CN111153975A

CN111153975A - 植物抗旱相关蛋白TaNAC15及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111153975A
Application number: CN202010047032.2A
Authority: CN
Inventors: 毛虎德; 康振生; 黄雪玲; 庄华
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111153975B

Abstract

本发明公开了一种植物抗旱相关蛋白TaNAC15及其编码基因与应用。该蛋白质TaNAC15来源于小麦(Triticum aestivum L.)，为如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，本发明发现一种蛋白TaNAC15，其将蛋白TaNAC15编码基因导入拟南芥或小麦中，得到的转基因植物的抗旱性均提高。证明，蛋白TaNAC15在提高植物抗旱性的育种和研究中具有重要意义，可用于培育抗旱植物品种。

Description

植物抗旱相关蛋白TaNAC15及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种植物抗旱相关蛋白TaNAC15及其编码基因与应用。

背景技术

植物在复杂多变的环境中生长发育，常受到逆境胁迫，其中干旱是影响和限制植物生长发育的主要逆境因子，甚至会导致植物死亡，严重影响农业生产。因此，培育抗旱作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。

小麦(Triticum aestivum L.)是全世界人民最主要的碳水化合物和蛋白质来源。据测算，到2050年时全球小麦的产量至少还需要增长60％才能够满足那时全球人口的需要。因此，迫切需要寻找有效的育种手段来提高小麦产量。尽管全球小麦种植面积和产量取得了突飞猛进的增长，但是干旱、高温、高盐等非生物逆境严重影响小麦产量。在诸多环境胁迫因素中，干旱对农业生产的威胁是最严重的一个世界性问题。研究表明，作物耐旱性遗传改良的关键是优良耐旱基因的克隆和利用。因此，对小麦进行抗旱基因挖掘对培育抗旱小麦品种并提高小麦产量具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物抗旱相关蛋白TaNAC15及其编码基因。

本发明提供了一种蛋白，来源于小麦(Triticum aestivum L.)，名称为TaNAC15，该蛋白是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的抗旱性相关的由(a)衍生的蛋白质。

上述序列表序列1所示的氨基酸由335个氨基酸残基组成。

为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2的第116-1123位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。

所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列2的第116-1123位所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述蛋白的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白的DNA分子。

序列表序列2由1803个脱氧核苷酸组成，为编码所述蛋白的全长cDNA序列，其中的第116-1123位为编码区。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也是本发明保护的范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述核酸分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pCAMBIA3301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

在本发明的实施例中，所述重组载体为pGZ或pCAMBIA3301-GZ；

重组载体pGZ具体可为在pGKX的Not I和Xho I酶切位点间插入了所述核酸分子(序列表序列2的第116—1123位所示的DNA片段)得到的重组载体pGZ；

所述重组载体pCAMBIA3301-GZ为在pCAMBIA3301的HindIII和EcoRI酶切位点间插入了所述核酸分子(序列表序列2的第116—1123位所示的DNA片段)得到的重组载体pCAMBIA3301-GZ。

上述蛋白在作为或者制备转录激活剂中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白或上述核酸分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白或上述核酸分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育抗旱植物或抗旱性提高的植物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：提高目的植物中上述蛋白的含量或活性，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

2)所示的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码上述蛋白核酸分子的表达量，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白的含量或活性，或，所述提高目的植物中编码上述蛋白核酸分子的表达量，均是通过将编码上述蛋白核酸分子导入目的植物中实现。

上述将编码上述蛋白核酸分子导入目的植物是通过导入所述重组载体pGZ或pCAMBIA3301-GZ实现的。

在上述方法或应用中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在本发明的实施例中，具体举例：所述双子叶植物具体可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)，所述单子叶植物具体可为小麦(Triticum aestivum L.)。

