JP2004527201A - アルフィン１の発現、ならびに根の生長および根の特定の遺伝子活性化の増大したトランスジェニック植物を生産する方法 - Google Patents
アルフィン１の発現、ならびに根の生長および根の特定の遺伝子活性化の増大したトランスジェニック植物を生産する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】アルフィン１ｃＤＮＡはムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ）中で塩耐性と関連する推定上の転写因子をコード化する。組換え蛋白は、塩誘発性遺伝子ＭｓＰＲＰ２のプロモーターフラグメントを含む配列特異的にＤＮＡと結合する。
【解決手段】アルフィン１を過剰発現するカルスはベクター形質転換対照よりも１７１ｍＭのＮａＣｌによる生長阻害に対して更に抵抗性が高く、一方アルフィン１アンチセンスを発現するカルスは塩阻害に更に感受的であった。センス方位でアルフィン１を過剰発現するトランスジェニック植物はよく生長した。これとは対照的にアンチセンストランスジェニック植物は土壌では生長が悪く、これはアルフィン１発現が正常の植物発達に必須であることを示す。アルフィン１を過剰発現するトランスジェニックカルスと植物根は、高められたレベルの内在性ＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡ蓄積を示した。しかしながら、ＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡ蓄積はまた、アルフィン１を過剰発現するトランスジェニック体の葉で示されるように組織特異的に調節された。これらの結果はまたアルフィン１が、ムラサキウマゴヤシでのＭｓＰＲＰ２発現と植物での転写調節剤として作用することを示唆する。トランスジェニック体を過剰発現するアルフィン１は我々の塩耐性植物の１つと比較可能な塩耐性を示し、これはアルフィン１もまた塩耐性での遺伝子調節に機能することを示している。
【解決手段】アルフィン１を過剰発現するカルスはベクター形質転換対照よりも１７１ｍＭのＮａＣｌによる生長阻害に対して更に抵抗性が高く、一方アルフィン１アンチセンスを発現するカルスは塩阻害に更に感受的であった。センス方位でアルフィン１を過剰発現するトランスジェニック植物はよく生長した。これとは対照的にアンチセンストランスジェニック植物は土壌では生長が悪く、これはアルフィン１発現が正常の植物発達に必須であることを示す。アルフィン１を過剰発現するトランスジェニックカルスと植物根は、高められたレベルの内在性ＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡ蓄積を示した。しかしながら、ＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡ蓄積はまた、アルフィン１を過剰発現するトランスジェニック体の葉で示されるように組織特異的に調節された。これらの結果はまたアルフィン１が、ムラサキウマゴヤシでのＭｓＰＲＰ２発現と植物での転写調節剤として作用することを示唆する。トランスジェニック体を過剰発現するアルフィン１は我々の塩耐性植物の１つと比較可能な塩耐性を示し、これはアルフィン１もまた塩耐性での遺伝子調節に機能することを示している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は増大した根の生産、増大した根特異的な遺伝子および一般生長をもつトランスジェニック植物の生産のためのアルフィン（Ａｌｆｉｎ）１遺伝子の使用に関するものである。アルフィン１によって調節されるＭｓＰＲＰ２遺伝子（アルフィン１ＤＮＡ結合部位を含有）からの根に特異的なプロモーターおよびアルフィン１導入遺伝子を用いたトランスジェニック植物の予期せぬ成長力について詳しく説明する。
【０００２】
【背景技術】
植物の根は、土壌から水や栄養素を蓄積し、植物全体の最適な生長と発達のために必要な成分を提供するための器官である。植物の根はまた、全体としての植物の収穫に貢献する特別の機能を行なっており、根または塊茎作物の場合は本質的な植物の収穫を構成するものである。根の生長と発達については総説がある（次を参照：Ａｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．「根の発達の遺伝的および分子的基礎」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，４５，２５−４５；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｍａｓｕｃｃｉ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｈ．「根の形成：根の発達におけるパターン化と形態生成」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９，１９９７，１０８９−１０９８）。根の分裂組織の維持と増殖的生長は細胞サイクル調節によって定められ、サイクリン発現または例えばエチレンやオーキシンのような植物ホルモンは根の生長を高めることができる（次を参照：Ｂｏｅｒｊａｎ，Ｗ．，Ｃｅｒｖｅｒａ，Ｍ−Ｔ．，Ｄｅｌａｒｕｅ，Ｍ．，Ｂｅｅｃｋｍａｎ，Ｔ．，Ｄｅｗｉｔｔｅ，Ｗｌ，Ｂｅｌｌｉｎｉ，Ｃ．，Ｃａｂｏｃｈｅ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｏｎｃｋｅｌｅｎ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．ａｎｄ Ｉｎｚｅ，Ｄ．「シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における劣勢突然変異の超根（ｓｕｐｅｒｒｏｏｔ）はオーキシンの過剰生産をもたらす」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，７，１９９５，１４０５−１４１９）。更なる調節因子もまた新規な根の生長に必要とみられる。
【０００３】
根の環境条件との遭遇は植物の生産性を決定し、そしてよく発達した根のシステムは栄養素と水の摂取のために機能して顕著な植物の収穫を決定する。根の機能は、非生物的や生物的な環境ストレスと同様に土壌の栄養素組成物や毒物によって著しく影響を受ける。すなわち、継続した根の生長による若枝の生長阻害は、水のストレスまたは塩のストレスへの形態学的適応と考えられてきた（次を参照：Ｃｒｅｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｓｏｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｂｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｔ，Ｊ．Ｅ．，「水の欠乏とアブシジン酸は、大豆の苗木における根の生長と若枝の阻害の相違をひきおこす」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０，９２，２０５−２１４）。増大した根の塊はまた金属毒性において重要な防衛的役割を果たすであろう。何故ならば若枝の広がりや収穫の減少は、根の生長と栄養素の蓄積の阻害からの二次的なものであるからである（次を参照：Ｌａｒｓｅｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｋｏｃｈｉａｎ，Ｌ．Ｖ．ａｎｄ Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．，「Ａｌは、Ａｌ感受性のシロイヌナズナ突然変異体であるａｌｓ３における根の発達および根の生長の双方を阻害する」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９７，１１４，１２０７−１２１４）。すなわち改良された根の生長と発達は植物全体の生産性を高め、そして植物における操作のために望ましい特徴のようである。
【０００４】
今回の成果は、栽培中における塩耐性細胞の選択後の植物の再生を含む、塩耐性の細胞と植物で異なって調節された遺伝子の同定化（次を参照：Ｗｉｎｉｖｏｃ，Ｉ．ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．，「農作物における塩耐性：組織培養と遺伝子調節による新しいアプローチ」Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１９９７，１９，４３５−４４９）を併せたところの、改良された塩耐性の農作物を開発する初期の努力の発展したものである（次を参照：Ｗｉｎｃｏｖ，Ｉ．「塩耐性細胞系から再生した塩耐性ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）植物の特性化」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９１，１０，５６１−５６４；Ｗｉｎｉｖｏｃ，Ｉ．「塩耐性細胞系から再生したイネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ Ｌ．）植物の特性化」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９６，１１３，１０５−１１１）。トランスジェニック植物が、原核生物または植物における塩／早魃ストレスにより上方調節されたとして知られている多くの他の研究所において構築された（次を参照：Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｂｕｌｏｗ，Ｌ．「遺伝子転移による植物内での改良されたストレス耐性」Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１９９８，３，６１−６５）。しかしながら、植物が改良された長期間の塩耐性を獲得でき生産性を維持できる分子メカニズムは未だ理解されておらず、多くの遺伝子の調節を含むものであろう（次を参照：Ｗｉｎｎｉｖｏｃ，Ｉ．「農作物における改良された塩耐性への新規な分子的なアプローチ」Ａｎｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，１９９８，８２，７０３−７１０）。これは塩耐性は定性的な特徴であると考えられてきたからである（次を参照：Ｆｏｏｌａｄ Ｍ．Ｒ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ａ．「特徴に基礎をおくマーカー分析を用いてのトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｃｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）での塩耐性遺伝子のマッピング」Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３，８７，１８４−１９２）。特定の方法で他の遺伝子の発現に影響可能な調節遺伝子の同定は、植物の生長を操作するためのみならず、種々の生物的や非生物的環境ストレス条件への耐性を向上させるのにも特に有用である。
【０００５】
【発明の開示】
塩耐性ムラサキウマゴヤシ細胞中で高められたり植物全体でｍＲＮＡレベルで塩導入された色んな遺伝子転写産物がクローン化されてきた。今回の開示は、２つの特に興味ある新規な単離物に焦点をあてるものである。その１つは推定上の亜鉛フィンガー調節蛋白をコード化するアルフィン１である（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．「塩耐性ムラサキウマゴヤシから推定上の亜鉛フィンガーモチーフをコード化するｃＤＮＡ」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３，１０２，６８１−６８２）。もう１つは、細胞壁と膜の間のリンカー分子として作用できる疎水性のシステインの豊富なカルボキシ末端でプロリンの豊富な蛋白をコード化する単純コピー遺伝子のＭｓＰＲＰ２である（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｄｅｕｔｃｈ，Ｃ．Ｅ．，「塩誘発可能な根特異性の転写産物を同定する塩耐性ムラサキウマゴヤシ細胞からのｃＤＮＡクローンの特性化」Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９４，１４４，２２２−２２８；Ｄｅｕｔｃｈ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．「推定上のキメラプロリンの豊富な細胞壁蛋白をコード化する塩誘導性ムラサキウマゴヤシ遺伝子の後転写調節」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，２７，４１１−４１８）。興味あることは、これら遺伝子の双方がまず根において発現され、そしてＭｓＰＲＰ２が８７又は１７１ｍＭのＮａＣｌにおいて植物の継続した生長に対して強力に塩誘発可能なことである。アルフィン１はムラサキウマゴヤシのゲノムにある特異的な遺伝子であり、イネやシロイヌナズナのような種々の植物に保存されているようである（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．「農作物における塩耐性：組織栽培と遺伝子調節による新しいアプローチ」Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１９９７，１９，４３５−４４９；Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．「転写因子 Ａｌｆｉｎ １のトランスジェニックな過剰発現はムラサキウマゴヤシの内在性ＭｓＰＲＰ２遺伝子の発現を高め植物の塩耐性を改良する」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９，（印刷中）。
