CN101679493A - 在植物中通过调节玉米alfin的产量增强 - Google Patents

在植物中通过调节玉米alfin的产量增强 Download PDF

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Abstract

提供了用于调节花器官发育、叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育、根发端和用于提高植物中产量的组合物和方法。所述组合物包括4种ZmALF序列。本发明的组合物包含选自SEQ ID NO：1－8及其变体和片段的氨基酸序列和核苷酸序列。在用于目的植物中表达的DNA构建体中提供了编码玉米alfin的核苷酸序列，用来调节植物或植物部分中4种ZmALF序列之一的水平。所述方法包括将包含本发明ZmALF序列的异源多核苷酸导入植物或植物部分。能够提高或降低ZmALF多肽的水平。此种方法可以用来提高植物中的产量；在一个实施方案中，所述方法用来提高谷类中的谷粒产量。

Description

在植物中通过调节玉米ALFIN的产量增强
发明背景
本发明涉及遗传学和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在植物中调节转录和改善产量的组合物和方法。
发明领域
借助常规育种法的谷粒产量改善已经在玉米中几乎达到一个平台期。随后自然要探索可能用来获得进一步产量提高的备选、非常规方法。由于玉米中的收获指数已经在过去百年左右对谷粒产量选择的期间基本上保持不变，产量改善已经因提高每单位土地面积的总生物量生产而实现(Sinclair等人(1998)Crop Science 38：638-643；Duvick等人(1999)CropScience 39：1622-1630；和Tollenaar等人(1999)Crop Science39：1597-1604)。这种提高的总生物量已经通过增加植物密度实现，这导致适应性表型变更，如叶片角减小和玉米穗状花序大小降低，前者导致减少对下部叶子的遮蔽并且后者可能提高收获指数(Duvick等人(1999)CropScience 39：1622-1630)。
Alfin-1最初因差异筛选耐盐性和正常苜蓿细胞之间的cDNA文库而鉴定并且显示其编码一种新的锌指DNA结合因子(Bastola，D.R.、V.V.Pethe和I.Winicov(1998)Alfin1，一种在苜蓿根中与盐诱导型MsPRP2基因中启动子元件结合的新锌指蛋白(Alfin 1，a novel zinc-finger protein in alfalfaroots that binds to promoter elements in the salt-inducible MsPRP2 gene).Plant Mol Biol，38：1123-35)。这种新的Alfin-1衍生的锌指结构域属于PHD指结构域家族(Aasland，R.、T.J.Gibson和A.F.Stewart(1995)PHD指：对染色质介导的转录调节的意义(The PHD finger：implications forchromatin-mediated transcriptional regulation).Trends Biochem Sci20：56-9)。据推测Alfin-1 PHD结构域在以EDTA敏感方式结合DNA中发挥作用，推断需要锌以结合在核心六聚体基序GNGGTG或GTGGNG处(Bastola等人，1998)。已经在拟南芥属(Arabidopsis)中鉴定了8种Alfin-1样因子(ALF)基因(Riechmann，J.L.等人(2000)拟南芥转录因子：在真核生物之间的基因组级别比较性分析(Arabidopsis transcription factors：gen ome-wide comparative analysis among eukaryotes).Science，290：2105-10)，而已经通过将苜蓿Alfin-1蛋白质序列分别针对稻和玉米基因组Blast检索分别在稻和玉米中鉴定了9种和13种ALF基因(W.Bruce，未发表的数据)。
Winicov和Bastola(Winicov，I.和D.R.Bastola，(1999)转录因子Alfin1的转基因过量表达增强苜蓿中内源性MsPRP2基因的表达并且改善植物的盐度耐受性(Transgenic overexpression of the transcription factorAlfin1 enhances expression of the endogenous MsPRP2 gene in alfalfa andimproves salinity tolerance of the plants).Plant Physiol，120：473-480)使用组成型35S启动子过量表达Alfin-1并且显示转基因植物伴随几乎不可观察到的效应正常生长，除了叶子比来自亲代植物的那些叶子或多或少更宽阔以外。然而过量表达反义形式的Alfin-1导致转基因苜蓿在土壤中更劣势地生长，提示Alfin-1对于正常植物生长是必需的。后来显示通过35S启动子组成型表达的Alfin-1的确在正常土壤和盐胁迫土壤中增强根生长(Winicov，I.(2000)Alfin1转录因子过量表达增强正常条件和盐条件下的植物根生长并且改善苜蓿中的盐耐受性(Alfin1 transcription factoroverexpression enhances plant root growth under normal and salineconditions and improves salt tolerance in alfalf).Planta 210：416-22)。Winicov报道了转基因苜蓿植物的幼苗重量的轻度增强，提示Alfin-1对于在苜蓿植物中增加产量是有用的。然而，有关ALF家族的其他成员或在其他植物物种中的功能知之甚少。
本领域需要可以使用此类序列来在植物中调节植物生长并改善产量的方法和组合物。
发明简述
提供了用于调节花器官发育、叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育、根发端和用于提高植物中产量的组合物和方法。所述组合物包含ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列，其中所述序列包含新的“PEPAL”和先前描述的PHD指结构域序列。本发明的组合物包含选自SEQ ID NO：1-8的氨基酸序列和核苷酸序列及其变体和片段。
在用于目的植物中表达的DNA构建体中提供了编码alfin的核苷酸序列。还提供了包含本发明序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施方案中，多核苷酸与组成型启动子有效连接。
提供了用于调节植物或植物部分中ZmALF序列的水平的方法。所述方法包括将包含可以提高或降低的ZmALF序列、ZmALF多肽的异源多核苷酸导入植物或植物部分。此方法可以用来提高植物中的产量；在一个实施方案中，该方法用来提高谷类中的谷粒产量。
附图简述
图1提供了来自玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻(Oryza sativa)和紫花苜蓿(Medicago sativum)的几个ALF序列的比对。ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a共有结构域包括新的“PEPAL”结构域和先前描述过的PHD指结构域。对PEPAL结构域加单下划线而对PHD指结构域加双下划线。
发明详述
现在将参考附图在下文中更充分地描述本发明，其中显示了一些但非全部的本发明实施方案。实际上，这些发明可以以多种不同形式体现并且不得解释为限于本文中所述的实施方案；相反，提供了这些实施方案，从而本公开内容将满足适用的法律要求。
这里所述的本发明的众多修改和其他实施方案将是得益于在前面描述和相关附图中所展示教导的这些发明所涉及领域的技术人员可想起的。因此，应当理解所述发明不意图限于所公开的具体实施方案并且修改和其他实施方案将意图被包含于所附权利要求书的范围中。尽管本文中使用了具体术语，不过它们仅在一般性和描述性意义上使用并且其目的不在于限制。
I.概述
提供了在植物中促进花器官发育、根发端及产量和用于调节叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育等的方法和组合物。本发明的组合物和方法通过调节植物中至少一种ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a的水平或含有新“PEPAL”和/或先前所述PHD-指结构域多肽的任意构建体或具有本发明ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的生物学活性变体或片段的多肽的水平产生改善的植物或作物产量。
II.组合物
本发明的组合物包含了参与调节转录的ZmALF多核苷酸和多肽及其变体和片段。ZmALF1、3和4a编码具有PEPAL和PHD指结构域这两者的植物蛋白质，而ZmALF2b仅编码具有PEPAL结构域的植物蛋白质。作为在ZmALF1中的一个新的约72氨基酸序列，共有的PEPAL结构域(SEQ ID NO：38)是与SEQ ID NO：2氨基酸位置对应的第39至110位氨基酸残基。ZmALF2b中的PEPAL结构域是与SEQ ID NO：4氨基酸位置对应的第44至115位氨基酸残基。ZmALF3中的PEPAL结构域是与SEQ IDNO：6氨基酸位置对应的第46至117位氨基酸残基。ZmALF4a中的PEPAL结构域因氨基酸序列中的变异而较小并且是与SEQ ID NO：8氨基酸位置对应的第45至116位氨基酸残基。ZmALF1、3和4a中的PHD指结构域(SEQ ID NO：39)分别是与SEQ ID NO：2、6和8的氨基酸位置分别对应的第199至245位、第206至250位和第204至248位氨基酸残基。“对应于”意指对于每个结构域的所提到的氨基酸位置涉及所提到SEQID NO的氨基酸位置并且意指包含这些结构域的多肽可以通过使用标准比对方法比对所述多肽与所提到SEQ ID NO：而找到。
本发明的ZmALF1、ZmALF3和ZmALF4a序列充当核酸结合蛋白，而ZmALF2b因缺少PHD-指而充当显性失活效应物。
如本文中所用，“ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a”序列包含编码具有PEPAL和/或PHD指结构域的或具有该PEPAL和/或PHD指结构域的生物学活性变体或片段的多核苷酸或具有PEPAL和/或PHD指结构域的或具有该PEPAL和/或PHD指结构域的生物学活性变体或片段的多肽。见，例如，Jurata和Gill(1997)Mol.Cell.Biol.17：5688-98；和Franks等人(2002)Development 129：253-63。
在一个实施方案中，本发明提供了包含如SEQ ID NO：2、4、6和8中所示氨基酸序列的分离的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽及其片段和变体。还提供了包含SEQ ID NO：1、3、5或7中所述核苷酸序列的多核苷酸和包含编码PEPAL结构域(SEQ ID NO：38)或PHD指结构域(SEQ ID NO：39)的多核苷酸的序列。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码PEPAL结构域和PHD指结构域这两者的序列。
本发明包括分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物学活性部分基本上或实质上不含这样的组分，其中所述组分通常伴随或与该多核苷酸或蛋白质相互作用，如在该组分天然存在环境中所发现的那样。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在衍生该多核苷酸的生物的基因组DNA中天然分布于该多核苷酸侧翼(即位于该多核苷酸的5’或3’端)的序列(最佳地是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施方案中，这种分离的多核苷酸可以含有在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然分布于该多核苷酸侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)杂质蛋白的蛋白质制品。当重组地产生本发明的蛋白质或生物学活性部分时，培养基最佳地出现小于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学前体或非目的蛋白质化学品。
PEPAL或PHD指结构域、ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸及其所编码蛋白质的片段和变体也被本发明的方法和组合物包括。“片段”意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段可以编码仍保留天然蛋白生物学活性并且因而调节转录的蛋白质片段。例如，多肽片段将包含PEPAL结构域(SEQ ID NO：38)或PHD指结构域(SEQ ID NO：39)。在一些实施方案中，该多肽片段包含PEPAL结构域和PHD指结构域这两者。备选地，用于抑制或沉默(即降低表达水平)ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的片段不需要编码蛋白质片段，但仍将保留抑制此靶序列表达的能力。另外，用作杂交探针的片段通常不编码保留生物学活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的片段可以具有至少约18个核苷酸、约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸并多达编码本发明蛋白质的全长多核苷酸。
编码PEPAL和PHD指结构域或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的多核苷酸的片段编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、675、700、725、750、775、800、825个连续氨基酸或多达全长PEPAL或PHD指结构域或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白(即SEQ ID NO：2)中存在的氨基酸总数。用作杂交探针、PCR引物或用作抑制构建体的PEPAL或PHD指结构域的片段或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸片段一般不需要编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a结构域的生物学活性部分。
可以通过如下方式制备包含PEPAL和PHD指结构域的多肽或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的生物学活性部分，即通过分离ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸的一部分，表达ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的所编码部分(例如通过体外重组表达)并评估ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的所编码部分的活性。作为ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a核苷酸序列的片段的多核苷酸或包含PEPAL和PHD指结构域的多核苷酸序列包含了至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,050、2,100、2,150、2,200、2,250、2,300、2,350、2,400、2,450、2,500个连续核苷酸或多达全长PEPAL和PHD指结构域中或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸(即SEQ ID NO：1，2504个核苷酸)中存在的核苷酸数目。
“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸而言，变体包含一个或多个核苷酸在天然多核苷酸内部一个或多个内部位点处的缺失和/或添加和/或一个或多个核苷酸在天然多核苷酸中一个或多个位点处的置换。如本文中所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言，保守性变体包括这些序列，其中所述序列因遗传密码的简并性而编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽或PEPAL和PHD指结构域之一的氨基酸序列。可以使用熟知的分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体，例如用下文说明的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸也包括合成方式衍生的多核苷酸，例如通过位点定向诱变产生、不过仍编码包含PEPAL或PHD指结构域(或这两者)的多肽或能够调节转录或能够降低(即抑制或沉默)ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸之表达水平的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的那些多核苷酸。通常，本发明的特定多核苷酸的变体将与该特定核苷酸具有如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数所确定的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。
本发明的特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体也可以通过比较在变体多核苷酸所编码的多肽与这种参照多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数进行评价。因此，例如公开了一种分离的多核苷酸，其编码与SEQ ID NO.2、4、6或8的多肽具有给定序列同一性百分数的多肽。可以使用在本文其他地方描述的序列比对程序和参数计算任意两个多肽之间的序列同一性百分数。在本发明任意给定的多核苷酸配对通过比较由所述多核苷酸编码的两个多肽所共有的序列同一性百分数而进行评价的情况下，这两个编码的多肽之间的序列同一性百分数是至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。
“变体”蛋白质意指从天然蛋白中通过在该天然蛋白中一个或多个内部位点处缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在该天然蛋白中一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而衍生的蛋白质。由本发明包括的变体蛋白质是有生物学活性的，即它们继续具有该天然蛋白的想要的生物学活性，即如本文中所述调节转录。此类变体可以例如因遗传多态性或因人类操作产生。本发明的ZmALF蛋白的生物学活性变体或者PEPAL或PHD指结构域的生物学活性变体将与ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的氨基酸序列或共有的PEPAL和PHD指结构域的氨基酸序列具有如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数所确定的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。本发明的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的或者PEPAL或PHD指结构域的生物学活性变体可以与该蛋白质具有少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，如6-10个，少至5个，少至4、3、2个或甚至1个氨基酸残基的不同。
本发明的多核苷酸可以按照多种方式进行改变，所述的方式包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变来制备ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白或PEPAL和PHD指结构域的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸变更的方法是本领域熟知的。见，例如，Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods inEnzymol.154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编著(1983)，Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，纽约)以及其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物学活性的适宜氨基酸置换的指导可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequenceand Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型中找到，所述文献在本文中引用作为参考。保守性置换，如将一个氨基酸交换为具有相似特性的另一个氨基酸，可以是最佳的。
因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突变形式。同样，本发明的蛋白质包括天然存在的蛋白质以及其改变和修饰的形式。此类变体将继续具有想要的活性(即，调节转录或降低靶ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的表达水平的能力)。在具体的实施方案中，将于编码该变体的DNA中产生的突变未使该序列不符合可读框并且不产生可能产生二级mRNA结构的互补性区域。见，EP专利申请公开号75,444。不希望本文中所包括的蛋白质序列的缺失、插入和置换导致该蛋白质特征的基本变化。然而，当难以在这样做之前预测所述置换、缺失或插入的确切作用时，本领域技术人员将知道可以通过常规筛选测定法评估这种作用。例如，ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性可以通过测试该多肽调节转录的能力进行评价。可以使用多种方法来测试这种活性，所述方法包括直接监测靶基因在核苷酸或多肽水平上的表达水平。用于这种分析的方法是已知的，并且包括例如RNA印迹法、S1保护测定法、蛋白质印迹法、酶测定法或比色测定法。备选地，测试对转录活性的调节作用的方法可以包括监测植物表型的改变。例如，如在本文其他地方更详细地讨论，调节ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平可以导致植物生长速率变化和产量变化。测试这些变化的方法在本文其他地方进一步详细地描述。
变体多核苷酸和蛋白质也包括从诱变的和重组方法如DNA改组法衍生的序列和蛋白质。用这种方法，可以操作一个或多个不同的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a编码序列以产生具有想要特性的新ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列或PEPAL和PHD指结构域。以这种方式，从包含具有显著序列同一性并且可以进行体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群体中产生重组多核苷酸的文库。例如，使用这种方法，可以在本发明的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因与其他已知ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因之间改组编码目的结构域的序列基序以获得编码蛋白质的新基因，其中所述蛋白质具有改善的目的属性，如在酶的情况下提高的Km。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。见，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。
本发明的多核苷酸可以用来分离来自其他生物、特别来自其他植物、更特别来自其他单子叶植物的相应序列。以这种方式，方法如PCR、杂交等可以用来基于它们与本文中所述序列的同源性鉴定此类序列。基于它们与本文中所述的完整ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列或与本发明的PEPAL或PHD指结构域或与其变体和片段的序列同一性而分离的序列被本发明包括。此类序列包括作为所公开序列的直向同源物的序列。“直向同源物”意指从共同先祖基因衍生并且作为物种形成的结果而存在于不同物种中的基因。当存在于不同物种中的诸基因的核苷酸序列和/或它们所编码的蛋白质序列共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性时，将所述存在于不同物种中的诸基因视为直向同源物。直向同源物的功能往往在物种之间是高度保守的。因此，下述分离的多核苷酸被本发明包括，其中所述的分离的多核苷酸能够沉默或抑制ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的表达或编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的多核苷酸的表达，并在严格条件下与本文中公开的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列或与其变体或片段杂交。
在PCR方法中，可以设计用在PCR反应中的寡核苷酸引物，以从提取自任意目的植物的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域通常已知的并且在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，纽约)。也见Innis等人编辑(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(AcademicPress，纽约)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press，纽约)；以及Innis和Gelfand编辑(1999)PCR Methods Manual(AcademicPress，纽约)中公开。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，使用已知多核苷酸的全部或部分作为探针，其中所述探针与存在于来自所选生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体(即基因组或cDNA文库)中的其他对应多核苷酸选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32p或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，可以通过标记基于本发明ZmALF多核苷酸的合成寡核苷酸产生用于杂交的探针。制备用于杂交的探针和用于构建cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的并且在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，纽约)中公开。
例如，可以使用完整ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸或编码本文中公开的PEPAL和PHD指结构域的多核苷酸或其一个或多个部分作为能够与相应ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括在ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸序列中独特并且最佳地具有至少约10个核苷酸长度并且最为最佳地具有至少约20个核苷酸长度的序列。此类探针可以用来通过PCR扩增来自所选植物的相应ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸。该项技术可以用来从所需植物分离额外的编码序列或用作诊断测定法以确定编码序列在植物中的存在。杂交技术包括铺板DNA文库的杂交筛选法(蚀斑或菌落；见，例如，Sambrook，等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，纽约)。
此类序列的杂交可以在严格条件下实施。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，其中探针与其靶序列在所述条件下杂交至大于与其他序列杂交的可检测程度(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖的并且会在不同环境中不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源性探测)。备选地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源性探测)。通常，探针小于约1000个核苷酸长度，最佳地小于500个核苷酸长度。
一般，严格条件将是这些条件，其中盐浓度在pH 7.0至8.3时小于约1.5M Na离子，一般约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)；并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)，温度是至少约30℃；对于长探针(例如大于50个核苷酸)，是至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例的低严格条件包括在37℃用30至35％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液杂交，并且在50至55℃于1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例的中等严格条件包括在37℃于40至45％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，并且在55至60℃于0.5×至1×SSC中洗涤。示例的高严格条件包括在37℃于50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，并且在60至65℃于0.1×SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间一般是小于约24小时，通常约4至约12小时。洗涤的持续时间将是至少足以达到平衡的一个时间长度。
特异性一般是杂交后洗涤的函数，关键因素是终末洗涤液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L近似获得；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交液中甲酰胺的百分数，并且L是该杂合体的碱基对长度。Tm是50％互补性靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。Tm因每1％错配下降约1℃；因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件旨在与具有想要的同一性的序列杂交。例如，若寻求具有≥90％同一性的序列，Tm可以降低10℃。通常，选择严格条件比在定义的离子强度和pH下的特定序列及其互补物低的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可以利用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热解链温度(Tm)低ll、12、13、14、l 5或20℃的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交与洗涤组合和想要的Tm，普通技术人员将理解本申请固有地描述了杂交液和/或洗涤液的严格性的变化。若想要的错配程度引起小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，最佳是提高SSC浓度，从而可以使用较高的温度。对核酸杂交的广泛指南存在于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，I部分，第2章(Elsevier，纽约)；和Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，纽约)。见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，纽约)。
使用以下术语来描述两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参照序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分数”。
(a)如本文中所用，“参照序列”是作为序列比较基础所用的定义序列。参照序列可以是特定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的节段，或完整的cDNA或基因序列。
(b)如本文中所用，“比较窗口”指多核苷酸序列的连续和指定的节段，其中与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，在比较窗口中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即空位)以最佳地比对两个多核苷酸。通常，该比较窗口是至少20个连续核苷酸长度，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长的连续核苷酸长度。本领域技术人员理解为了避免因多核苷酸序列中包含空位而所致与参照序列的高度相似性，一般引入并且从匹配数中扣除空位罚分。
出于比较而比对序列的方法是本领域熟知的。因此，可以使用数学算法完成任意两个序列之间序列同一性百分数的确定。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的搜索-局部比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中那样进行改良。
这些数学算法的计算机执行可以用于序列的比较以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(从Intelligenetics，Mountain View，California可获得)中的CLUSTAL；ALIGN程序(2.0版本)和GCGWisconsin Genetics软件包，版本10(从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA可获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以利用默认参数进行。CLUSTAL程序由Higgins等人(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331充分地描述。ALIGN程序基于上文的Myers和Miller(1988)算法。当比较氨基酸序列时，可以随ALIGN程序使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于上文的Karlin和Altschul(1990)算法。可以用BLASTN程序、分值＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序、分值＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述使用空位BLAST(在BLAST 2.0中)。备选地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用来进行检测分子之间远缘关系的反复搜索。见上文的Altschul等人(1997)。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-BLAST时，可以使用相应程序(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)的默认参数。见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对可以通过目测法人工地进行。
