CN105821050B - 菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因及其编码蛋白 - Google Patents

菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因及其编码蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，旨在提供一种菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SERPIN基因及其编码蛋白。该菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SERPIN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述蛋白去除信号肽前体后得到的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过基于高通量转录组测序方法，得到CvT‑SERPIN的cDNA核苷酸序列后，利用大肠杆菌表达系统进行诱导表达蛋白，利用His‑tag能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT‑SERPIN重组蛋白，为进行CvT‑SERPIN的活性实验提供了便利。

Description

菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因及其编码 蛋白
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。本发明涉及到从菜蛾盘绒茧蜂cDNA文库中克隆得到丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因全长cDNA序列，并对其基因编码区除去信号肽进行体外重组表达，也涉及到该重组蛋白的分离纯化及其对弹性蛋白酶、糜蛋白酶和凝血酶的抑制作用，以及对金黄色葡球菌萄和枯草芽孢杆菌有抑制作用，同时还涉及该重组蛋白获得方法作为蛋白酶抑制剂类药物开发和获得的重组蛋白作为抗菌剂在食品防腐或饲料添加剂生产等方面的潜在应用价值。
背景技术
丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor,SERPIN)是一类分布广泛于植物、动物、微生物等中，已知的最大的蛋白酶抑制剂类超家族。1980年，Hunt andDayhoff指出了鸡卵清蛋白ovalbumin(OVA)、人类抗凝血酶antithrombin III(AT-III)和人类α1-蛋白酶抑制剂α1-protease inhibitor(α1-PI)三个蛋白一级结构的序列相似性。由于这个超家族的大部分是丝氨酸蛋白酶抑制剂，1985年，Carrell就确定了SERPIN的简写。目前，人类、模式昆虫果蝇等中关于SERPIN的结构和功能的研究已经有很多。丝氨酸蛋白酶抑制剂通常是具有350～500个氨基酸的单链蛋白，一般有3个β-sheets和8～9个α-helices，含有一个反应中心环RCL(reactive center loop)，RCL上的P1氨基酸与靶酶的活性丝氨酸间形成共价键,P1通常决定了抑制蛋白酶的特异性。抑制性的SERPIN使用独特的自杀底物机理,与靶酶反应，构象发生改变，与靶酶形成极为稳定的共价复合物，靶酶活性被不可逆抑制。SERPIN在人体中参与调控许多生理过程比如血液凝结、补体激活、炎症反应、荷尔蒙转运和肿瘤抑制等。一旦SERPIN出现功能缺陷等异常变化，人体内环境稳态不能维持将会导致许多疾病。SERPIN在昆虫体内调节昆虫免疫系统的内稳态，比如酚氧化酶激活系统和toll信号通路等，同时也调控果蝇胚胎的发育。
菜蛾盘绒茧蜂(Cotesia vestalis)是防治小菜蛾(Plutella xylostella)的主要优势寄生性天敌，畸形细胞(Teratocytes)是菜蛾盘绒茧蜂卵在寄主体内发育过程中由蜂卵的浆膜层解离下来的一种特殊细胞。畸形细胞能够分泌一些功能蛋白，其中也包括一些胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂。目前，没有菜蛾盘绒茧蜂来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂的相关报道。
发明内容
要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因及其编码蛋白。本发明的目的也在于提供CvT-SERPIN重组蛋白的获得方法，本发明目的还在于CvT-SERPIN重组蛋白的获得方法作为蛋白酶抑制剂类药物开发和获得的重组蛋白作为抑菌剂在食品或饲料添加剂生产等方面的潜在应用价值。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明进一步提供了所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明进一步提供了蛋白制得的菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN重组蛋白，是将所述蛋白去除信号肽前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明进一步提供了所述重组蛋白的制备方法，包括：去除信号肽的序列用于构建原核表达载体，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag纯化重组蛋白。