本发明保护上述任一所述方法得到的转基因植物。

本发明的实验证明，本发明发现一种蛋白TaNAC15，其将蛋白TaNAC15编码基因导入拟南芥或小麦中，得到的转基因植物的抗旱性均提高；证明蛋白TaNAC15在提高植物抗旱性的育种和研究中具有重要意义，可用于培育抗旱植物品种。

附图说明

图1为TaNAC15基因在非生物胁迫下的表达模式。

图2为TaNAC15蛋白的转录激活活性分析。

图3为TaNAC15-GFP融合蛋白的亚细胞定位。

图4为T₃代转基因拟南芥植株的RT-PCR产物的电泳结果。

图5为T₃代转基因拟南芥植株经干旱处理并复水6天后的表型。

图6为T₃代转基因拟南芥植株经干旱处理并复水6天后的存活率统计结果。

图7为T₃代转基因拟南芥植株正常生长及干旱胁迫下的气孔开度。

图8为T₃代转基因拟南芥植株干旱胁迫下的失水速率。

图9为T₃代转基因小麦植株的qPT-PCR结果。

图10为T₃代转基因小麦植株经干旱处理并复水3天后的表型。

图11为T₃代转基因小麦植株经干旱处理并复水3天后的存活率统计结果。

图12为T₃代转基因小麦植株正常生长及干旱胁迫下的气孔开度。

图13为T₃代转基因小麦植株干旱胁迫下的水分利用效率。

图14为转基因小麦正常生长条件下上调表达基因GO分析。

图15为转基因小麦正常生长条件下下调表达基因GO分析。

图16为转基因小麦干旱胁迫条件下上调表达基因GO分析。

图17为转基因小麦干旱胁迫条件下下调表达基因GO分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的生物材料信息如下：

载体pGKX：记载在如下文献中：Qin F,Sakuma Y,Tran LS,Maruyama K,KidokoroS,et al.(2008)Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3ligases and negatively regulate plant drought stress-responsive geneexpression.Plant Cell 20:1693-1707.公众可从西北农林科技大学获得；

载体pCAMBIA3301：记载在如下文献：Regulatory changes in TaSNAC8-6A areassociated with drought tolerance in wheat seedlings.Plant Biotechnol J 2019.公众可从西北农林科技大学获得。

载体pTF486：记载在如下文献：ABA-induced sugar transporter TaSTP6promotes wheat susceptibility to stripe rust.Plant Physiol.2019,181(3):1328-1343，公众可从西北农林科技大学获得；

根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株：记载在如下文献中：Scholthof HB,Alvarado VY,Vega-Arreguin JC,Ciomperlik J,Odokonyero D,et al.(2011)Identification of anARGONAUTE for antiviral RNA silencing in Nicotiana benthamiana.Plant Physiol156:1548-1555，公众可从西北农林科技大学获得；

根癌农杆菌GV3101菌株：记载在如下文献：Jing Y,Zhang D,Wang X,Tang W,WangW,et al.(2013)Arabidopsis chromatin remodeling factor PICKLE interacts withtranscription factor HY5 to regulate hypocotyl cell elongation.Plant Cell 25:242-256，公众可从西北农林科技大学获得；

哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana(Columbia ecotype))(col-0；以下简称为野生型拟南芥)：记载在如下文献：Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K(1994)Anovel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsivenessto drought,low-temperature,or high-salt stress.Plant Cell 6:251-264.公众可从西北农林科技大学获得。

小麦品种中国春(Chinese Spring)：记载在如下文献：Regulatory changes inTaSNAC8-6A are associated with drought tolerance in wheat seedlings.PlantBiotechnol J 2019.公众可从西北农林科技大学获得。

小麦品种Fielder：记载在如下文献：Regulatory changes in TaSNAC8-6A areassociated with drought tolerance in wheat seedlings.Plant Biotechnol J 2019.公众可从西北农林科技大学获得。

