CN110590925A - 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域；特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的蛋白PpVPG及其编码的核酸序列和应用。本发明公开了蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG以及编码该蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的基因；蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG，能用于制备蝶蛹金小蜂毒腺分泌的毒液蛋白PpVPG，该蛋白能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。

Description

蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的蛋白PpVPG及其编码的核酸序列和应用。

背景技术

人类从事农事活动已有上万年的时间，植物的驯化产生了有害生物的防治问题，人们长期寻找能够防治害虫的有效方法，通过多年的探索，害虫综合治理策略被提出，以期达到在经济受害允许水平之下，获得最佳的经济、生态、社会效益的结果。目前，害虫防治多采用化学防治，从1939年开始人工合成DDT到后来有机磷等农药和氨基甲酸酯，使得化学农药成为早期害虫防治的主要手段。但是长期地高频率使用化学农药，出现了害虫产生抗药性，有益生物杀伤，农药中毒，农药残留超标，害虫再猖獗以及次要害虫上升为主要害虫等问题，这些问题最终导致了生态平衡遭到破坏和环境受到污染，从而影响人类健康。

利用生物手段对害虫进行控制能有效解决抗药性以及化学农药产生的污染等问题，生物防治有极大的优越性，不仅能够有效地保护天敌，发挥持续控制作用，还能有效抑制害虫大量繁殖，从而保护生态环境。此外，人们一直探索通过转基因技术去解决害虫造成的各种问题。随着转Bt基因的作物的连续种植，靶标害虫也对其产生抗性，因此，有学者开始从其他植物或动物中挖掘具有杀虫活性的蛋白质或多肽，通过技术手段，培育新的转基因抗虫植物。

寄生蜂作为一种重要的害虫生物防治的作用物，在传统生物防治中起到了一定的作用。目前，寄生蜂与寄主之间的互作关系的有了一定的研究，包括寄生蜂能够抑制寄主的免疫反应、调控寄主的生长发育，寄主防御寄生蜂入侵等。已有的研究明确了寄生蜂利用自身携带的因子(如毒液、多DNA病毒等)可以抑制寄主的免疫反应。未来，如果将寄生蜂的寄生因子与现代生物技术结合，用于研制新型生防制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，将红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草中，可减缓烟草天蛾(Manduca sexta)的生长，与非转基因烟草相比，危害明显降低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG基因及其编码的蛋白质和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG，其具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

备注说明：SEQ ID NO：2包含了信号肽(Met Met Lys Ile Ala Leu Phe Leu AlaVal Gly Leu Val Ala Val Phe Asn Ser Pro Val Thr Ala)。

作为本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的改进：该蛋白为其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。

本发明还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述；或者与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。

SEQ ID NO：1中的最后三个碱基“TAA”为终止密码子。

作为本发明的基因的改进：序列中包含SEQ ID NO：1中8～66个连续核苷酸。

本发明还同时提供了上述蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的用途：用于制备蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG，该抑制蛋白能用于抑制菜粉蝶血淋巴PPO的激活。

本发明所提供的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG及其编码的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。

本发明具体是通过以下技术方案实现的：本发明利用蝶蛹金小蜂基因组和转录组获得了毒液蛋白PpVPG基因全部序列，对提取的蝶蛹金小蜂的RNA进行反转录得到cDNA，进行分子克隆、原核表达和非变性条件下纯化，获取原核表达的PpVPG蛋白(氨基酸序列如SEQID NO：2所示)。原核表达的PpVPG能够抑制农业害虫菜粉蝶(Pieris rapae)蛹酚氧化酶前体(prophenoloxidase，PPO)的激活，阻止其形成有活性的酚氧化酶(phenoloxidase，PO)，具有抑制寄主体液免疫的功能。

本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

本发明分离出的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该蛋白是具有SEQID NO：2序列的蛋白。

本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-66个连续核苷酸。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是昆虫细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核酸序列指：编码具有蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG活性的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，SEQ ID NO：1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG指：具有蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG酶活性的SEQ ID NO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG相同功能的SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG活性片段和活性衍生物。