本发明进一步提供了所述重组蛋白在制备抑制糜蛋白酶、凝血酶和弹性蛋白酶活性的药物中的应用。
本发明进一步提供了所述重组蛋白作为抑菌剂在制备食品防腐剂或饲料添加剂中的应用。
发明原理描述：
本发明所述菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的全长是1405bp,开放阅读框是1239bp,编码412aa,其中1-25aa是信号肽序列，CvT-SERPIN包含有丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，该结构域含有RCL(reactive center loop),RCL上的P1氨基酸是蛋氨酸(Met),与人类α1-蛋白酶抑制剂(α1-protease inhibitor，α1-PI)的P1氨基酸相同,α1-PI能够抑制中性粒细胞弹性蛋白酶。
本发明所述菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因cDNA的克隆方法:以菜蛾盘绒茧蜂总RNA反转录得到cDNA为模板，构建cDNA文库，测序获得菜蛾盘绒茧蜂转录组，在转录组数据中找出编码SERPIN的EST序列，然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因cDNA全长序列。
本发明所述菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因重组蛋白表达方法如下：将去除信号肽的CvT-SERPIN基因编码序列，连接到表达载体，获得重组表达质粒，利用大肠杆菌原核表达系统诱导表达，用HisTALONTM重力柱纯化上清表达的重组蛋白，然后使用超滤管进行去离子浓缩得到重组蛋白。
本发明所述菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因体外原核表达获得的重组蛋白能够抑制牛胰腺α-糜蛋白酶，凝血酶和猪胰腺弹性蛋白酶的活性，同时测不同菌的生长曲线，结果表明CvT-SERPIN能够抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长。
本发明所提供的菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN的基因及其氨基酸序列和其重组蛋白的获得方法，CvT-SERPIN基因或者蛋白或获得重组蛋白的方法可以用在药物开发和饲料添加剂生产等方面。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过基于高通量转录组测序方法，以菜蛾盘绒茧蜂为实验材料，通过基因注释，筛选其表达的丝氨酸蛋白酶的EST序列标签，并通过RACE方法得到CvT-SERPIN的cDNA全长序列。得到CvT-SERPIN的cDNA核苷酸序列后，利用大肠杆菌表达系统进行诱导表达蛋白，利用His-tag能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT-SERPIN重组蛋白，为进行CvT-SERPIN的活性实验提供了便利。
附图说明
图1：菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN的基因验证；
图2：菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因原核诱导表达和纯化的蛋白电泳图，其中1，没有加IPTG诱导结果；2，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导结果；3，超声破碎可溶性蛋白点样；4，超声破碎后包涵体蛋白点样；5，纯化浓缩后的蛋白样品；M，蛋白Marker；
图3：菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN的基因序列和氨基酸序列分析，其中黑色加粗字体标注信号肽序列；下划线标注CvT-SERPIN的反应中心位点(reactivecenter site,RCL)；黑色加粗斜体表示多腺苷酸化信号；P1位点的氨基酸是蛋氨酸(Met)；
图4：菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因原核表达获得的重组蛋白对牛胰腺糜蛋白酶、凝血酶、猪胰腺弹性蛋白酶和胰蛋白酶的抑制效果；
图5：测定加入CvT-SERPIN重组蛋白的情况下，金黄色葡萄球菌的生长曲线,其中Amp浓度为0.1mg/ml,TBS为0.01M,CvT-SERPIN浓度为3.5mg/ml；
图6：测定加入CvT-SERPIN重组蛋白的情况下，枯草芽孢杆菌的生长曲线,其中Amp浓度为0.1mg/ml,TBS为0.01M,CvT-SERPIN浓度为3.5mg/ml。
具体实施方案
为进一步解释说明本发明，下面结合具体实施例对本发明内容作进一步详细说明，实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施案例1:菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的cDNA克隆
