CN103724415A - 斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其制备方法和应用 - Google Patents

斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其制备方法和应用 Download PDF

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CN103724415A CN201310753282.8A CN201310753282A CN103724415A CN 103724415 A CN103724415 A CN 103724415A CN 201310753282 A CN201310753282 A CN 201310753282A CN 103724415 A CN103724415 A CN 103724415A
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Abstract

本发明公开了斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其应用。基因Rspo1的cDNA序列如SEQIDNO:1所示,全长756bp,其编码蛋白共251个氨基酸,序列如SEQIDNO:2所示。本发明方法利用反转录PCR技术从斜带石斑鱼中克隆到了一个斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1,并根据实验结果说明了Rspo1可能参与调控斜带石斑鱼其他性别调控基因的表达,为相关鱼类性别调控的研究提供一定的理论依据和重要线索。基因Rspo1编码的蛋白有望应用于鱼类催产、催熟、人工调控雌雄转换、大规模工业化养殖等方面。

Description

斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于水生动物基因工程技术领域,涉及一种斜带石斑鱼性别调控基因及其应用,特别涉及斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其应用。
背景技术
Rspo1~4超家族,作为经典Wnt信号的配体,它们之间有着40%~60%的蛋白一致性和结构同源性。Rspo蛋白包含一个N端信号肽,两段临近的富含半胱氨酸的区域,一段高同源的TSP-1模块,以及一段包含双向核定位信号的碳端尾巴。 他们在各种发育和癌症发生通路中其重要作用。Rspo1的结构具有5`端信号肽,具有转移分泌蛋白的作用;两段含有半胱氨酸的弗林样片段,这是它与其受体结合的重要部位;还有一段TSP-1(凝血酶敏感蛋白-1 )。在斜带石斑鱼的Rspo1中,未发现C端核定位信号。Rspo1是该超家族中的一种,它的最初发现是在人类性别调控方面发挥的重要作用。传统观点认为雌性性别决定和分化是被动的,但目前对RSPO1的研究却对上述提出了质疑。
RSPO1 是一种小分泌因子,能够刺激经典的Wnt/b-连环素信号通路,提高细胞膜上的Wnt与Rspo1共受体LRP6的水平。重要的是,Wnt/b-连环素通路在卵巢和睾丸早期发育中起到重要作用。雌性小鼠敲除Rspo1很明显发生性逆转,有些生育能力降低。与Wnt4敲除不同,Rspo1敲除的小鼠部分是可育的,卵泡在一定程度上发育,但是大多数的雌性是不育的。敲除XX中RPSO1的小鼠发生明显的性别转化,局部上皮的Rspo1信号对于乳腺的发育是必须的。RSPO1是卵巢性别调控基因,它积极地掌管卵巢的分化,而WNT4是RSPO1的即时的或者是协同的下游基因,它和RSPO1重叠表达,直接或者间接地受RSPO1调节。我们推测,Rspo1在鱼类中也可能存在相同性别调控的功能。
与高等的脊椎动物相比,大多数低等鱼类没有性染色体,其性别决定主要由多种性别调控基因所控制,至今依然没有找到鱼类的性别决定基因。鱼类性别调控的研究,能够使得人为控制鱼类性别的分化和成熟,提早或者延迟鱼类的性成熟,甚至可以人为调控鱼类的性别转化,得到转化后的、具有功能性的雌鱼或雄鱼。此类研究的成果,将对人工养殖的工业化、现代化产生深远影响。
石斑鱼是一种深海性的名贵经济鱼种,营养丰富,肉质细嫩洁白,类似鸡肉,素有“海鸡肉”之称,成为港澳台等地区的美味佳肴。在国际自然保护联盟的“濒危物种红色名录”上,163种石斑鱼类,有20种面临灭绝,另有5种属濒危水平。斜带石斑鱼属鲈形目,属于雌雄同体、雌性先熟的物种,群体生活,出生的时候都是雌性,成年后才会转为雄性。斜带石斑鱼的这些特征使其成为研究性别调控的重要材料。因此,研究斜带石斑鱼及其性别调控机制,对于斜带石斑鱼功能基因组学及斜带石斑鱼育种、人工调控雌雄转换、大规模工业化养殖的实现等等都具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其应用。
本发明所采取的技术方案是:
斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1的编码蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
编码斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1蛋白的核酸序列。
进一步的,上述核酸序列为基因Rspo1的cDNA,全长756bp,其序列如SEQ ID NO:2所示。
斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1的重组蛋白含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
编码斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1的重组蛋白的核酸序列。
进一步的,上述核酸序列含有如SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
Rspo1的编码蛋白或重组蛋白在制备鱼类性别催熟剂中的应用。
Rspo1的编码蛋白或重组蛋白在制备鱼类性别转换剂中的应用。
本发明的有益效果是:
本发明方法利用反转录PCR 技术从斜带石斑鱼中克隆到了性别调控基因Rspo1,并构建了Rspo1的原核表达载体,可大量表达获得斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1所编码的蛋白。
在本发明中,斜带石斑鱼Rspo1蛋白能够在卵巢组织的大量表达,并说明了Rspo1参与调控斜带石斑鱼中其他性别调控基因的表达,丰富了鱼类性别调控的系统信号通路理论,能为相关鱼类性别调控的研究提供一定的理论依据。
在本发明中,斜带石斑鱼Rspo1蛋白在鱼类催产、催熟、人工调控雌雄转换、大规模工业化养殖等方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为基因Rspo1的PCR扩增图;
图2为重组质粒pQE30-Rspo1转化大肠杆菌M15的菌液PCR验证图;
图3为Rspo1重组蛋白的Western检测图,其中1表示诱导后总菌体,2表示诱导前总菌体,3表示诱导后上清,4表示诱导前上清,5表示诱导后沉淀,6表示诱导前沉淀;
图4为Rspo1重组蛋白纯化后的SDS-PAGE检测图,从左到右箭头所示的泳道分别为50mM、100mM 150mM、200mM、250mM、300mM咪唑洗脱液的洗脱情况。黑色框内的条带为目的重组蛋白,分子量约27kDa;
图5 为Rspo1重组蛋白的SDS-PAGE检测,箭头所示为目的重组蛋白条带;
图6为 Rspo1重组蛋白对相关性别调控基因在mRNA转录水平上的表达调节;A表示Rspo1重组蛋白对Cyp19a表达的影响;B表示Rspo1重组蛋白对Sox9表达的影响;图中T表示用Rspo1重组蛋白处理的实验组,Treat的缩写;C表示不加Rspo1重组蛋白的对照组,Control的缩写。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明,本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1
一、Rspo1重组蛋白的制备
1、斜带石斑鱼RNA 的提取
取健康斜带石斑鱼全鱼,以冰浴麻醉约2 min 后,杀鱼取样,分离卵巢组织,采用Trizol 试剂法抽提获得斜带石斑鱼卵巢组织总RNA。
2、Rspo1基因的克隆
第一链cDNA 的合成: 
1) 取出保存的斜带石斑鱼RNA 1μL,加入1μL 的Oligo (dT) 16 (10 mM),混匀后置于70 ℃中水浴5 min;
2) 冰上放置5 min 后,于冰上向EP 管中先后加入dNTP Mixture (10 mM) 2μL 、5XRT Buffer 4μL、Rnase 抑制剂1μL (10 U/μL)、Rnase-free ddH2O 8μL 、ReverTra Ace 1μL;
3) 将EP 管置于PCR 仪中,按30℃ 10 min,42℃ 60 min,99℃ 5 min,4℃ 5 min 程序后瞬时离心,反转录得到第一链的单链cDNA ,于-20℃冰箱保存备用。
以cDNA 为模板的Rspo1基因克隆:
根据生物信息学中相关的序列比对和结构分析结果,在基因Rspo1的cDNA序列(如SEQ ID NO:2所示,其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:1所示)中去除编码19个氨基酸的信号肽的序列,以剩下的序列在两端设计特异性引物,如下:
Rspo1-RT-F :5' - CGCGGATCCGATGTTCTCAAGCTCTC -3' (SEQ ID NO:5)(下划线标记部分为内切酶Bam H1的识别序列);