【０００６】
従って、本発明の主たる目的は、増大された根の生産と一般的生長をもつトランスジェニック植物の生産を高めることである。
【０００７】
本発明の他の目的は、植物全体の収穫を高めるためにＭｓＰＲＰ２遺伝子（これはアルフィン１によって影響をうける）からの根特異性プロモーターおよびアルフィン１導入遺伝子を用いてトランスジェニック稙物の活性を高めることである。
【０００８】
これらの及びこれ以降に示すようなそれ以外の目的は、以下の例示的実施態様の詳細な記載から、特に幾つもの観点を通じて数字で示した部分がある添付の図面と併せて読むことにより容易に認識されるような、著しく予期不能の形で本発明によって容易に満たされているであろう。
【０００９】
【発明の最良の実施態様】
アルフィン１ｃＤＮＡは分化スクリーニングによってクローン化されたので、植物の根における増強調節因子としてのアルフィン１の機能は知られておらず、示されなければならない。アルフィン１ｃＤＮＡ配列と演繹アミノ酸配列の示されている図１を参照のこと。推定上の亜鉛フィンガーから成るＣｙｓおよびＨｉｓ残基には下線をつけてある。破線は蛋白の強酸性領域を示している。もしアルフィン１が根に特異的な調節における転写因子として作用しているのであれば、蛋白のＤＮＡ結合が予期されるであろう。配列特異的なＤＮＡ結合をテストするために、アルフィン１融合蛋白のためのｐＥＴ−２９の概略表示を示している図１Ｂに示した構築からの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の中で、まず組換えアルフィン１を発現させた。アミノ酸配列の上の行はベクターのビオチン化トロンビン切断部位およびＳ−Ｔａｇを示す。下のアルフィン１配列は、構築の中で欠失した９つのＮ−末端アミノ酸を太線で示し、関連するＣｙｓ４とＨｉｓ／Ｃｙｓ３残基で陰性に荷電された領域と推定上の亜鉛結合ドメインを下線つきで示す。アフィニティー精製した組換え蛋白は、蛋白のアミノ末端領域を配列するアミノ酸によって標準的なアルフィン１蛋白であることが示された。この配列は、以下の表１に示すようにクローン化されたｃＤＮＡから予測される配列と同等であった。
【００１０】
【表１】
【００１１】
組換えアルフィン１蛋白は精製され、そしてアミノ酸配列はＢａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｅｔｈｅ，Ｖ．Ｖ．ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ（１９９８）「アルフィン１、塩誘導可能ＭｓＰＲＰ２遺伝子内のプロモーター要素と結合するムラサキウマゴヤシ根の中の新規な亜鉛フィンガー蛋白」Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．３８，１１２３−１１３５に記載のようにしてトロンビン切断蛋白から決定した。数字は開始メチオニンから予測されるアミノ酸の位置を示す。
【００１２】
アルフィン１蛋白で認識されるＤＮＡ配列を同定するために、精製したアルフィン１蛋白を“ランダムＤＮＡ結合”アッセイ（次を参照：ＲａｕｓｃｈｅｒＩＩＩ Ｆ．Ｊ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｔｏｕｒｎａｙ，Ｏ．Ｅ．，Ｃｏｏｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．「Ｗｉｌｍの腫瘍遺伝子座亜鉛フィンガー蛋白のＥＦＲ−１共通配列との結合」Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２５０，１２５９−１２６２）で使用し、結合したＤＮＡをＲＣＲ増幅と結合を４回行なって精製し、そして単離配列のクローニングを行なった。単離されたクローン（図２）の配列分析は、ＧＴＧＧＮＧまたはＧＮＧＧＴＧである高度親和性の結合クローンでの共通配列を示し、これはアルフィン１が正に遺伝子調節で増幅的に機能できる特定のＤＮＡ結合因子であることを確認するものである。図２において、［Ａ］は結合物質のＰＣＲ増幅と共に４回のゲルシフト分析後に単離したアルフィン１と結合した個々のクローンから整列された共通配列を示し、［Ｂ］はインビトロでアルフィン１蛋白と結合する３つのＭｓＰＲＰ２プロモーターフラグメント中に見出されるアルフィン１蛋白結合配列のＰＣＲ増幅によるクローンと類似の配列要素を示す。
【００１３】
アルフィン１はその発現パターンで強力な根特異性を示すことが見出された。従ってＤＮＡ結合蛋白としては、それは根特異的遺伝子発現のための調節剤であろう。ムラサキウマゴヤシからの１５５２ｂｐの根特異的で塩誘発的ＭｓＰＲＰ２プロモーター（図３）からの３つのフラグメント（次を参照：Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９８，既述）は組替えアルフィン１蛋白とインビトロで結合することが見出され、一方では類似のサイズの対照ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ結合を示さなかった。ＭｓＰＲＰ２プロモーターの１５５２ｂｐのＤＮＡ配列を図３に示す。（下線で示したものは＋１における翻訳開始部位；ＴＡＴＡＡおよびＣＡＡＴ配列；組換えアルフィン１とのＤＮＡ結合実験のためのフラグメント１、２および３の単離に用いたＴｆｉｌ切断部位；明細書で説明したｍｙｃおよびｍｙｂ転写因子と同様のアルフィン１のための蛋白結合部位。［＊］は潜在的な結合部位が相補的ＤＮＡ鎖上に見出されることを示す。このヌクレオチド配列データは、アメリカ合衆国によって運営されている国際的遺伝学情報データベースであるＧｅｎＢａｎｋにより寄託番号ＡＦ０２８８４１が与えられている。ＭｓＰＲＰ２プロモーターフラグメントとの結合は特異的であり、ＥＤＴＡによって阻害され、組換えアルフィン１蛋白濃度に依存的であり、そして各々のフラグメントについて異なる親和性を示した。各々のフラグメントのＤＮＡ配列は、図２に示すランダムオリゴヌクレオチド選択で同定されたアルフィン１蛋白のための種々のＧの豊富な共通結合配列を含んでおり、ゲルシフト分析で観察される結合を説明できるものである。この発見と根でのアルフィン１およびＭｓＰＲＰ２発現ならびに塩によるＭｓＰＲＰ２誘発性との相関関係は、アルフィン１が我々の塩耐性植物での遺伝子発現と根の維持において役割を演じているという我々の仮説を指示し、そして強力な根の生長と発達におけるアルフィン１の潜在的な役割を示唆するものであった。
【００１４】
ＭｓＰＲＰ２発現はムラサキウマゴヤシでは根特異的でないので、新規に特性化されたプロモーターは、潜在的な根特異的ＤＮＡ配列要素の同定のために有用である。多くの根特異的な遺伝子が同定されており、また幾つもの領域がレポーター遺伝子の根特異的発現のための配列を含んでいることが示されているが（上記のＡｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照）、現在のところ根特異的発現を特定化する共通配列は同定されていない。９０ｂｐのトランケートされたカリフラワーのモザイクイウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターは、ＡＳＦ１因子と相互作用するｃｉｓ−調節要素（ＴＧＡＣＧ）を含んでいることが示されている（次を参照：Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｆ．，Ｌａｍ，Ｅ．ａｎｄ Ｃｈｕａ，Ｎ−Ｈ．「核因子 ＣＲＥＢと相同性のある２つのタバコＤＮＡ−結合蛋白」Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０，７２７−７３０）が、その他の根特異的遺伝子プロモーターは明らかにこの配列を含んでいない。ＭｓＰＲＰ２プロモーターは−１０３３の位置に１つの５′ＣＧＴＣＡ３′配列（ＡＳＦ１結合要素のＴＧＡＣＧの逆）を含んでいるが、ＴｏＢＲ７遺伝子調節に関連する根特異的要素を含んでいない（次を参照：Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｇ．，Ａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｎ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ−Ｌ ａｎｄ Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．「タバコにおける ｃｉｓ−作動配列調節根特異的遺伝子発現」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９１，３，３７１−３８２）。したがってアルフィン１結合部位が、根で発現する遺伝子のプロモーター配列での共通要素を表わすかどうかを決定する必要がある。根および塩ストレスで発現する遺伝子からのプロモーター領域でのアルフィン１結合配列の限定されたリストを以下の表２に示す。これによればこれらのプロモーターの全てがアルフィン１結合配列の若干の変動を含んでいることを示す。根特異的であるＣａＭＶ３５Ｓ最少プロモーター（−９５がら−５１まで）（次を参照：Ｌａｍ，Ｅ．，Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．，Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｆａｎ，Ｒ−Ｘ．ａｎｄ Ｃｈｕａ，Ｎ−Ｈ．「部位特異的変異はインビボ因子結合を変化し、トランスジェニック植物でのプロモーター発現パターンを変える」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，ＵＳＡ ９８６，７８９０−７８９４）は非コード化鎖上でアルフィン１結合部位を含んでいる。表２に示す植物の種は様々であり単子葉植物と双子葉植物の両方を含んでいる。これらの結果は、アルフィン１配列は広く保存されているという我々の観察と一致している。ＴｏＲＢ７、ＡｂＰＲＰＰ１およびＰｈｙＡプロモーターの場合、アルフィン１結合配列は、根発現に必要な欠失実験で同定した領域に位置している（次を参照：Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｇ．，Ａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ−Ｌ．，ａｎｄ Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．（１９９１）「タバコにおけるｃｉｓ−作動配列調節根特異的遺伝子発現」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３，３７１−３８２）。幾つものアルフィン１結合配列が、オーキシンまたは銅やカドミウムのような重金属で誘発されるグルタチオンｓトランスフェラーゼ根特異的遺伝子と同様に他の塩／旱魃誘発性転写因子Ａｔｍｙｂ２のプロモーターの中に見出されている。アルフィン１結合部位はまた、ジャガイモやトウモロコシの中の異なった遺伝子クラスからのシュクロース合成酵素プロモーターの中に豊富にある。塊茎発現パタチンＩ多重遺伝子族のすべてのプロモーターは、保存されたアルフィン１結合部位を含んでいる。
【００１５】
【表２】
【００１６】
＊：本質的に同一の配列がＰＡＴ２１、ＰＳ３およびＰＳ２７において同じ順序で、ならびにＰＳ７において少し低い程度で見出される。パラチンクラスＩＩ遺伝子はこの形式をもっておらず、非コード鎖上に類似の配列をもつ。
【００１７】
選択は、少なくとも２つの近接トリプレットに基づくコード鎖について行なわれ、インビトロアルフィン１結合で定義されるようにそのうち１つはＧＴＧであり他の１つはＧが境となっている（Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９８，既述）。更なる部位がこれら遺伝子のプロモーターの多くのものに非コード鎖上で見出された。括弧の中の数字はＧｅｎＢａｎｋの寄託番号を示す。
【００１８】