除非另外说明，本文中提供的序列同一性/相似性值指使用GAP第10版，利用以下参数：核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重50和长度权重3，和nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重8和长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵；或其任意的等价程序所获得的值。“等价程序”意指任意的序列比较程序，其中对于所讨论的任意两个序列而言，与GAP第10版所产生的相应比对比较时，所述序列比较程序产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分数的比对。
GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法来找到两个互补序列的比对，所述的比对使匹配数最大并使空位数最小。GAP考虑了全部可能的比对和空位位置并且产生具有最大匹配数和最少空位的比对。它允许提供匹配的碱基单元中的空位创立罚分和空位延伸罚分。GAP必须为其插入的每个空位产生空位创立罚分匹配数目的收益。若选择大于零的空位延伸罚分，GAP必须额外地为乘以空位延伸罚分的空位长度的每个所插入空位产生收益。GCG Wisconsin Genetics软件包第10版中的默认空位创立罚分值和空位延伸罚分值对于蛋白质序列分别是8和2。对于核苷酸序列，默认空位创立罚分是50而默认空位延伸罚分是3。空位创立罚分和空位延伸罚分可以表述为选自由0至200的整数组成的组中的整数。因此，例如，空位创立罚分和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP代表显示最佳比对家族的一个成员。可能存在该家族的众多成员，不过其他成员均不具有较好的质量。GAP为比对显示了四个优点特征：品质、比率、同一性和相似性。所述品质是旨在比对序列而最大化的量度。所述比率是除以较短节段中碱基数的品质。同一性百分数是实际上匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似符号的百分数。忽略了在空位对面的符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，计为相似性。在GCG Wisconsin Genetics软件包第10版中使用的评分矩阵是BLOSUM62(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。
(c)如本文中所用，“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的环境下意指当对指定比较窗口范围内的最大对应性进行比对时，在这两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数就蛋白质而使用时，认识到不相同的残基位置往往不同在于保守性氨基酸置换，其中氨基酸残基被置换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因而不改变该分子的功能性属性。当序列不同在于保守性置换时，可以向上调节序列同一性百分数以针对该置换的保守本质进行校正。将不同在于此类保守性置换的序列称作具有“序列相似性”或“相似性”。用于作出这种调节的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如当分值1给予相同氨基酸并且分值0给予非保守性置换的情况下，给予保守性置换在0至1之间的分值。例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中执行的那样来计算保守性置换的分值。
(d)如本文中所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列而测定的值，其中与参照序列(其不包含添加或缺失)相比时，所述多核苷酸序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)以最佳地比对这两个序列。通过以下方式计算百分数，即确定其中相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100以产生序列同一性百分数。
III.植物
在具体的实施方案中，本发明提供了具有改变水平(即提高或降低)的ZmALF序列的植物、植物细胞和植物部分。在一些实施方案中，所述植物和植物部分具有编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽或其生物学活性变体或片段的至少一个异源多核苷酸稳定地并入它们的基因组，其中所述的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽包含分别如SEQ ID NO：38或39中所述的PEPAL和PHD指结构域。在一个实施方案中，编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的多核苷酸如SEQ ID NO：2、4、6或8或其生物学活性变体或片段中描述。
又在其他实施方案中，提供了这样的植物和植物部分，其中稳定整合到所述植物或植物部分的基因组中的异源多核苷酸包含在植物中表达时提高ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽水平的多核苷酸，其中所述的多肽包含PEPAL和PHD指结构域、PEPAL结构域、PHD指结构域、或其活性变体或片段。可以用来增加ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽表达的序列包括但不限于如SEQ ID NO：2、4、6或8或其变体或片段中所示的序列。
如本文中其他地方更详细地讨论，此类植物、植物细胞、植物部分和种子可以具有改变的表型，所述改变的表型包括例如改变的花器官发育、叶形成、向光性、顶端优势、果实发育、根发端和改善的产量。
如本文中所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从中可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和在植物或植物部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、谷粒、谷穗、穗轴、荚壳、茎、根、根尖、花药中完整的植物细胞等。谷粒意指由商业种植者产生的用于除生长或再生物种之外目的的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含本文中所公开的导入性或异源多核苷酸即可。
本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是可作为种子油来源的芸苔属物种，苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryzasativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(双色蜀黍(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如，御谷(Pennisetum glaucum)、稷(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(普通小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Srachis hypogaea)、棉(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananascomosus)、柑桔树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、油橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松柏类植物。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、生菜(例如莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(Phaseolus limensis)，豌豆(山黛豆属物种(Lathyrus spp.))和黄瓜属(Cucumis)成员如黄瓜(C.sativus)、网纹甜瓜(C.cantalupensis)和香甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃属物种(Rhododendron spp.))、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(玫瑰属物种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙(水仙属物种(Narcissus spp.))、矮牵牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianth us caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可以在实施本发明中使用的松柏类植物例如包括松如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、小干松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加拿大铁杉(Tsuga canadensis)；白云杉(Picea glauca)；北美红杉(Sequoiasempervirens)；真冷杉如银杉(Abies amabilis)和红杉(香脂冷杉(Abiesbalsamea))；和柏树如西部红柏(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄柏(黄柏(Chamaecyparis nootkatensis))。在具体的实施方案中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属(Brassica)植物、大豆、棉、红花、落花生、高粱、小麦、谷子、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，并且又在其他实施方案中，玉米植物是最佳的。
其他目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油籽植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、燕麦等。油籽植物包括棉、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆类。豆类包括瓜尔豆(guar)、角豆(locustbean)、胡卢巴、大豆、四季豆(garden bean)、豇豆(cowpea)、绿豆、利马豆(lima bean)、蚕豆(fava bean)、兵豆(lentil)、鹰嘴豆等。
“主题植物或植物细胞”是其中改变(如转化或导入多肽)已经发生的一种植物或植物细胞或是从经过如此改变的植物或细胞传递下来并且包含所述改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型变化的参照点。
对照植物或植物细胞可以包含例如(a)野生型植物或细胞，即，以相同基因型的野生型植物或细胞作为用于改变的原材料，其中所述改变导致产生主题植物或细胞；(b)相同基因型的植物或植物细胞，作为原材料但是已经用无效构建体(即用已知不影响目的性状的构建体，如包含标记基因的构建体)转化；(c)作为主题植物或植物细胞的后代当中非转化的分离体的植物或植物细胞；(d)遗传上与主题植物或植物细胞相同但是不暴露于将诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)在不表达目的基因的条件下的该主题植物或植物细胞本身。
IV.多核苷酸构建体
术语“多核苷酸”的使用不意图将本发明限于包含DNA的多核苷酸。本领域的普通技术人员将认识到多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括全部的序列形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎和环结构等。
可以在用于目的植物中表达的表达盒中提供在本发明方法和组合物中使用的多种多核苷酸。该表达盒将包括与本发明多核苷酸有效连接的5′和3′调节序列。“有效连接”意指两个或多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的有效连接是允许该目的多核苷酸表达的功能性连接。有效连接的元件可以是邻接的或非邻接的。当用来指两个蛋白质编码区的连接时，有效连接意指所述编码区位于相同的可读框中。该表达盒可以额外地含有待共转化至生物内的至少一个额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供所述的额外基因。向这种表达盒提供多个限制性位点和/或重组位点，用于插入ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸以处在该调节区的转录调节作用下。该表达盒可以额外地含有选择性标记基因。
此表达盒可以在5’-3’转录方向上包括在植物中有功能的转录和翻译起始区(即启动子)、ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸以及转录和翻译终止区(即终止区)。调节区(即启动子、转录调节区和翻译中止区)和/或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸可以对于宿主细胞或彼此是天然的/类似的。备选地，所述调节区和/或ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸可以对于宿主细胞或彼此是异源的。如本文中所用，“异源的”对序列而言是这样的序列，其源自外来物种，或若来自相同的物种，则因人类有意介入在组成和/或基因组位点而被显著地修饰，有别于其天然形式。例如，与异源多核苷酸有效连接的启动子来自与衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或若来自相同的/类似的物种，其一或二者均受到显著的修饰而有别于其原始形式和/或基因组位点，或该启动子不是有效连接的多核苷酸的天然启动子。如本文中所用，嵌合基因包含编码序列，其中所述的编码序列有效连接到对该编码序列为异源的转录起始区。
尽管使用异源启动子表达该序列可能是最佳的，不过可以使用天然启动子序列。此类构建体可以改变植物或植物细胞中ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转录物或蛋白质的表达水平。因此，可以改变植物或植物细胞的表型。
终止区可以对于转录起始区是天然的，可以对于有效连接的目的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸是天然的，可以对于植物宿主是天然的，或可以从另一来源衍生，即对于所述启动子、目的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸、植物宿主或其任意组合为外来或异源的。常规终止区可以从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒得到，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。
根据需要，可以优化所述多核苷酸以在转化植物中增加表达。即，可以使用植物优选的密码子合成该多核苷酸以改进表达。见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11对宿主优选的密码子使用的讨论。本领域中可获得用于合成植物优选的基因的方法。见，例如，美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，所述文献通过引用的方式并入本文。
增强细胞宿主中基因表达的额外序列修饰是已知的。这些序列修饰包括消除编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子重复序列和可能有损于基因表达的其它充分表征的此类序列。可以调整序列的G-C含量至对于给定细胞宿主为平均的水平，其中所述的水平如通过参考在该宿主细胞中表达的已知基因进行计算。当可能时，修饰此序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以额外含有5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀斑病毒)(Gallie等人，(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)(Virology 154：9-20)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling等人，(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Gallie等人(1989)，于Molecular Biology of RNA一书中，Cech编著(Liss，纽约)，第237-256页)；玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，(1991)Virology 81：382-385)。也见Della-Cioppa等人(1987)，Plant Physiol.84：965-968。
在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段，从而使得DNA序列处于合适方向并且根据需要处于恰当的阅读框中。为此目的，可以使用衔接头或接头来连接所述DNA片段或可以包括其它操作以提供方便的限制性位点、移除多余的DNA、除去限制性位点等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制作用、复性和再置换，例如转换和颠换。
可以在本发明的实施中使用众多启动子，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。可以基于想要的结果选择启动子。核酸可以与用于植物中表达的组成型、组织优选的或其它启动子组合。
例如，此类组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)PlantMol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)、GOS2启动子(dePater等人(1992)Plant J.2：837-44)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
表达盒也可以包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予针对除草剂化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)的抗性的基因。额外的选择标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等人(2004)Plant Cell 16：215-28)、蓝色(cyan)荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol129：913-42)和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFPTM，见Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54)。对于额外的选择标记，一般见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人(1980)在The Operon中第177-220页；Hu等人(1987)Cell 48：555-566；Brown等人(1987)Cell 49：603-612；Figge等人(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)博士论文，海德堡大学；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)博士论文，海德堡大学；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature 334：721-724。此类公开内容通过引用的方式并入本文。上述选择性标记基因的名单不意在限制。在本发明中可以使用任意的选择性标记基因。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸可以与目的多核苷酸序列的任何组合堆积以产生具有所需性状的植物。如本文中所用，性状指从特定序列或序列群组衍生的表型。所产生的组合也可以包括任一种目的多核苷酸的多重拷贝。本发明的多核苷酸也可以与所需的对疾病或除草剂抗性(例如烟曲霉毒素解毒基因(美国专利号5,792,931)的性状；无毒力和疾病抗性基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体如S4和/或Hra突变体；谷氨酰胺合酶抑制剂如膦丝菌素或basta(例如bar基因)；和草甘磷抗性(EPSPS基因))；和加工过程或加工产品想要的性状如高油(例如美国专利号6,232,529)；改性油(例如脂防酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如美国专利号5,602,321；促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)表达的β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)堆积；所述文献的公开内容通过引用的方式并入本文。也可能将本发明的多核苷酸与提供农学性状如雄性不育(例如见美国专利号5,583,210)、茎强度、开花时间或转化技术性状如细胞周期调节作用或基因靶向作用(例如WO 99/61619、WO00/17364和WO 99/25821)的多核苷酸组合；所述文献的公开内容通过引用的方式并入本文。
这些堆积的组合可以通过任意方法产生，所述的方法包括但不限于通过任何常规方法或顶交法或遗传转化法使植物杂交育种。若所述序列通过遗传方式转化植物进行堆积，则目的多核苷酸序列可以在任何时间并以任何顺序进行组合。例如，可以使用包含一个或多个所需性状的转基因植物作为通过后续转化导入其他性状的靶标。性状可以在共转化方法中用通过转化盒的任意组合提供的目的多核苷酸同时导入。例如，若导入两个序列，则这两个序列可以包含在独立的转化盒中(反式)或包含在相同的转化盒上(顺式)。所述序列的表达可以由相同启动子或由不同启动子驱动。在某些情况下，可能想要的是导入抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过量表达盒的任意组合进行组合，以在植物中产生想要的性状组合。进一步认识到，使用位点特异性重组系统，可以在想要的基因组位置处堆积多核苷酸序列。见，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，全部专利文献通过引用的方式并入本文。
V.导入方法
本发明的方法包括导入多肽或多核苷酸到植物中。“导入”意指将多核苷酸或多肽以这样的方式递呈至植物中，从而该序列进入该植物的细胞内部。本发明的方法不依赖于用于导入序列至植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入该植物的至少一个细胞内部即可。用于导入多核苷酸或多肽到植物中的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”意指导入植物中的核苷酸构建体整合至该植物的基因组中并且能够由其后代继承。“瞬时转化”意指多核苷酸被导入植物且不整合到该植物的基因组中，或多肽被导入植物。
转化方案以及用于导入多肽或多核苷酸序列到植物中的方案可以根据转化所靶向的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物而变化。将多肽和多核苷酸导入植物细胞中的合适方法包括显微注射法(Crossway等人(1986)，Biotechniques 4：320-334)、电穿孔法(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌介导的转化法(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移法(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)和射弹粒子加速法(见，例如美国专利号4,945,050、美国专利号5,879,918、美国专利号5,886,244和美国专利号5,932,782，Tomes等人(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：FundamentalMethods，编者Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)中；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)和Lec1转化法(WO 00/28058)。也见，Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)，Nature(London)311：763-764；美国专利号5,736,369(禾谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，编者Chapman等人，Longman，NY，第197-209页中(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant CellReports 9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化法(whisker-mediated transformation))；D′Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔法)；Li等人(1993)PlantCell Reports 12：250-255；以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(借助根癌农杆菌转化的玉米)；全部文献通过引用的方式并入本文。
在具体的实施方案中，可以使用多种瞬时转化方法向植物提供ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列或其变体和其片段。此类瞬时转化方法包括但不限于直接导入ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白或变体和其片段到植物中或导入ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转录物到该植物中。此类方法例如包括微量注射法或粒子轰击法。见，例如，Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等人(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush等人(1994)The Journal of CellScience 107：775-784，全部文献通过引用的方式并入本文。备选地，ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸可以使用本领域已知的技术瞬时地转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统并且以排除DNA的随后释放的方式沉淀多核苷酸。因此，来自粒子结合性DNA的转录可以发生，但是该DNA被释放以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用以聚乙基亚胺(polyethylimine)(PEI；Sigma #P3143)涂敷的粒子。
在其他实施方案中，本发明的多核苷酸可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而导入植物中。通常，此类方法包括并入本发明的核苷酸构建体到病毒DNA或RNA分子中。认识到ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列或其变体或片段可以最初作为病毒多蛋白的一部分加以合成，随后通过体内或体外的蛋白水解进行加工以产生所需的重组蛋白。另外，认识到本发明的启动子也包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。用于导入多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996)MolecularBiotechnology 5：209-221；所述文献通过引用的方式并入本文。
用于在植物基因组中的特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，使用位点特异性重组系统实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。见，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，全部专利文献通过引用的方式并入本文。简而言之，可以在侧翼具有两个非重组性重组位点的转移盒中含有本发明的多核苷酸。导入该转移盒到使得在靶位点稳定并入其基因组的植物，其中所述的靶位点在侧翼具有与该转移盒的位点相对应的两个非重组性重组位点。提供适宜的重组酶并且该转移盒在所述靶位点整合。目的多核苷酸因而在植物基因组特定的染色体位置处整合。
已经转化的细胞可以根据常规方法培育成植物。见，例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。随后可以培育这些植物，并且用相同的转化株系或不同的株系授粉，并且可以鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得后代。可以培育两个或多个世代以确保所需表型特征的表达是稳定维持和遗传的，并且随后可以收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了使得本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)稳定并入其基因组的转化种子(也称作“转基因种子”)。
VI.使用方法
A.用于调节植物或植物部分中至少一个ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列或其变体或片段的表达的方法
多肽的“受调节的水平”或“调节水平”在本发明方法的上下文中指基因产物的表达、浓度或活性的任意提高或降低，包括表达、浓度或活性的任意的相对增量。在转录或翻译水平调节靶基因产物表达或调节靶基因产物活性的任意方法或组合物可以用来实现靶基因产物的受调节的表达、浓度、活性。通常，相对于适宜的对照植物、植物部分或细胞，所述水平提高或降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。本发明中的调节可以在植物生长到所需的发育期期间和/或其后发生。在具体的实施方案中，调节了单子叶植物、尤其谷物植物如稻、小麦、玉米等中的本发明多肽。
具有PEPAL和PHD指结构域的多肽或其生物学活性变体或片段的表达水平可以直接测量，例如通过测试植物中ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平，或间接地测量，例如通过测量植物中编码所述蛋白质的多核苷酸的水平或通过测量ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性。用于确定ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽活性的方法在本文其他地方描述。
在具体的实施方案中，将本发明的多肽或多核苷酸导入植物细胞。随后，使用本领域技术人员已知的方法，如，但不限于DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析法，选择具有导入的本发明序列的植物细胞。由前述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下培育一段时间，其中所述时间足以调节本发明多肽在植物中的浓度和/或活性。形成植物的条件是本领域熟知的并且在本文中其他地方简要讨论。
还认识到可以通过使用不能在转化的植物中指导蛋白质或RNA表达的多核苷酸调节多肽的水平和/或活性。例如，本发明的多核苷酸可以用来设计多核苷酸构建体，其中所述的多核苷酸构建体可以在改变或突变生物中基因组核苷酸序列的方法中使用。此类多核苷酸构建体包括但不限于RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合的双链体寡核苷酸、自我互补的RNA:DNA寡核苷酸和重组性寡核酸碱基。此类核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。见，美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972和5,871,984；全部专利文献通过引用的方式并入本文。也见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；这些文献通过引用的方式并入本文。
因而认识到本发明的方法不依赖于完整的多核苷酸并入基因组中，只要植物或其细胞因导入该多核苷酸到细胞中而改变即可。在本发明的一个实施方案中，基因组可以在导入所述多核苷酸至细胞中之后被改变。例如，多核苷酸或其任意部分可以并入植物的基因组。改变本发明的基因组包括但不限于向基因组中添加、缺失和置换核苷酸。尽管本发明的方法不取决于添加、缺失和置换任何具体数目的核苷酸，然而认识到此类添加、缺失或置换包含至少一个核苷酸。
在一个实施方案中，ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性和/或水平提高。ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平和/或活性的提高可以通过向植物提供ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽或其生物学活性变体或片段实现。如本文中其他地方所讨论，本领域已知用于向植物提供多肽的多种方法，所述方法包括但不限于直接导入ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽到植物中或(瞬时或稳定地)导入编码具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a活性的多肽的多核苷酸构建体到植物中。还认识到本发明的方法可以使用不能在转化的植物中指导蛋白质或RNA表达的多核苷酸。因此，ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平和/或活性可以通过改变编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的基因或其启动子而提高。见，例如，Kmiec美国专利号5,565,350；Zarling等人PCT/US93/03868。因而，提供了在ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因中携带突变的诱变植物，其中所述的突变增加ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因的表达或提高所编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性。