1.1TRIzol法提取总RNA
1)将一定量(5只左右菜蛾盘绒茧蜂)冰冻1min，放入1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol试剂，充分研磨匀浆，室温静置5min，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min
2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置2min。
3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。
4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。
6)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于-80℃超低温冰箱中长期保存)
7)晾干离心管，加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶)，分光光度计测量OD260/OD280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。
1.2cDNA第一链合成
(1)往0.5ml无菌的离心管中分别加入1μl提取的RNA，1μl SMARTⅣ/5’PCR正向引物，1μl CDSⅢ/3’PCR反向引物，加2μl DEPC H2O使总体积达到5μl。
(2)混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃孵育2min。
(3)迅速将离心管冰浴2min，短暂离心。
(4)往离心管中分别加入2μl 5×Frist-strand Buffer，1μl 20mM二硫苏糖醇(DTT)，1μl 10mM dNTP，1μl Reverse Transcriptase反转录酶，反复吹打混匀，短暂离心。
(5)42℃孵育1h。
(6)将离心管置于冰上2～3min，终止反应。取一部分用于进一步实验，其余于-80℃超低温冰箱冷冻保存。
1.3dsDNA合成
(1)往0.5离心管中分别加入1μl第一链合成反应产物，5μl 10×LA Buffer(Mg2+free)，5μl Mg2+，8μl dNTP，1μl SMARTⅣ/5’PCR正向引物，1μlCDSⅢ/3’PCR反向引物，0.5μl LA Tag DNA聚合酶，29.5μl ddH2O，充分混匀，短暂离心。
(2)PCR仪中按以下扩增程序(95℃，20s；25～28×(95℃，5s；68℃，6min))扩增。
(3)取5μl PCR产物用于凝胶检测(检测条带所含分子量范围及条带亮暗)，取检测结果良好的1μl产物稀释100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80℃超低温冰箱冷冻保存。
1.4用RACE的方法扩增菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的5’和3’末端
按Clontech公司试剂盒SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。根据试剂盒的要求，依据已知的CvT-SERPIN基因EST序列分别设计两条上、下游特异性引物，以进行巢式PCR。所用引物分别为：第一次PCR反应条件为：95℃，3min；30×(95℃，25s；58℃，20s；72℃，1min)；72℃，6min。第二次PCR以第一次PCR产物为模板进行扩增，反应条件为：95℃，3min；35×(95℃，25s；60℃，20s；72℃，1min)；72℃，6min。将扩增产物连接到pMD-19T载体上得到重组质粒，并用pMD-19T的通用引物M13±进行序列测定，测定结果与已知序列片段进行比较和序列拼接。序列拼接结果在NCBI上进行BlastX，结果显示该基因具有一个保守的SERPIN结构域，结构域中包含一个RCL(reactive center loop)。
实施例2：菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的蛋白原核诱导表达和纯化
2.1构建CvT-SERPIN的重组表达载体
(1)根据获得的CvT-SERPIN序列的全长设计引物，正反向引物分别还有BamH I和Xho I酶切位点，扩增基因开放阅读框，去除信号肽,以cDNA为模板，用50ul的LA-taq酶体系做PCR扩增，将扩增的带有酶切位点的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带进行DNA凝胶回收。
(2)分别以PET-28a表达载体质粒和第一步回收的DNA作为DNA模板，配制双酶切体系50ul：限制性内切酶BamH I 2.5ul,限制性内切酶Xho I 2.5ul,DNA模板或者表达载体质类20ul,酶切buffer 5ul,ddH2O 20ul。轻轻混匀，短暂离心，37℃酶切20min,然后80℃、5min,停止酶切。
(3)用第二步双酶切的反应产物跑回收胶，切下目的DNA条带，进行DNA凝胶回收
