CN107523572A

CN107523572A - 菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SPI基因及应用

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Publication number: CN107523572A
Application number: CN201710818904.9A
Authority: CN
Inventors: 陈学新; 谷启娟; 时敏; 黄健华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2037-09-12
Also published as: CN107523572B

Abstract

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域，旨在提供一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SPI基因及应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由该基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由该基因体外原核表达获得的重组蛋白能够有效抑制其寄主小菜蛾血淋巴酚氧化酶原的激活，从而抑制寄主血淋巴的黑化作用，减弱寄主的免疫反应，为获得新型转基因抗虫作物提供了序列参考。该重组蛋白能够抑制枯草杆菌蛋白酶A，胰蛋白酶和猪胰腺弹性蛋白酶的活性，对于开发丝氨酸蛋白酶抑制剂类药物具有重要的意义。本发明能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT‑SPI重组蛋白，为进行CvT‑SPI的活性实验提供了便利。

Description

菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及其编码的核酸序列和潜在应用价值。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类分布广泛于植物、动物、微生物等中，是丝氨酸蛋白酶活性的调节剂。根据其序列的同源性、半光氨酸残基和分子中二硫键的数目，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL(Trypsin Inhibitor LikeCysteine Rich Domain)等几个家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂参与生物体内一系列的生理和病理过程的调控，如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等发挥着关键性的调控作用，从而维持生命体内稳态。丝氨酸蛋白酶抑制剂在在医学上具有很好的应用价值，丝氨酸蛋白酶抑制在临床上用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗已有报道。

害虫一直严重危害着农作物的安全生产，给粮食生产带来了严重的损失，而长期以来害虫的防治主要依赖于化学农药，其后果是导致害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药残留以及环境污染等，迫切需要新的安全、高效、低毒的防治方法。随着转基因技术的发展，提供了一种新的害虫防治的新方法。菜蛾盘绒茧蜂(Cotesiavestalis)是防治小菜蛾(Plutellaxylostella)的主要优势寄生性天敌，寄生蜂利用多种寄生因子如毒液、多分DNA病毒、类病毒颗粒、畸形细胞等寄生因子破坏寄主免疫反应，调控寄主生长发育等以保证其后代在寄主血腔或者体表正常发育。畸形细胞(Teratocytes)是菜蛾盘绒茧蜂卵在寄主体内发育过程中由蜂卵的浆膜层解离下来的一种特殊细胞，畸形细胞能够分泌一些功能蛋白，其中也包括一些胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂。将寄生蜂的寄生因子的基因结合转基因生物技术，有望用于获得新型转基因抗虫作物，为鳞翅目害虫生物防治开辟新的途径。目前，将红足侧沟茧蜂(Microplitisdemolitor)畸形细胞的分泌蛋白转入烟草，并使烟草天蛾(Manducasexta)生长明显缓慢，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案如下：

提供一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供了由前述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供了由前述基因编码的蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有95％～100％同源性，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。

本发明进一步提供了由前述蛋白制得的重组蛋白，是将所述蛋白去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中，所述重组蛋白的制备方法包括：将去除信号肽的序列用于构建原核表达载体，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag纯化重组蛋白。

本发明进一步提供了前述重组蛋白在制备丝氨酸蛋白酶抑制剂药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因序列经基因数据库比对分析，未发现任何相同基因。本发明的菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因所编码的氨基酸序列进行蛋白数据库比对分析，未发现任何相同蛋白。

2、本发明克隆了一个菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的cDNA的全长，该基因编码的氨基酸序列比对结果显示，CvT-SPI含有一个TIL(Trypsin InhibitorLike Cysteine Rich Domain)结构域，该菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶CvT-SPI基因体外原核表达获得的重组蛋白能够有效抑制其寄主小菜蛾血淋巴酚氧化酶原的激活，从而抑制寄主血淋巴的黑化作用，减弱寄主的免疫反应，为获得新型转基因抗虫作物提供了序列参考。同时，该重组蛋白能够抑制枯草杆菌蛋白酶A，胰蛋白酶和猪胰腺弹性蛋白酶的活性，对于开发丝氨酸蛋白酶抑制剂类药物具有重要的意义。