在其他实施方案中，本发明的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性和/或水平通过导入抑制多肽水平或活性的多核苷酸到植物中而降低或消除。该多核苷酸可以通过阻止ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a信使RNA翻译而直接抑制ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因的表达，或通过编码一种抑制编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因转录或翻译的多肽而间接抑制ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因的表达。用于抑制或消除植物中基因表达的方法是本领域熟知的，并且可以在本发明中使用任意的方法来抑制植物中至少一个ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的表达。在本发明的其他实施方案中，ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性通过用编码抑制ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性的多肽的序列转化植物细胞而降低或消除。在其他实施方案中，ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性可以通过破坏编码ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的基因而降低或消除。本发明包括在ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因中携带突变的诱变植物，其中所述的突变减少ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因的表达或抑制所编码的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a活性。
降低特定基因的活性(也称作基因沉默或基因抑制作用)对于植物中的基因工程的几个方面是想要的。用于基因沉默的众多技术是本领域技术人员熟知的，它们包括但不限于反义技术(见例如Sheehy等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8805-8809和美国专利号5,107,065；5,453,566和5,759,829)；共抑制(例如Taylor(1997)Plant Cell 9：1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12)：340-344；Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3490-3496；Finnegan等人(1994)Bio/Technology 12：883-888和Neuhuber等人(1994)Mol.Gen.Genet.244：230-241)；RNA干扰(Napoli等人(1990)Plant Cell 2：279-289；美国专利号5,034,323；Sharp(1999)Genes Dev.13：139-141；Zamore等人(2000)Cell 101：25-33；和Montgomery等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15502-15507)、病毒诱导的基因沉默(Burton等人(2000)Plant Cell 12：691-705；和Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.2：109-113)；靶RNA特异性核酶(Haseloff等人(1988)Nature 334：585-591)；发夹结构物(Smith等人(2000)Nature 407：319-320；WO 99/53050；WO02/00904；WO 98/53083；Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人，BMC Biotechnology 3：7，美国专利公开号20030175965；Panstruga等人(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140；Wesley等人(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；美国专利公开号20030180945和WO 02/00904，全部文献通过引用的方式并入本文)；核酶(Steinecke等人(1992)EMBO J.11：1525；和Perriman等人(1993)Antisense Res.Dev.3：253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如，WO 03/076574和WO 99/25853)；Zn指靶向的分子(例如WO 01/52620；WO 03/048345和WO 00/42219)；转座子标签法(Maes等人(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等人(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等人(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等人(1999)Genetics 153：1919-1928；Bensen等人(1995)Plant Cell 7：75-84；Mena等人(1996)Science 274：1537-1540和美国专利号5,962,764)；每份文献通过引用的方式并入本文；和其他方法或本领域技术人员已知的上述方法的组合。
认识到借助本发明的多核苷酸，可以构建与ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义构建体。构建反义核苷酸以同对应的mRNA杂交。可以修饰反义序列，只要所述序列与对应的mRNA杂交并干扰其表达即可。以这种方式，可以使用与对应的反义序列具有70％、最佳地80％，更为最佳地85％序列同一性的反义构建体。另外，反义核苷酸的部分可以用来破坏靶基因的表达。通常，可以使用具有至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550个或更多个核苷酸的序列。
本发明的多核苷酸也可以在有义方向上用来抑制植物中内源基因的表达。使用有义方向上的多核苷酸抑制植物中基因表达的方法是本领域已知的。所述方法通常包括用DNA构建体转化植物，其中所述的DNA构建体包含驱动在植物中表达的与对应于内源基因转录物的多核苷酸的至少一部分有效连接的启动子。一般，这样的核苷酸序列与该内源基因转录物的序列具有相当大的序列同一性，最佳地大于约65％的序列同一性、更为最佳地大于约85％的序列同一性，最为最佳地大于约95％的序列同一性。见，美国专利号5,283,184和5,034,323，它们通过引用的方式并入本文。
因此，许多方法可以用来降低或消除ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽或其生物学活性变体或片段的活性。另外，可以使用方法的组合来降低或消除至少一种ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的活性。还认识到可以调节单一ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的水平以产生所需的表型。备选地，可能想要的是调节(提高和/或降低)具有PEPAL和PHD指结构域或其生物学活性变体或片段的多种序列的表达水平。
如上所讨论，可以使用多种启动子来调节ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的水平。在一个实施方案中，调节至少一种ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽水平的异源多核苷酸的表达可以由组织优选的启动子、尤其叶优选的启动子(即叶肉优选的启动子或维管束鞘优选的启动子)和/或种子优选的启动子(即胚乳优选的启动子或胚优选的启动子)调节。
B.调节植物中花器官发育和产量的方法
提供了调节ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽并且因此调节植物中花器官发育、根发端和产量的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物可以用来提高禾谷类植物中的谷粒产量。在这个实施方案中，在目的禾谷类植物中表达ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a编码序列以增加ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转录因子的表达。
以这种方式，所述方法和组合物可以用来提高植物中的产量。如本文中所用，术语“改善的产量”意指任何测量的植物产物的产量方面的任意改善。产量的改善可以包括所测量的植物产物提高0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。备选地，提高的植物产量可以包括所测量的植物产物提高约0.5倍、1倍、2倍、4倍、8倍、16倍或32倍。例如，与在相同条件下培育的未处理的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相比，从具有本发明处理的作物衍生的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量提高将视为产量改善。提高的产量也意指总种子数提高、总种子重量提高、根生物量增加和收获指数提高中的至少一种提高。收获指数定义为收获时产量生物量对总累积生物量之比。
因此，提供了提高植物产量的多种方法。在一个实施方案中，提高植物或植物部分的产量包括导入异源多核苷酸到该植物或植物部分中；并且在该植物或植物部分中表达该异源多核苷酸。在这种方法中，该异源多核苷酸的表达调节植物或植物部分中至少一种ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平，其中所述ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽包含了具有SEQ ID NO：38(PEPAL结构域)或SEQ ID NO：39(PHD指结构域)中所示氨基酸序列的PEPAL或PHD指结构域(或这两者)或所述结构域的变体或片段。
在具体的实施方案中，调节ZmALF多肽的水平包括提高至少一种ZmALF多肽的水平。在此类方法中，导入植物的异源多核苷酸编码具有PEPAL和PHD指结构域或其生物学活性变体或片段的多肽。在具体的实施方案中，该异源多核苷酸包含至少一个SEQ ID NO：1和/或其生物学活性变体或片段中所示的序列。
在其他实施方案中，调节至少一种ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平包括降低至少一种ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的水平。在此类方法中，导入植物的异源多核苷酸不需要编码有功能的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽，但是，该多核苷酸的表达导致包含PEPAL和PHD指结构域或PEPAL和/或PHD指结构域的生物学活性变体或片段的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的表达降低。在具体的实施方案中，具有降低水平的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽在至少一个SEQ ID NO：2或其生物学活性变体或片段中描述。
以说明方式且不以限制方式提供以下实施例。
项
1.分离的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、3、5或7中所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：1、3、5或7具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性的多肽；
(d)包含SEQ ID NO：1、3、5或7的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列；和，
(e)编码与SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性的多肽。
2.表达盒，其包含项1的多核苷酸。
3.项2的表达盒，其中所述的多核苷酸与驱动在植物中表达的启动子有效连接。
4.项3的表达盒，其中所述的多核苷酸与组成型启动子有效连接。
5.植物，其包含项3或项4的表达盒。
6.项5的植物，其中所述植物是单子叶植物。
7.项6的植物，其中所述的单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
8.项7的植物，其中所述单子叶植物是稻。
9.项7的植物，其中所述单子叶植物是玉米。
10.项5的植物，其中所述的植物具有选自以下的多肽提高的水平：
(a)包含SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列的多肽；
(b)与SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述的多肽具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性；和-
(c)包含SEQ ID NO：38中所示PEPAL结构域的多肽。
11.项5的植物，其中所述的植物具有选自以下的表型：
(a)提高的总种子数；
(b)提高的总种子重量；
(c)提高的收获指数；和
(d)增加的根生物量。
12.提高植物中多肽水平的方法，所述方法包括导入项3或项4的表达盒到所述植物中。
13.项12的方法，其中植物的产量提高。
14.项12的方法，其中提高所述多肽的水平在植物中产生选自以下的表型：
(a)提高的总种子数；
(b)提高的总种子重量；
(c)提高的收获指数；和
(d)增加的根生物量。
15.项13的方法，其中所述的表达盒稳定地整合到植物的基因组中。
16.项13的方法，其中所述植物是单子叶植物。
17.项16的方法，其中所述的单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
18.项17的方法，其中所述单子叶植物是稻。
19.项17的方法，其中所述单子叶植物是玉米。
20.提高植物中产量的方法，所述方法包括增加ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽在所述植物中的表达，其中所述的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性并且选自以下多肽：
(a)包含与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：38中所示PEPAL结构域的多肽；和，
(c)包含SEQ ID NO：38中所示PEPAL结构域和SEQ ID NO：39中所示PHD-指结构域的多肽。
21.项20的方法，其中所述的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
22.项20的方法，其中所述的多肽包含SEQ ID NO：2、4、6或8中所示的氨基酸序列。
23.项20至22中任一项所述的方法，所述方法包括将表达盒导入所述的植物，所述的表达盒包含与驱动在植物细胞中表达的启动子有效连接的编码所述ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、3、5或7中所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽的核苷酸序列；
(c)包含相对于SEQ ID NO：1、3、5或7中所示序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
(d)编码包含SEQ ID NO：2、4、6或8中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和，
(e)编码与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
24.项23的方法，所述方法包括：
(a)用所述表达盒转化植物细胞；和
(b)从步骤(a)的经转化植物细胞再生出转化的植物。
25.项23或项24的方法，其中所述的表达盒稳定地并入植物的序列中。
26.项23的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
27.分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
(a)包含SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列；
(b)包含相对于SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述的多肽具有调节转录的能力；和，
(c)包含SEQ ID NO：2、4、6或8的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述的多肽保留调节转录的能力。
实验
实施例1：玉米ZmALF基因的克隆
通过来自EST集合的序列同源性鉴定编码玉米ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的cDNA，其中使用针对NCBI DNA序列数据库的BLAST 2.0(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403)从玉米cDNA文库产生所述的EST集合。通过PCR，使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下，用包含用于
Figure A20088001738600421
重组克隆的AttB位点的玉米ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a-特异性引物从EST质粒扩增玉米ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a cDNA片段。使用如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，纽约)所述的标准方法扩增和纯化具有预期长度的PCR片段。随后进行
Figure A20088001738600422
方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”。质粒pDONR201从Invitrogen购买，作为
Figure A20088001738600423
技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)的部分。
实施例2：载体构建(pGOS2::ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a)
该进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有植物选择标记、筛选标记和
Figure A20088001738600424
盒作为T-DNA边界内部的功能性元件，其中所述的
Figure A20088001738600425
盒意图与已经在该进入克隆中克隆的目的序列发生LR体内重组。这个
Figure A20088001738600426
盒的上游是赋予目的基因中等程度组成型表达的稻GOS2启动子(Hensgens等人(1993)Plant Mol.Biol.23：643-669)。在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2::ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转化到根癌农杆菌菌株LBA4044中并且随后转化至粳稻“日本晴”(Oryza sativa var.Nipponbare)植物(见Chan，M.T.等人(1993)Plant Mol Biol 22(3)：491-506和Chan，M.T.等人(1992)Plant Cell Physiol 33(5)：577-583)。培育转化的稻植物并且如实施例4中所述检验多种生长特征。
实施例3：稻转化方法
使用涂敷以核酸构建体的金属粒子的高速射弹轰击法用来转化野生型稻(Klein等人(1987)Nature 327：70-73；美国专利号4,945,050，所述文献通过引用的方式并入本文)。生物射弹PDS-1000/He(BioRAD Laboratories，Hercules，CA)用于这些互补作用实验。粒子轰击技术用来以pGOS2::ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转化野生型稻。使用来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因(其赋予抗生素抗性)作为稻转化的选择标记。在载体pML18中，对Hpt II基因设计配备来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的终止和聚腺苷酸化信号。pML18在WO97/47731中描述，所述专利的公开内容通过引用的方式并入本文。
从正在萌发的稻种子的小盾片中衍生的胚发生愈伤组织培养物用作转化实验的来源材料。这种材料通过在愈伤组织发端培养基(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，1.0mg/l 2，4-D和10μM AgNO3)上于黑暗中在27-28℃萌发无菌稻种子产生。随后转移从胚的小盾片中增殖的胚发生愈伤组织至CM培养基(N6盐，Nitsch和Nitsch维生素，1mg/l 2，4-D；Chu等人(1985)Sci.Sinica 18：659-668)。愈伤组织培养物通过常规传代培养法在CM上间隔两周维持培养并且在发端的10周内用于转化。通过传代培养置于CM培养基上的圆形Whatman #541滤纸中央的相距大约1mm、排列在约4cm直径环形区域内的0.5-1.0mm小片，制备用于转化的愈伤组织。含愈伤组织的平板在27-28℃于黑暗中温育3-5日。轰击前，转移带愈伤组织的滤纸至补充有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM，在黑暗中持续3小时。随后在无菌柜中半开启培养皿盖20-45分钟以使得组织上的潮气消散。
将每个DNA片段与含有稻转化的选择标记的pML18共沉淀到金粒子的表面。为实现这一点，将性状：选择标记DNA比例为2∶1的总计10μgDNA添加至已经以60mg ml-1浓度重悬的50μl等分试样的金粒子。随后添加氯化钙(2.5M溶液50μl)和亚精胺(0.1M溶液20μl)至金-DNA悬液，同时将管子涡旋混合3分钟。将金粒子在微型离心机中离心1秒钟并弃去上清液。金粒子随后用1ml无水乙醇洗涤两次并重悬于50μl无水乙醇中并超声处理(浴槽式超声处理器)1秒钟以分散金粒子。金悬液在-70℃温育5分钟并超声处理(浴槽式超声处理器)以分散粒子。随后将6μl DNA涂敷的金粒子加载到迈拉巨载体盘上并且使乙醇蒸发。
在干燥期结束时，含有组织的培养皿置于PDS-1000/He的腔室。随后排出腔室内的空气至真空度28-29英寸Hg。使用激波管内He压力达到1080-1100psi时破裂的防爆膜，用氦激波加速巨载体。组织距中止屏大约8cm放置并且轰击愈伤组织2次。以这种方式用DNA涂敷的金粒子轰击2至4个组织平板。轰击后，将愈伤组织转移到无山梨醇或甘露醇补充物的CM培养基。
轰击后3至5日，将愈伤组织转移至SM培养基(含有50mg/l潮霉素的CM培养基)。为实现这一点，将愈伤组织从平板转移至无菌的50ml锥形管并称重。使用2.5ml顶层琼脂/100mg愈伤组织，添加40℃的融化顶层琼脂。通过10ml吸管反复分散，将愈伤组织团块分散成直径小于2mm的碎片。将3ml等分试样的愈伤组织悬液涂布在新鲜的SM培养基上并将平板在27-28℃于黑暗中温育4周。4周后，鉴定转基因愈伤组织事件、转移至新鲜的SM平板并在27-28℃于黑暗中培育额外的2周。
将正在生长的愈伤组织转移至RM1培养基(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，2％蔗糖，3％山梨醇，0.4％脱乙酰吉兰糖胶+50ppm潮霉素B)在25℃于黑暗持续2周。2周后，将愈伤组织转移至RM2培养基(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，3％蔗糖，0.4％脱乙酰吉兰糖胶+50ppm潮霉素B)并置于冷白光(～40μEm-2s-1)下，12小时光周期，25℃和30-40％湿度。在光照下2-4周后，愈伤组织开始组织起来并形成幼枝。将幼枝从环绕的愈伤组织/培养基取出并温和地转移至植物托盘(phytatrays)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)中的RM3培养基(1/2x MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，并且使用与前述步骤中所述相同的条件继续温育。2-3周后当足够的根和幼枝生长已经发生时，将所得的T0转化体从RM3转移至含有Metro mix 350的4英寸花钵。
实施例4：在用pGOS2::ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转化的T0、T1和T2稻植物中评价过量表达ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列以在稻中提高产量
产生大约15至20个独立的T0转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。留下对于转基因存在/不存在以3∶1分离的T1子代的6个事件。“无效植物”或“无效分离体”或“失效合子”是按照与转基因植物相同的方式处理但是其中转基因已经分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化体。对于这些事件中的每一个事件，通过PCR选择含有转基因的大约10株T1籽苗(杂合子和纯合子)和缺少该转基因的大约10株T1籽苗(失效合子)。
基于(本文中描述的)T1评价的结果，选择在T1水平显示出改善的生长和产量特征的4个事件以在T2世代中进一步表征。至此，通过监测标记表达而筛选来自阳性T1植物(杂合子和纯合子)的种子批次。对于每个所选的事件，随后选择杂合种子批次用于T2评价。移植每个种子批次中相等数目的阳性和阴性植物用于在温室中评价(即对于每个事件40株植物，其中20株对转基因为阳性并且20株对于该转基因为阴性)。对于这四个事件，评价T2世代中的总计160株植物。如本文中所述，将T1和T2植物这两者都转移至温室并评价营养生长参数。
对转基因T1和T2品系的统计分析
使用对非平衡设计所校正的两因素ANOVA(方差分析)作为用于所观察植物表型特征的数值的统计评价模型。数值接受t-检验和F-检验。通过比较t-值与t-分布或备选地通过比较F-值与F-分布获得p-值。p-值代表虚假设(即无转基因的作用)为正确的概率。
对每个事件的全部植物的全部值进行t-检验。这种t-检验对每个事件和对每个生长特征重复进行。实施t-检验以检查基因在一个转化事件中的效应，在本文中也称作“品系特异的效应”。在t-检验中，显著性品系特异的效应的阈值设在10％概率水平。因此，具有小于10％的t-检验的p-值的数据意指在该品系的转基因植物中观察到的表型因转基因的存在所致。在一个转化事件群体中，一些事件可小于或低于该阈值。这种差异可能因该转基因在稻基因组中位置的差异所致(即基因可能仅在基因组的某些位置中有效应)。因此，“品系特异的效应”有时称作“位置依赖的效应”。
对全部事件的全部植物的全部值实施F-检验。对每个生长特征重复进行F-检验。实施F-检验以检查基因对全部转化事件的效应并且以验证该基因的全局效应，在本文中也称作“基因效应”。在F-检验中，显著的总基因效应的阈值设在5％概率水平。因此，具有小于5％的F检验的p-值的数据意指观察到的表型不仅因转基因的存在和/或因该转基因在基因组中的位置引起。“基因效应”是基因在转基因植物中广泛应用的一种指示。
营养生长测定
在温室中培育选择的植物。每株植物接受唯一条码标签以无误地将表型数据与相应的植物关联。选择的植物在直径10cm的透明花钵的土壤中，于以下环境设置中培育：光周期＝11.5小时；昼间光照强度＝30,000lux或更大；昼间温度＝28℃或更高；夜间温度＝22℃；和相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。从播种期直至成熟期(即，此期间生物量不再增加)，使植物每周通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1千6百万色彩)。使用图像分析软件，以自动方式从数字图像衍生本文中所述的参数。
还使植物通过根成像系统，其中所述的根成像系统以数字方式从透明底花钵的基部拍摄根形态和根体的画面。通过计数来自植物部分的与背景相区别的像素总数确定植物地上部分的面积和根质量。地上部分值对在相同时间点上从不同角度拍摄的图片平均，并且转换成经校正的以平方毫米表示的实际表面值。实验已经显示对应于以这种方式测量的最大总面积的地上部分植物面积同地上植物部分的生物量相关。
除了植物生长期间的数字图像外，当植物达到成熟并且衰老时，手工计数每株植物的圆锥花序数和每株植物的小花总数。收集干燥的小花，并且使用封闭式空气驱动的鼓风系统机械分开具有充实种子的那些小花与空的小花。随后收集脱壳的种子并且使用种子计数仪计数和使用标准天平称重。使用每株植物所产生种子的总重量与如本文中所述从数字图像计算的生物量的比率计算收获指数。从每株植物的总种子重量与每株植物的充实种子数之比乘以1000计算千粒重。至开花的时间记录为播种与首个圆锥花序出现之间的天数，通过在检测到圆锥花序的最早成像过程中圆锥花序的尺寸和该成像过程的日期外推而来。
ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a在稻中的总效应
就所检验的5个事件平均而言，与失效合子相比，T1世代中的pGOS2::ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a转基因植物以小于0.04的p-值显示每株植物的总种子数统计显著地提高多达11％、每株植物的充实种子数提高51％、每株植物的总种子重量提高54％并且收获指数提高42％。这些数据显示组成型表达的ZmALF基因对植物中几种重要的产量性状赋予强烈的正效应。
实施例5：ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列在玉米中的过量表达
来自温室供体植物的不成熟玉米胚用含有在UB1启动子控制下的ZmALF序列(如ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a/SEQ ID NO：1、3、5或7)和赋予除草剂双丙氨磷抗性的选择标记基因PAT(Wohlleben等人(1988)Gene 70：25-37)的质粒轰击。备选地，在一个单独质粒上提供该选择标记基因。转化如下文进行。培养基配方如下。
靶组织的制备
将玉米穗去壳并在加0.5％Micro去垢剂的30％Clorox漂白液中表面消毒20分钟，并用无菌水漂洗2次。将不成熟胚切下并按照胚轴侧面向下(小盾片侧面向上)方式在560Y培养基上放置4小时，每个平板25个胚，并且随后排列在准备轰击的2.5cm靶区内部。
产生了包含与遍在蛋白启动子有效连接的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的质粒载体。使用如下的CaCl2沉淀法：100μl制备好的在水中的钨粒子；10μl(1μg)在Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaC12；和10μl 0.1M亚精胺，将这种质粒DNA及含有PAT选择标记的质粒DNA沉淀在1.1μm(平均直径)钨沉淀物上。
每种试剂依次添加至钨粒子悬液内，同时在多管涡旋混合器上维持。短暂地超声处理终末混合物并且使其在恒定的涡旋混合下温育10分钟。在沉淀期后，将管子短暂离心，除去液体，用500ml 100％乙醇洗涤并离心30秒。再次除去液体，并添加105μl 100％乙醇至最终的钨粒子沉淀物。对于粒子枪轰击，短暂地超声处理钨/DNA粒子，并且将10μl悬液点在每个巨载体的中心上并且使其在轰击前干燥约2分钟。
在水平#4上用粒子枪轰击样品平板(美国专利号5,240,855)。全部样品接受650PSI的单次射击，从每个制备的粒子/DNA管中取出总计10个等分试样。
在轰击后，将胚在560Y培养基上保持2日，随后转移到含有3mg/升双丙胺膦的560R选择培养基并每隔2周传代培养。在选择大约10周后，将抗选择作用的愈伤组织克隆转移至288J培养基以启动植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)后，将充分发育的体细胞胚转移到培养基以萌发并转移到光照的培养室内。大约7-10日后，将正在发育的小植物转移到管中的272V无激素培养基内持续7-10日直至小植物充分地建立。随后将植物转移至平台中含有盆栽土壤的卡盘(等同于2.5″花钵)内并在生长箱中培育1周，随后在温室中培育另外1-2周，随后转移至常规600花钵(1.6加仑)内并培育至成熟。监测植物并对其氮利用效率增加、产量提高或胁迫耐受性提高进行评分。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D或ZmALF 2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调节至pH5.8后，用去离子水H2O补足体积)；2.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(用去离子水H2O补足体积后添加)；和8.5mg/l硝酸银(将培养基灭菌并冷却至室温后添加)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、30.0g/l蔗糖或ZmALF2.0mg/l 2，4-D(用KOH调节至pH 5.8后，用去离子水H2O补足体积)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(用去离子水H2O补足体积后添加)；和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙胺膦(均在将培养基灭菌并冷却至室温后添加)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素贮存液(0.100g烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL和0.40g/l甘氨酸，用精加工的去离子水补足体积)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、和1.0ml/l 0.1mM脱落酸(调节至pH 5.6后，用精加工的去离子水补足体积)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(用去离子水H2O补足体积后添加)；和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙胺膦(在将培养基灭菌并冷却至60℃后添加)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素贮存液(0.100g/l烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL和0.40g/l甘氨酸，用精加工的去离子水补足体积)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖((调节至pH 5.6后，用精加工的去离子水补足体积)；和6g/l细菌培养用琼脂(用精加工的去离子水补足体积后添加)，消毒并冷却至60℃。
实施例6：农杆菌介导的转化
对于用ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸进行的农杆菌介导的玉米转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840和PCT专利公开WO98/32326；所述文献的内容通过引用的方式并入)。简而言之，从玉米分离不成熟的胚并使胚与农杆菌悬液接触，其中所述的细菌能够转移ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸到至少一个不成熟胚的至少一个细胞内(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，将不成熟胚浸没在农杆菌悬液中以启动接种。胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培育步骤)。不成熟胚在感染步骤后于固体培养基上培养。在这个共培育时期后，构思了任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，在已知抑制农杆菌生长的至少一种抗生素存在下，在不添加用于植物转化体的选择剂的情况下，温育所述胚(步骤3：静息步骤)。在含抗生素但无选择剂的固体培养基上培养不成熟胚，以消除农杆菌并且持续感染细胞的静息期。接下来，在含有选择剂的培养基上培养接种的胚并且回收生长的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含选择剂的固体培养基上培养不成熟的胚，从而导致转化细胞的的选择性培育。愈伤组织随后再生成植物(步骤5：再生步骤)，并且将选择性培养基上所培育的愈伤组织在固体培养基上培养以再生出植物。