(4)双酶切的表达载体和目的片段连接，连接体系为20ul,分别加入5ul的双酶切后目的片段DNA,2ul双酶切后的表达载体质粒，1ul的T4Ligase,2ul的T4ligase buffer,10ul ddH2O,4℃条件下，连接过夜。
(5)将连接过夜的产物转化到感受态中，涂在含有抗生素卡那的LB培养基平板上，37℃培养过夜。挑菌斑摇菌，以通用引物T7Promoter引物和T7Terminator引物进行rTaq的菌液检测PCR反应体系，对于阳性样品每份取200ul保存，其余送测序
(6)对测序结果进行比对，选取正确的保存菌液进行下一步的实验。
2.2菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的蛋白诱导表达
(1)在15ml的无菌三角瓶中加入5ml含有卡那抗性的LB液体培养基，然后加入50ul的含有正确重组质粒的菌液。在37℃，180rpm的摇床中培养过夜，接着取5ml,回收重组质粒。
(2)取5ul的回收的重组质粒，转化到DE3(BL21)感受态菌株中，涂布于含有卡那抗性的LB培养基平板上，37℃培养过夜。挑斑培养菌液至对数期，以通用引物T7Promoter引物和T7Terminator引物进行rTaq菌液检测PCR反应体系,选取其中一份阳性样品，取50ul菌夜加入到装有50ml含有卡那抗生素的LB液体培养基的150ml无菌三角瓶中，37℃，250rmp的摇床中培养对数期，大约OD＝0.6～0.8。
(3)取6支15ml的灭菌后的试管，每管加入5ml加入培养到对数期的菌液，并分别加入0ul,10ul,20ul,30ul,40ul,50ul 100mM IPTG,使六支试管菌液中的IPTG的终浓度分别为0mM,0.2mM,0.4mM,0.6mM,0.8mM,1.0mM；将试管至于22℃，210rpm的摇床中培养过夜，以诱导蛋白表达
(4)用12％的SDS-PAGE电泳分析(3)诱导表达的蛋白情况，诱导表达的菌液各吸取1ml到2ml的离心管中,12000g离心5min后，去除上清，分别加入60ul的PBS吹打均匀，然后加入15ul的5x的蛋白上样缓冲液,混匀，接着沸水中煮10min,16000g离心后，取上清，即为分析样品。用微量加液器分别吸取5ul以上分析样品加入点样孔中，其中一个空加入蛋白Marker，作为参照。先60V恒压电泳，待样品浓缩胶部分浓缩成一条线后，再调电压到120V,待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳；取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，置于水平摇床上，染色30mi；然后脱色液脱色，期间换脱色液2～3次，直至背景干净透明，条带清晰。用Bio-Rad GS-800Calibrated Densitometer凝胶成像系统观察分析结果并扫描拍照。
(5)根据(4)的成像结果，选取特异性条带最粗的诱导条件，此IPTG浓度作为最优IPTG浓度，作为下一次的扩大培养条件，并将这个条件下的剩余菌液，取2ml,离心去上清；用200ul BugBuster Master Mix裂解,离心取上清，沉淀加200ul的PBS混匀,然后加入蛋白上样缓冲液，沸水中10min,最后跑12％的SDS-PAGE蛋白胶，检测蛋白是可溶性表达还是包涵体表达。如上清中有表达，然后扩大培养，诱导蛋白表达用于纯化重组蛋白。诱导方法参见步骤(2)、(3)，但只使用最优IPTG浓度，用300ml的锥形瓶加入200ml对数期的菌液，进行诱导。
2.3菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的诱导表达蛋白的纯化
(1)按照HisTALONTM Gravity Columns Purification Kit(Clontech,USA)中的说明书对诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白纯化。具体步骤参照试剂盒中的说明书进行。纯化蛋白用12％的SDS-PAGE检测结果。
(2)采用截留分子量为10kDa的超滤管Ultra-4对重组蛋白进行浓缩，脱盐。第一次使用的超滤管是干燥的，在使用前要进行预冷，加入过膜的ddH2O,冰浴或者冰箱里预冷几分钟，倒掉水后，加入(1)纯化的蛋白样品。以4000g的转速进行离心，当浓缩到剩余1ml时，加入0.01M TBS(PH＝8.0),进行缓冲液的置换，这个步骤重复至少4次，最后一次浓度的终体积根据需要的蛋白浓度而定，取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上进行。取出蛋白浓缩液用Bradford方法定量，存于液氮中，后续使用。
实施案例3.菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的原核表达重组蛋白的活性检测
3.1菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因的原核表达重组蛋白对商业化的丝氨酸蛋白酶的抑制活性