实施例1、蛋白TaNAC15及其编码基因的获得

一、蛋白TaNAC15及其编码基因的克隆

取小麦栽培种Chinese Spring种子，25℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到营养土或营养液中培养两周，取全株于液氮中速冻、研磨，提取总RNA，进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，5’-ATGGACCACGGCTTCGAC-3’和5’-TCAGAACGGCTTCTGCAGGTA-3’为引物进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化1008bp的DNA片段进行测序，结果表明，该DNA片段的序列如序列表序列2的第116-1123位所示。

序列表序列2为小麦栽培种Chinese Spring中编码序列表序列1所示蛋白TaNAC15的全长cDNA序列，其中的第1—115位为5’非编码区，第116—1123位为编码序列，第1124—1803位为3’非编码区。将编码蛋白TaNAC15的基因命名为基因TaNAC15。

二、TaNAC15基因在干旱胁迫下的表达分析

取小麦栽培种Chinese Spring种子，25℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到营养土或营养液中培养两周，然后进行以下处理：干旱胁迫采取台面干燥处理的方法，将三叶期的幼苗放置在台面上(温度为20℃；湿度为50％)，分别取处理0，1，3，6，12，24小时的根和叶于液氮中速冻；ABA处理时将三叶期幼苗根浸入100μM ABA水溶液中，分别取处理0，1，3，6，12，24小时的根和叶于液氮中速冻。上述样品分别进行研磨，提取总RNA，进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，5’-TTGGGTGACTTGGTACAAGCC-3’和5’-GTTCGACCTCTACTTCTAATTTGG-3’为引物(扩增TaNAC15基因)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，分析TaNAC15基因的表达模式。

结果如图1所示，TaNAC15基因在叶片及根中受干旱胁迫上调表达。

实施例2、TaNAC15蛋白的转录激活活性分析

以Chinese Spring(CS)的cDNA为模板，5’-ATGGACCACGGCTTCGAC-3’和5’-TCAGAACGGCTTCTGCAGGTA-3’为引物进行PCR扩增，得到1008bpPCR产物。

经过测序，该PCR产物具有序列表中序列2所示的第116-1123片段，其为TaNAC15基因。

将上述PCR产物克隆并连接入酵母表达载体pGBKT7(Clontech，630489)中，得到重组载体(表达TaNAC15蛋白)，再将重组载体转化酵母菌株AH109(上海斯信生物科技有限公司，addgene 0278；含有报告基因HIS3和ADE2)，以转化空载体pGBKT7为对照，分别获得重组酵母菌株TaNAC15及pGBKT7-Control。将AH109重组酵母菌株涂到营养缺陷型培养基的板上，通过菌斑生长情况分析TaNAC15蛋白的转录激活活性。

结果如图2所示，重组酵母菌株TaNAC15能在SD/-Trp(单缺)培养基的板上生长。在SD/-T-H(两缺)、SD/-T-H-A(三缺)营养缺陷型培养基的板上，含有pGBKT7-Control质粒的酵母菌株(pGBKT7-Control)不能正常生长，而重组酵母菌株TaNAC15均能够正常生长。

上述结果表明：TaNAC15蛋白具有转录激活活性，可以作为转录激活剂。

实施例3、TaNAC15-GFP融合蛋白的亚细胞定位

以Chinese Spring(CS)的cDNA为模板，5’-ATGGACCACGGCTTCGAC-3’和5’-GAACGGCTTCTGCAGGTACGT-3’为引物进行PCR扩增，将目的基因克隆并连接入表达载体pTF486中，转化小麦(Chinese Spring)原生质体，以转化空载体pTF486为对照，分别在激光共聚焦显微镜下观察。

结果如图3所示，转化空载体pTF486的原生质体中绿色荧光分布在整个细胞中，而转化TaNAC15-GFP融合蛋白载体的原生质体中绿色荧光仅分布在细胞核中，表明：TaNAC15是一个核定位蛋白。