实施例7：大豆胚转化
培养条件
大豆胚发生悬浮培养物(栽培品种Jack)在150转/分钟的旋转振荡培养箱上的35ml液体培养基SB196(见下文配方)中维持，26℃，用冷白色荧光灯按照16∶8小时昼/夜的光周期以光强度60-85μE/m2/s照明。培养物每隔7日至2周通过接种大约35mg组织到35ml新鲜液体培养基SB196中进行传代培养(优选的传代培养间隔期是每隔7日)。
大豆胚发生悬浮培养物用以下实施例中描述的质粒和DNA片段，通过粒子枪轰击法(Klein等人(1987)Nature，327：70)转化。
大豆胚发生悬浮培养物的启动
每月两次启动大豆培养物，每个启动之间间隔5-7日。
从种植45-55日后的可获得的大豆植物挑出带不成熟种子的豆荚，从它们的壳中取出并置于灭菌的深红色盒中。通过在含1滴象牙色皂的5％Clorox溶液(95ml高压消毒的蒸馏水外加5ml Clorox和1滴皂液)中振摇15分钟对大豆种子消毒。充分混合。使用2个1升瓶的无菌蒸馏水漂洗种子并且将小于4mm的种子置于分别的显微镜载玻片上。切开种子的小端并将子叶从种衣挤出。子叶转移至含有SB1培养基的平板(每个平板25-30片子叶)。平板用纤维胶带包裹并贮存8周。这段时间后，切下次生胚并置于SB196液体培养基中7日。
制备用于轰击的DNA
含有目的基因和选择标记基因的完整质粒或DNA质粒片段用于轰击。使用PromegaTM方案和应用指南2版(第106页)中所述的方法常规地制备和纯化用于轰击的质粒DNA。通过凝胶分离经双酶切消化的质粒获得携带ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸的质粒片段。在每种情况下，100μg质粒DNA在0.5ml的适于目的质粒的特定酶混合物中消化。所得的DNA片段通过在1％ SeaPlaque GTG琼脂糖(Bio Whitaker Molecular Applications)上凝胶电泳分离和从所述琼脂糖凝胶切下含有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多核苷酸的DNA片段。使用GELase消化酶，按照制造商方案从琼脂糖纯化DNA。
含有3mg金粒子(3mg金)的50μl等分试样的无菌蒸馏水添加至5μl的1μg/μl DNA溶液(如上所述制备的完整质粒或DNA片段)、50μl 2.5MCaCl2或ZmALF 20μl的0.1M亚精胺。该混合物在涡旋振荡器的第3水平振摇3分钟并在桌面离心机中离心10秒钟。用400μl 100％乙醇洗涤后，通过超声处理使沉淀悬浮于40μl的100％乙醇中。5μl DNA悬液分配至Biolistic PDS1000/HE仪器盘(instrument disk)的每个飞盘(flying disk)。每个5μl等分试样大约含有每次轰击(即每个盘)0.375mg金。
组织制备和用DNA轰击
大约150-200mg的7日龄胚悬浮培养物置于一个空的、无菌60×15mm培养皿中并且该培养皿用塑料网覆盖。以每个平板1或2次射击方式轰击组织，膜破裂压力设在1100PSI并且将腔室排空至27-28英寸汞柱的真空。距滞留/中止屏大约3.5英寸放置组织。
转化胚的选择
使用潮霉素(当使用潮霉素磷酸转移酶HPT基因作为选择标记时)或氯磺隆(当使用乙酰乳酸合酶ALS基因作为选择标记时)选择转化的胚。
潮霉素(HPT)选择
轰击后，将组织置于新鲜SB196培养基中并且如上所述培养。轰击6日后，将SB196更换为含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196。该选择培养基每周更新。选择4至6周后，可以观察到从非转化的坏死性胚发生团块中长出的绿色转化组织。取出分离的绿色组织并接种到多孔板中，以产生新的克隆性繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。
氯磺隆(ALS)选择
轰击后，将组织在含有新鲜SB196培养基的2个烧瓶之间分配并且如上所述培养。轰击6至7日后，将SB196更换为含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196。该选择培养基每周更新。选择4至6周后，可以观察到从非转化的坏死性胚发生团块中长出的绿色转化组织。取出分离的绿色组织并接种到含有SB196的多孔板中，以产生新的克隆性繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。
大豆体细胞胚再生成植物
为了从胚发生悬浮培养物获得完整植物，必须使组织再生。
胚成熟
胚在26℃于SB196中，在冷白色荧光灯下(飞利浦冷白色EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro)(40瓦特)按照16∶8小时光周期以光强度90-120uE/m2s培养4-6周。在这段时间后，将胚团移至固体琼脂培养基SB166持续1-2周。团块随后传代培养于培养基SB103中，持续3周。在这个时段期间，可以从团块中取出单个的胚并且筛选其ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a表达和/或活性的水平。
胚干燥和萌发
成熟的单个胚通过置于一个空的、小培养皿(35X10mm)中大约4-7日进行干燥。平板用纤维胶带密封(创造一个小湿室)。干燥的胚接种到SB71-4培养基中，其中使所述胚在上文所述的相同培养条件下萌发。从萌发培养基取出萌发的小植物并用水彻底漂洗并且随后栽种在24穴填充盘的Redi-Earth内，以透明塑料圆盖覆盖。2周后，撤去圆盖并且使植物硬化又一周。若小植物看上去粗壮，则将它们移植到含Redi-Earth的10英寸花钵，每个花钵多达3株小植物。10至16周后，收获成熟种子、切碎并分析蛋白质。
培养基配方
SB 196-FN Lite液体增殖培养基(每升)-
MS FeEDTA-100×原液1                 10ml
MS硫酸盐-100×原液2            10ml
FN Lite卤化物-100×原液3       10ml
FN Lite P、B、Mo-100×原液4    10ml
B5维生素(1ml/L)                1.0ml
2，4-D(10mg/L终浓度)           1.0ml
KNO3                           2.83gm
(NH4)2SO4                      0.463gm
天冬酰胺                       1.0gm
蔗糖(1％)                      10gm
pH 5.8
FNLite贮存液
原液#                          1000ml        500ml
1MS Fe EDTA 100×原液
Na2 EDTA＊                     3.724g        1.862g
FeSO4-7H2O                     2.784g        1.392g
首先添加，在黑色瓶子中溶解，同时搅拌
2MS硫酸盐100×原液
MgSO4-7H2O                     37.0g         18.5g
MnSO4-H2O                      1.69g         0.845g
ZnSO4-7H2O                     0.86g         0.43g
CuSO4-5H2O                     0.0025g       0.00125g
3FN Lite卤化物100×原液
CaCl2-2H2O                     30.0g        15.0g
KI                             0.083g       0.0715g
CoCl2-6H2O                     0.0025g      0.00125g
4FN Lite P、B、Mo 100×原液
KH2PO4                         18.5g        9.25g
H3BO3                          0.62g        0.31g
Na2MoO4-2H2O             0.025g         0.0125g
SB1固体培养基(每升)包含：1pkg.MS盐(GIBCO/BRL-目录号11117-066)；1ml B5维生素1000×原液；31.5g蔗糖；2ml 2，4-D(20mg/L终浓度)；pH 5.7和8g TC琼脂。
SB166固体培养基(每升)包含：1pkg.MS盐(GIBCO/BRL-目录号11117-066)；1ml B5维生素1000×原液；60g麦芽糖；750mg六水合MgCl2；5g活性炭；pH 5.7和2g脱乙酰吉兰糖胶。
SB103固体培养基(每升)包含：1pkg.MS盐(GIBCO/BRL-目录号11117-066)；1ml B5维生素1000×原液；60g麦芽糖；750mg六水合MgCl2；pH 5.7；和2g脱乙酰吉兰糖胶。
SB 71-4固体培养基(每升)包含：1瓶Gamborg B5盐w/蔗糖(GIBCO/BRL-目录号21153-036)；pH 5.7；和5g TC琼脂。
2，4-D原液从Phytotech目录号D 295预制获得-浓度是1mg/ml。
以等分试样在-20℃贮存的B5维生素原液(每100ml)包含：10g肌醇；100mg烟酸；100mg吡哆醇HCl；和1g硫胺素。若该溶液没有足够迅速地溶解，则通过热搅拌板施加低水平的热。
氯磺隆原液包含：0.01N氢氧化铵中的1mg/ml。
实施例8：ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的变体
A.不改变所编码氨基酸序列的ZmALF的变体核苷酸序列
使用ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a核苷酸序列来产生变体核苷酸序列，其中与相应SEQ ID NO的初始的未改变的ORF核苷酸序列相比时，所述的变体核苷酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性的可读框的核苷酸序列。使用标准密码子表，产生了这些功能性变体。尽管所述变体的核苷酸序列是被改变了的，但由其可读框编码的氨基酸序列没有变化。
B.ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的变体氨基酸序列
产生了ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的变体氨基酸序列。在本实施例中，改变了一个氨基酸。具体而言，审查可读框以确定适宜的氨基酸改变。通过参考蛋白质比对(与其它直向同源物和源自多个物种的其他基因家族成员)做出待改变氨基酸的选择。选择了这样的氨基酸，其中认为所述氨基酸不处在高选择压力下(不是高度保守的)并且相当容易地被具有相似化学特征(即相似的功能性侧链)的氨基酸替换。使用图1中所示的蛋白质比对，可以改变适宜的氨基酸。一旦确定了靶氨基酸，遵循以下C部分中概述的方法。使用这种方法，产生了具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性的变体。
C.ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的额外的变体氨基酸序列
在本实施例中，产生相对于参考蛋白质序列具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。后一项工作要求从图1中所示的比对鉴定保守区和可变区并且随后适宜地使用氨基酸置换表。这些部分将在下文更详细地讨论。
总体上，基于ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白中或其他ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽中的保守区域，做出改变哪些氨基酸序列的决定。基于序列比对，以小写字母代表可能可以被改变的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的多个区域，而保守区域由大写字母代表。认识到可以在下文的保守区域中进行保守性置换而不改变功能。另外，技术人员将理解的是：本发明的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a序列的功能性变体可以在保守结构域中具有少量的非保守氨基酸变化。
随后产生了与原始序列不同在于80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性区间的人工蛋白质序列。靶向这些区间的中点，例如加或减1％的充分范围。氨基酸置换将由惯用Perl script实现。下文在表1中提供置换表。
表1置换表
  氨基酸   强相似的和最佳的置换   改变的顺序等级   评论
  I   L，V   1   50∶50置换
  L   I，V   2   50∶50置换
  V   I，L   3   50∶50置换
  A   G   4
  G   A   5
  D   E   6
  E   D   7
  W   Y   8
  Y   W   9
  S   T   10
  T   S   11
  K   R   12
  R   K   13
  N   Q   14
  Q   N   15
  F   Y   16
  M   L   17   首个甲硫氨酸不能改变
  H   Na   非良好的取代基
  C   Na   非良好的取代基
  P   Na   非良好的取代基
首先，鉴定并且“标出”蛋白质中不应当改变的任意保守氨基酸以杜绝置换。首个甲硫氨酸当然将自动添加至该清单中。接下来，作出改变。
在任何情况下不改变H、C和P。改变将首先从异亮氨酸开始，从氨基端涵盖至羧基端。随后是亮氨酸，并且如此沿该表格进行下去直至它达到所需靶标。可以作出中间数目的置换，从而不引起改变的逆转。该清单分成1-17级，从而在亮氨酸之前，从所需要的尽可能多的异亮氨酸改变开始，并且如此向下进行直至甲硫氨酸。显然，将不需要以这种方式改变许多氨基酸。L、I和V涉及两个备选的最佳置换物的50∶50置换。
变体氨基酸序列记录为输出形式。使Perl script来计算同一性百分数。使用这种方法，产生了与SEQ ID NO：1、3、5或7的初始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽变体。
D.破坏ZmALF多肽的靶结构域或序列
产生了ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的受破坏的氨基酸序列。在本实施例中，特定的结构域被破坏或从最终的多肽中排除。若破坏氨基端结构域或基序，则通过插入、缺失或碱基置换改变起始ATG的DNA密码子以防止翻译首个甲硫氨酸。通常，下一个可用的甲硫氨酸将决定启动翻译，因此越过多肽的氨基端部分。对于ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a基因，可以改变头两个ATG以有效地防止在这两个ATG处开始的翻译并且在下游ZM-ALF1(SEQ ID NO：1)第83位置、ZM-ALF2b(SEQ ID NO：3)第88位置、ZM-ALF3(SEQ ID NO：5)第90位置或ZM-ALF4a(SEQ ID NO：7)第89位置处起始。若破坏羧基端结构域，则通过插入、缺失或碱基置换或更常见地如下文所述通过PCR在想要的位点处产生终止密码子。提前终止可能导致翻译丢失羧基端结构域的多肽。
用于选择性分离所靶向结构域以表达的备选方法是设计引物以通过PCR扩增想要的结构域，其中所述的结构域在克隆的5’端具有天然存在的或工程化设计的ATG序列并在克隆的3’端具有天然存在的或工程化设计的终止密码子。所得的片段具有待克隆到表达载体中的想要的结构域(见实施例2)。在对应于ZM-ALF1(SEQ ID NO：2)第83氨基酸位置、ZM-ALF2b(SEQ ID NO：4)第88氨基酸位置、ZM-ALF3(SEQ ID NO：6)第90氨基酸位置或ZM-ALF4a(SEQ ID NO：8)第89氨基酸位置的核苷酸位置处，设计5′引物并且该引物含有一个ATG密码子，而在所述4种ZM-ALF序列的终止密码子的核苷酸位置处设计3′引物。使用这些方法，产生了分离的多肽结构域或基序的变体，其中所述变体如实施例8A、B或C中所述产生并且具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性。
冠词“一个”和“一种”在本文中用来指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)的语法对象。例如，“一种要素”意指一种或多种要素。
本说明书中提到的全部出版物及专利申请说明了本发明所属领域的技术人员的水平。全部出版物及专利申请通过引用的方式以相同程度并入本文，如同专门且个别地说明通过引用方式并入每份单独的出版物或专利申请。
尽管已经通过旨在阐明理解的目的以说明和举例方式详细描述了前述发明，然而可以在所附带权利要求书的范围内实施某些变化和修改。
序列表
<110>克罗普迪塞恩股份有限公司
<120>在植物中通过调节玉米ALFIN的产量增强
<130>PF60826
<150>US 60/940,116
<151>2007-05-25
<160>39
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1269
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>1
ccacgcgtcc gagctcctcc tcctcctccc ccccagtccc tcccaggctc ccaccccgcc     60
ttgctcgcag cctccccaaa accctagccc tagccctagc cctagctctc ccacacccgc    120
actgggagat ggacggcggc ggcacgcacc gcacgccgga agacgtgttc cgggatttcc    180
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agtgtgaccc agagaaagag aatctgtgtt tgtatggtct tcccaatgaa acatgggaag    300
tgaacttgcc tgcagaggag gttcctcctg aacttccaga gccagctctg ggaattaatt    360
ttgctcgtga cgggatggat gaaaaagatt ggctgtcact agtcgcggtg cacagtgatg    420
cttggttgct ggctgtggcc ttttacttcg gtgcaagatt tggttttgac aaagaatcca    480
ggaagcgcct ttttgtcatg attaataacc tccctacaat atatgaagtt gtcacgggaa    540
ctgccaagaa gcaaaccaag gagaaaactc cgaaaagcag cagcaagagc aataaagctg    600
gcccaaaacc gccacgccag ccagaaccca actcaagggg ttcgaagatg ccacctccga    660
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tgtgtggttc ttgtggtgac aactacggac aggatgagtt ctggatatgc tgcgatgcgt    780
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gtatgtcaaa gacgttctag atctattgtt agtaactagc aactaattgt agtagcctgt    1080
atttcttcaa tcttctccca gggcgcctgt gctgaactca aactgtttta gatctaagtt    1140
gtgcattatg tatcactcat gttagtttgt taaaaaatgt gttagcattc gtatgaaaaa    1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1260
aaaaaaaaa                                                            1269
<210>2
<211>254
<212>PRT
<213>玉米
<400>2
Met Asp Gly Gly Gly Thr His Arg Thr Pro Glu Asp Val Phe Arg Asp
1               5                   10                  15
Phe Arg Ala Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu Thr Thr Asp Val
            20                  25                  30
Glu Lys Phe Tyr Gln Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu
        35                  40                  45
Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu Glu
    50                  55                  60
Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg
65                  70                  75                  80
Asp Gly Met Asp Glu Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val His Ser
                85                  90                  95
Asp Ala Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly
            100                 105                 110
Phe Asp Lys Glu Ser Arg Lys Arg Leu Phe Val Met Ile Asn Asn Leu
        115                 120                 125
Pro Thr Ile Tyr Glu Val Val Thr Gly Thr Ala Lys Lys Gln Thr Lys
    130                 135                 140
Glu Lys Thr Pro Lys Ser Ser Ser Lys Ser Asn Lys Ala Gly Pro Lys
145                 150                 155                 160
Pro Pro Arg Gln Pro Glu Pro Asn Ser Arg Gly Ser Lys Met Pro Pro
                165                 170                 175
Pro Lys Asp Glu Asp Asp Ser Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Asp His Glu Asn Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly Asp Asn Tyr Gly Gln
        195                 200                 205
Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ala Cys Glu Thr Trp Phe His Gly
    210                 215                 220
Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His Ile Lys His Tyr
225                 230                 235                 240
Lys Cys ProAsn Cys Ser Gly Ser Gly Lys Arg Ala Arg Ala
               245                 250
<210>3
<211>1199
<212>DNA
<213>玉米
<400>3
ccacgcgtcc gaactcctgt gtgtgcctgc caacgcctcg tcgcccgccg ccgccgctgc     60
ttcgcccctc tccgccagcc gctcccgctc ggagcacgcc gccgccggcg tgggcgcgca    120
ccgacggccg tcgtgtcgca tggatatggc ccccgcggcc gtctcctcca acccgcgctc    180
ggtcgaggaa atcttcaaag acttctccgg ccggcgcgcg gggctcgtcc gcgccctcac    240
ctccgatgtg gacgatttct gcagcttctg cgacccagat aaggagaact tgtgtctcta     300
cggccttccc aacggtagct gggaggtctc gccgccggcg gacgaggttc ctccggagtt     360
gcccgagccg gcgctcggca tcaactttgc gcgcgatggc atgcagcgcc gcgactggct     420
ctcactcgtc gcggtccact ctgactcgtg gctcatctca gtcgccttct tctacggcgc     480
ccgcctcaac gccaacgacc ggaagcgctt attcagcatg atcagtgatc ttccttctgt     540
ctttgaagca tttgcggaca ggaaacacgt cagggatagg tctggcgttg atagcagcgg     600
caagtccagg cactcatcaa aggtgccaca ttaatccttc caatagtttg gttttgctcc     660
actttatata caaaaatctt actcagaacg agttgcttct ttctcgtgtg tagagaggaa     720
acgatggcca tgcgaagaac tccagggcag cagctcctgc tgccaaagag tacgacgacg     780
acgatgacga ggaggacgag gaacacacgg aaaccttttg tggaagctgc ggcggcctct     840
acaacgcgaa cgagttctgg atcggctgcg acatctgcga gcggtggttc cacgggaagt     900
gcgtgcggat cacccctgcc aaagcggacc acataaagca ctacaagtgc ccggactgca     960
gctcgaagaa aataaggcag taggtcccag tgtgcaccgc cggccatcgc tgacctgtct    1020
gatcccaaac catactccat tgcttgcctg ccttgcccca aggtcgcagc tagcagatgc    1080
gaattccttc atttgtgggg ggttgttgtg tgatggatag cctggtagga agaggcaaag    1140
gactgatata taatgactcg tttattgttc atctttttgc ctgcaaaaaa aaaaaaaaa     1199
<210>4
<211>164
<212>PRT
<213>玉米
<400>4
Met Asp Met Ala Pro Ala Ala Val Ser Ser Asn Pro Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Glu Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala
            20                  25                  30
Leu Thr Ser Asp Val Asp Asp Phe Cys Ser Phe Cys Asp Pro Asp Lys
        35                  40                  45
Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Gly Ser Trp Glu Val Ser
    50                  55                  60
Pro Pro Ala Asp Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly
65                  70                  75                  80
Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu
                85                  90                  95
Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Ile Ser Val Ala Phe Phe Tyr
            100                 105                 110
Gly Ala Arg Leu Asn Ala Asn Asp Arg Lys Arg Leu Phe Ser Met Ile
        115                 120                 125
Ser Asp Leu Pro Ser Val Phe Glu Ala Phe Ala Asp Arg Lys His Val
    130                 135                 140
Arg Asp Arg Ser Gly Val Asp Ser Ser Gly Lys Ser Arg His Ser Ser
145                 150                 155                 160
Lys Val Pro His
<210>5
<211>1092
<212>DNA
<213>玉米
<400>5
ccacgcgtcc ggtcttctct gtcacagcgc cgactcttcc caattccttc caatcggcac     60
ctcgccgtcc tcgtgtgcaa tccccagctc tcctcgcccc tccctcccaa actccagcgg    120
ccccccctga ccaagctccg gggacggatg gacggaggag ccggctttcc gggcacgcag    180
ccggtctccc gctcgccgga ggacgtcttc cgggactacc gcgcgcgcca ggccggcctg    240
atcagggcgc tcaccaccga tgtggagaag ttctacgtga tgtgcgaccc agagaaggag    300
aacttatgtt tatatggact tcctaatgag acatgggaaa taaacttgcc tgctgaagag     360
gtccctcctg aactgccaga gccagctctt ggaattaatt ttgctcgtga tgggatggat     420
gaaaaagatt ggctatcact tgttgcagtg catagtgatt cttggctaat gtctgttgca     480
ttttattttg gagcaaggtt tggattcgat aaagaatcca ggaaacgtct cttcaccatg     540
atcaataacc ttcccagcat atatgaggtt gtcacaggaa cagccaagaa agagcccaaa     600
gaaaaaactc ctaaaagcaa cattaagact aacaaatctg gctcaaagcc ctcgcgccat     660
gcggaacaac ccaactcaag ggtcccaaag atgccacctc caaaggacga ggagagtgaa     720
gaggaggaag gggaaccaca ggaagaccag gagagtgcgc tgtgtggcgc atgtggccta     780
ggttatgacg acttctggat ctgctgcgac ctatgcgaga catggttcca cggcaagtgt     840
gttaagatca ccccagctaa agcggaccac atcaagcagt ataagtgccc ctcctgcacg     900
ggaagcaaga gggccaaggt ttgatccacg atccaaggag cctttgacga gagctgtaag     960
ctgactcttc gtgctagggc agctaataga ttcgaatgct tgttttgata caaattacga    1020
gtactgacga accgtaaact gatgtagttt gtgtggccct caaagcatct atgtcctgaa    1080
aaaaaaaaaa aa                                                        1092
<210>6
<211>258
<212>PRT
<213>玉米
<400>6
Met Asp Gly Gly Ala Gly Phe Pro Gly Thr Gln Pro Val Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
Pro Glu Asp Val Phe Arg Asp Tyr Arg Ala Arg Gln Ala Gly Leu Ile
            20                  25                  30
Arg Ala Leu Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Val Met Cys Asp Pro
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu
    50                  55                  60
Ile Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asp Glu Lys Asp Trp Leu
                85                  90                  95
Ser Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Met Ser Val Ala Phe
            100                 105                 110
Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ser Arg Lys Arg Leu
        115                 120                 125