Ａｄａｍ，Ｅ．，Ｋｏｚｍａ−Ｂｏｇｎａｒ，Ｌ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｎａｇｙ，Ｆ．（１９９５）．タバコのフィトクロームＡ遺伝子は複数の開始部位で始まり、複数のｃｉｓ−作用調製要素を必要とする。Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，９８３−９９３。
【００１９】
Ｍｉｇｎｅｒｙ，Ｇ．Ａ．，Ｐｉｋａａｒｄ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９８８）ジャガイモのパタチン多重遺伝子族の分子特性化。Ｇｅｎｅ ６２，２７−４４。
【００２０】
Ｓａｔｏ，Ｆ．，Ｋｉｔｊｉｍａ，Ｓ．，Ｋｏｙａｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｙ．（１９９６）タバコＰＲ−５の中性イソ型であるオスモチン様蛋白のエチレン誘発遺伝子発現はＡＧＣＣＧＣＣ ｃｉｓ−配列によって仲介される。Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，２４９−２５５。
【００２１】
Ｗｅｒｒ，Ｗ．，Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．−Ｂ．，Ｍａａｓ，Ｃ．ａｎｄ Ｓｔａｒｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．（１９８５）。Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．の染色体９上のシュクロース合成酵素遺伝子の構造。ＥＭＢＯ Ｊ．４，１３７３−１３８０。
【００２２】
これらの結果は、アルフィン１蛋白は広布根（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｒｏｏｔ）特異的転写因子であり得ること、広範な様々な環境下での遺伝子調節に関与していること、ならびに種々の生長条件下での栄養素摂取、生物的や無生物的ストレスに対する抵抗および植物収穫の一般的な増加の目的のための根の生長を高めるために用いることができることを示している。アルフィン１は植物、特に植物根における遺伝子発現のための本質的な転写因子であると信じられており、そしてアルフィン１結合配列機能はこれらのプロモーターで制御される遺伝子発現のアルフィン１蛋白調節の遺伝子プロモーターとして機能しかつこれらの遺伝子からのｍＲＮＡ蓄積を高めるようにするものと期待されている。これらの予測は、アルフィン１を過剰発現するトランスジェニック植物でテストされた。
【００２３】
ムラサキウマゴヤシにおける内在性遺伝子に対するアルフィン１の過剰発現および過少発現の効果をテストするために、センスおよびアンチセンス方位でクローン化し、図４に示すような構築でムラサキウマゴヤシの葉円盤（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）または未熟の子房へ形質転換した。（次を参照。Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．（１９９９）転写因子アルフィン１のトランスジェニックな過剰発現はムラサキウマゴヤジの内在性ＭｓＰＲＰ２遺伝子の発現を高め、植物の塩耐性を改良する。Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）。
【００２４】
組換えプラスミド構築
全長コードアルフィン１クローン（ｐＡ５０）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のアルフィン１ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０７２９１）の９０４ｂｐのフラグメントから成る。それは３０ｂｐの５′非翻訳リーダー、完全な７７１ｂｐのコード領域、および翻訳終末コドンを含む１０３ｂｐの３′非翻訳領域を含んでいる（Ｗｉｎｉｃｏｖ １９９３，既述）。このｃＤＮＡフラグメントは、図４に示すようにバイナリー発現ベクターｐＧＡ６４３の多重クローニング部位中においてセンスおよびアンチセンス方位でクローン化された。
【００２５】
センス構築を生成するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−からの９３９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ フラグメントを先ずＰＦ−ｐＡ５０として示すようにｐＦＬＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）へサブクローニングしてｐＧＡ６４３中のｃＤＮＡフラグメントをクローン化するのに適した制限部位を得た。次いでアルフィン１ｃＤＮＡを含有するＰＦ−ｐＡ５０からの９５７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターへの多重クローニング部位（ＭＣＳ）３′中のｐＧＡ６４３と連結させてｐＧＡ−センスを得た。このクローンは完全なアルフィン１コード化転写物を与えるものと予測されるが、内在性のアルフィン１とは異なって、ｍＲＮＡはその３′ＵＴＲ中のベクターから付加的な配列を担持するようである。
【００２６】
アンチセンス構築（ｐＧＡ−ＡＴＳ）化生成するために、ｐＡ５０（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−）からの９４４ｂｐのＣａｌＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＧＡ６４３ＭＣＳ部位へ直接連結させた。もう１つのＣｌａＩ部位はｐＧＡ６４３ではＭＣＳの上流にあると報告されているが、我々は図４に示すＭＣＳ内のＣｌａＩ部位のみが酵素で切断されることを見出した。
【００３７】
プラスミド、ｐＧＡ−センス、ｐＧＡ−ＡＴＳ（アンチセンス）およびｐＧＡ６４３（ベクター）はテトラサイクリンの存在下でＭＣ１０００株の大腸菌中で増殖した。冷凍−解凍方法を、組換えバイナリープラスミドでのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ ４４０４の形質転換に用いた。形質転換コロニーを１２ｍｇ／ｌのリファンピシンと６ｋｇ／ｌのテトラサイクリンで選別した。組換え形質転換コロニーは、ｐＡ５０からのアルフィン１ ６７０ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントを用いるコロニーハイブリダイゼーションで同定した。
【００３８】
植物形質転換
ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｒｅｇｅｎ Ｓ）の塩感受性野生型親植物＃１（Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９１，既述）の葉を２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）と２ｍｇ／ｌのカイネチンを含むＳＨ生育培地においてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ共培養で形質転換させ（次を参照：Ｓｃｈｅｎｋ，Ｒ．Ｕ．ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ａ．Ｃ．単子葉植物と双子葉植物の細胞培養の誘発と生長のための培地と技術）、室温で３０から６０分間５０μＭのアセトシリンゴン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で補足した。１つの成功的な形質転換は、ｐＧＡ−ＡＴＳを担持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、塩耐性ムラサキウマゴヤシＩＷ＃９（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１，既述）からの未熟の子房との共培養で行なわれた。カルス培地で２から６日後に、エクスプラントを選択培地（３００ｍｇ／ｌのカルベニシリンと１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足したＳＨ培地）へ移し、そして３−４週間培養した。抵抗性のカルスを月基準で選択培地で継代培養した。植物は、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足したＳＨ培地（ホルモンなし）で形質転換カルスから再生された。はっきりわかる若枝と根をもった植物をピートモスに、次いで土壌に移した。
【００２９】
以下の表３に示すように、センス構築で形質転換したカルス培養物は１７ｍＭのＮａＣｌで改良された生長を示し、アンチセンス構築で形質転換したカルス培養物は同じ濃度のＮａＣｌには更に感受的でありた。しかしながら何れの形質転換体も、連続点灯下での通常のＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２，既述）培地ではよく生育することができた。これらの結果は、我々の塩耐性カルスは、細胞がＮａＣｌで生長したときの僅かに増大した定常状態のｍＲＮＡレベルでの核ランオン実験で測定したアルフィン１転写の増大を示すという我々の以前の観察と一致するものである（次を参照：Ｗｉｎｉｖｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｍ．「塩耐性ムラサキウマゴヤシ細胞中の遺伝子の転写および転写後活性化」Ｐｌａｎｔａ，１９９６，２００，３９７−４０４）。
【００３０】
【表３】
【００３１】
植物の発達におけるアルフィン１の役割は、植物がトランスジェニックカルスから再生されたときに一層明白となった。アルフィン１発現は根の生産に必要とみられる。何故ならばカルスを発現しているアルフィン１は若枝を再生したけれども根の生産には不足しており、最低の根の生産が得られた少数の植物は土壌中では数週間以上は生存しなかった。これとは対照的に、センス構築物は全ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下にあり根と葉の両方で導入遺伝子を発現するという事実にも係わらず、ベクターのみを含むカルスまたはセンス構築物は、生育良好な植物、花および所定の種子を再生した。図５は、１）センス方位にアルフィン１を発現した２つの大きな植物：２）数週間のあいだ土壌で生存した唯一の小さなアンチセンス植物；および３）再生培地における数ヶ月後の根の少ないアンチセンス植物の写真を集めたものである。これらの結果から、アルフィン１発現は根の発達と植物の生長に必須であり、アルフィン１蛋白は広布根特異的転写因子であるとの確信を支持することが明らかである。
【００３２】
我々の組換えアルフィン１でのＤＮＡ結合実験はＭｓＰＲＰ２プロモーターとの特異的な結合を示したので、ＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡレベルをアルフィン１を過剰発現するトランスジェニックカルスと植物で測定した（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，１９９９，既述）。トランスジェニックなカルスと植物根においては、アルフィン１過剰発現は図６Ａおよび６Ｃに示すように増大したレベルのＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡを伴なっていた。なお図においてカルスのデータは次のものを示す。レーン１および２：±１７１ｍＭのＮａＣｌで４週間生長した非形質転換塩耐性カルスから単離したＲＮＡ。レーン３：非形質転換塩感受性カルスから単離したＲＮＡ。レーン４：ｐＧＡベクターで形質転換した塩感受性カルスから単離したＲＮＡ。レーン５−８：アルフィン１構築物で形質転換した塩感受性カルスから単離したＲＮＡ；ここでＳ１、Ｓ２、Ｓ４およびＳ６は独立に形質転換した系である。レーン９：１７１ｍＭのＮａＣｌ内で生長したＳ２形質転換カルスから単離したＲＮＡ。各々のレーンは１０μｇの全ＲＮＡを含んでいる。
【００３３】
各々のブロットは次のプローブで逐次的にハイブリッド化した。アルフィン１、大きなＥｃｏＲＩフラグメント（図１）；ＭｓＰＲＰ２、カルボキシ末端および３′非翻訳領域フラグメント（Ｗｉｎｉｃｏｖ ａｎｄ Ｄｅｕｔｃｈ，１９９４、既述）、Ｍｓｃ２７、構築的に発現したムラサキウマゴヤシ遺伝子のフラグメント。アルフィン１センス構築で形質転換した各々の細胞系において、アルフィン１過剰発現は、増大したレベルのＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡを伴なう。
【００３４】
図６Ｂは、アルフィン１で形質転換した植物はアルフィン１ｍＲＮＡの中のＰＧＡ−ベクターのタグでモニターした導入遺伝子を発現することを示す。
【００３５】