实施例4、过表达基因TaNAC15提高拟南芥抗旱性

1、重组载体的构建

将序列表序列2的第116—1123位所示的DNA片段克隆到载体pGKX的Not I和Xho I酶切位点间(位于35S启动子下游)，并经测序证实，获得重组载体pGZ，该重组载体表达序列1所示的TaNAC15蛋白。

2、重组根癌农杆菌的获得

将重组载体pGZ转化根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株，获得含有重组载体pGZ的重组农杆菌X；

将空载体pGKX转化根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株，获得含有空载体pGKX的重组农杆菌Y。

3、转基因拟南芥的获得

将重组农杆菌X用花芽浸泡法转化野生型拟南芥，收获T₁代种子；将T₁代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选并将抗性苗种植收种，获得T₂代种子；将T₂代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选，挑选卡那霉素抗性分离比符合3:1的卡那霉素抗性苗种植，同时随机选取培养皿的抗性幼苗按照步骤4的方法进行RT-PCR检测，确定过表达TaNAC15的拟南芥株系、收种，获得T₃代单拷贝过表达TaNAC15的拟南芥种子，将T₃代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选得到不再产生卡那霉素抗性分离的T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系3个，分别命名为TL1、TL2和TL3。

将重组农杆菌Y用花芽浸泡法转化野生型拟南芥，按照上述方法筛选，获得T₃代不再产生卡那霉素抗性分离的T₃代纯合转空载体的拟南芥株系3个，分别命名为Y1、Y2和Y3(表型实验中统称Y)。

T₁代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

上述花芽浸泡法的具体步骤如下：

取重组农杆菌X或Y接种于含有50mg/L卡那霉素和5mg/L四环素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.8，25℃、5000转/分钟离心2分钟，除去上清液，用重悬溶液(溶剂为水，溶质蔗糖和silwet77的浓度分别为50g/L、0.02％(体积百分含量)重悬菌体，获得侵染液。用移液器将侵染液点在花蕾及生长点，用薄膜覆盖，保湿2天后，置于正常条件下生长，收获种子。

4、RT-PCR检测转基因拟南芥

取步骤3获得的T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系(TL1-TL3)，T₃代纯合转空载体的拟南芥株系(Y)植株，及野生型拟南芥(CK)，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientificproduct,USA)测定浓度，统一取5微克跑0.8％琼脂糖胶。取1微克总RNA，用重组M-MLV反转录酶，以1微克Oligo(dT)23(Promega)为引物，进行cDNAs的合成,用特异引物F1和R1对基因TaNAC15的cDNA进行PCR扩增，以拟南芥中的基因Actin2为内参，引物为FC1和RC1。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。

上述引物的序列如下：

F1：5’-GTGCTCTGCCGAATCTACAA-3’(序列表序列3)；

R1：5’-GAACCCGTCGTCTTCTATGAC-3’(序列表序列4)；

FC1：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’(序列表序列5)；

RC1：5’-GCATCAATTCGATCACTCAGAG-3’(序列表序列6)。

图4的结果表明，野生型拟南芥CK植株中不表达目的基因TaNAC15；而转基因TaNAC15的拟南芥株系TL1-TL3中目的基因TaNAC15的表达量都很高。

5、转基因拟南芥的抗旱性表型分析

取野生型拟南芥(CK)、T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系(TL1，TL2，TL3)和T₃代纯合转空载体的拟南芥株系苗龄7天的植株，转移到装有130g营养土的钵中，正常条件下生长32天后，进行干旱处理(即停止浇水)，14天后，表型差异明显即野生型CK株系莲座叶严重干枯而TL1，TL2，TL3株系莲座叶严重萎蔫时复水。复水6天后统计各株系植株的存活率(将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长和收种的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设4次重复，每次重复各株系的植株数不少于20株，取平均值进行统计分析。

表型观察结果如图5，可以看出，与CK相比，T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系复水后植株存活率高。

统计存活率，结果如图6所示，T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系复水后植株存活率为77％-82％，显著高于CK。