Phe Thr Met Ile Asn Asn Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Val Val Thr Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Lys Lys Glu Pro Lys Glu Lys Thr Pro Lys Ser Asn Ile Lys
145                 150                 155                 160
Thr Asn Lys Ser Gly Ser Lys Pro Ser Arg His Ala Glu Gln Pro Asn
                165                 170                 175
Ser Arg Val Pro Lys Met Pro Pro Pro Lys Asp Glu Glu Ser Glu Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Gly Glu Pro Gln Glu Asp Gln Glu Ser Ala Leu Cys Gly Ala
        195                 200                 205
Cys Gly Leu Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu
    210                 215                 220
Thr Trp Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Asp
225                 230                 235                 240
His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Thr Gly Ser Lys Arg Ala
                245                 250                 255
Lys Val
<210>7
<211>1320
<212>DNA
<213>玉米
<400>7
ccacgcgtcc gcggacgcgt gggaaagtct tctcttctct gtctcagcgc cgacgcttcc     60
caactcctct cttttctttc caagaaaagt cttctcttct ctgtctcagc gccgacgctt    120
cccaactcct tccaatcgat tcttcgtctc gtcctcgtgt aatccccagc ttgccctcct    180
cgctcttccc tcccaaaacc ctacgcctcc ctgaccaagc tccggggacg aatggacgga    240
ggagccggct tccctggcac gccggtcccg cgctcgccgg aggacgtttt ccgggactac    300
cgcgcgcgcc aggccggcct aatcagggcg ctcaccaccg atgttgagaa gttctacgtg    360
atgtgcgacc cagagaagga taatttatgt ttatatggac ttcccaatga gacatgggaa    420
gtaaacttgc ctgctgagga ggttcctcct gaactcccag agccagctct cggaattaat    480
tttgctcgtg atgggatgaa tgaaaaagat tggctatcac ttgttgcagt gcatagtgat    540
tcttggctaa tgtctgttgc attttatttt ggagcaaggt ttggattcga caaggaatcc    600
aggaaacgtc tcttcaccat gatcaataat cttcccagca tatatgaggt tgtcacagga    660
acagccaaga aagagtccaa agaaaaaact cctaaaagca gcaacaagac taacaaatct    720
ggctcaaagc cttcacgcca ggtagaaccc aactccaggg tcccaaagat gccacctcca    780
aaggacgagg agagtgaagg ggaggaaggt gaaccacagg aagaccatga gagtgcgctg    840
tgcggcgcat gtggcctagg ttatgacgac ttctggatct gttgcgactt atgcgagaca    900
tggttccacg gcaagtgtgt caagatcacc ccaaataaag cggagcacat caagcagtat    960
aagtgcccct cgtgcacagg aagcaagagg gccaaggctt gattctatct atctacgata   1020
tagatatgaa ttgcggacaa tgctccaaga accgaggagc ctttgacgag agttgtaaga   1080
tgaatcttcc gggtagggca gctaatagat ttgaatactt cgtgtggata ctgtcggcat   1140
tggtgcttga gatgcctcaa aatatagtgt cagtactgat caactgttaa ctgttgtagt   1200
ttgtggggcc ctcaggcatc tatgttctgt agtctactgt gtggtggttt agataccgtc   1260
tatgccattt gtgatgaagc agtcgtttta aagtttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   1320
<210>8
<211>256
<212>PRT
<213>玉米
<400>8
Met Asp Gly Gly Ala Gly Phe Pro Gly Thr Pro Val Pro Arg Ser Pro
1               5                   10                  15
Glu Asp Val Phe Arg Asp Tyr Arg Ala Arg Gln Ala Gly Leu Ile Arg
            20                  25                  30
Ala Leu Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Val Met Cys Asp Pro Glu
        35                  40                  45
Lys Asp Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val
    50                  55                  60
Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ser
                85                  90                  95
Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Met Ser Val Ala Phe Tyr
            100                 105                 110
Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ser Arg Lys Arg Leu Phe
        115                 120                 125
Thr Met Ile Asn Asn Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Val Val Thr Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Lys Lys Glu Ser Lys Glu Lys Thr Pro Lys Ser Ser Asn Lys Thr
145                 150                 155                 160
Asn Lys Ser Gly Ser Lys Pro Ser Arg Gln Val Glu Pro Asn Ser Arg
                165                 170                 175
Val Pro Lys Met Pro Pro Pro Lys Asp Glu Glu Ser Glu Gly Glu Glu
            180                 185                 190
Gly Glu Pro Gln Glu Asp His Glu Ser Ala Leu Cys Gly Ala Cys Gly
        195                 200                 205
Leu Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu Thr Trp
    210                 215                 220
Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Asn Lys Ala Glu His Ile
225                 230                 235                 240
Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Thr Gly Ser Lys Arg Ala Lys Ala
                245                 250                 255
<210>9
<211>252
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>9
Met Glu Gly Ile Gln His Pro Ile Pro Arg Thr Val Glu Glu Val Phe
1                   5                   10                  15
Ser Asp Phe Arg Gly Arg Arg Ala Gly Leu Ile Lys Ala Leu Ser Thr
            20                  25                  30
Asp Val Gln Lys Phe Tyr His Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu
        35                  40                  45
Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Val
    50                  55                  60
Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe
65                  70                  75                  80
Ala Arg Asp Gly Met Gln Glu Lys Asp Trp Ile Ser Leu Val Ala Val
                85                  90                  95
His Ser Asp Ser Trp Leu Ile Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg
            100                 105                 110
Phe Gly Phe Gly Lys Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Gln Met Ile Asn
        115                 120                 125
Asp Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Thr Gly Asn Ala Lys Gln Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Gln Ser Ala Asn His Asn Ser Ser Arg Ser Lys Ser Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Lys Pro Arg His Ser Glu Ser His Thr Lys Ala Ser Lys Met Ser
                165                 170                 175
Pro Pro Pro Arg Lys Glu Asp Glu Ser Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp
            180                 185                 190
Glu Gln Gly Ala Val Cys Gly Ala Cys Gly Asp Asn Tyr Gly Gly Asp
        195                 200                 205
Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ala Cys Glu Lys Trp Phe His Gly Lys
    210                 215                 220
Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His Ile Lys His Tyr Lys
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ser Cys Thr Thr Ser Lys Lys Met Lys Ala
                245                 250
<210>10
<211>256
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>10
Met Glu Gly Ile Thr His Pro Ile Pro Arg Thr Val Glu Glu Val Phe
1               5                   10                  15
Ser Asp Phe Arg Gly Arg Arg Ala Gly Leu Ile Lys Ala Leu Thr Asn
            20                  25                  30
Asp Met Val Lys Phe Tyr Gln Thr Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu
        35                  40                  45
Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Val
    50                  55                  60
Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe
65                  70                  75                  80
Ala Arg Asp Gly Met Gln Glu Lys Asp Trp Val Ser Leu Val Ala Val
                85                  90                  95
His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg
            100                 105                 110
Phe Gly Phe Gly Lys Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Gln Met Ile Asn
        115                 120                 125
Glu Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Ser Gly Asn Ala Lys Gln Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Leu Ser Val Asn Asn Asn Asn Ser Lys Ser Lys Pro Ser Gly
145                 150                 155                 160
Val Lys Ser Arg Gln Ser Glu Ser Leu Ser Lys Val Ala Lys Met Ser
                165                 170                 175
Ser Pro Pro Pro Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Ser Glu Asp
            180                 185                 190
Glu Ser Glu Asp Asp Glu Gln Gly Ala Val Cys Gly Ala Cys Gly Asp
        195                 200                 205
Asn Tyr Gly Thr Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ala Cys Glu Lys
    210                 215                 220
Trp Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His
225                 230                 235                 240
Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Thr Cys Ser Asn Lys Arg Ala Arg Pro
                245                 250                 255
<210>11
<211>250
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>11
Met Glu Gly Gly Ala Ala Leu Tyr Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Val
1               5                   10                  15
Phe Lys Asp Phe Lys Gly Arg Arg Thr Ala Ile Val Lys Ala Leu Thr
            20                  25                  30
Thr Asp Val Gln Glu Phe Tyr Gln Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn
        35                  40                  45
Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Glu Trp Glu Val Asn Leu Pro
    50                  55                  60
Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn
65                  70                  75                  80
Phe Ala Arg Asp Gly Leu Ser Glu Lys Glu Trp Leu Ser Leu Val Ala
                85                  90                  95
Ile His Ser Asp Ala Trp Leu Leu Ser Val Ser Phe Tyr Phe Gly Ser
            100                 105                 110
Arg Phe Ser Phe His Lys Glu Glu Arg Lys Arg Leu Phe Asn Met Ile
        115                 120                 125
Asn Asp Val Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Thr Gly Met Ala Lys Ala
    130                 135                 140
Lys Asp Lys Ser Ser Ala Ala Asn Gln Asn Gly Asn Lys Ser Lys Ser
145                 150                 155                 160
Asn Ser Lys Val Arg Thr Ser Glu Gly Lys Ser Ser Lys Thr Lys Gln
                165                 170                 175
Pro Lys Glu Glu Asp Glu Glu Ile Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp His
            180                 185                 190
Gly Glu Thr Leu Cys Gly Ala Cys Gly Asp Ser Asp Gly Ala Asp Glu
        195                 200                 205
Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu Lys Trp Phe His Gly Lys Cys
    210                 215                 220
Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys
225                 230                 235                 240
Pro Ser Cys Ser Asn Lys Arg Ala Arg Ala
                245                 250
<210>12
<211>246
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>12
Met Ala Ala Ala Ala Val Ser Ser Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Ile
1               5                   10                  15
Phe Lys Asp Tyr Ser Ala Arg Arg Ala Ala Leu Leu Arg Ala Leu Thr
            20                  25                  30
Lys Asp Val Asp Asp Phe Tyr Ser Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn
        35                  40                  45
Leu Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Glu Ser Trp Glu Val Asn Leu Pro
    50                  55                  60
Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn
65                  70                  75                  80
Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Arg Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala
                85                  90                  95
Val His Ser Asp Cys Trp Leu Leu Ser Val Ser Phe Tyr Phe Gly Ala
            100                 105                 110
Arg Leu Asn Arg Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu Ile Asn Asp
        115                 120                 125
Leu Pro Thr Leu Phe Asp Val Val Thr Gly Arg Lys Ala Met Lys Asp
    130                 135                 140
Asn Lys Pro Ser Ser Asp Ser Gly Ser Lys Ser Arg Asn Gly Thr Lys
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Asp Gly Gln Thr Lys Ser Ser Thr Pro Lys Leu Met Glu
                165                 170                 175
Glu Ser Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu His Gly Asp Thr Leu
            180                 185                 190
Cys Gly Ser Cys Gly Gly His Tyr Thr Asn Glu Glu Phe Trp Ile Cys
        195                 200                 205
Cys Asp Val Cys Glu Arg Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr
    210                 215                 220
Pro Ala Lys Ala Glu Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Pro Cys Cys
225                 230                 235                 240
Ala Lys Lys Gly Arg Gln
                245
<210>13
<211>241
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>13
Met Ala Ala Glu Ser Ser Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Ile Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ser Gly Phe Leu Arg Ala Leu Ser Val Asp
            20                  25                  30
Val Asp Lys Phe Tyr Ser Leu Cys Asp Pro Glu Met Glu Asn Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Tyr Gly His Pro Asn Gly Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu
    50                  55                  60
Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala
65                  70                  75                  80
Arg Asp Gly Met Gln Arg Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val His
                85                  90                  95
Ser Asp Cys Trp Leu Leu Ser Val Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Arg Leu
            100                 105                 110
Asn Arg Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu Ile Asn Asp Leu Pro
        115                 120                 125
Thr Leu Phe Glu Val Val Thr Gly Arg Lys Pro Ile Lys Asp Gly Lys
    130                 135                 140
Pro Ser Met Asp Leu Gly Ser Lys Ser Arg Asn Gly Val Lys Arg Ser
145                 150                 155                 160
Ile Glu Gly Gln Thr Lys Ser Thr Pro Lys Leu Met Glu Glu Ser Tyr
                165                 170                 175
Glu Asp Glu Asp Asp Glu His Gly Asp Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly
            180                 185                 190
Gly Asn Tyr Thr Asn Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Val Cys Glu
        195                 200                 205
Arg Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu
    210                 215                 220
Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Cys Thr Lys Lys Gly Arg
225                 230                 235                 240
Gln
<210>14
<211>255
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>14
Met Glu Ala Gly Gly Ala Tyr Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Val Phe
1               5                   10                  15
Arg Asp Phe Lys Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu Thr Thr
            20                  25                  30
Asp Val Gln Glu Phe Phe Arg Leu Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu
        35                  40                  45
Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Glu His Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala
    50                  55                  60
Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Val Leu Gly Ile Asn Phe
65                  70                  75                  80
Ala Arg Asp Gly Met Ala Glu Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val
                85                  90                  95
His Ser Asp Ala Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Phe Phe Gly Ala Arg
            100                 105                 110
Phe Gly Phe Asp Lys Ala Asp Arg Lys Arg Leu Phe Asn Met Val Asn
        115                 120                 125
Asp Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Ala Gly Thr Ala Lys Lys Gln
    130                 135                 140
Gly Lys Asp Lys Ser Ser Val Ser Asn Asn Ser Ser Asn Arg Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ser Lys Arg Gly Ser Glu Ser Arg Ala Lys Phe Ser Lys Pro
                165                 170                 175
Glu Pro Lys Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Val Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Asp Glu Gln Gly Glu Thr Gln Cys Gly Ala Cys Gly Glu Ser