図６Ｃは、根と葉でのアルフィン１とＭｓＰＲＰ発現を示す。全ＲＮＡは、同じ植物の根と葉から単離された。＃１は対照の塩感受性植物であり、ＩＶはエンプティーベクター形質転換植物であり、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３はアルフィン１センス構築物で形質転換され形質転換カルスから再生された植物である。＃９は塩耐性の対照植物である。各々のブロットは次のプローブで逐次的にハイブリッド化された。アルフィン１、大きなＥｃｏＲＩフラグメント（図１）；ＭｓＰＲＰ２、カルボキシ末端および３′非翻訳領域フラグメント；Ｍｓｃ２７、各々のレーンの負荷をモニターするために構築的に発現したムラサキウマゴヤシ遺伝子のフラグメント。各々のレーンは全ＲＮＡを１０μｇ含有している これらの結果は、アルフィン１のＭｓＰＲＰ２転写活性化における役割と同じく、内在性のＭｓＰＲＰ２遺伝子からのｍＲＮＡ蓄積の増大したレベルをもたらす事を示している。しかしながら、この転写活性化は根に特異的ではない。何故ならば、同じトランスジェニック植物からの葉は、ＭｓＰＲＰ２転写物に付随しての増大なしにアルフィン１ｍＲＮＡレベルの増大を示し、これはアルフィン１とＭｓＰＲＰ２転写活性化のために根に存在する他の遺伝子産物との間の相互作用を暗示するものである。図１Ｂに示すように、アルフィン１は仮定の亜鉛フィンガー領域から丁度上流に極めて酸性のドメインを含んでいるので、アルフィン１はまたＤＮＡとの結合において付加的な因子と相互作用することができる。興味あることには、図３に示すＭｓＰＲＰ２プロモーター配列は多くのｍｙｃおよびｍｙｂ認識部位を含んでおり、そのうちの幾つかはアルフィン１結合部位と極めて近接したところにあって、シロイヌナズナのｍｙｃとｍｙｂで既に示されている（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ、１９９７、既述）ようなものと類似したこれらの転写因子との相互作用の可能性を示唆している。
【００３６】
ここで得られた結果は、根の発達と根特異的な遺伝子発現におけるアルフィン１の中心的役割を支持している。更なる実験は、正常およびストレス条件下での高められた根の生長におけるアルフィン１の過剰発現の役割を支持している。テスト条件下で比較した植物は、形質転換実験に用いた葉をもつ塩感受性の親植物の＃１、ベクター単独で形質転換したトランスジェニック体、および高いレベルのアルフィン１を発現するトランスジェニック体を含んでいる。対照もまた、アンチセンス構築物で形質転換したとき根を発達できないような塩耐性植物の＃９を含んでいる。根の生長とアルフィン１過剰発現トランスジェニック植物の塩耐性の測定のために、根のある切断物をＰｅｒｌｉｔｅ（Ｐａｘｌｉｔｅ，Ｐｘ Ｃｏ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）の中で容器内で上記植物から定着させ、毎日潅水して養い、塩の蓄積があればそれを洗い出し、次いで（Ｗｉｎｉｃｏｖ、１９９１、既述）に記載のようにして１／４強度のホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）溶液で充分に潅水した。４週間後の植物の根と若枝の生長の測定（ｃｍ長さ）および全重量（グラム）の予備的な結果は我々の理論を確認した。下記の表４に示すように、根の発達におけるアルフィン１の仮定した役割が予測したように、アルフィン１で形質転換した植物は高い根の生長（対照の親植物の４３８％）を示す。現在の実験はこれらの測定を、トランスジェニック植物を含むその他の個々の再生アルフィン１へと拡張した。
【００３７】
【表４】
ａ：全ての測定値は、一定の時間のあいだの生長後の個々の植物の複製切断物のＭ±ＳＤで表わした。アルフィン１、アルフィン２、アルフィン３は、異なった形質転換から再生した３つの異なった植物である。温室内での平均の昼間の温度は実験２のほうが温かかった。
ｂ：これは１７１ｍＭのＮａＣｌで組織培養し既述（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１、既述）のようにして再生したものから選択した塩耐性植物である。
【００３８】
上述の植物の切断物での比較のための根の生長実験もまた、温室条件下で同じサイズのポットを使い規則的な潅水スケジュールで土壌で行なった。生長率はｐｅｒｌｉｔｅと土壌とでは異なっているが、種々のテスト植物と対照との間の根と若枝の生長の相対比率は実質的に同一を保っていた。
【００３９】
改良された根の発達をもっているアルフィン１を過剰発現するトランスジェニック植物もまた改良された塩耐性を示すことと考えられた。塩耐性は既述のようにして測定した（次を参照：Ｖｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．「塩耐性細胞系から再生した塩耐性のムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）植物の特性化」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９１，１０，５６１−５６４）。植物は上記のような容器で定着させ、短く摘み、そして２つのグループに分けた、なお、各々のグループには各個々の再生直物の少なくとも５つのレプリカ切断物があるようにした。グループＩ（対照、すなわち０％のＮａＣｌ）は、上記のように水と１／４強度のホーグランド溶液で処理した。グループＩＩは、０．５％またはそれより多いＮａＣｌを含むホーグランド溶液で処理した。耐性は、処理後の各グループでのレプリカ植物の数に対する生存数として表わした。植物の生長は、各実験の最後で生存している植物の若枝を採取することによって定量し、そして各グループの植物に対する平均の全若枝の新鮮な重量として計算した。この値は、与えられた塩の条件下でのテスト期間を通じての質量の正味の増大を表わしている。
【００４０】
正常条件下におけるアルフィン１過剰発現植物の増大した根の生長と更に強い若枝の生長が期待されたが、塩ストレステストは、組織特異的な調節条件下でのアルフィン１過剰発現の塩耐性能力を正確に予測できないようである。３５Ｓプロモーター下でアルフィン１を過剰発現する我々の今回のトランスジェニック植物は、葉においてこの遺伝子産物を不適当に発現し、それはストレス条件下ではこの遺伝子産物の不適当な存在によって逆影響されるようである。しかしながら、アルフィン１の組織特異的な調節は、この潜在的な問題を覆すように思われる。すなわち、アルフィン１過剰発現トランスジェニック体の高められた生物的および非生物的抵抗の正確な評価は、アルフィン１発現が根特異的プロモーターの管理下でもっと厳しいところの新規なトランスジェニック体の構築によって改良されるようである。図３に示すＭｓＰＲＰ２プロモーターである上記のプロモーターは、根特異的なアルフィン１導入遺伝子の構築のためにそして根への直接的で付加的なアルフィン１発現へとクローン化されている。本質的には、図４に示すセンスおよびアンチセンス構築物のための３５Ｓプロモーターは、ＭｓＰＲＰ２の１５ｂｐプロモーターで置き換えられ、そして既述のようにして形質転換が繰り返される。我々の現在のテストで示されるように、このプロモーターはまたアルフィン１蛋白と結合するので、これらの根特異的なアルフィン１トランスジュニック体は、現在得られた結果で示される３５Ｓプロモーター下のアルフィン１センストランスジェニック体よりも良好に遂行すると考えられる。
【００４１】
アルフィン１ｃＤＮＡ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物の創製は、既に述べたようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換プロトコール又は植物分子生物学で普通に用いられているその他の方法たとえば電気穿孔、浸透、プロトプラストにおけるポリエチレングリコール仲介遺伝子移動、リポソーム仲介移動もしくは粒子衝撃によって達成することができる（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｒ．Ａ．，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９８）。
【００４２】
アルフィン１導入遺伝子は、既述のようにＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの管理下にあり得る。更に、アルフィン１導入遺伝子は、アルフィン１蛋白を過剰発現するトランスジェニック植物の創製のための新規なアルフィン１発現ベクターを構築するために、図４に記載したアルフィン１センス構築物とプロモーター領域の適当な限定部位を用いて、１５００ｂｐのＭｓＰＲＰ２プロモーター図３（Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅ ａｎｄ Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９８，既述）の全部または一部分の管理下におくことができる。
【００４３】
ＭｓＰＲＰ２プロモーターの全部または一部の配列（Ｂａｓｔｒｏｌａ，Ｐｅｔｈｅ ａｎｄ Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９８，既述）はまた、それ自身であるいは他のプロモーター配列要素と共に、（限定酵素で切断した特定のＤＮＡフラグメントを再連結する通常の分子生物学的技術を用いて）植物の中へ移動させた他の遺伝子へ根特異的及び／又はアルフィン１蛋白制限発現を与える新規な複合プロモーター限定配列を構築するために用いることができる。
【００４４】
アルフィン１蛋白結合配列（Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅ ａｎｄ Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９８，既述）はまた、それ自身で、コンカテマーとして、または他のプロモーター配列要素と共に、（限定酵素で切断した特定のＤＮＡフラグメントを再連結する通常の分子生物学的技術を用いて）植物の中へ移動させた他の遺伝子へ根特異的及び／又はアルフィン１蛋白制限発現を与える新規な複合プロモーター限定配列を構築するために用いることができる
【００４５】
適当なプロモーター状況でのアルフィン１結合部位の導入は、アルフィン１による付加的な遺伝子の調節をもたらす事ができると考えられる。
【００４６】
さらに、植物の根でのアルフィン１（又はその類似体）発現または機能との如何なる化合物または分子による如何なる分子干渉も、植物の根の発達や植物の生長を阻害し、従って除草剤として効果的に作用すると考えられる。
【００４７】
最後に、アルフィン１を過剰発現する植物による増大した根の生長は、塩条件下での植物の生存を増大させ、親植物やエンプティベクターで形質転換した植物がここに示すように最低の若芽の収穫を生じる条件下で生長を提供し続ける。以下の表５Ａ、５Ｂ、６および７を参照。
【００４８】
【表５Ａ】
ａ：全ての測定は個々の植物の複製切断物のＭ±ＳＤとして表わす。根のついた切断物（根のサイズは凡そ１ｃｍ）をＰｅｒｌｉｔｅを入れた容器に移植し１／４強度のホーグランド溶液で６日間潅水した。第７日から第２０日まで、１７１ｍＭのＮａＣｌを含むホーグランド溶液で潅水を続けた。表２に示すように第１１日から第２０日までに若枝の死滅が発生した。すべての根は第２０日に測定した。
ｂ：これは１７１ｍＭのＮａＣｌで組織培養し既述（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１、既述）のようにして再生したものから選択した塩耐性植物である。
【００４９】
【表５Ｂ】
ａ：全ての測定は個々の植物の複製切断物のＭ±ＳＤとして表わす。根のついた切断物（根のサイズは凡そ１ｃｍ）をＰｅｒｌｉｔｅを入れた容器に移植し１／４強度のホーグランド溶液で６日間潅水した。第７日から第２０日まで、１７１ｍＭのＮａＣｌを含むホーグランド溶液で潅水を続けた。表２に示すように第１１日から第２０日までに若枝の死滅が発生した。すべての根は第２０日に測定した。
ｂ：これは１７１ｍＭのＮａＣｌで組織培養し既述（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１、既述）のようにして再生したものから選択した塩耐性植物である。
【００５０】
【表６】
ａ：各々の植物からの根のついた複数の切断物をＰｅｒｌｉｔｅの入った容器で６週間定着させ、１／４強度のホーグランド溶液で生長させた。次いですべての若枝は樹冠まで剪定した。その点から１２８ｍＭ（０．７５％）のＮａＣｌを補充した１／４強度のホーグランド溶液で生長を継続させた。新しく再成長した若枝を採取し１７日後に計量した。重量はグラム（Ｍ±ＳＤ）である。
ｂ：親植物＃１からの組織培養での選別後に再生成した塩耐性植物（Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９１，既述）
【００５１】
アルフィン１を過剰発現する植物が、テスト条件下での短い収穫において親植物やエンプティベクターで形質転換した植物よりも優れていることを示す更なるテスト。これは、それらの高められた根の発達と一致していた。