在本发明中蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG保守性变异蛋白指：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。

本发明还包括蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG或蛋白的类似物。这些类似物与毒液蛋白PpVPG的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L－氨基酸的残基(如D氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ－氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG时，可以将蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG表达载体。

如本发明所述的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与蛋白的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于蛋白DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为真核细胞。常见的真核宿主细胞指的是昆虫细胞系。

还可用Northern印迹法技术或荧光定量PCR分析蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG基因产物的表达，即蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG同源基因或同源蛋白。

本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。利用本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG，通过各种常规筛选方法，可筛选出蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG发生相互作用的物质，或者受体等。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明在调控蝶蛹金小蜂的寿命上具有明显作用，蝶蛹金小蜂寿命的延长对防治十字花科重要害虫菜粉蝶有重要的作用。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG正是对农业害虫的生物防治上具有很大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG原核表达纯化图；

M为标准蛋白，1道为含pET-32a-PpVPG质粒大肠杆菌BL21(DE3)诱导后上清，2道为含pET-32a质粒大肠杆菌BL21(DE3)诱导后上清，3道为大肠杆菌中纯化后的蝶蛹金小蜂毒液PpVPG融合蛋白，4道为大肠杆菌中纯化后的pET-32a载体蛋白。

图2为本发明的原核表达的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG基因表达产物对菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；

阴性对照为PBS缓冲液，原核表达pET32a空载蛋白；阳性对照为苯硫脲PTU。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、重组的pET32a-PpVPG的表达和纯化

1.1、RNA的提取

在Leica MZ 16A显微镜(Leica,Germany)下，将雌蜂用75％酒精消毒并擦拭干净，将其消化道从腹部扯出，浸泡在载玻片上无菌的含1unit/μL RNA酶抑制剂(TOYOBO,Osaka,Japan)的磷酸盐缓冲液(PBS)液滴中，收集消化道于TRIzol试剂中(Invitrogen,California,USA)，RNA提取方法如下：

1)准备取羽化第三天的蝶蛹金小蜂雌蜂多头，收集到一个指形管中，在-80℃冷冻10min，取出后插入冰盒中。取寄生蜂在滴放在有PBS缓冲液的载玻片上使用解剖镊在雌蜂腹部将毒腺取出，收集解剖的毒腺，加入1ml Trizol，剧烈振荡，室温静置5min。

2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置3min。

3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。

4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。

6)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于-80℃超低温冰箱中长期保存)。

7)晾干离心管，加入适量的无RNA酶水溶解(65℃促溶)，分光光度计测量OD260/OD280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。

1.2、cDNA第一链合成

采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgen,Beijing,China)试剂盒将1μg RNA反转录成单链cDNA模板，体系如下：

总RNA：1μg

Anchored Oligo(dT)₁₈Primer(0.5μg/μl)：0.5μl

Random Primer(0.1μg/μl)：0.5μl

TransScript RT/RI Enzyme Mix:1μl

2×TS Reaction Mix：10μl

gDNA Remover:1μl

Rnase-free Water:to 20μl

配好体系之后，25℃孵育10分钟，42℃孵育1h，最后85℃孵育5分钟。

通过Premier primer 5设计原核引物(正向引物5’-3’：ATGATGAAAATCGCACTT；反向引物5’-3’：TTAATTCTCCTGGGGTTC)。以cDNA为模板使用LA Taq酶(TaKaRa，大连，中国)，进行PCR扩增：反应液体系如下：

TaKaRa LA Taq(5U/μl)：0.5μl

10×LA PCR Buffer II：5μl

dNTP Mixture：8μl

cDNA(浓度为100ng/μl)：1μl

PCR Forward primer(20μM)：1μl

PCR Reverse primer(20μM)：1μl

RNAase-free Water to 50μl

将上述试剂混匀后，轻轻振荡混匀，低速离心后，放入PCR扩增仪。

PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述。该基因编码的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的具有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