T₃代纯合转空载体的拟南芥株系和野生型拟南芥(CK)结果无显著差异。

上述结果表明，与野生型拟南芥或CK相比，T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥抗旱型提高。

6、转基因拟南芥在干旱胁迫下气孔开度观察

取野生型拟南芥(CK)、T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系(TL1，TL2，TL3)和T₃代纯合转空载体的拟南芥株系苗龄7天的植株，转移到装有130g营养土的钵中，正常条件下生长32天后，进行干旱处理(即停止浇水)，10天后，观察它们的气孔开度变化。将正常生长及干旱胁迫下的小麦叶片固定后去除叶肉细胞，留下表皮后于显微镜下观察气孔开度，以气孔宽与长的比率(气孔宽/气孔长)表示。实验设三次重复，每次统计100个气孔。

结果如图7，可以看到在正常生长条件下，T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系和野生型拟南芥叶片的气孔开度没有明显差异，但是干旱胁迫后，与正常条件相比，野生型植株的气孔开度变化较小，而T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系的气孔开度明显变小。

野生型拟南芥和T₃代纯合转空载体的拟南芥株系结果无显著差异。

因此TaNAC15基因可能在干旱响应气孔关闭过程中起重要作用。

7、转基因拟南芥在干旱胁迫下失水速率分析

取野生型拟南芥(CK)、T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系(TL1，TL2，TL3)和T₃代纯合转空载体的拟南芥株系苗龄7天的植株，转移到装有130g营养土的钵中，正常条件下生长32天后，进行失水速率测定，以植株相对含水量的变化表示。具体方法为：每个转基因株系及对照CK植株各取5棵苗，进行台面干燥并在干燥0h,1h,2h,3h,4h,5h时分别测定总鲜重，计算干旱胁迫每个时间点的相对含水量。相对含水量＝干旱后鲜重/起始鲜重。

结果如图8所示，可以看到随着干燥处理，野生型植株的失水速率明显快于T₃代纯合转基因TaNAC15的拟南芥株系。

野生型拟南芥(CK)和T₃代纯合转空载体的拟南芥株系结果无显著差异。

实施例4的结果表明，蛋白TaNAC15及其编码基因具有调控植物抗旱性的功能，在植物中过表达蛋白TaNAC15的编码基因，可以提高植物的抗旱性。

实施例5、过表达基因TaNAC15提高小麦抗旱性

1、重组载体的构建

将序列表序列2的第116—1123位所示的DNA片段克隆到pCAMBIA3301的HindIII和EcoRI酶切位点间(位于Ubi启动子下游)，并经测序证实，获得重组载体pCAMBIA3301-GZ，该重组载体表达序列1所示的TaNAC15蛋白。

2、重组根癌农杆菌的获得

将重组载体pCAMBIA3301-GZ转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有重组载体pCAMBIA3301-GZ的重组农杆菌Y。

将空载体pCAMBIA3301转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有空载体pCAMBIA3301的重组农杆菌CK；

3、转基因小麦的获得

将重组农杆菌Y用农杆菌介导的基因转化法转化小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，得到T₀代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)；T₀代植株经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T₁代种子；T₁代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T₂代种子，同时随机选取阳性苗和阴性苗按照步骤4的方法进行qRT-PCR检测，确定过表达TaNAC15的表达量。T₂代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T₃代种子。

将重组农杆菌CK按照上述方法转化到小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，直到得到T₃代转pCAMBIA3301小麦株系。

T₀代表示转化当代所长成的植株；T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株。T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

上述农杆菌介导的基因转化法的具体步骤如下：

重组农杆菌Y接种于含有25mg/L壮观霉素的YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5。取小麦幼胚放置于装满保存液的2mL离心管，46℃热处理3min，4℃、2000转/分钟离心10分钟。将准备好的重组农杆菌加入处理好的幼胚，22℃黑暗培养3天，转移到新的培养基上28℃黑暗培养7-10天。通过不同浓度草胺膦筛选，最后转移到分化培养基上，分化后转移到生根培养基上培养，一定大小后移入营养土中。