【００５２】
結果を以下の表７に示す。
【００５３】
【表７】
ａ：各々の植物からの根のついた複数の切断物をＰｅｒｌｉｔｅの入った容器で６週間定着させ、１／４強度のホーグランド溶液で生長させた。次いですべての若枝は樹冠まで剪定した。その点から１／４強度のホーグランド溶液で生長を継続させた。新しく再成長した若枝を採取し１７日後に計量した。重量はグラム（Ｍ±ＳＤ）である
ｂ：親植物＃１からの組織培養での選別後に再生成した塩耐性植物（Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９１，既述）
【００５４】
以上から、本発明の新規で有用な実施態様がここに記載され説明されており、それが著しく予期できない方法で前述の目的のすべてを充足していることは容易に明らかである。この開示をみた当業者が容易に想起する修飾、変更および適応は、ここに記載の特許請求の範囲の領域によってのみ限定をうける本発明の精神の中にあると意図されている事は当然理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】アルフィン１ｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０７２９１）。
【図１Ｂ】大腸菌でのアルフィン１融合蛋白の発現。
【図２】インビトロでアルフィン１と結合するＤＮＡ配列。
【図３】Ｍ．ｓａｔｉｖａでのＭｓＰＲＰ２ゲノム領域（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０２８８４１）。
【図４】ムラサキウマゴヤシの形質転換に用いられたアルフィン１のセンスおよびアンチセンス構築物の模式的表現。
【図５】アルフィン１のセンスおよびアンチセンス形質転換細胞系から再生成したムラサキウマゴヤシ。
【図６】アルフィン１センス形質転換体からのトランスジェニックなカルスと植物でのアルフィン１およびＭｓＰＲＰ２発現のノーザンブロット分析。
【発明の属する技術分野】
この発明は増大した根の生産、増大した根特異的な遺伝子および一般生長をもつトランスジェニック植物の生産のためのアルフィン（Ａｌｆｉｎ）１遺伝子の使用に関するものである。アルフィン１によって調節されるＭｓＰＲＰ２遺伝子（アルフィン１ＤＮＡ結合部位を含有）からの根に特異的なプロモーターおよびアルフィン１導入遺伝子を用いたトランスジェニック植物の予期せぬ成長力について詳しく説明する。
【０００２】
【背景技術】
植物の根は、土壌から水や栄養素を蓄積し、植物全体の最適な生長と発達のために必要な成分を提供するための器官である。植物の根はまた、全体としての植物の収穫に貢献する特別の機能を行なっており、根または塊茎作物の場合は本質的な植物の収穫を構成するものである。根の生長と発達については総説がある（次を参照：Ａｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．「根の発達の遺伝的および分子的基礎」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，４５，２５−４５；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｍａｓｕｃｃｉ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｈ．「根の形成：根の発達におけるパターン化と形態生成」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９，１９９７，１０８９−１０９８）。根の分裂組織の維持と増殖的生長は細胞サイクル調節によって定められ、サイクリン発現または例えばエチレンやオーキシンのような植物ホルモンは根の生長を高めることができる（次を参照：Ｂｏｅｒｊａｎ，Ｗ．，Ｃｅｒｖｅｒａ，Ｍ−Ｔ．，Ｄｅｌａｒｕｅ，Ｍ．，Ｂｅｅｃｋｍａｎ，Ｔ．，Ｄｅｗｉｔｔｅ，Ｗｌ，Ｂｅｌｌｉｎｉ，Ｃ．，Ｃａｂｏｃｈｅ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｏｎｃｋｅｌｅｎ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．ａｎｄ Ｉｎｚｅ，Ｄ．「シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における劣勢突然変異の超根（ｓｕｐｅｒｒｏｏｔ）はオーキシンの過剰生産をもたらす」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，７，１９９５，１４０５−１４１９）。更なる調節因子もまた新規な根の生長に必要とみられる。
【０００３】
根の環境条件との遭遇は植物の生産性を決定し、そしてよく発達した根のシステムは栄養素と水の摂取のために機能して顕著な植物の収穫を決定する。根の機能は、非生物的や生物的な環境ストレスと同様に土壌の栄養素組成物や毒物によって著しく影響を受ける。すなわち、継続した根の生長による若枝の生長阻害は、水のストレスまたは塩のストレスへの形態学的適応と考えられてきた（次を参照：Ｃｒｅｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｓｏｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｂｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｔ，Ｊ．Ｅ．，「水の欠乏とアブシジン酸は、大豆の苗木における根の生長と若枝の阻害の相違をひきおこす」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０，９２，２０５−２１４）。増大した根の塊はまた金属毒性において重要な防衛的役割を果たすであろう。何故ならば若枝の広がりや収穫の減少は、根の生長と栄養素の蓄積の阻害からの二次的なものであるからである（次を参照：Ｌａｒｓｅｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｋｏｃｈｉａｎ，Ｌ．Ｖ．ａｎｄ Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．，「Ａｌは、Ａｌ感受性のシロイヌナズナ突然変異体であるａｌｓ３における根の発達および根の生長の双方を阻害する」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９７，１１４，１２０７−１２１４）。すなわち改良された根の生長と発達は植物全体の生産性を高め、そして植物における操作のために望ましい特徴のようである。
【０００４】
今回の成果は、栽培中における塩耐性細胞の選択後の植物の再生を含む、塩耐性の細胞と植物で異なって調節された遺伝子の同定化（次を参照：Ｗｉｎｉｖｏｃ，Ｉ．ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．，「農作物における塩耐性：組織培養と遺伝子調節による新しいアプローチ」Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１９９７，１９，４３５−４４９）を併せたところの、改良された塩耐性の農作物を開発する初期の努力の発展したものである（次を参照：Ｗｉｎｃｏｖ，Ｉ．「塩耐性細胞系から再生した塩耐性ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）植物の特性化」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９１，１０，５６１−５６４；Ｗｉｎｉｖｏｃ，Ｉ．「塩耐性細胞系から再生したイネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ Ｌ．）植物の特性化」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９６，１１３，１０５−１１１）。トランスジェニック植物が、原核生物または植物における塩／早魃ストレスにより上方調節されたとして知られている多くの他の研究所において構築された（次を参照：Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｂｕｌｏｗ，Ｌ．「遺伝子転移による植物内での改良されたストレス耐性」Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１９９８，３，６１−６５）。しかしながら、植物が改良された長期間の塩耐性を獲得でき生産性を維持できる分子メカニズムは未だ理解されておらず、多くの遺伝子の調節を含むものであろう（次を参照：Ｗｉｎｎｉｖｏｃ，Ｉ．「農作物における改良された塩耐性への新規な分子的なアプローチ」Ａｎｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，１９９８，８２，７０３−７１０）。これは塩耐性は定性的な特徴であると考えられてきたからである（次を参照：Ｆｏｏｌａｄ Ｍ．Ｒ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ａ．「特徴に基礎をおくマーカー分析を用いてのトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｃｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）での塩耐性遺伝子のマッピング」Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３，８７，１８４−１９２）。特定の方法で他の遺伝子の発現に影響可能な調節遺伝子の同定は、植物の生長を操作するためのみならず、種々の生物的や非生物的環境ストレス条件への耐性を向上させるのにも特に有用である。
【０００５】
【発明の開示】
塩耐性ムラサキウマゴヤシ細胞中で高められたり植物全体でｍＲＮＡレベルで塩導入された色んな遺伝子転写産物がクローン化されてきた。今回の開示は、２つの特に興味ある新規な単離物に焦点をあてるものである。その１つは推定上の亜鉛フィンガー調節蛋白をコード化するアルフィン１である（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．「塩耐性ムラサキウマゴヤシから推定上の亜鉛フィンガーモチーフをコード化するｃＤＮＡ」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３，１０２，６８１−６８２）。もう１つは、細胞壁と膜の間のリンカー分子として作用できる疎水性のシステインの豊富なカルボキシ末端でプロリンの豊富な蛋白をコード化する単純コピー遺伝子のＭｓＰＲＰ２である（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｄｅｕｔｃｈ，Ｃ．Ｅ．，「塩誘発可能な根特異性の転写産物を同定する塩耐性ムラサキウマゴヤシ細胞からのｃＤＮＡクローンの特性化」Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９４，１４４，２２２−２２８；Ｄｅｕｔｃｈ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．「推定上のキメラプロリンの豊富な細胞壁蛋白をコード化する塩誘導性ムラサキウマゴヤシ遺伝子の後転写調節」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，２７，４１１−４１８）。興味あることは、これら遺伝子の双方がまず根において発現され、そしてＭｓＰＲＰ２が８７又は１７１ｍＭのＮａＣｌにおいて植物の継続した生長に対して強力に塩誘発可能なことである。アルフィン１はムラサキウマゴヤシのゲノムにある特異的な遺伝子であり、イネやシロイヌナズナのような種々の植物に保存されているようである（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．「農作物における塩耐性：組織栽培と遺伝子調節による新しいアプローチ」Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１９９７，１９，４３５−４４９；Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．「転写因子 Ａｌｆｉｎ １のトランスジェニックな過剰発現はムラサキウマゴヤシの内在性ＭｓＰＲＰ２遺伝子の発現を高め植物の塩耐性を改良する」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９，（印刷中）。
【０００６】
従って、本発明の主たる目的は、増大された根の生産と一般的生長をもつトランスジェニック植物の生産を高めることである。
【０００７】
本発明の他の目的は、植物全体の収穫を高めるためにＭｓＰＲＰ２遺伝子（これはアルフィン１によって影響をうける）からの根特異性プロモーターおよびアルフィン１導入遺伝子を用いてトランスジェニック稙物の活性を高めることである。
【０００８】
