求5所述的植物，其中所述植物具有选自以下的表型：
(a)种子总数增加；和
(b)种子总重量增加。
12.一种提高植物中多肽的水平的方法，所述方法包括将根据权利要求3或权利要求4所述的表达盒引入到所述植物中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述植物的产量得到提高。
14.根据权利要求12所述的方法，其中提高所述多肽的水平在所述植物中产生出选自以下的表型：
(a)种子总数增加；和
(b)种子总重量增加。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述表达盒稳定整合到所述植物的基因组中。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述单子叶植物是水稻。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。
20.一种提高植物中的产量的方法，所述方法包括提高PC4多肽在所述植物中的表达，其中所述PC4多肽具有PC4蛋白活性且选自：
(a)包含与SEQ ID NO：2所示序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；和
(b)包含SEQ ID NO：3所示的PC4结构域的多肽。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ IDNO：2所示序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求22所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，所述方法包括将表达盒引入到所述植物中，所述表达盒包含可操作性连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子的编码所述PC4多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：1所示序列包含至少95％序列同一性的核苷酸序列；
(d)编码包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和
(e)编码与SEQ ID NO：2所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的方法，所述方法包括：
(a)用所述表达盒转化植物细胞；和
(b)从步骤(a)的转化植物细胞再生出转化植物。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述表达盒稳定整合到所述植物的序列中。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
27.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2具有包含至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有调节转录的能力；和
(c)包含SEQ ID NO：2的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽保持调节转录的能力。
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