3、本发明通过基于高通量转录组测序方法，以菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞为实验材料，通过基因注释，筛选其表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂的EST序列标签，并通过RACE方法得到CvT-SPI的cDNA全长序列。得到CvT-SPI的cDNA核苷酸序列后，利用大肠杆菌表达系统进行诱导表达蛋白，利用His-tag能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT-SPI重组蛋白，为进行CvT-SPI的活性实验提供了便利。

附图说明

图1:菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI的基因验证；

图2:菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核诱导表达和纯化的蛋白电泳图，其中1，没有加IPTG诱导结果；2，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导结果；3，纯化浓缩后的蛋白样品；M，蛋白Marker；

图3：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI的基因序列和氨基酸序列分析，其中下划线标注CvT-SPI的信号肽序列；黑色加粗斜体表示多腺苷酸化信号；灰色阴影部分表示半光氨酸残基(Cysteine,C)；*表示终止密码子；

图4:菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对胰蛋白酶的抑制效果；

图5：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对弹性蛋白酶的抑制效果；

图6：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对枯草杆菌蛋白酶A的抑制效果；

图7：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对寄主血淋巴PPO激活的影响；其中阴性对照是1μg/μl BSA,阳性对照是饱和的PTU,诱导剂为浓度0.1μg/μl的灭活藤黄微球菌Micrococcus luteus,空白是TBS缓冲液，浓度是0.01M Tris-HCl(pH＝7.4)。

具体实施方式

本发明提供了一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，该基因的全长是696bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中该基因开放阅读框(ORF)是480bp，编码160aa，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸组成的蛋白质或者

本发明提供了一种与序列SEQ ID NO.2限定的氨基酸序列同源性在95％～100％编码相同功能蛋白的氨基酸序列或者由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。

本发明提供了用于菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因体外重组表达的序列，是将所述蛋白氨基酸序列去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因cDNA的克隆方法:以菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞总RNA反转录得到cDNA为模板，构建cDNA文库，测序获得菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞转录组，在转录组数据中找出编码SPI的EST序列，然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因cDNA全长序列。

本发明提供了一种含有菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的表达载体PET-28a，以及含有菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的表达载体PET-28a的表达菌株BL21。

本发明提供了一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因重组蛋白制备方法，流程如下：将菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的第88位到第505位之间的序列连接到表达载体，获得重组表达质粒，利用大肠杆菌原核表达系统诱导表达，用HisTALONTM重力柱纯化上清表达的重组蛋白，然后使用超滤管进行去离子浓缩得到重组蛋白。

本发明提供了所述丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的用途：用于制备菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白，该抑制剂蛋白能够有效抑制菜蛾盘绒茧蜂血淋巴酚氧化酶原(proPhenoloxidase,PPO)的激活，该抑制剂基因在研发新品种转基因抗虫植物方面具有潜在的应用价值。

本发明提供了所述丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因体外获得的重组蛋白在蛋白酶抑制剂类药物开发上的潜在应用价值。

为进一步解释说明本发明，下面结合具体实施例对本发明内容作进一步详细说明，实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施案例1:

菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的cDNA克隆

1.1畸形细胞的收集

待被寄生的小菜蛾分别饲喂3、5、7d后将其从甘蓝叶片上取下，用75％的乙醇进行虫体表面消毒并置于加入终浓度均为50ng/μl的氨苄青霉素(amplicillin)和卡那霉素(kanamycin)的HyClone SFX-Insect(Thermo Scientific)细胞培养基，在体视解剖镜下用解剖镊小心的撕开表皮，防止损伤小菜蛾的脏器，并将被解剖的小菜蛾残体和寄生蜂幼虫移出培养皿。将含有畸形细胞和寄主血淋巴的培养皿室温下放置30min，以使寄主的血细胞粘附于培养皿壁上。将畸形细胞用移液器逐颗吸出，并在加入氨苄青霉素和卡那霉素的Hyclone细胞培养基中洗涤5遍。将洗涤完的畸形细胞移入装有HyClone SFX-Insect(Thermo Scientific)细胞培养基的1.5ml的离心管中，4℃条件下650rcf/min离心5min，弃上清收集沉淀，以获得纯畸形细胞。