        195                 200                 205
Tyr Ala Ala Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu Met Trp
    210                 215                 220
Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His Ile
225                 230                 235                 240
Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Ser Asn Lys Arg Ala Arg Ser
                245                 250                 255
<210>15
<211>241
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>15
Met Ala Ala Glu Ser Ser Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Ile Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ser Gly Phe Leu Arg Ala Leu Ser Val Asp
            20                  25                  30
Val Asp Lys Phe Tyr Ser Leu Cys Asp Pro Glu Met Glu Asn Leu Cys
        35                  40                  45
Leu Tyr Gly His Pro Asn Gly Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu
    50                  55                  60
Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala
65                  70                  75                  80
Arg Asp Gly Met Gln Arg Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val His
                85                  90                  95
Ser Asp Cys Trp Leu Leu Ser Val Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Arg Leu
            100                 105                 110
Asn Arg Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu Ile Asn Asp Leu Pro
        115                 120                 125
Thr Leu Phe Glu Val Val Thr Gly Arg Lys Pro Ile Lys Asp Gly Lys
    130                 135                 140
Pro Ser Met Asp Leu Gly Ser Lys Ser Arg Asn Gly Val Lys Arg Ser
145                 150                 155                 160
Ile Glu Gly Gln Thr Lys Ser Thr Pro Lys Leu Met Glu Glu Ser Tyr
                165                 170                 175
Glu Asp Glu Asp Asp Glu His Gly Asp Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly
            180                 185                 190
Gly Asn Tyr Thr Asn Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Val Cys Glu
        195                 200                 205
Arg Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu
    210                 215                 220
Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Cys Thr Lys Lys Gly Arg
225                 230                 235                 240
Gln
<210>16
<211>260
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>16
Met Glu Gly Gly Thr Ala His Tyr Ser Pro Arg Thr Val Glu Glu Val
1               5                   10                  15
Phe Arg Asp Phe Lys Gly Arg Arg Ala Gly Ile Ile Gln Ala Leu Thr
            20                  25                  30
Thr Asp Val Glu Asp Phe Phe Gln Gln Cys Asp Pro Glu Lys Gln Asn
        35                  40                  45
Leu Cys Leu Tyr Gly Phe Pro Asn Glu Val Trp Glu Val Asn Leu Pro
    50                  55                  60
Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn
65                  70                  75                  80
Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Glu Arg Asn Trp Leu Ser Leu Val Ala
            85                  90                  95
Val His Ser Asp Ala Trp Leu Leu Ser Val Ser Phe Tyr Phe Gly Ser
        100                 105                 110
Arg Phe Gly Phe Asp Arg Ala Asp Arg Lys Arg Leu Phe Ser Met Ile
        115                 120                 125
Asn Glu Val Pro Thr Val Tyr Glu Val Val Thr Gly Asn Ala Glu Lys
    130                 135                 140
Gln Thr Lys Glu Met Pro Ser Ser Ala Asn Gln Asn Gly Asn Arg Ser
145                 150                 155                 160
Lys Ser Asn Ser Lys Met Arg Gly Leu Glu Ser Lys Ser Ser Lys Thr
                165                 170                 175
Ile His Ala Lys Asp Glu Glu Glu Gly Leu Glu Leu Glu Glu Gly Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu His Gly Glu Thr Leu Cys Gly
        195                 200                 205
Ala Cys Gly Asp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp
    210                 215                 220
Met Cys Glu Lys Trp Phe His Gly Glu Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala
225                 230                 235                 240
Arg Ala Glu His Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Thr Cys Ser Asn Lys
                245                 250                 255
Arg Ala Arg Pro
            260
<210>17
<211>233
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>17
Met Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Phe Arg Leu Leu Asp Thr Leu Leu Cys
1               5                   10                  15
Val Leu Leu Arg Phe Asp Phe Asn Phe Trp Val Phe Val Val Ile Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Glu Ser Trp Glu Val
        35                  40                  45
Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Arg Lys Asp Trp Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Val His Ser Asp Cys Trp Leu Leu Ser Val Ser Phe Tyr
                85                  90                  95
Phe Gly Ala Arg Leu Asn Arg Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Ile Asn Asp Leu Pro Thr Leu Phe Asp Val Val Thr Gly Arg Lys Ala
        115                 120                 125
Met Lys Asp Asn Lys Pro Ser Ser Asp Ser Gly Ser Lys Ser Arg Ash
    130                 135                 140
Gly Thr Lys Arg Ser Ile Asp Gly Gln Thr Lys Ser Ser Thr Pro Lys
145                 150                 155                 160
Leu Met Glu Glu Ser Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu His Gly
                165                 170                 175
Asp Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly Gly His Tyr Thr Asn Glu Glu Phe
            180                 185                 190
Trp Ile Cys Cys Asp Val Cys Glu Arg Trp Tyr His Gly Lys Cys Val
        195                 200                 205
Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Cys Ala Lys Lys Gly Arg Gln
225                 230
<210>18
<211>271
<212>PRT
<213>稻(Oryza sativa)
<400>18
Met Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Tyr Ala Thr Arg Thr Ala Glu Glu
            20                  25                  30
Val Phe Arg Asp Leu Arg Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu
        35                  40                  45
Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Lys Leu Cys Asp Pro Glu Lys Glu
    50                  55                  60
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Ile Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
                85                  90                  95
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ala Leu Val
            100                 105                 110
Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly
        115                 120                 125
Ala Arg Phe Gly Phe Asp Arg Glu Ala Arg Arg Arg Leu Phe Asn Met
    130                 135                 140
Ile Asn Asn Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Thr Gly Ala Ala Lys
145                 150                 155                 160
Lys Gln Ala Lys Glu Lys Thr Pro Asn Ser Ser Ser Lys Ser Asn Lys
                165                 170                 175
Pro Ser Ser Lys Val Ser Lys Ala Glu Ser Arg Ser Lys Ser Lys Leu
            180                 185                 190
Ser Ala Pro Lys Asp Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp Glu Gly Glu Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp His Asp Asn Thr Leu Cys Gly Thr Cys Gly Thr Asn
    210                 215                 220
Asp Gly Lys Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Asn Cys Glu Lys Trp
225                 230                 235                 240
Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His Ile
                245                 250                 255
Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Thr Asn Lys Arg Ala Arg Ala
            260                 265                 270
<210>19
<211>272
<212>PRT
<213>稻
<400>19
Met Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Tyr Ala Thr Arg Thr Ala Glu Glu
            20                  25                  30
Val Phe Arg Asp Leu Arg Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu
        35                  40                  45
Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Lys Leu Cys Asp Pro Glu Lys Glu
    50                  55                  60
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Ile Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
                85                  90                  95
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ala Leu Val
            100                 105                 110
Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly
        115                 120                 125
Ala Arg Phe Gly Phe Asp Arg Glu Ala Arg Arg Arg Leu Phe Asn Met
    130                 135                 140
Ile Asn Asn Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Thr Gly Ala Ala Lys
145                 150                 155                 160
Lys Gln Ala Lys Glu Lys Thr Pro Asn Ser Ser Ser Lys Ser Asn Lys
                165                 170                 175
Pro Ser Ser Lys Val Gln Ser Lys Ala Glu Ser Arg Ser Lys Ser Lys
            180                 185                 190
Leu Ser Ala Pro Lys Asp Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp Glu Gly Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Glu Asp Asp His Asp Asn Thr Leu Cys Gly Thr Cys Gly Thr
    210                 215                 220
Asn Asp Gly Lys Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Asn Cys Glu Lys
225                 230                 235                 240
Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His
                245                 250                 255
Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Thr Asn Lys Arg Ala Arg Ala
            260                 265                 270
<210>20
<211>245
<212>PRT
<213>稻
<400>20
Met Ala Pro Ala Ala Gln Val Ala Ser Asn Pro Arg Thr Val Glu Asp
1               5                   10                  15
Ile Phe Lys Asp Tyr Ser Ala Arg Arg Gly Ala Leu Val Arg Ala Leu
            20                  25                  30
Thr Ser Asp Val Asp Glu Phe Phe Gly Leu Cys Asp Pro Asp Lys Glu
        35                  40                  45
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Ala Asn Gly Ser Trp Glu Val Ala Leu
     50                  55                  60
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
65                  70                  75                  80
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu Val
                85                  90                  95
Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Val Ser Val Ala Phe Phe Phe Ala
            100                 105                 110
Ala Arg Leu Asn Gly Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Asn Met Ile Asn
        115                 120                 125
Asp Leu Pro Thr Val Tyr Glu Ala Leu Val Asp Arg Lys His Val Arg
    130                 135                 140
Asp Arg Ser Gly Val Asp Ser Ser Gly Lys Ser Lys His Ser Thr Lys
145                 150                 155                 160
Arg Thr Gly Glu Gly Gln Val Lys Arg Ser Arg Val Val Ala Glu Glu
                165                 170                 175
Tyr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His Asn Glu Thr Phe Cys Gly Thr Cys
            180                 185                 190
Gly Gly Leu Tyr Asn Ala Asn Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp Ile Cys
        195                 200                 205
Glu Arg Trp Phe His Gly Lys Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala Lys Ala
    210                 215                 220
Glu His Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Ser Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Lys Lys Thr Arg Leu
                245
<210>21
<211>247
<212>PRT
<213>稻
<400>21
Met Glu Met Ala Pro Ala Ala Gln Val Ala Ser Asn Pro Arg Thr Val
1               5                   10                  15
Glu Asp Ile Phe Lys Asp Tyr Ser Ala Arg Arg Gly Ala Leu Val Arg
            20                  25                  30
Ala Leu Thr Ser Asp Val Asp Glu Phe Phe Gly Leu Cys Asp Pro Asp
        35                  40                  45
Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Ala Asn Gly Ser Trp Glu Val
    50                  55                  60
Ala Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Arg Arg Asp Trp Leu Ser
                85                  90                  95
Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Val Ser Val Ala Phe Phe
            100                 105                 110
Phe Ala Ala Arg Leu Asn Gly Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Asn Met
        115                 120                 125
Ile Asn Asp Leu Pro Thr Val Tyr Glu Ala Leu Val Asp Arg Lys His
    130                 135                 140
Val Arg Asp Arg Ser Gly Val Asp Ser Ser Gly Lys Ser Lys His Ser
145                 150                 155                 160
Thr Lys Arg Thr Gly Glu Gly Gln Val Lys Arg Ser Arg Val Val Ala
                165                 170                 175
Glu Glu Tyr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His Asn Glu Thr Phe Cys Gly
            180                 185                 190
Thr Cys Gly Gly Leu Tyr Asn Ala Asn Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp
        195                 200                 205
Ile Cys Glu Arg Trp Phe His Gly Lys Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala
    210                 215                 220
Lys Ala Glu His Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ser Ser Lys Lys Thr Arg Leu
                245
<210>22
<211>244
<212>PRT
<213>稻
<400>22
Met Glu Met Ala Ala Pro Val Ser Pro Ala Pro Arg Thr Val Glu Asp
1               5                   10                  15
Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu
            20                  25                  30
Thr Val Asp Val Asp Glu Phe Tyr Gly Phe Cys Asp Pro Glu Lys Glu
        35                  40                  45
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Gly Arg Trp Glu Val Ala Leu
    50                  55                  60
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
65                  70                  75                  80
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met His Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu Val
                85                  90                  95
Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Phe Phe Gly
            100                 105                 110
Ala Arg Leu Asn Gly Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu Ile Asn
        115                 120                 125
Asp His Pro Thr Val Leu Glu Ala Leu Ser Asp Arg Lys His Gly Arg
    130                 135                 140
Asp Asn Lys Ser Gly Ala Asp Asn Gly Ser Lys Ser Arg His Ser Gly
145                 150                 155                 160
Lys Arg Ala Asn Asp Val Gln Thr Lys Thr Ser Arg Pro Ala Val Val
                165                 170                 175
Asp Asp Gly Tyr Asp Glu Glu Glu His Ser Glu Thr Leu Cys Gly Thr
            180                 185                 190
Cys Gly Gly Arg Tyr Asn Ala Asn Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp Ile
        195                 200                 205
Cys Glu Arg Trp Phe His Gly Lys Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala Lys
    210                 215                 220
Ala Glu His Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Ser Ser Lys
225                 230                 235                 240
Lys Ser Arg Gln
<210>23
<211>369
<212>PRT
<213>稻
<400>23
Met Asp Ala Gln Tyr Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Val Phe Arg Asp
1               5                   10                  15
Phe Lys Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Val
            20                  25                  30
Glu Asp Phe Phe Arg Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu
        35                  40                  45