4、qRT-PCR检测转基因小麦

取步骤3获得的野生型小麦、T₃代转pCAMBIA3301小麦株系、T₃代转TaNAC15小麦株系(OE1-OE9)，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product,USA)测定浓度，统一取5微克跑0.8％琼脂糖胶。取1微克总RNA，用重组M-MLV反转录酶，以1微克Oligo(dT)23(Promega)为引物，进行cDNAs的合成，用特异引物F2和R2对基因TaNAC15的cDNA进行qRT-PCR定量，以小麦的基因TaActin1为内参，结果如图9所示。

上述引物的序列如下：

F2：5’-TTGGGTGACTTGGTACAAGCC-3’(序列表序列7)；

R2：5’-GTTCGACCTCTACTTCTAATTTGG-3’(序列表序列8)；

FC2：5’-AAATCTGGCATCACACTTTCTAC-3’(序列表序列9)；

RC2：5’-GTCTCAAACATAATCTGGGTCATC-3’(序列表序列10)。

图9的结果表明，T₃代转TaNAC15小麦株系OE1-OE9中目的基因TaNAC15的表达量显著高于野生型WT。因此，选取三个表达量较高的T₃代转基因阳性株系进行后续实验。分别命名为OE2、OE4、OE9。

5、转基因小麦的抗旱性表型分析

取T₃代转TaNAC15小麦株系(OE2、OE4、OE9)、野生型小麦(WT)植株和T₃代转pCAMBIA3301小麦株系，转移到装有250g营养土的钵中，正常条件下生长21天后，进行干旱处理(即停止浇水)，20-30天后，表型差异明显即WT植株叶片明显干枯而OE2、OE4、OE9株系叶片严重萎蔫时复水。复水3天后统计各株系植株的存活率(将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长和收种的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于48株，取平均值进行统计分析。

结果如图10所示，可以看出，T₃代转TaNAC15小麦株系复水后的存活高于野生型小麦。

复水3天后统计各株系植株的存活率结果如图11所示，可以看出，T₂代转TaNAC15小麦株系复水后的存活率为79％—87％，显著高于野生型小麦。

T₃代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。

6、转基因小麦在干旱胁迫下气孔开度观察

取野生型小麦(WT)、T₃代转pCAMBIA3301小麦株系、T₃代转TaNAC15小麦株系(OE2、OE4、OE9)植株，转移到装有250g营养土的钵中，正常条件下生长21天后，进行干旱处理(即停止浇水)，20天后，观察它们的气孔开度变化。将正常生长及干旱胁迫下的小麦叶片于2.5％戊二醛固定液中固定，包埋切片后于电镜下观察气孔开度。统计气孔比率，完全打开，部分打开及完全关闭的气孔数目占总气孔数目的百分比(％)。

结果如图12，可以看到，在正常生长条件下，T₃代转TaNAC15小麦株系和野生型小麦叶片的气孔开度没有明显差异。但是，干旱胁迫后，T₃代转TaNAC15小麦株系中已关闭的以及部分关闭的气孔数目明显多于野生型小麦(WT)植株。

T₃代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。

因此TaNAC15基因可能在干旱响应气孔关闭过程中起重要作用。

7、转基因小麦干旱胁迫下水分利用效率分析

取T₃代转TaNAC15小麦株系(OE2、OE4、OE9)、T₃代转pCAMBIA3301小麦株系及野生型(WT)植株，转移到装有250g营养土的钵中，正常条件下生长21天后，进行干旱处理(即停止浇水)，并在停水后0，4，8，12，16，20，24，28天时测定水分利用效率(水分利用效率＝光合速率/蒸腾速率，光合速率及蒸腾速率采用LI-COR/LI-6400XT便携式光合作用测量系统进行测定)。