これらの及びこれ以降に示すようなそれ以外の目的は、以下の例示的実施態様の詳細な記載から、特に幾つもの観点を通じて数字で示した部分がある添付の図面と併せて読むことにより容易に認識されるような、著しく予期不能の形で本発明によって容易に満たされているであろう。
【０００９】
【発明の最良の実施態様】
アルフィン１ｃＤＮＡは分化スクリーニングによってクローン化されたので、植物の根における増強調節因子としてのアルフィン１の機能は知られておらず、示されなければならない。アルフィン１ｃＤＮＡ配列と演繹アミノ酸配列の示されている図１を参照のこと。推定上の亜鉛フィンガーから成るＣｙｓおよびＨｉｓ残基には下線をつけてある。破線は蛋白の強酸性領域を示している。もしアルフィン１が根に特異的な調節における転写因子として作用しているのであれば、蛋白のＤＮＡ結合が予期されるであろう。配列特異的なＤＮＡ結合をテストするために、アルフィン１融合蛋白のためのｐＥＴ−２９の概略表示を示している図１Ｂに示した構築からの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の中で、まず組換えアルフィン１を発現させた。アミノ酸配列の上の行はベクターのビオチン化トロンビン切断部位およびＳ−Ｔａｇを示す。下のアルフィン１配列は、構築の中で欠失した９つのＮ−末端アミノ酸を太線で示し、関連するＣｙｓ４とＨｉｓ／Ｃｙｓ３残基で陰性に荷電された領域と推定上の亜鉛結合ドメインを下線つきで示す。アフィニティー精製した組換え蛋白は、蛋白のアミノ末端領域を配列するアミノ酸によって標準的なアルフィン１蛋白であることが示された。この配列は、以下の表１に示すようにクローン化されたｃＤＮＡから予測される配列と同等であった。
【００１０】
【表１】
組換えアルフィン１蛋白は精製され、そしてアミノ酸配列はＢａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｅｔｈｅ，Ｖ．Ｖ．ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ（１９９８）「アルフィン１、塩誘導可能ＭｓＰＲＰ２遺伝子内のプロモーター要素と結合するムラサキウマゴヤシ根の中の新規な亜鉛フィンガー蛋白」Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．３８，１１２３−１１３５に記載のようにしてトロンビン切断蛋白から決定した。数字は開始メチオニンから予測されるアミノ酸の位置を示す。
【００１２】
アルフィン１蛋白で認識されるＤＮＡ配列を同定するために、精製したアルフィン１蛋白を“ランダムＤＮＡ結合”アッセイ（次を参照：ＲａｕｓｃｈｅｒＩＩＩ Ｆ．Ｊ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｔｏｕｒｎａｙ，Ｏ．Ｅ．，Ｃｏｏｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．「Ｗｉｌｍの腫瘍遺伝子座亜鉛フィンガー蛋白のＥＦＲ−１共通配列との結合」Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２５０，１２５９−１２６２）で使用し、結合したＤＮＡをＲＣＲ増幅と結合を４回行なって精製し、そして単離配列のクローニングを行なった。単離されたクローン（図２）の配列分析は、ＧＴＧＧＮＧまたはＧＮＧＧＴＧである高度親和性の結合クローンでの共通配列を示し、これはアルフィン１が正に遺伝子調節で増幅的に機能できる特定のＤＮＡ結合因子であることを確認するものである。図２において、［Ａ］は結合物質のＰＣＲ増幅と共に４回のゲルシフト分析後に単離したアルフィン１と結合した個々のクローンから整列された共通配列を示し、［Ｂ］はインビトロでアルフィン１蛋白と結合する３つのＭｓＰＲＰ２プロモーターフラグメント中に見出されるアルフィン１蛋白結合配列のＰＣＲ増幅によるクローンと類似の配列要素を示す。
【００１３】
アルフィン１はその発現パターンで強力な根特異性を示すことが見出された。従ってＤＮＡ結合蛋白としては、それは根特異的遺伝子発現のための調節剤であろう。ムラサキウマゴヤシからの１５５２ｂｐの根特異的で塩誘発的ＭｓＰＲＰ２プロモーター（図３）からの３つのフラグメント（次を参照：Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９８，既述）は組替えアルフィン１蛋白とインビトロで結合することが見出され、一方では類似のサイズの対照ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ結合を示さなかった。ＭｓＰＲＰ２プロモーターの１５５２ｂｐのＤＮＡ配列を図３に示す。（下線で示したものは＋１における翻訳開始部位；ＴＡＴＡＡおよびＣＡＡＴ配列；組換えアルフィン１とのＤＮＡ結合実験のためのフラグメント１、２および３の単離に用いたＴｆｉｌ切断部位；明細書で説明したｍｙｃおよびｍｙｂ転写因子と同様のアルフィン１のための蛋白結合部位。［＊］は潜在的な結合部位が相補的ＤＮＡ鎖上に見出されることを示す。このヌクレオチド配列データは、アメリカ合衆国によって運営されている国際的遺伝学情報データベースであるＧｅｎＢａｎｋにより寄託番号ＡＦ０２８８４１が与えられている。ＭｓＰＲＰ２プロモーターフラグメントとの結合は特異的であり、ＥＤＴＡによって阻害され、組換えアルフィン１蛋白濃度に依存的であり、そして各々のフラグメントについて異なる親和性を示した。各々のフラグメントのＤＮＡ配列は、図２に示すランダムオリゴヌクレオチド選択で同定されたアルフィン１蛋白のための種々のＧの豊富な共通結合配列を含んでおり、ゲルシフト分析で観察される結合を説明できるものである。この発見と根でのアルフィン１およびＭｓＰＲＰ２発現ならびに塩によるＭｓＰＲＰ２誘発性との相関関係は、アルフィン１が我々の塩耐性植物での遺伝子発現と根の維持において役割を演じているという我々の仮説を指示し、そして強力な根の生長と発達におけるアルフィン１の潜在的な役割を示唆するものであった。
【００１４】
ＭｓＰＲＰ２発現はムラサキウマゴヤシでは根特異的でないので、新規に特性化されたプロモーターは、潜在的な根特異的ＤＮＡ配列要素の同定のために有用である。多くの根特異的な遺伝子が同定されており、また幾つもの領域がレポーター遺伝子の根特異的発現のための配列を含んでいることが示されているが（上記のＡｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照）、現在のところ根特異的発現を特定化する共通配列は同定されていない。９０ｂｐのトランケートされたカリフラワーのモザイクイウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターは、ＡＳＦ１因子と相互作用するｃｉｓ−調節要素（ＴＧＡＣＧ）を含んでいることが示されている（次を参照：Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｆ．，Ｌａｍ，Ｅ．ａｎｄ Ｃｈｕａ，Ｎ−Ｈ．「核因子 ＣＲＥＢと相同性のある２つのタバコＤＮＡ−結合蛋白」Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０，７２７−７３０）が、その他の根特異的遺伝子プロモーターは明らかにこの配列を含んでいない。ＭｓＰＲＰ２プロモーターは−１０３３の位置に１つの５′ＣＧＴＣＡ３′配列（ＡＳＦ１結合要素のＴＧＡＣＧの逆）を含んでいるが、ＴｏＢＲ７遺伝子調節に関連する根特異的要素を含んでいない（次を参照：Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｇ．，Ａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｎ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ−Ｌ ａｎｄ Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．「タバコにおける ｃｉｓ−作動配列調節根特異的遺伝子発現」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９１，３，３７１−３８２）。したがってアルフィン１結合部位が、根で発現する遺伝子のプロモーター配列での共通要素を表わすかどうかを決定する必要がある。根および塩ストレスで発現する遺伝子からのプロモーター領域でのアルフィン１結合配列の限定されたリストを以下の表２に示す。これによればこれらのプロモーターの全てがアルフィン１結合配列の若干の変動を含んでいることを示す。根特異的であるＣａＭＶ３５Ｓ最少プロモーター（−９５がら−５１まで）（次を参照：Ｌａｍ，Ｅ．，Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．，Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｆａｎ，Ｒ−Ｘ．ａｎｄ Ｃｈｕａ，Ｎ−Ｈ．「部位特異的変異はインビボ因子結合を変化し、トランスジェニック植物でのプロモーター発現パターンを変える」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，ＵＳＡ ９８６，７８９０−７８９４）は非コード化鎖上でアルフィン１結合部位を含んでいる。表２に示す植物の種は様々であり単子葉植物と双子葉植物の両方を含んでいる。これらの結果は、アルフィン１配列は広く保存されているという我々の観察と一致している。ＴｏＲＢ７、ＡｂＰＲＰＰ１およびＰｈｙＡプロモーターの場合、アルフィン１結合配列は、根発現に必要な欠失実験で同定した領域に位置している（次を参照：Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｇ．，Ａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ−Ｌ．，ａｎｄ Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．（１９９１）「タバコにおけるｃｉｓ−作動配列調節根特異的遺伝子発現」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３，３７１−３８２）。幾つものアルフィン１結合配列が、オーキシンまたは銅やカドミウムのような重金属で誘発されるグルタチオンｓトランスフェラーゼ根特異的遺伝子と同様に他の塩／旱魃誘発性転写因子Ａｔｍｙｂ２のプロモーターの中に見出されている。アルフィン１結合部位はまた、ジャガイモやトウモロコシの中の異なった遺伝子クラスからのシュクロース合成酵素プロモーターの中に豊富にある。塊茎発現パタチンＩ多重遺伝子族のすべてのプロモーターは、保存されたアルフィン１結合部位を含んでいる。
【００１５】
【表２】
＊：本質的に同一の配列がＰＡＴ２１、ＰＳ３およびＰＳ２７において同じ順序で、ならびにＰＳ７において少し低い程度で見出される。パラチンクラスＩＩ遺伝子はこの形式をもっておらず、非コード鎖上に類似の配列をもつ。
【００１７】
選択は、少なくとも２つの近接トリプレットに基づくコード鎖について行なわれ、インビトロアルフィン１結合で定義されるようにそのうち１つはＧＴＧであり他の１つはＧが境となっている（Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９８，既述）。更なる部位がこれら遺伝子のプロモーターの多くのものに非コード鎖上で見出された。括弧の中の数字はＧｅｎＢａｎｋの寄託番号を示す。
【００１８】
Ａｄａｍ，Ｅ．，Ｋｏｚｍａ−Ｂｏｇｎａｒ，Ｌ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｎａｇｙ，Ｆ．（１９９５）．タバコのフィトクロームＡ遺伝子は複数の開始部位で始まり、複数のｃｉｓ−作用調製要素を必要とする。Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，９８３−９９３。
【００１９】
Ｍｉｇｎｅｒｙ，Ｇ．Ａ．，Ｐｉｋａａｒｄ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９８８）ジャガイモのパタチン多重遺伝子族の分子特性化。Ｇｅｎｅ ６２，２７−４４。
【００２０】
Ｓａｔｏ，Ｆ．，Ｋｉｔｊｉｍａ，Ｓ．，Ｋｏｙａｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｙ．（１９９６）タバコＰＲ−５の中性イソ型であるオスモチン様蛋白のエチレン誘発遺伝子発現はＡＧＣＣＧＣＣ ｃｉｓ−配列によって仲介される。Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，２４９−２５５。
【００２１】
Ｗｅｒｒ，Ｗ．，Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．−Ｂ．，Ｍａａｓ，Ｃ．ａｎｄ Ｓｔａｒｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．（１９８５）。Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．の染色体９上のシュクロース合成酵素遺伝子の構造。ＥＭＢＯ Ｊ．４，１３７３−１３８０。