1.3、重组蛋白的表达和纯化

通过转录组和基因组数据获得的PpVPG全长，以全长ORF(去掉信号肽)设计构建原核表达载体的引物(PpVPG重组质粒酶切位点为BamHⅠ和HindIII)，原核表达通过大肠杆菌表达系统进行，通过Premier primer 5设计原核引物(正向引物5’-3’：

GCCATGGCTGATATCGGATCCGCTAGATTGAGCGAAAGT；反向引物5’-3’：

CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAATTCTCCTGGGGTTC。以上述合成cDNA作为模板，

PCR体系如下：

cDNA(浓度为100ng/μl)：1μl

Forward primer(10μM)：2μl

Reverse primer(10μM)：2μl

2×TransStart FastPfu PCR SuperMix：25μl

ddH₂O：20μl

Total volume：50μl；

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min；得片段扩增产物；

配制1％琼脂糖凝胶，PCR产物经电泳验证片段大小后，用Axygen Gel ExtractionKit凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

随后，使用BamH I和HindIII对PCR产物及pET32a空载质粒进行双酶切，酶切步骤如下：

1)配制反应液：

10×Buffer 5μL

BamHⅠ 2μL

HindIII 2μL

pET32a质粒 41μL

2)离心混匀后，37℃反应6h，得线性化pET32a质粒；

使用ClonExpress One Step Cloning Kit(Vazyme,China)试剂盒将PCR扩增获得的目的片段与线性化pET32a质粒(酶切位点：BamHI和HindIII)进行同源重组，同源重组体系为：

5×CE II Buffer：4μl

线性化克隆载体(pET32a质粒载体)：1μl

插入片段扩增产物：2μl

ExnaseTM II：2μl；

反应条件为：37℃反应30分钟，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却15分钟，直接进行转化或者存储于-20℃待用；至此得到了含有PpVPG基因序列的pET32a重组质粒(pET32a-PpVPG)。

将未重组pET32a空载质粒(pET32a)和含有PpVPG序列的重组的pET32a质粒(pET32a-PpVPG)分别转入到表达菌株BL21(DE3)中，将成功插入片段的菌株送到上海博尚测序公司进行测序。验证无误后，随后将菌液涂在含有氨苄抗性的固体培养基上进行过夜培养。然后对含有PpVPG序列的pET32a蛋白及pET32a空载蛋白分别进行原核表达。

原核表达过程：

1.挑取LB固体培养基上长出来的单菌落于液体培养基(含有氨苄抗生素)中，放入摇床中进行培养，温度37℃，220RPM培养过夜。

2.次日加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2h至OD600nm 0.5-0.6。

3.加入200ul的1M IPTG在28℃诱导表达3.5h。

4.在4℃离心收集菌体，转速3000×g，离心15min，弃上清。

5.加入BugBuster Master Mix细胞裂解液对细胞进行裂解，摇床4℃孵育1小时。

6.在4℃，10,000×g离心15min，留取上清，加入400ul镍柱(Ni-NTA His*Resin)4℃结合过夜。

7.离心收集镍柱后，用20mM imidazole洗涤液洗涤镍柱，洗去杂蛋白(1ml×3次)。

8.加入300ul 300mM imidazole洗脱液,让洗脱液与镍柱充分结合1h，离心收集上清。向镍柱中再次加入300ul的洗脱液，洗脱1h，离心收集上清。

9.上清中加入PBS缓冲液进行透析。

10.用8％-16％的SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量。

至此，得到了pET32a空载蛋白(pET32a)及pET32a-PpVPG重组蛋白(pET32a-PpVPG)。

所得结果如图1所述，由图1第4泳道可看出纯化的目的蛋白PpVPG条带单一，片段大小正确，可用于后续的功能研究。

泳道1为pET32a-PpVPG细胞裂解上清，泳道2为pET32a细胞裂解上清，泳道3为纯化透析后的pET32a-PpVPG重组蛋白，泳道4为纯化透析后的pET32a空载蛋白。