1.2TRIzol法提取总RNA

1)往获取的畸形细胞中加入1ml TRIzol试剂，充分研磨匀浆，室温静置5min。

2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置2min。

3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。

4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。

6)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液。

7)晾干离心管，加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶)，分光光度计测量OD260/OD280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。

1.3cDNA第一链合成

(1)往0.5ml无菌的离心管中分别加入1μl提取的RNA，1μl SMARTⅣ/5’PCR正向引物，1μl CDSⅢ/3’PCR反向引物，加2μl DEPC H2O使总体积达到5μl。

(2)混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃孵育2min。

(3)迅速将离心管冰浴2min，短暂离心。

(4)往离心管中分别加入2μl 5×Frist-strand Buffer，1μl 20mM二硫苏糖醇(DTT)，1μl 10mM dNTP，1μl Reverse Transcriptase反转录酶，反复吹打混匀，短暂离心。

(5)42℃孵育1h。

(6)将离心管置于冰上2～3min，终止反应。取一部分用于进一步实验，其余于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

1.4dsDNA合成

(1)往0.5离心管中分别加入1μl第一链合成反应产物，5μl 10×LA Buffer(Mg2+free)，5μl Mg2+，8μl dNTP，1μl SMARTⅣ/5’PCR正向引物，1μlCDS Ⅲ/3’PCR反向引物，0.5μl LA Tag DNA聚合酶，29.5μl ddH2O，充分混匀，短暂离心。

(2)PCR仪中按以下扩增程序(95℃，20s；25～28×(95℃，5s；68℃，6min))扩增。

(3)取5μl PCR产物用于凝胶检测(检测条带所含分子量范围及条带亮暗)，取检测结果良好的1μl产物稀释100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

1.5用RACE的方法扩增菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的5’和3’末端

按Clontech公司试剂盒SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。根据试剂盒的要求，依据已知的CvT-SPI基因EST序列分别设计两条上、下游特异性引物，以进行巢式PCR。所用引物分别为：第一次PCR反应条件为：95℃，3min；30×(95℃，25s；58℃，20s；72℃，1min)；72℃，6min。第二次PCR以第一次PCR产物为模板进行扩增，反应条件为：95℃，3min；35×(95℃，25s；60℃，20s；72℃，1min)；72℃，6min。将扩增产物连接到pMD-19T载体上得到重组质粒，并用pMD-19T的通用引物M13±进行序列测定，测定结果与已知序列片段进行比较和序列拼接。序列拼接结果在NCBI上进行BlastX，结果显示该基因具有一个TIL(Trypsin Inhibitor Like Cysteine Rich Domain)结构域,结构域中包含6个半光氨酸Cysteine。

实施例2：

菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核诱导表达和纯化

2.1构建CvT-SPI的重组表达载体

(1)根据获得的CvT-SPI序列的全长设计引物，正反向引物分别还有BamH I和XhoI酶切位点，扩增基因开放阅读框，去除信号肽，以cDNA为模板，用50μl的LA-taq酶体系做PCR扩增，将扩增的带有酶切位点的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带进行DNA凝胶回收。

(2)分别以PET-28a表达载体质粒和第一步回收的DNA作为DNA模板，配制双酶切体系50μl：限制性内切酶BamH I 2.5μl,限制性内切酶Xho I 2.5μl,DNA模板或者表达载体质粒20μl,酶切buffer 5μl,ddH₂O 20μl。轻轻混匀，短暂离心，37℃酶切20min,然后80℃、5min,停止酶切。

(3)用第二步双酶切的反应产物跑回收胶，切下目的DNA条带，进行DNA凝胶回收

(4)双酶切的表达载体和目的片段连接，连接体系为20μl，分别加入5μl的双酶切后目的片段DNA，2μl双酶切后的表达载体质粒，1ul的T4Ligase，2ul的T4ligase buffer,10ul ddH₂O,4℃条件下，连接过夜。

(5)将连接过夜的产物转化到感受态中，涂在含有抗生素卡那的LB培养基平板上，37℃培养过夜。挑菌斑摇菌，以通用引物T7Promoter引物和T7Terminator引物进行rTaq的菌液检测PCR反应体系，对于阳性样品每份取200ul保存，其余送测序。