【００２２】
これらの結果は、アルフィン１蛋白は広布根（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｒｏｏｔ）特異的転写因子であり得ること、広範な様々な環境下での遺伝子調節に関与していること、ならびに種々の生長条件下での栄養素摂取、生物的や無生物的ストレスに対する抵抗および植物収穫の一般的な増加の目的のための根の生長を高めるために用いることができることを示している。アルフィン１は植物、特に植物根における遺伝子発現のための本質的な転写因子であると信じられており、そしてアルフィン１結合配列機能はこれらのプロモーターで制御される遺伝子発現のアルフィン１蛋白調節の遺伝子プロモーターとして機能しかつこれらの遺伝子からのｍＲＮＡ蓄積を高めるようにするものと期待されている。これらの予測は、アルフィン１を過剰発現するトランスジェニック植物でテストされた。
【００２３】
ムラサキウマゴヤシにおける内在性遺伝子に対するアルフィン１の過剰発現および過少発現の効果をテストするために、センスおよびアンチセンス方位でクローン化し、図４に示すような構築でムラサキウマゴヤシの葉円盤（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）または未熟の子房へ形質転換した。（次を参照。Ｗｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，Ｄ．Ｒ．（１９９９）転写因子アルフィン１のトランスジェニックな過剰発現はムラサキウマゴヤジの内在性ＭｓＰＲＰ２遺伝子の発現を高め、植物の塩耐性を改良する。Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）。
【００２４】
組換えプラスミド構築
全長コードアルフィン１クローン（ｐＡ５０）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のアルフィン１ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０７２９１）の９０４ｂｐのフラグメントから成る。それは３０ｂｐの５′非翻訳リーダー、完全な７７１ｂｐのコード領域、および翻訳終末コドンを含む１０３ｂｐの３′非翻訳領域を含んでいる（Ｗｉｎｉｃｏｖ １９９３，既述）。このｃＤＮＡフラグメントは、図４に示すようにバイナリー発現ベクターｐＧＡ６４３の多重クローニング部位中においてセンスおよびアンチセンス方位でクローン化された。
【００２５】
センス構築を生成するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−からの９３９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ フラグメントを先ずＰＦ−ｐＡ５０として示すようにｐＦＬＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）へサブクローニングしてｐＧＡ６４３中のｃＤＮＡフラグメントをクローン化するのに適した制限部位を得た。次いでアルフィン１ｃＤＮＡを含有するＰＦ−ｐＡ５０からの９５７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターへの多重クローニング部位（ＭＣＳ）３′中のｐＧＡ６４３と連結させてｐＧＡ−センスを得た。このクローンは完全なアルフィン１コード化転写物を与えるものと予測されるが、内在性のアルフィン１とは異なって、ｍＲＮＡはその３′ＵＴＲ中のベクターから付加的な配列を担持するようである。
【００２６】
アンチセンス構築（ｐＧＡ−ＡＴＳ）化生成するために、ｐＡ５０（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−）からの９４４ｂｐのＣａｌＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＧＡ６４３ＭＣＳ部位へ直接連結させた。もう１つのＣｌａＩ部位はｐＧＡ６４３ではＭＣＳの上流にあると報告されているが、我々は図４に示すＭＣＳ内のＣｌａＩ部位のみが酵素で切断されることを見出した。
【００３７】
プラスミド、ｐＧＡ−センス、ｐＧＡ−ＡＴＳ（アンチセンス）およびｐＧＡ６４３（ベクター）はテトラサイクリンの存在下でＭＣ１０００株の大腸菌中で増殖した。冷凍−解凍方法を、組換えバイナリープラスミドでのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ ４４０４の形質転換に用いた。形質転換コロニーを１２ｍｇ／ｌのリファンピシンと６ｋｇ／ｌのテトラサイクリンで選別した。組換え形質転換コロニーは、ｐＡ５０からのアルフィン１ ６７０ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントを用いるコロニーハイブリダイゼーションで同定した。
【００３８】
植物形質転換
ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｒｅｇｅｎ Ｓ）の塩感受性野生型親植物＃１（Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９１，既述）の葉を２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）と２ｍｇ／ｌのカイネチンを含むＳＨ生育培地においてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ共培養で形質転換させ（次を参照：Ｓｃｈｅｎｋ，Ｒ．Ｕ．ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ａ．Ｃ．単子葉植物と双子葉植物の細胞培養の誘発と生長のための培地と技術）、室温で３０から６０分間５０μＭのアセトシリンゴン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で補足した。１つの成功的な形質転換は、ｐＧＡ−ＡＴＳを担持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、塩耐性ムラサキウマゴヤシＩＷ＃９（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１，既述）からの未熟の子房との共培養で行なわれた。カルス培地で２から６日後に、エクスプラントを選択培地（３００ｍｇ／ｌのカルベニシリンと１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足したＳＨ培地）へ移し、そして３−４週間培養した。抵抗性のカルスを月基準で選択培地で継代培養した。植物は、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足したＳＨ培地（ホルモンなし）で形質転換カルスから再生された。はっきりわかる若枝と根をもった植物をピートモスに、次いで土壌に移した。
【００２９】
以下の表３に示すように、センス構築で形質転換したカルス培養物は１７ｍＭのＮａＣｌで改良された生長を示し、アンチセンス構築で形質転換したカルス培養物は同じ濃度のＮａＣｌには更に感受的でありた。しかしながら何れの形質転換体も、連続点灯下での通常のＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２，既述）培地ではよく生育することができた。これらの結果は、我々の塩耐性カルスは、細胞がＮａＣｌで生長したときの僅かに増大した定常状態のｍＲＮＡレベルでの核ランオン実験で測定したアルフィン１転写の増大を示すという我々の以前の観察と一致するものである（次を参照：Ｗｉｎｉｖｏｖ，Ｉ．ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｍ．「塩耐性ムラサキウマゴヤシ細胞中の遺伝子の転写および転写後活性化」Ｐｌａｎｔａ，１９９６，２００，３９７−４０４）。
【００３０】
【表３】
植物の発達におけるアルフィン１の役割は、植物がトランスジェニックカルスから再生されたときに一層明白となった。アルフィン１発現は根の生産に必要とみられる。何故ならばカルスを発現しているアルフィン１は若枝を再生したけれども根の生産には不足しており、最低の根の生産が得られた少数の植物は土壌中では数週間以上は生存しなかった。これとは対照的に、センス構築物は全ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下にあり根と葉の両方で導入遺伝子を発現するという事実にも係わらず、ベクターのみを含むカルスまたはセンス構築物は、生育良好な植物、花および所定の種子を再生した。図５は、１）センス方位にアルフィン１を発現した２つの大きな植物：２）数週間のあいだ土壌で生存した唯一の小さなアンチセンス植物；および３）再生培地における数ヶ月後の根の少ないアンチセンス植物の写真を集めたものである。これらの結果から、アルフィン１発現は根の発達と植物の生長に必須であり、アルフィン１蛋白は広布根特異的転写因子であるとの確信を支持することが明らかである。
【００３２】
我々の組換えアルフィン１でのＤＮＡ結合実験はＭｓＰＲＰ２プロモーターとの特異的な結合を示したので、ＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡレベルをアルフィン１を過剰発現するトランスジェニックカルスと植物で測定した（次を参照：Ｗｉｎｉｃｏｖ ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌａ，１９９９，既述）。トランスジェニックなカルスと植物根においては、アルフィン１過剰発現は図６Ａおよび６Ｃに示すように増大したレベルのＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡを伴なっていた。なお図においてカルスのデータは次のものを示す。レーン１および２：±１７１ｍＭのＮａＣｌで４週間生長した非形質転換塩耐性カルスから単離したＲＮＡ。レーン３：非形質転換塩感受性カルスから単離したＲＮＡ。レーン４：ｐＧＡベクターで形質転換した塩感受性カルスから単離したＲＮＡ。レーン５−８：アルフィン１構築物で形質転換した塩感受性カルスから単離したＲＮＡ；ここでＳ１、Ｓ２、Ｓ４およびＳ６は独立に形質転換した系である。レーン９：１７１ｍＭのＮａＣｌ内で生長したＳ２形質転換カルスから単離したＲＮＡ。各々のレーンは１０μｇの全ＲＮＡを含んでいる。
【００３３】
各々のブロットは次のプローブで逐次的にハイブリッド化した。アルフィン１、大きなＥｃｏＲＩフラグメント（図１）；ＭｓＰＲＰ２、カルボキシ末端および３′非翻訳領域フラグメント（Ｗｉｎｉｃｏｖ ａｎｄ Ｄｅｕｔｃｈ，１９９４、既述）、Ｍｓｃ２７、構築的に発現したムラサキウマゴヤシ遺伝子のフラグメント。アルフィン１センス構築で形質転換した各々の細胞系において、アルフィン１過剰発現は、増大したレベルのＭｓＰＲＰ２ｍＲＮＡを伴なう。
【００３４】
図６Ｂは、アルフィン１で形質転換した植物はアルフィン１ｍＲＮＡの中のＰＧＡ−ベクターのタグでモニターした導入遺伝子を発現することを示す。
【００３５】
図６Ｃは、根と葉でのアルフィン１とＭｓＰＲＰ発現を示す。全ＲＮＡは、同じ植物の根と葉から単離された。＃１は対照の塩感受性植物であり、ＩＶはエンプティーベクター形質転換植物であり、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３はアルフィン１センス構築物で形質転換され形質転換カルスから再生された植物である。＃９は塩耐性の対照植物である。各々のブロットは次のプローブで逐次的にハイブリッド化された。アルフィン１、大きなＥｃｏＲＩフラグメント（図１）；ＭｓＰＲＰ２、カルボキシ末端および３′非翻訳領域フラグメント；Ｍｓｃ２７、各々のレーンの負荷をモニターするために構築的に発現したムラサキウマゴヤシ遺伝子のフラグメント。各々のレーンは全ＲＮＡを１０μｇ含有している これらの結果は、アルフィン１のＭｓＰＲＰ２転写活性化における役割と同じく、内在性のＭｓＰＲＰ２遺伝子からのｍＲＮＡ蓄積の増大したレベルをもたらす事を示している。しかしながら、この転写活性化は根に特異的ではない。何故ならば、同じトランスジェニック植物からの葉は、ＭｓＰＲＰ２転写物に付随しての増大なしにアルフィン１ｍＲＮＡレベルの増大を示し、これはアルフィン１とＭｓＰＲＰ２転写活性化のために根に存在する他の遺伝子産物との間の相互作用を暗示するものである。図１Ｂに示すように、アルフィン１は仮定の亜鉛フィンガー領域から丁度上流に極めて酸性のドメインを含んでいるので、アルフィン１はまたＤＮＡとの結合において付加的な因子と相互作用することができる。興味あることには、図３に示すＭｓＰＲＰ２プロモーター配列は多くのｍｙｃおよびｍｙｂ認識部位を含んでおり、そのうちの幾つかはアルフィン１結合部位と極めて近接したところにあって、シロイヌナズナのｍｙｃとｍｙｂで既に示されている（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ、１９９７、既述）ようなものと類似したこれらの転写因子との相互作用の可能性を示唆している。