Rspo1-RT-R :5' - CGGGGTACCTTAGCTGACAGAGCTGG -3' (SEQ ID NO:6)(下划线标记部分为内切酶Kpn 1的识别序列)。
以第一链cDNA为模板,采用上游引物Rspo1-RT-F和Rspo1-RT-R进行PCR 扩增,获得不含信息肽的Rspo1基因,扩增片段大小为699bp,如图1所示,扩增序列为如SEQ ID NO:4所示,其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。电泳分离DNA 片段,切胶回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pTZ57R/T 载体,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆测序,测序结果经BLAST 比对分析,比对结果表明目的产物确为基因Rspo1。
3、基因Rspo1原核表达载体的构建
提取含有基因Rspo1的pTZ57R/T 质粒,分别经过内切酶BamH1和Kpn1的酶切,获得目的片段,将目的片段连接到经BamH1和Kpn1双酶切过的pQE30质粒载体,pQE30为带有His标签的原核表达载体。连接过程中采有连接酶T4 DNA Ligase,温度37℃,连接反应12~16h。
将上述连接产物转化进入扩增宿主-大肠杆菌DH5α的感受态细胞,筛选培养,将获得的阳性单克隆菌落进行菌液PCR验证,PCR扩增的片段大小与目的片段大小相似,约699bp, 并将该阳性单菌落进行测序验证,测序结果与目片段的序列一致,说明成功构建了Rspo1的原核重组表达载体:pQE30-Rspo1。
4、基因Rspo1的原核表达及纯化
转化表达宿主:
提取3中构建好的重组表达载体质粒(pQE30-Rspo1),将质粒转化进入表达宿主-大肠杆菌M15的感受态细胞,用含氨苄霉素(Amp)和卡那霉素(Kana)的培养基,进行筛选培养,挑取阳性单克隆菌落,进行菌液PCR验证(如图2所示),PCR扩增的片段大小与目的片段大小相似,约699bp。验证正确后,以含Amp的培养基过夜扩大培养该阳性菌落,取菌液加入甘油,按8%甘油终浓度保存在-80度冰箱中,进行菌种保存。
重组蛋白的诱导表达:
将含有重组表达载体(pQE30-Rspo1)的大肠杆菌M15先经过LB培养基的扩大培养,再经过2xYT培养基的二级扩大培养,当菌液OD600值介于0.4~0.6之间时,取少量诱导前的菌液,作为后续实验的对照。剩下的菌液加入IPTG进行诱导培养,诱导培养后收集菌液,离心获得菌体,加入1xNi-NTA结合缓冲液重悬菌体,此时取20μL菌体重悬液,作为后续实验对照。将剩下的菌体重悬液超声波破碎,离心,将上清和沉淀分开。
分别将诱导前和诱导后的总菌体、上清和沉淀加入蛋白Loading buffer,混匀,沸水浴中煮5分钟,分别取10μL进行Western blotting检测,检测结果如图3所示。从图3的western blotting检测结果中,可看出Rspo1重组蛋白在菌体的上清和沉淀中都存在。
上述2xYT培养基配方为:胰蛋白胨(Tryptone)16g,酵母提取物(Yeast Extract)10g,氯化钠5g,加水至1L,120℃高压灭菌20分钟。
重组蛋白的纯化、脱盐及冻干:
将诱导表达后的菌体超声破碎,离心,弃沉淀,将上清经孔径0.45微米的滤膜过滤备用。
镍柱准备,往柱子内加入2mL的Ni-NTA His-Bind(Novagen,货号:70666),再加10mL水过柱;再加入10mL的1xNi-NTA结合缓冲液平衡柱子。
挂柱,往50mL离心管中加入结合缓冲液,再加入菌体上清液,盖上盖子,封口膜封口,置于冰上,缓慢摇匀、亲和吸附1小时。将摇匀的融合液过镍柱,收集穿过液,再重复过镍柱两次。
漂洗和洗脱,重组蛋白挂柱后,先用1xNi-NTA漂洗液漂洗,再分别以50mM、100mM 150mM、200mM、250mM浓度的咪唑洗脱液洗脱,对不同浓度咪唑洗脱液洗脱下来的物质进行SDS-PAGE检测,检测结果显示重组蛋白能被浓度为150~200mM的咪唑洗脱下来,其中咪唑浓度为200mM时,洗脱的条带单一(如图4所示),故选用200mM的咪唑洗脱液用于洗脱获得纯化重组蛋白。
基于上述探索出的最优的诱导培养条件、最适浓度的咪唑洗脱液等,再进行大量表达、纯后获得大量重组蛋白,并结合SDS-PAGE 进行检测,检测结果如图5所示。Rspo1重组蛋白的分子量约为27kDa,如图5中的箭头所示。
将纯化后的重组蛋白进行脱盐,先用0.02M的PB缓冲液进行清洗和平衡柱子。加入样品,收集穿过液。待样品完全进入下端柱子后,再加入PB缓冲液洗脱,收集洗脱液,即为脱盐后的重组蛋白。
将脱盐的重组蛋白进行冻存:将含有目的蛋白的收集液置于合适大小的干净管子中,用封口膜封好,在膜上扎几个针眼,以便冻存时水分的散失。管子竖直放于-20度冰箱约2小时以上,待全部冻成冰状,迅速放于-80度冰箱。第二天,将-80度保存的管子置于调试完好的冻存机挂瓶内,开始冻存。冻存时间视水分散失快慢而定,一般8小时以上或者过夜。将冻存完成的、含有目的蛋白的管子取下迅速放于-80度冰箱保存,以便下一步的实验。