(6)对测序结果进行比对，选取正确的保存菌液进行下一步的实验。

2.2菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的蛋白诱导表达

(1)在15ml的无菌三角瓶中加入5ml含有卡那抗性的LB液体培养基，然后加入50μl的含有正确重组质粒的菌液。在37℃，180rpm的摇床中培养过夜，接着取5ml,回收重组质粒。

(2)取5μl的回收的重组质粒，转化到DE3(BL21)感受态菌株中，涂布于含有卡那抗性的LB培养基平板上，37℃培养过夜。挑斑培养菌液至对数期，以通用引物T7Promoter引物和T7Terminator引物进行rTaq菌液检测PCR反应体系，选取其中一份阳性样品，取50μl菌夜加入到装有50ml含有卡那抗生素的LB液体培养基的150ml无菌三角瓶中，37℃，250rmp的摇床中培养对数期，大约OD＝0.6～0.8。

(3)取6支15ml的灭菌后的试管，每管加入5ml加入培养到对数期的菌液，并分别加入0μl，10μl，20μl，30μl，40μl，50μl 100mM IPTG，使六支试管菌液中的IPTG的终浓度分别为0mM，0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM；将试管至于22℃，210rpm的摇床中培养过夜，以诱导蛋白表达

(4)用12％的SDS-PAGE电泳分析(3)诱导表达的蛋白情况，诱导表达的菌液各吸取1ml到2ml的离心管中，12000g离心5min后，去除上清，分别加入60ul的PBS吹打均匀，然后加入15μl的5x的蛋白上样缓冲液，混匀，接着沸水中煮10min，16000g离心后，取上清，即为分析样品。用微量加液器分别吸取5μl以上分析样品加入点样孔中，其中一个空加入蛋白Marker，作为参照。先60V恒压电泳，待样品浓缩胶部分浓缩成一条线后，再调电压到120V，待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳；取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，置于水平摇床上，染色30min；然后用脱色液脱色，期间换脱色液2～3次，直至背景干净透明，条带清晰。用Bio-Rad GS-800Calibrated Densitometer凝胶成像系统观察分析结果并扫描拍照。

(5)根据(4)的成像结果，选取特异性条带最粗的诱导条件，此IPTG浓度作为最优IPTG浓度，作为下一次的扩大培养条件，并将这个条件下的剩余菌液，取2ml，离心去上清；用200μl BugBuster Master Mix裂解，离心取上清，沉淀加200μl的PBS混匀，然后加入蛋白上样缓冲液，沸水中10min，最后跑12％的SDS-PAGE蛋白胶，检测蛋白是可溶性表达还是包涵体表达。如上清中有表达，然后扩大培养，诱导蛋白表达用于纯化重组蛋白。诱导方法参见步骤(2)、(3)，但只使用最优IPTG浓度，用300ml的锥形瓶加入200ml对数期的菌液，进行诱导。

2.3菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因诱导表达蛋白的纯化

(1)按照HisTALON^TM Gravity Columns Purification Kit(Clontech，USA)中的说明书对诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白纯化。具体步骤参照试剂盒中的说明书进行。纯化蛋白用12％的SDS-PAGE检测结果。

(2)采用截留分子量为3kDa的超滤管Ultra-4对重组蛋白进行浓缩，脱盐。第一次使用的超滤管是干燥的，在使用前要进行预冷，加入过膜的ddH₂O，冰浴或者冰箱里预冷几分钟，倒掉水后，加入(1)纯化的蛋白样品。以4000g的转速进行离心，当浓缩到剩余1ml时，加入0.01M TBS(pH＝8.0)，进行缓冲液的置换，这个步骤重复至少4次，最后一次浓度的终体积根据需要的蛋白浓度而定，取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上进行。取出蛋白浓缩液用Bradford方法定量，存于液氮中，后续使用。

实施案例3.

菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的原核表达重组蛋白的活性检测

3.1菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的原核表达重组蛋白对商业化的丝氨酸蛋白酶的抑制活性

本实验检测的蛋白酶分别为牛胰腺糜蛋白酶(bovine pancreaticα-chymotrypsin,Sigma),牛胰蛋白酶(bovine pancreatic trypsin，Sigma),猪胰腺弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase，Sigma)和人血浆凝血酶(thrombin from humanplasma，Sigma)和枯草杆菌蛋白酶A(subtilisin A from Bacillus Licheniformis,Sigma),其对应的底物分别是N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide(Sigma S-7388),Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(Sigma B-3133),N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu p-nitroanilide(Sigma S-8511),N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Argp-nitroanilide acetate salt(SigmaT1637),Z-Gly-Gly-Leup-nitroanilide(SigmaC3022)。

实验方法如下：不同体积的CvT-SPI(1.0μg/μl)的重组蛋白，分别为0μl,2μl,4μl,6μl,8μl,10μl,12μl，分别于以上10μl蛋白酶(1μg/μl),然后每个反应用0.01M Tris-HCl(pH＝8.0)含有0.1M NaCl和1mM CaCl2的缓冲液调节到总体积45μl，在30℃下反应10min；然后加入5μl对应酶特异性显色底物，至显色底物的终浓度为1mM，在30℃条件下，再反应10min；测量OD₄₁₀表示p-nitroaniline产物的增长作为剩余酶活；每个反应重复三次，绘制CvT-SPI重组蛋白浓度依赖型的剩余酶活曲线。

具体结果如图4、5、6所示，试验结果表明：不同量的菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白(1μg/μl)与10ul(1μg/μl)的不同蛋白酶反应，随着加入的重组蛋白的量的增加，胰蛋白酶、弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A的剩余酶活减少，但是胰蛋白酶和凝血酶的的剩余酶活不受影响。当重组蛋白的体积达到12ul时，对胰蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的抑制效果分别达到26％、18.5％、41.8％。结果表明，该重组蛋白对胰蛋白酶、弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A具有一定的抑制效果，但是对胰凝乳蛋白酶和凝血酶没有抑制作用；因此，该重组蛋白具有作为蛋白酶抑制剂类药物的潜在应用价值。

3.2菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对寄主小菜蛾血淋巴酚氧化酶原(PPO)激活的抑制

本发明涉及的诱导剂是灭活的藤黄微球菌(M.luteus),所涉及的试剂包括牛血清蛋白(BSA),苯基硫脲(PTU)和50mM,pH7.4的TBS缓冲液，待测样品是寄主小菜血淋巴。

实验方法如下：1.将Parafilm膜置于冰板上，把用70％酒精清洗晾干的小菜蛾置于parafilm膜上，用镊子夹断小菜蛾腹足，使其血淋巴流出，迅速用毛细管将血淋吸到预冷的1.5ml离心管中备用，此过程避免菌污染。

2.取2ul的血淋巴加入到含有10μl TBS(pH7.4)和10μl TBS含0.5μg藤黄微球菌(M.luteus)的96孔板里，室温诱导60min,加入200μl L-DOPA(2mM/L),在470nM的波长下测定60min，酚氧化酶活性单位U是指每分钟变化的0.001OD的量,每个样品重复3次，选取血淋巴样品在TBS里只有很低或者没有酚氧化酶活性，而在藤黄微球菌(M.luteus)里有很高的酚氧化酶活性的样品用于酚氧化酶原(PPO)激活的实验。

3.小菜蛾血淋巴酚氧化酶前体(PPO)激活抑制试验：TBS缓冲液和BSA(1μg/μl)溶液为阴性对照，饱和的苯基硫脲PTU为阳性对照以及重组表达的CvT-SPI(1μg/μl)蛋白共4个处理，每个处理中加2μl小菜蛾血淋巴，然后加入5μl的藤黄微球菌溶液(0.1μg/μl),室温诱导60min,加入200μl L-DOPA(2mM/L),在470nM的波长下测定60min，酚氧化酶活性单位U是指每分钟变化的0.001OD的量，每个样品重复3次。数据采用SPSS分析软件进行方差分析和统计分析。

具体结果如图7所示，结果表明：本发明的CvT-SPI重组蛋白对于小菜蛾血淋巴酚氧化酶原PPO的激活有极显著的抑制效果。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 696

<212> DNA

<213> 菜蛾盘绒茧蜂(Cotesia vestalis)