【００３６】
ここで得られた結果は、根の発達と根特異的な遺伝子発現におけるアルフィン１の中心的役割を支持している。更なる実験は、正常およびストレス条件下での高められた根の生長におけるアルフィン１の過剰発現の役割を支持している。テスト条件下で比較した植物は、形質転換実験に用いた葉をもつ塩感受性の親植物の＃１、ベクター単独で形質転換したトランスジェニック体、および高いレベルのアルフィン１を発現するトランスジェニック体を含んでいる。対照もまた、アンチセンス構築物で形質転換したとき根を発達できないような塩耐性植物の＃９を含んでいる。根の生長とアルフィン１過剰発現トランスジェニック植物の塩耐性の測定のために、根のある切断物をＰｅｒｌｉｔｅ（Ｐａｘｌｉｔｅ，Ｐｘ Ｃｏ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）の中で容器内で上記植物から定着させ、毎日潅水して養い、塩の蓄積があればそれを洗い出し、次いで（Ｗｉｎｉｃｏｖ、１９９１、既述）に記載のようにして１／４強度のホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）溶液で充分に潅水した。４週間後の植物の根と若枝の生長の測定（ｃｍ長さ）および全重量（グラム）の予備的な結果は我々の理論を確認した。下記の表４に示すように、根の発達におけるアルフィン１の仮定した役割が予測したように、アルフィン１で形質転換した植物は高い根の生長（対照の親植物の４３８％）を示す。現在の実験はこれらの測定を、トランスジェニック植物を含むその他の個々の再生アルフィン１へと拡張した。
【００３７】
【表４】
ｂ：これは１７１ｍＭのＮａＣｌで組織培養し既述（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１、既述）のようにして再生したものから選択した塩耐性植物である。
【００３８】
上述の植物の切断物での比較のための根の生長実験もまた、温室条件下で同じサイズのポットを使い規則的な潅水スケジュールで土壌で行なった。生長率はｐｅｒｌｉｔｅと土壌とでは異なっているが、種々のテスト植物と対照との間の根と若枝の生長の相対比率は実質的に同一を保っていた。
【００３９】
改良された根の発達をもっているアルフィン１を過剰発現するトランスジェニック植物もまた改良された塩耐性を示すことと考えられた。塩耐性は既述のようにして測定した（次を参照：Ｖｉｎｉｃｏｖ，Ｉ．「塩耐性細胞系から再生した塩耐性のムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）植物の特性化」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９１，１０，５６１−５６４）。植物は上記のような容器で定着させ、短く摘み、そして２つのグループに分けた、なお、各々のグループには各個々の再生直物の少なくとも５つのレプリカ切断物があるようにした。グループＩ（対照、すなわち０％のＮａＣｌ）は、上記のように水と１／４強度のホーグランド溶液で処理した。グループＩＩは、０．５％またはそれより多いＮａＣｌを含むホーグランド溶液で処理した。耐性は、処理後の各グループでのレプリカ植物の数に対する生存数として表わした。植物の生長は、各実験の最後で生存している植物の若枝を採取することによって定量し、そして各グループの植物に対する平均の全若枝の新鮮な重量として計算した。この値は、与えられた塩の条件下でのテスト期間を通じての質量の正味の増大を表わしている。
【００４０】
正常条件下におけるアルフィン１過剰発現植物の増大した根の生長と更に強い若枝の生長が期待されたが、塩ストレステストは、組織特異的な調節条件下でのアルフィン１過剰発現の塩耐性能力を正確に予測できないようである。３５Ｓプロモーター下でアルフィン１を過剰発現する我々の今回のトランスジェニック植物は、葉においてこの遺伝子産物を不適当に発現し、それはストレス条件下ではこの遺伝子産物の不適当な存在によって逆影響されるようである。しかしながら、アルフィン１の組織特異的な調節は、この潜在的な問題を覆すように思われる。すなわち、アルフィン１過剰発現トランスジェニック体の高められた生物的および非生物的抵抗の正確な評価は、アルフィン１発現が根特異的プロモーターの管理下でもっと厳しいところの新規なトランスジェニック体の構築によって改良されるようである。図３に示すＭｓＰＲＰ２プロモーターである上記のプロモーターは、根特異的なアルフィン１導入遺伝子の構築のためにそして根への直接的で付加的なアルフィン１発現へとクローン化されている。本質的には、図４に示すセンスおよびアンチセンス構築物のための３５Ｓプロモーターは、ＭｓＰＲＰ２の１５ｂｐプロモーターで置き換えられ、そして既述のようにして形質転換が繰り返される。我々の現在のテストで示されるように、このプロモーターはまたアルフィン１蛋白と結合するので、これらの根特異的なアルフィン１トランスジュニック体は、現在得られた結果で示される３５Ｓプロモーター下のアルフィン１センストランスジェニック体よりも良好に遂行すると考えられる。
【００４１】
アルフィン１ｃＤＮＡ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物の創製は、既に述べたようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換プロトコール又は植物分子生物学で普通に用いられているその他の方法たとえば電気穿孔、浸透、プロトプラストにおけるポリエチレングリコール仲介遺伝子移動、リポソーム仲介移動もしくは粒子衝撃によって達成することができる（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｒ．Ａ．，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９８）。
【００４２】
アルフィン１導入遺伝子は、既述のようにＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの管理下にあり得る。更に、アルフィン１導入遺伝子は、アルフィン１蛋白を過剰発現するトランスジェニック植物の創製のための新規なアルフィン１発現ベクターを構築するために、図４に記載したアルフィン１センス構築物とプロモーター領域の適当な限定部位を用いて、１５００ｂｐのＭｓＰＲＰ２プロモーター図３（Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅ ａｎｄ Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９８，既述）の全部または一部分の管理下におくことができる。
【００４３】
ＭｓＰＲＰ２プロモーターの全部または一部の配列（Ｂａｓｔｒｏｌａ，Ｐｅｔｈｅ ａｎｄ Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９８，既述）はまた、それ自身であるいは他のプロモーター配列要素と共に、（限定酵素で切断した特定のＤＮＡフラグメントを再連結する通常の分子生物学的技術を用いて）植物の中へ移動させた他の遺伝子へ根特異的及び／又はアルフィン１蛋白制限発現を与える新規な複合プロモーター限定配列を構築するために用いることができる。
【００４４】
アルフィン１蛋白結合配列（Ｂａｓｔｏｌａ，Ｐｅｔｈｅ ａｎｄ Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９８，既述）はまた、それ自身で、コンカテマーとして、または他のプロモーター配列要素と共に、（限定酵素で切断した特定のＤＮＡフラグメントを再連結する通常の分子生物学的技術を用いて）植物の中へ移動させた他の遺伝子へ根特異的及び／又はアルフィン１蛋白制限発現を与える新規な複合プロモーター限定配列を構築するために用いることができる
【００４５】
適当なプロモーター状況でのアルフィン１結合部位の導入は、アルフィン１による付加的な遺伝子の調節をもたらす事ができると考えられる。
【００４６】
さらに、植物の根でのアルフィン１（又はその類似体）発現または機能との如何なる化合物または分子による如何なる分子干渉も、植物の根の発達や植物の生長を阻害し、従って除草剤として効果的に作用すると考えられる。
【００４７】
最後に、アルフィン１を過剰発現する植物による増大した根の生長は、塩条件下での植物の生存を増大させ、親植物やエンプティベクターで形質転換した植物がここに示すように最低の若芽の収穫を生じる条件下で生長を提供し続ける。以下の表５Ａ、５Ｂ、６および７を参照。
【００４８】
【表５Ａ】
ｂ：これは１７１ｍＭのＮａＣｌで組織培養し既述（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１、既述）のようにして再生したものから選択した塩耐性植物である。
【００４９】
【表５Ｂ】
ｂ：これは１７１ｍＭのＮａＣｌで組織培養し既述（Ｗｉｎｉｃｏｖ，１９９１、既述）のようにして再生したものから選択した塩耐性植物である。
【００５０】
【表６】
ｂ：親植物＃１からの組織培養での選別後に再生成した塩耐性植物（Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９１，既述）
【００５１】
アルフィン１を過剰発現する植物が、テスト条件下での短い収穫において親植物やエンプティベクターで形質転換した植物よりも優れていることを示す更なるテスト。これは、それらの高められた根の発達と一致していた。
【００５２】
結果を以下の表７に示す。
【００５３】
【表７】
ｂ：親植物＃１からの組織培養での選別後に再生成した塩耐性植物（Ｗｉｎｉｖｏｃ，１９９１，既述）
【００５４】
以上から、本発明の新規で有用な実施態様がここに記載され説明されており、それが著しく予期できない方法で前述の目的のすべてを充足していることは容易に明らかである。この開示をみた当業者が容易に想起する修飾、変更および適応は、ここに記載の特許請求の範囲の領域によってのみ限定をうける本発明の精神の中にあると意図されている事は当然理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】アルフィン１ｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０７２９１）。
【図１Ｂ】大腸菌でのアルフィン１融合蛋白の発現。
【図２】インビトロでアルフィン１と結合するＤＮＡ配列。
【図３】Ｍ．ｓａｔｉｖａでのＭｓＰＲＰ２ゲノム領域（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０２８８４１）。
【図４】ムラサキウマゴヤシの形質転換に用いられたアルフィン１のセンスおよびアンチセンス構築物の模式的表現。
【図５】アルフィン１のセンスおよびアンチセンス形質転換細胞系から再生成したムラサキウマゴヤシ。
【図６】アルフィン１センス形質転換体からのトランスジェニックなカルスと植物でのアルフィン１およびＭｓＰＲＰ２発現のノーザンブロット分析。
Claims (13)
- 非トランスジェニック植物へ結合転写因子としてアルフィン１導入遺伝子を適用することから成るトランスジェニック植物を創製する方法。
- 該アルフィン１導入遺伝子が該非トランスジェニック植物の中へ発現される請求項１の方法。
- 該トランスジェニック植物が、高められた根の生長および高められた根の特性遺伝子の発現を得る請求項２の方法。
- 該トランスジェニック植物が、ストレスに対して高められた抵抗を得る請求項２の方法。
- 該トランスジェニック植物が、高められた植物栄養生長を得る請求項２の方法。
- 該ストレスが生物的なものである請求項４の方法。
- 該ストレスが非生物的なものである請求項４の方法。
- 該植物栄養生長が、高められた植物の根の収穫より成り塊茎、植物果実および植物種子生長を改善するものである請求項５の方法。
- 該アルフィン１導入遺伝子が、１５００ｂｐのＭｓＰＲＰ２プロモーターの完全なまたは部分的な制御下にある請求項１の方法。
- 該ＭｓＰＲＰ２プロモーターが、遺伝子を発現するためにトランスジェニック植物中で根指向プロモーターとして使用される請求項９の方法。
- 該ＭａＰＲＰ２プロモーターが、アルフィン１を発現するためにトランスジェニック植物中で根指向プロモーターとして使用される請求項９の方法。
- 新規な複合プロモーター配列を構築し、植物中へ転移した他の遺伝子へ根特異的な及び／又はアルフィン１蛋白調節発現を提供するように、アルフィン１蛋白結合配列それ自身をコンカテマーとして又は他のプロモーター配列要素と共に使用する方法。
- 図３に示すような配列をもつムラサキウマゴヤシＭｓＰＲＰ２プロモーター。
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