实施例2、重组的PpVPG蛋白对菜粉蝶PPO激活抑制作用的测定

在冰上取单头菜粉蝶蛹血淋巴于1.5ml预冷离心管中，并立即置于冰上，在4℃下，3300×g离心5分钟后，转移上清于一新预冷的1.5ml离心管中，去除血细胞，用于酚氧化酶本底的测定。

每个样品分别取2μl血淋巴加入到96孔板孔里含10μl TBS(pH7.4)和10μl TBS里含0.5μg藤黄微球菌(Micrococcus luteus)里，室温放置20分钟，加入200μl L dopa(2mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.001OD的量。若加有TBS的和血淋巴的样品孔OD值较低，且加有TBS和藤黄微球菌的血淋巴的样品孔OD值较高，则说明该血淋巴在TBS里只有很低或没有酚氧化酶活性，而在藤黄微球菌(M.luteus)里有很高的酚氧化酶活性，选取这样的血淋巴样品用于酚氧化酶前体(PPO)激活的实验。

菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶前体(PPO)激活抑制试验：5μl样品+5μl藤黄微球菌(0.1μg/μl)+5μl 50mMDopa混匀，十分钟后，加入10μl血淋巴，其中，样品蛋白分别为：阴性对照PBS，原核表达的pET32a质粒蛋白(即，pET32a)；原核表达的PpVPG融合蛋白(即，pET32a-PpVPG)；阳性对照苯硫脲PTU，在470nm波长下测定2小时分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0.001OD的量，每个样品重复3次，数据采用DPS数据分析软件进行方差分析统计分析(唐启义和冯明光，2007)。具体结果如图2所示。标有不同字母的数据即为在统计上有差异的数据，由图2可见，PTU作为阴性对照，已知它能抑制PPO激活，因而OD值较低；PBS作为阳性对照，已知它不能抑制PPO激活，因而OD值偏高；加有pET32a-PpVPG蛋白的样品OD值较低，加入pET32a蛋白的样品OD值偏高；且加入pET32a-PpVPG蛋白的样品与pET32a蛋白和PBS的组别的OD值在统计学上有显著差异，因此上述试验结果证明：本发明的PpVPG蛋白对菜粉蝶血淋巴中的PPO激活有抑制作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 303

<212> DNA

<213> 蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)

<400> 1

atgatgaaaa tcgcactttt cttagccgtt ggtttggttg ccgtcttcaa ctctccagta 60

accgccgcta gattgagcga aagtgatggg cagctacttc ttgatgccat cacagaagaa 120

attgcaaacc aaaacctcca gtgcgcagat gttgactcat attgttccca gaataaccca 180

agtcatatgc cagaaaatat atgcccggct gtattgaaag cacacctgtg tgaccacgta 240

aacagtgcat ctggaatgat caaggtacta gaggatcttg taaaagaacc ccaggagaat 300

taa 303

<210> 2

<211> 100

<212> PRT

<213> 蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)

<400> 2

Met Met Lys Ile Ala Leu Phe Leu Ala Val Gly Leu Val Ala Val Phe

1 5 10 15

Asn Ser Pro Val Thr Ala Ala Arg Leu Ser Glu Ser Asp Gly Gln Leu

20 25 30

Leu Leu Asp Ala Ile Thr Glu Glu Ile Ala Asn Gln Asn Leu Gln Cys

35 40 45

Ala Asp Val Asp Ser Tyr Cys Ser Gln Asn Asn Pro Ser His Met Pro

50 55 60

Glu Asn Ile Cys Pro Ala Val Leu Lys Ala His Leu Cys Asp His Val

65 70 75 80

Asn Ser Ala Ser Gly Met Ile Lys Val Leu Glu Asp Leu Val Lys Glu

85 90 95

Pro Gln Glu Asn

100

Claims (5)

1.蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG，其特征是：为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG，其特征是：所述蛋白为蛋白、其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。

3.编码如权利要求1或2所述的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的基因，其特征是：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述；或者与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征是：所述核苷酸序列中包含8～66个连续核苷酸。

5.如权利要求1或2所述的蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpVPG的用途，其特征是：用于制备蝶蛹金小蜂毒腺分泌的毒液蛋白PpVPG，该蛋白能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。