Tyr Gly Phe Pro Asn Glu His Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu Glu
    50                  55                  60
Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg
65                  70                  75                  80
Asp Gly Met Gln Glu Lys Asp Trp Leu Ser Met Val Ala Val His Ser
                85                  90                  95
Asp Ala Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly
            100                 105                 110
Phe Asp Lys Asn Asp Arg Lys Arg Leu Phe Gly Met Ile Asn Asp Leu
        115                 120                 125
Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Ser Gly Lys Ser Lys Ala Lys Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Ala Asn Asn His Ser Asn Ser Lys Ser Lys Ser Ser Asn Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Ser Ser Glu Pro Arg Ala Lys Gln Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro
                165                 170                 175
Pro Val Lys Asn Glu Gly Arg Glu Glu Glu Gly Gly Pro Asp Asp Glu
            180                 185                 190
Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Glu Glu His Gly
        195                 200                 205
Glu Thr Leu Cys Gly Ala Cys Gly Glu Ser Tyr Gly Ala Asp Glu Phe
    210                 215                 220
Trp Ile Cys Cys Asp Ile Cys Glu Lys Trp Phe His Gly Lys Cys Val
225                 230                 235                 240
Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro
                245                 250                 255
Ser Cys Ser Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gly Gly Val Ser Gly Asn Gly
            260                 265                 270
Lys Gln Leu Lys Ile Cys Ser Thr Lys Arg Glu Ala Ile Ile Ser Gln
        275                 280                 285
Tyr Leu Val Arg Asp Glu Arg Ser Lys Asn Thr Ser Thr His Ala Arg
    290                 295                 300
Ser Pro Leu Ile Ser Asp Asn Pro Tyr Glu Val Ile Ser Asp Ile Arg
305                 310                 315                 320
Ile Met Leu Ala Glu Gln Tyr Thr Thr Asn Ala Arg Glu Asp Asp Phe
                325                 330                 335
Asp Ala Lys Pro Asn Asp Lys Asp Asn Gln Gly Glu Gly Asn Val Ala
            340                 345                 350
Trp Gly Gly Ile Asn Lys Glu Leu Tyr Ser Leu Gln Val Thr Ile Gln
        355                 360                 365
Asn
<210>24
<211>273
<212>PRT
<213>稻
<400>24
Met Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ser Gly Gly Gly Ala Pro Tyr Ala Thr Arg Thr Ala Glu Glu
            20                  25                  30
Val Phe Arg Asp Leu Arg Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu
        35                  40                  45
Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Lys Leu Cys Asp Pro Trp Lys Arg
    50                  55                  60
Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Ile Pro Glu Pro Ala Leu Gly
                85                  90                  95
Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ala Leu
            100                 105                 110
Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr Phe
        115                 120                 125
Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Arg Glu Ala Arg Arg Arg Leu Phe Asn
    130                 135                 140
Met Ile Asn Asn Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Thr Gly Ala Ala
145                 150                 155                 160
Lys Lys Gln Ala Lys Glu Lys Thr Pro Asn Ser Ser Ser Lys Ser Asn
                165                 170                 175
Lys Pro Ser Ser Lys Val Gln Ser Lys Ala Glu Ser Arg Ser Lys Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Ser Ala Pro Lys Asp Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp Glu Gly
        195                 200                 205
Glu Glu Glu Glu Asp Asp His Asp Asn Thr Leu Cys Gly Thr Cys Gly
    210                 215                 220
Thr Asn Asp Gly Lys Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Asn Cys Glu
225                 230                 235                 240
Lys Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu
                245                 250                 255
His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Thr Asn Lys Arg Thr Arg
            260                 265                 270
Ala
<210>25
<211>173
<212>PRT
<213>稻
<400>25
Met Glu Met Ala Ala Pro Val Ser Pro Ala Pro Arg Thr Val Glu Asp
1               5                   10                  15
Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu
            20                  25                  30
Thr Val Asp Val Asp Glu Phe Tyr Gly Phe Cys Asp Pro Glu Lys Glu
        35                  40                  45
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Gly Arg Trp Glu Val Ala Leu
    50                  55                  60
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
65                  70                  75                  80
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met His Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu Val
                85                  90                  95
Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Phe Phe Gly
            100                 105                 110
Ala Arg Leu Asn Gly Asn Glu Ser Arg Val Leu Asn Cys Glu Val Leu
        115                 120                 125
Pro Ser Val Leu Ser Cys Ala Ser Phe Val Leu His Lys Glu Leu Asn
    130                 135                 140
Gln Ser Gln Asn Leu Tyr Tyr Hi s Tyr Val Met Gly Ser Ile Ile Cys
145                 150                 155                 160
Ser Leu Ser Val Cys Leu Cys Cys Phe His Val Cys Leu
                165                 170
<210>26
<211>256
<212>PRT
<213>稻
<400>26
Met Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Val Thr Ile Val His Asp Ala Arg Ser
1               5                   10                  15
Pro Glu Asp Val Phe Gln Asp Phe Cys Gly Arg Arg Ser Gly Ile Val
            20                  25                  30
Lys Ala Leu Thr Ile Glu Val Glu Lys Phe Tyr Lys Gln Cys Asp Pro
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Gly Thr Trp Ala
    50                  55                  60
Val Thr Leu Pro Ala Asp Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Glu Lys Asp Trp Leu
                85                  90                  95
Ser Leu Ile Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe
            100                 105                 110
Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Lys Ala Arg Glu Arg Leu
        115                 120                 125
Phe Met Met Thr Ser Ser Leu Pro Thr Val Phe Glu Val Val Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Val Asn Thr Gln Ser Lys Thr Ala Asn Gly Ser Ser Lys Asn Lys
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Lys Pro Pro Lys Arg Pro Asn Ser Asp Ser Lys Pro Gln
                165                 170                 175
Lys Gln Val Gln Ala Lys Tyr Glu Glu Glu Asn Gly Gly Arg Gly Asn
            180                 185                 190
Gly Gly Asp Glu Asp Gln Ala Glu Thr Ile Cys Gly Ala Cys Gly Glu
        195                 200                 205
Ala Tyr Ala Asn Gly Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ile Cys Glu Thr
    210                 215                 220
Trp Phe His Gly Lys Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His
225                 230                 235                 240
Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Gly Cys Ser Asn Lys Arg Thr Arg Glu
                245                 250                 255
<210>27
<211>256
<212>PRT
<213>玉米
<400>27
Met Asn Gly Gly Gly Ser Gly Leu Ala Pro Asn Ala Ala His Thr Ala
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Phe Arg Asp Tyr Lys Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys
            20                  25                  30
Ala Leu Thr Thr Asp Val Glu Arg Phe Phe Lys Leu Cys Asp Pro Glu
        35                  40                  45
Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Pro Asp Glu Thr Trp Glu Val
    50                  55                  60
Thr Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Ile Pro Glu Pro Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ala
                85                  90                  95
Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr
            100                 105                 110
Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Arg Glu Thr Arg Arg Arg Leu Phe
        115                 120                 125
Ser Leu Ile Asn Asn Met Pro Thr Ile Phe Glu Val Val Thr Gly Ala
    130                 135                 140
Ala Lys Lys Gln Ala Lys Glu Lys Thr Pro Asn Ser Ser Ser Lys Ser
145                 150                 155                 160
Asn Arg Pro Ser Ser Lys Val Gln Ser Arg Ala Glu Ser Arg Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Lys Val Pro Gln Asp Glu Glu Glu Ser Gly Asp Asp Asp Glu Asp
            180                 185                 190
Glu Glu Ala Asp Glu His Asn Asn Thr Leu Cys Gly Thr Cys Gly Thr
        195                 200                 205
Asn Asp Ser Lys Asp Gln Phe Trp Ile Cys Cys Asp Asn Cys Glu Lys
    210                 215                 220
Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His
225                 230                 235                 240
Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Thr Asn Lys Arg Ala Arg Ala
                245                 250                 255
<210>28
<211>257
<212>PRT
<213>紫花苜蓿(Medicago sativum)
<400>28
Met Glu Gly Met Ala Gln His Pro Val Pro Arg Thr Val Glu Glu Val
1               5                   10                  15
Phe Ser Asp Tyr Lys Gly Arg Arg Ala Gly Leu Ile Lys Ala Leu Thr
            20                  25                  30
Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Gln Leu Val Asp Pro Glu Lys Glu Asn
        35                  40                  45
Leu Cys Leu Tyr Gly Phe Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro
    50                  55                  60
Val Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn
65                  70                  75                  80
Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Glu Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala
                85                  90                  95
Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala
            100                 105                 110
Arg Phe Gly Phe Gly Lys Asn Asp Arg Lys Arg Leu Phe Gln Met Ile
        115                 120                 125
Asn Asp Leu Pro Thr Val Phe Glu Leu Ala Thr Gly Thr Ala Lys Gln
    130                 135                 140
Ser Lys Asp Gln Leu Thr Ala His Asn Asn Gly Ser Asn Ser Lys Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Ser Ser Gly Lys Ser Arg Gln Ser Glu Ser Gln Thr Lys Gly Val
                165                 170                 175
Lys Met Ser Ala Pro Val Lys Glu Glu Val Asp Ser Gly Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Asp Asp Asp Glu Gln Gly Ala Thr Cys Gly Ala Cys Gly Asp
        195                 200                 205
Asn Tyr Gly Thr Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Met Cys Glu Lys
    210                 215                 220
Trp Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His
225                 230                 235                 240
Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Gly Cys Ser Ile Lys Lys Pro Arg Ile
                245                 250                 255
Gly
<210>29
<211>251
<212>PRT
<213>玉米
<400>29
Met Asp Met Ala Pro Ala Ser Val Tyr Phe Asn Pro Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Glu Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala
            20                  25                  30
Leu Thr Ser Asp Val Asp Asp Phe Cys Ser Leu Cys Asp Pro Asp Lys
        35                  40                  45
Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Gly Ser Trp Glu Val Ser
    50                  55                  60
Pro Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly
65                  70                  75                  80
Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Arg Arg Asp Trp Leu Thr Leu
                85                  90                  95
Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Ile Ser Val Ala Phe Phe Tyr
            100                 105                 110
Gly Ala Arg Leu Asn Gly Asn Asp Arg Lys Arg Leu Phe Ser Met Met
        115                 120                 125
Ser Asp Leu Pro Ser Val Leu Glu Ala Phe Ala Asp Arg Lys His Gly
    130                 135                 140
Arg Asp Arg Ser Gly Val Asp Ser Ser Gly Lys Ser Arg His Ser Ser
145                 150                 155                 160
Lys Arg Gly Lys Asp Gly His Ala Lys Ser Phe Arg Ala Ala Ala Pro
                165                 170                 175
Ala Ala Lys Glu Tyr Asp Glu Asp Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu
            180                 185                 190
His Thr Glu Thr Phe Cys Gly Ser Cys Gly Gly Leu Tyr Asn Ala Ser
        195                 200                 205
Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp Ile Cys Glu Arg Trp Phe His Gly Lys
    210                 215                 220
Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala Lys Ala Asp His Ile Lys His Tyr Lys
225                 230                 235                 240
Cys Pro Asp Cys Ser Ser Lys Lys Met Arg Gln
                245                 250
<210>30
<211>245
<212>PRT
<213>玉米
<400>30
Met Asp Gly Gly Ala Gly Phe Pro Gly Thr Pro Val Pro Arg Ser Pro
1               5                   10                  15
Glu Asp Val Phe Arg Asp Tyr Arg Ala Arg Gln Ala Gly Leu Ile Arg
            20                  25                  30
Ala Leu Thr Thr Glu Lys Asp Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn
        35                  40                  45
Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu
    50                  55                  60
Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu
65                  70                  75                  80
Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Met
                85                  90                  95
Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ser
            100                 105                 110
Arg Lys Arg Leu Phe Thr Met Ile Asn Asn Leu Pro Ser Ile Tyr Glu
        115                 120                 125
Val Val Thr Gly Thr Ala Lys Lys Glu Ser Lys Glu Lys Thr Pro Lys
    130                 135                 140
Ser Ser Asn Lys Thr Asn Lys Ser Gly Ser Lys Pro Ser Arg Gln Val
145                 150                 155                 160
Glu Pro Asn Ser Arg Val Pro Lys Met Pro Pro Pro Lys Asp Glu Glu
                165                 170                 175
Ser Glu Gly Glu Glu Gly Glu Pro Gln Glu Asp His Glu Ser Ala Leu
            180                 185                 190
Cys Gly Ala Cys Gly Leu Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ile Cys Cys Asp
        195                 200                 205
Leu Cys Glu Thr Trp Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Asn
    210                 215                 220
Lys Ala Glu His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Thr Gly Ser
225                 230                 235                 240
Lys Arg Ala Lys Ala
    245
<210>31
<211>256
<212>PRT
<213>玉米
<400>3l
Met Asp Pro Gly Ala Gly Ala His Tyr Ser Ala Arg Thr Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Val Phe Arg Asp Phe Arg Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu
            20                  25                  30
Thr Asn Asp Val Glu Lys Phe Tyr Gln Leu Cys Asp Pro Glu Lys Glu
        35                  40                  45
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Thr Leu
    50                  55                  60
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Ile Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
65                  70                  75                  80
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Asp Lys Asp Trp Leu Ala Leu Val
                85                  90                  95