结果如图13，可以看到，随着干旱胁迫处理，T₃代转TaNAC15小麦株系水分利用效率明显高于野生型(WT)植株。

T₃代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。

8、转基因小麦RNA-seq分析

取T₃代转TaNAC15小麦株系(OE2、OE4)及野生型(WT)小麦苗龄8天的植株，进行PEG胁迫0h和6h处理，每个株系至少3棵苗，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product,USA)测定浓度，合格后送北京博奥生物技术有限公司进行转录组测序并进行数据分析。

结果如图14-图17所示。

图14-图17的结果表明，正常生长及干旱处理下的T₂代转TaNAC15小麦株系中，涉及到水分胁迫应答，ABA胁迫应答等生物学途径的基因普遍上调表达。

实施例5的结果表明，蛋白TaNAC15及其编码基因具有调控植物抗旱性的功能，在植物中过表达蛋白TaNAC15的编码基因，可以提高植物的抗旱性。

SEQUENCE LISTING

<110>西北农林科技大学

<120>植物抗旱相关蛋白TaNAC15及其编码基因与应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> Triticum aestivum L.

<400> 1

Met Asp His Gly Phe Asp Gly Ala Leu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Arg

1 5 10 15

Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Met Tyr Tyr Leu Cys Arg Lys

20 25 30

Cys Gly Gly Leu Pro Ile Ala Ala Pro Val Ile Ala Glu Val Asp Leu

35 40 45

Tyr Lys Phe Glu Pro Trp Arg Leu Pro Glu Lys Ala Ala Gly Gly Gly

50 55 60

Pro Asp Ala Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Thr Gly Tyr Trp Lys

85 90 95

Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro Val Gly Ser Pro Arg Pro Val Ala Ile

100 105 110

Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys Pro Pro Lys Gly Val Lys

115 120 125

Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser

130 135 140

Ala Ala Ala Arg Lys Lys Ser Asn Asn Ala Leu Arg Leu Asp Asp Trp

145 150 155 160

Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys Gly Val Ile Glu Arg Tyr Asp

165 170 175

Thr Ala Asp Ser Asp Val Ala Asp Val Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala

180 185 190

Ala Arg Asn Pro Arg Pro Gly Gln Tyr His Ala Ala Gly Pro Ala Met

195 200 205

Lys Val Glu Leu Ser Asp Tyr Gly Phe Tyr Gln Gln Pro Ser Pro Pro

210 215 220

Ala Thr Glu Met Leu Cys Phe Asp Arg Ser Gly Ser Ala Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ser Asn Ser Asn His Ser Met Pro Arg Leu His Thr Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Ser Glu Arg Ala Leu Ser Ser Pro Ser Pro Asp Phe Pro Ser Asp Met