本实验检测的蛋白酶分别为牛胰腺糜蛋白酶(bovine pancreaticα-chymotrypsin,Sigma),牛胰蛋白酶(bovine pancreatic trypsin，Sigma),猪胰腺弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase，Sigma)和人血浆凝血酶(thrombin from humanplasma，Sigma),其对应的底物分别是N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide(sigma S-7388),Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(sigma B-3133),N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu p-nitroanilide(sigma S-8511)和N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Arg p-nitroanilide acetate salt(sigma T1637)。
实验方法如下：不同体积的CvT-SERPIN(3.5mg/ml)的重组蛋白，分别为0ul,2ul,4ul,6ul,8ul,10ul,12ul，分别于以上10ul蛋白酶(1ug/ul),然后每个反应用0.01Tris-HCl(PH＝8.0)含有0.1M NaCl和1mM CaCl2的缓冲液调节到总体积45ul，在30℃下反应10min；然后加入5ul对应酶特异性显色底物，至显色底物的终浓度为1mM，在30℃条件下，再反应10min；测量OD410表示p-nitroaniline产物的增长作为剩余酶活；每个反应重复三次，绘制CvT-SERPIN重组蛋白浓度依赖型的剩余酶活曲线。
试验结果显示：不同体积的菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因原核表达获得的重组蛋白(3.5mg/ml)与10ul(1mg/ml)的不同蛋白酶反应，随着加入的重组蛋白的量的增加，糜蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的剩余酶活减少，但是胰蛋白酶的剩余酶活不受影响。当重组蛋白的体积达到12ul时，对糜蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的抑制效果分别达到78.51％、31.83％、36.63％。结果表明，该重组蛋白对糜蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶具有一定的抑制效果，但是对胰蛋白酶没有抑制作用；因此，该重组蛋白具有作为蛋白酶抑制剂类药物的潜在应用价值。
3.2菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因原核表达获得的重组蛋白对微生物的生长抑制
本发明涉及供试菌株有革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。其中革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichia coli)；
将供试菌株培养至对数期，大约OD600＝0.6～0.8，然后分别将处于生长对数期的供试菌株用MH培养基稀释至OD600＝0.001；取80ul的稀释菌液和20ul的CvT-SERPIN(3.5mg/ml)重组蛋白混匀，在96孔板中，37℃条件下，每隔10min测一次各管的吸光度，共测12h。其中Amp(0.1mg/ml)作为阳性对照，TBS(0.01M,PH＝8)作为阴性对照。以上处理重复3次。
实验结果显示：供试菌株中加入20ul(3.5mg/ml)的菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂基CvT-SERPIN基因原核表达获得的重组蛋白，与阴性对照相比，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长状况都发生显著的变化。该重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制剂效果在630min的时候达到最大值59.96％，对枯草芽孢杆菌的抑制剂效果在670min时达到最大值55.38％。结果表明，该重组蛋白对革兰氏阳性菌的生长具有抑制作用；因此，该重组蛋白具有作为抑菌剂在食品或者饲料添加剂生产上应用的潜在价值。

Claims (6)

1.菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.由权利要求2所述蛋白制得的菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SERPIN重组蛋白，其特征在于，是将所述蛋白去除信号肽前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求3所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：去除信号肽的序列用于构建原核表达载体，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag纯化重组蛋白。
5.权利要求3所述重组蛋白在制备抑制糜蛋白酶、凝血酶和弹性蛋白酶活性的药物中的应用。
6.权利要求3所述重组蛋白作为抑菌剂在制备食品防腐剂或饲料添加剂中的应用。
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