Ala Val His Ser Asp Ala Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Tyr Phe Ala
            100                 105                 110
Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ala Arg Arg Arg Leu Phe Asn Met
        115                 120                 125
Ile Asn Asn Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Ala Thr Gly Val Ala Lys
    130                 135                 140
Lys Gln Asn Lys Glu Lys Glu Pro Asn Ser Thr Ser Lys Ser Asn Lys
145                 150                 155                 160
Pro Ser Ser Lys Met Thr Thr Arg Pro Glu Ser His Leu Lys Ala Thr
                165                 170                 175
Lys Val Ala Pro Pro Lys Asp Glu Asp Asp Glu Ser Gly Glu Glu Tyr
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Glu Val Arg Asp Asn Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly Thr
        195                 200                 205
Asn Asp Gly Lys Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ser Cys Glu Arg
    210                 215                 220
Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His
225                 230                 235                 240
Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Asn Lys Arg Ala Arg Ala
                245                 250                 255
<210>32
<211>256
<212>PRT
<213>玉米
<400>32
Met Asp Gly Gly Ala Gly Phe Pro Gly Thr Pro Val Pro Arg Ser Pro
1               5                   10                  15
Glu Asp Val Phe Arg Asp Tyr Arg Ala Arg Gln Ala Gly Leu Ile Arg
            20                  25                  30
Ala Leu Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Val Met Cys Asp Pro Glu
        35                  40                  45
Lys Asp Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val
    50                  55                  60
Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ser
                85                  90                  95
Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Met Ser Val Ala Phe Tyr
            100                 105                 110
Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ser Arg Lys Arg Leu Phe
        115                 120                 125
Thr Met Ile Asn Asn Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Val Val Thr Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Lys Lys Glu Ser Lys Glu Lys Thr Pro Lys Ser Ser Asn Lys Thr
145                 150                 155                 160
Asn Lys Ser Gly Ser Lys Pro Ser Arg Gln Val Glu Pro Asn Ser Arg
                165                 170                 175
Val Pro Lys Met Pro Pro Pro Lys Asp Glu Glu Ser Glu Gly Glu Glu
            180                 185                 190
Gly Glu Pro Gln Glu Asp His Glu Ser Ala Leu Cys Gly Ala Cys Gly
        195                 200                 205
Leu Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu Thr Trp
    210                 215                 220
Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Asn Lys Ala Glu His Ile
225                 230                 235                 240
Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Thr Gly Ser Lys Arg Ala Lys Ala
                245                 250                 255
<210>33
<211>256
<212>PRT
<213>玉米
<400>33
Met Asp Pro Gly Ala Gly Ala His Tyr Ser Ala Arg Thr Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Val Phe Arg Asp Phe Arg Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu
            20                  25                  30
Thr Asn Asp Val Glu Lys Phe Tyr Gln Leu Cys Asp Pro Glu Lys Glu
        35                  40                  45
Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Thr Leu
    50                  55                  60
Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Ile Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile
65                  70                  75                  80
Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Glu Lys Asp Trp Leu Ala Leu Val
                85                  90                  95
Ala Val His Ser Asp Ala Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Tyr Phe Ala
            100                 105                 110
Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ala Arg Arg Arg Leu Phe Asn Met
        115                 120                 125
Ile Asn Asn Leu Pro Thr Ile Phe Glu Val Ala Thr Gly Val Ala Lys
    130                 135                 140
Lys Gln Asn Lys Glu Lys Glu Pro Asn Asn Thr Ser Lys Ser Asn Lys
145                 150                 155                 160
Pro Ser Ser Lys Met Thr Thr Arg Pro Glu Ser His Leu Lys Ala Thr
                165                 170                 175
Lys Val Ala Pro Pro Lys Asp Glu Asp Asp Glu Ser Gly Glu Glu Tyr
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Glu Glu Arg Asp Asn Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly Thr
        195                 200                 205
Asn Asp Gly Lys Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ser Cys Glu Arg
    210                 215                 220
Trp Tyr His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His
225                 230                 235                 240
Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Asn Lys Arg Ala Arg Ala
                245                 250                 255
<210>34
<211>164
<212>PRT
<213>玉米
<400>34
Met Asp Met Ala Pro Ala Ala Val Ser Ser Asn Pro Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Glu Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala
            20                  25                  30
Leu Thr Ser Asp Val Asp Asp Phe Cys Ser Phe Cys Asp Pro Asp Lys
        35                  40                  45
Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Gly Ser Trp Glu Val Ser
    50                  55                  60
Pro Pro Ala Asp Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly
65                  70                  75                  80
Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu
                85                  90                  95
Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Ile Ser Val Ala Phe Phe Tyr
            100                 105                 110
Gly Ala Arg Leu Asn Ala Asn Asp Arg Lys Arg Leu Phe Ser Met Ile
        115                 120                 125
Ser Asp Leu Pro Ser Val Phe Glu Ala Phe Ala Asp Arg Lys His Val
    130                 135                 140
Arg Asp Arg Ser Gly Val Asp Ser Ser Gly Lys Ser Arg His Ser Ser
145                 150                 155                 160
Lys Val Pro His
<210>35
<211>262
<212>PRT
<213>玉米
<400>35
Met Asp Ser Gly Tyr Asn Pro Arg Thr Val Glu Glu Val Phe Arg Asp
1               5                   10                  15
Phe Lys Gly Arg Arg Ala Gly Ile Ile Arg Ala Leu Thr Thr Asp Ala
            20                  25                  30
Glu Asp Phe Phe Lys Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu
        35                  40                  45
Tyr Gly Phe Pro Asn Glu Ser Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu Glu
    50                  55                  60
Val Pro Pro Asp Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg
65                  70                  75                  80
Asp Gly Met Gln Glu Lys Glu Trp Leu Ser Met Val Ala Ala His Ser
                85                  90                  95
Asp Ala Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly
            100                 105                 110
Phe Asn Lys Asn Asp Arg Lys Arg Leu Tyr Ser Leu Ile Asp Asp Leu
        115                 120                 125
Pro Met Ala Phe Glu Ile Val Ser Gly Lys Ser Glu Thr Lys Ala Pro
    130                 135                 140
Ala Pro Pro Ser Ser Ser Asn His Ser Asn Ile Lys Pro Lys Ser Asn
145                 150                 155                 160
Asn Lys Lys Lys Pro Pro Glu Pro Lys Val Lys Gln Pro Lys Pro Arg
                165                 170                 175
Ala Pro Ala Glu Glu Gly Glu Glu Glu Asp Gly Ser Ala Ser Glu Gly
            180                 185                 190
Glu His Gly Glu Thr Leu Cys Gly Ala Cys Lys Glu Ser Tyr Gly Pro
        195                 200                 205
Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu Lys Trp Phe His Gly
    210                 215                 220
Lys Cys Val Lys Ile Thr Ala Ala Lys Ala Glu His Ile Lys Gln Tyr
225                 230                 235                 240
Lys Cys Pro Ser Cys Thr Gly Gly Gly Gly Val Ser Asn Ser Gly Thr
                245                 250                 255
Lys Arg Ala Arg Pro Ser
            260
<210>36
<211>254
<212>PRT
<213>玉米
<400>36
Met Asp Gly Gly Gly Thr His Arg Thr Pro Glu Asp Val Phe Arg Asp
1               5                   10                  15
Phe Arg Ala Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu Thr Thr Asp Val
            20                  25                  30
Glu Lys Phe Tyr Gln Gln Cys Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu
        35                  40                  45
Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu Glu
    50                  55                  60
Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg
65                  70                  75                  80
Asp Gly Met Asp Glu Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val His Ser
                85                  90                  95
Asp Ala Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly
            100                 105                 110
Phe Asp Lys Glu Ser Arg Lys Arg Leu Phe Val Met Ile Asn Asn Leu
        115                 120                 125
Pro Thr Ile Tyr Glu Val Val Thr Gly Thr Ala Lys Lys Gln Thr Lys
    130                 135                 140
Glu Lys Thr Pro Lys Ser Ser Ser Lys Ser Asn Lys Ala Gly Pro Lys
145                 150                 155                 160
Pro Pro Arg Gln Pro Glu Pro Asn Ser Arg Gly Ser Lys Met Pro Pro
                165                 170                 175
Pro Lys Asp Glu Asp Asp Ser Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Asp His Glu Asn Thr Leu Cys Gly Ser Cys Gly Asp Asn Tyr Gly Gln
        195                 200                 205
Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ala Cys Glu Thr Trp Phe His Gly
    210                 215                 220
Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu His Ile Lys His Tyr
225                 230                 235                 240
Lys Cys Pro Asn Cys Ser Gly Ser Gly Lys Arg Ala Arg Ala
                245                 250
<210>37
<211>258
<212>PRT
<213>玉米
<400>37
Met Asp Gly Gly Ala Gly Phe Pro Gly Thr Gln Pro Val Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
Pro Glu Asp Val Phe Arg Asp Tyr Arg Ala Arg Gln Ala Gly Leu Ile
            20                  25                  30
Arg Ala Leu Thr Thr Asp Val Glu Lys Phe Tyr Val Met Cys Asp Pro
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Leu Pro Asn Glu Thr Trp Glu
    50                  55                  60
Ile Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asp Glu Lys Asp Trp Leu
                85                  90                  95
Ser Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Met Ser Val Ala Phe
            100                 105                 110
Tyr Phe Gly Ala Arg Phe Gly Phe Asp Lys Glu Ser Arg Lys Arg Leu
        115                 120                 125
Phe Thr Met Ile Asn Asn Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Val Val Thr Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Lys Lys Glu Pro Lys Glu Lys Thr Pro Lys Ser Asn Ile Lys
145                 150                 155                 160
Thr Asn Lys Ser Gly Ser Lys Pro Ser Arg His Ala Glu Gln Pro Asn
                165                 170                 175
Ser Arg Val Pro Lys Met Pro Pro Pro Lys Asp Glu Glu Ser Glu Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Gly Glu Pro Gln Glu Asp Gln Glu Ser Ala Leu Cys Gly Ala
        195                 200                 205
Cys Gly Leu Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ile Cys Cys Asp Leu Cys Glu
    210                 215                 220
Thr Trp Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Asp
225                 230                 235                 240
His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Ser Cys Thr Gly Ser Lys Arg Ala
                245                 250                 255
Lys Val
<210>38
<211>73
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有的PEPAL结构域
<220>
<221>未确定
<222>(6)..(6)
<223>未知的氨基酸
<220>
<221>未确定
<222>(14)..(14)
<223>未知的氨基酸
<400>38
Cys Asp Pro Glu Lys Xaa Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Xaa Pro Asn
1               5                   10                  15
Glu Thr Trp Glu Val Asn Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu
            20                  25                  30
Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Glu
        35                  40                  45
Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu
    50                  55                  60
Ser Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala Arg
65                  70
<210>39
<211>47
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有的PHDF结构域
<220>
<221>未确定
<222>(6)..(7)
<223>未知的氨基酸
<220>
<221>未确定
<222>(10)..(10)
<223>未知的氨基酸
<220>
<221>未确定
<222>(46)..(46)
<223>未知的氨基酸
<400>39
Cys Gly Ala Cys Gly Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Asp Glu Phe Trp Ile Cys
1               5                   10                  15
Cys Asp Ile Cys Glu Lys Trp Phe His Gly Lys Cys Val Lys Ile Thr
            20                  25                  30
Pro Ala Lys Ala Glu His Ile Lys Gln Tyr Lys Cys Pro Xaa Cys
        35                  40                  45

Claims (17)

1.分离的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、3、5或7中所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：1、3、5或7具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性的多肽；
(d)包含SEQ ID NO：1、3、5或7的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列；和，
(e)编码与SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性的多肽。
2.表达盒，其包含权利要求1的多核苷酸。
3.权利要求2的表达盒，其中所述的多核苷酸与驱动在植物中表达的启动子有效连接，优选地其中所述的多核苷酸与组成型启动子有效连接。
4.植物，其包含权利要求2或权利要求3的表达盒，优选地其中所述的植物是单子叶植物，进一步优选地其中所述的单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
5.权利要求4的植物，其中所述的植物具有选自以下的多肽提高的水平：
(a)包含SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列的多肽；
(b)与SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述的多肽具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性；和
(c)包含SEQ ID NO：38中所示PEPAL结构域的多肽。
6.权利要求4或5的植物，其中所述的植物具有选自以下的表型：
(a)提高的总种子数；
(b)提高的总种子重量；
(c)提高的收获指数；和
(d)增加的根生物量。
7.提高植物中多肽水平的方法，所述方法包括将权利要求3或权利要求4的表达盒导入所述的植物。
8.权利要求7的方法，其中植物的产量提高。
9.权利要求7或8的方法，其中提高所述多肽的水平在植物中产生选自以下的表型：
(a)提高的总种子数；
(b)提高的总种子重量；
(c)提高的收获指数；和
(d)增加的根生物量。
10.权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述的表达盒稳定地整合到植物的基因组中，优选地其中所述的植物是单子叶植物，进一步优选地其中所述的单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
11.提高植物中产量的方法，所述方法包括增加ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽在所述植物中的表达，其中所述的ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽具有ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a蛋白活性并且选自以下多肽：
(a)包含与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：38中所示PEPAL结构域的多肽；和，
(c)包含SEQ ID NO：38中所示PEPAL结构域和SEQ ID NO：39中所示PHD-指结构域的多肽。
12.权利要求11的方法，其中所述的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或其中所述的多肽包含SEQ ID NO：2、4、6或8中所示的氨基酸序列。
13.权利要求7至12中任一项所述的方法，所述方法包括将表达盒导入所述的植物，所述的表达盒包含与驱动在植物细胞中表达的启动子有效连接的编码所述ZmALF1、ZmALF2b、ZmALF3或ZmALF4a多肽的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1、3、5或7中所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO：1、3、5或7中所示序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
(d)编码包含SEQ ID NO：2、4、6或8中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和，
(e)编码与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
14.权利要求13的方法，所述方法包括：
(a)用所述表达盒转化植物细胞；和
(b)从步骤(a)的经转化植物细胞再生出转化的植物。
15.权利要求13或权利要求14的方法，其中所述的表达盒稳定地并入植物的序列中。
16.权利要求13的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
17.分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
(a)包含SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列；
(b)包含与SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述的多肽具有调节转录的能力；和，
(c)包含SEQ ID NO：2、4、6或8的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述的多肽保留调节转录的能力。
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