260 265 270

Asp Tyr Ala Glu Ser Gln His Ala Ala Gly Leu Ala Ala Gly Trp Pro

275 280 285

Gly Asp Asp Trp Gly Gly Val Ile Glu Asp Asp Gly Phe Val Ile Asp

290 295 300

Gly Ser Leu Ile Phe Asp Pro Pro Ser Pro Gly Ala Phe Ala Arg Asp

305 310 315 320

Ala Ala Ala Phe Gly Asp Met Leu Thr Tyr Leu Gln Lys Pro Phe

325 330 335

<210> 2

<211> 1803

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 2

cattccaagt cttcccccca agctcgagcc gccgccgccg ccgatcagcc gaaccagccg 60

ccgatccaac caatctcccg agcgcccgcc ctccgagctc aagccccgtt cgtgaatgga 120

ccacggcttc gacggcgctc tccagctgcc cccggggttc aggttccacc ccacggacga 180

ggagctggtg atgtactacc tttgccgcaa gtgcggcggc ctgcccatcg ccgcgccggt 240

gatcgccgag gtcgacctgt acaagttcga gccgtggagg ctgccggaga aggcggcggg 300

aggggggccg gacgccaagg agtggtactt cttctcgccg cgcgaccgca agtaccccaa 360

cgggtcgcgg ccgaaccgcg ccgccgggac cgggtactgg aaggccaccg gcgccgacaa 420

gcccgtgggg tcgccccgcc ccgtggccat caagaaggcc ctcgtcttct acgccggcaa 480

gccccccaag ggcgtcaaga ccaactggat catgcacgag taccgcctcg ccgacgtcga 540

ccgctccgcc gccgcccgca agaagtccaa caacgcgctc aggctggatg actgggtgct 600

ctgccgaatc tacaacaaga agggcgtgat cgagcggtac gacacggcgg actccgacgt 660

ggccgacgtc aagccggcgc cggcgccggc tgccaggaac ccgcggccgg gccagtacca 720

cgctgctggg ccggcgatga aggtcgagct gtccgactac gggttctacc agcagccgtc 780

gccgccggcc acggagatgc tctgcttcga ccgctccggg tcggcggacc gggactccaa 840

ctcgaaccac tccatgccgc gcctgcacac ggactccagc tcctcggagc gcgcgctgtc 900

ctcgccctcg cccgacttcc cgagcgatat ggactacgcg gagagccagc acgcggccgg 960

cctcgccgcg gggtggccgg gcgacgactg gggcggcgtc atagaagacg acgggttcgt 1020

catcgacggc tcgctcatct tcgacccgcc gtcgccgggc gccttcgccc gcgacgccgc 1080

cgcgttcggg gacatgctca cgtacctgca gaagccgttc tgaatgaacg cggcatccgt 1140

cagacccctc ctccttagca gcctccacta acatgttcgt caggtctcgt gtaattcggt 1200

ctgcaagctt ccgaaaccaa tgcagattag agaaaactta gtgaggatta acccgcacaa 1260

atctgatgcc cctagatcga tcgatcgggg ttcggatgca gagttttccc aaacgcacgt 1320

atataccagg tgttagcctc gtcaggtttt ggatggcatt tgggtgactt ggtacaagcc 1380

aggatcgttg taccatgtgc cctgctgccc ctgctccttg gccgccgctt ggacatggca 1440

agcatgcatg gtcaggtagc cgtcgggtaa tatttcaact tttgccgtgg tagtacattc 1500

caaccaaatt agaagtagag gtcgaacaag aagatgaaac tgaagttttg ggttcaggag 1560

ctgtggatcg tgttgtgtag ctagtagtgt agagctggtt cgggttatta ttttcttctc 1620

gaaggacttg ggttcagtgt cgtggcagct ggctgacgct tttaggtttt gttgtgtcat 1680

gtgtaattgt aattgcgaag atggatgtga tagagtcgat ttcagtggtg gtctctcgcg 1740

tgacctggaa agtcaatttt ttatgcaatt atcgtaataa ttaaacagtg atgtcaattg 1800

tag 1803

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gtgctctgcc gaatctacaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gaacccgtcg tcttctatga c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ggtaacattg tgctcagtgg tgg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gcatcaattc gatcactcag ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ttgggtgact tggtacaagc c 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gttcgacctc tacttctaat ttgg 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aaatctggca tcacactttc tac 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gtctcaaaca taatctgggt catc 24

Claims

1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.权利要求1所述蛋白在作为或者制备转录激活剂中的应用。

6.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用。

7.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育抗旱植物或抗旱性提高的植物中的应用。

8.一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白的含量或活性，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

2)所示的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码权利要求1所述蛋白核酸分子的表达量，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白的含量或活性，或，所述提高目的植物中编码权利要求1所述蛋白核酸分子的表达量，均是通过将编码权利要求1所述蛋白核酸分子导入目的植物中实现。

10.根据权利要求6或7所述的应用或权利要求8或9所述方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。