<400> 1

tacatgggga gtgttatcaa aaatgttgtc taagaattat aaaattattt ttctcgctgc 60

ggtattttgt ttctcatgga tcgaagcaat accaaccgga gatgttgatg aagattactt 120

aaacttaaac cctagaaaca cagaagctcc acacgattgc cctcaaaatg catactttag 180

cgaaatagta ccagtttgtg aagcttattg cgacgatcca catcctacct tgagtaacag 240

atttggttca gacggccgct tgtgcattga gggctacatc agaaacgcaa ctagcgattg 300

cataagaatc gaagactgtc ctaatatcga gccagagtat tcaggagaat taggaaataa 360

ttcctacgat gagaaagatt ggccggaagt tgaaacaccg aggattgatg atgtaaccga 420

ccaactcagt gacgaggaat ggaaaaagag actcgaagaa atttttggaa ctcctgatga 480

aactccagta gaaattgttg aataattatt aatcaattta gtacattaat ttttattctt 540

attatatcag ttatagaaat ttattgaagc ctcgtgtgtt ttttttatcg gcgttatgcg 600

tttctcaatg taaaagtttt taaagtttca cttttaaaat aaatgaatta ataatgaata 660

aaaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 696

<210> 2

<211> 160

<212> PRT

<213> 菜蛾盘绒茧蜂(Cotesia vestalis)

<400> 2

Met Leu Ser Lys Asn Tyr Lys Ile Ile Phe Leu Ala Ala Val Phe Cys

1 5 10 15

Phe Ser Trp Ile Glu Ala Ile Pro Thr Gly Asp Val Asp Glu Asp Tyr

20 25 30

Leu Asn Leu Asn Pro Arg Asn Thr Glu Ala Pro His Asp Cys Pro Gln

35 40 45

Asn Ala Tyr Phe Ser Glu Ile Val Pro Val Cys Glu Ala Tyr Cys Asp

50 55 60

Asp Pro His Pro Thr Leu Ser Asn Arg Phe Gly Ser Asp Gly Arg Leu

65 70 75 80

Cys Ile Glu Gly Tyr Ile Arg Asn Ala Thr Ser Asp Cys Ile Arg Ile

85 90 95

Glu Asp Cys Pro Asn Ile Glu Pro Glu Tyr Ser Gly Glu Leu Gly Asn

100 105 110

Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Asp Trp Pro Glu Val Glu Thr Pro Arg Ile

115 120 125

Asp Asp Val Thr Asp Gln Leu Ser Asp Glu Glu Trp Lys Lys Arg Leu

130 135 140

Glu Glu Ile Phe Gly Thr Pro Asp Glu Thr Pro Val Glu Ile Val Glu

145 150 155 160

<210> 3

<211> 138

<212> PRT

<213> 菜蛾盘绒茧蜂(Cotesia vestalis)

<400> 3

Ile Pro Thr Gly Asp Val Asp Glu Asp Tyr Leu Asn Leu Asn Pro Arg

1 5 10 15

Asn Thr Glu Ala Pro His Asp Cys Pro Gln Asn Ala Tyr Phe Ser Glu

20 25 30

Ile Val Pro Val Cys Glu Ala Tyr Cys Asp Asp Pro His Pro Thr Leu

35 40 45

Ser Asn Arg Phe Gly Ser Asp Gly Arg Leu Cys Ile Glu Gly Tyr Ile

50 55 60

Arg Asn Ala Thr Ser Asp Cys Ile Arg Ile Glu Asp Cys Pro Asn Ile

65 70 75 80

Glu Pro Glu Tyr Ser Gly Glu Leu Gly Asn Asn Ser Tyr Asp Glu Lys

85 90 95

Asp Trp Pro Glu Val Glu Thr Pro Arg Ile Asp Asp Val Thr Asp Gln

100 105 110

Leu Ser Asp Glu Glu Trp Lys Lys Arg Leu Glu Glu Ile Phe Gly Thr

115 120 125

Pro Asp Glu Thr Pro Val Glu Ile Val Glu

130 135

Claims

1.一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有95％～100％同源性，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。

4.由权利要求2所述蛋白制得的重组蛋白，其特征在于，是将所述蛋白去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求4所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：将去除信号肽的序列用于构建原核表达载体，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag纯化重组蛋白。

6.权利要求4所述重组蛋白在制备丝氨酸蛋白酶抑制剂药物中的应用。