二、Rspo1重组蛋白调节性别调控基因的表达
以斜带石斑鱼为研究对象,以高表达基因Rspo1的卵巢组织为材料,用Rspo1重组蛋白离体孵育卵巢碎片,研究Rspo1重组蛋白对相关性别调控基因Cyp19a、Foxl2、Sox9、Wnt4a在mRNA转录水平表达的调节情况。
分别以浓度100、1000、10000μg/μL的Rspo1重组蛋白孵育卵巢碎片8h,然后分别检测性别调控基因Cyp19a 、Foxl2、Sox9、Wnt4a在mRNA转录水平上的表达情况。检测结果如图6所示。
从图6的检测结果可获知,Rspo1重组蛋白对其它几种性别调控因子起不同作用。其中,三种不同浓度(100、1000、10000ng/ml)Rspo1对Cyp19a都有着上调作用;对Foxl2在1000ng/ml浓度时起着明显下调作用;对Sox9在1000和10000ng/ml时有着下调作用,在1000ng/ml时作用最明显;而Rspo1对Wnt4a的作用却不明显。可见,Rspo1重组蛋白能够促进雌性调节基因(Cyp19a),而抑制雄性调节基因(Sox9)的表达,从而可能促进雌性的发生、发育和成熟。说明,Rspo1蛋白可能具有上调雌性激素合成的作用,从而引起雌性性别发生和卵巢发育,同时抑制雄性特征,进而可能引发鱼类从雄性到雌性的性逆转。
<110>  中山大学
 
<120>  斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其制备方法和应用
 
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<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
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<212>  PRT
<213>  斜带石斑鱼
 
<400>  1
 
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Gly His Ser Asp Val Leu Lys Leu Ser Lys Ala Arg Arg Gln Arg Arg
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Val Ser Thr Glu Gly Pro Pro Ser Cys Pro Lys Gly Cys Asp Arg Cys
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Ser Glu Tyr Asn Gly Cys Ile Lys Cys Arg Pro Lys Leu Phe Ile Phe
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Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Ile Gly Val Cys Leu Ala Ser Cys
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Pro Met Gly Tyr Phe Gly Met Arg Asn Pro Glu Gly Asn Asn Arg Cys
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Thr Gln Cys Lys Ile Asp Asn Cys Glu Ala Cys Phe Asn Arg Asn Phe
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Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Ser His Ser Gly Arg Cys Tyr
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Val Ser Cys Pro Pro Gly Gln Arg Thr Ser Asn Glu Thr Met Glu Cys
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Val Gly Gln Arg Pro Ala Glu Cys Glu Leu Gly Glu Trp Ser Gln Trp
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Gly Ser Cys Met Lys Lys Asn Lys Thr Cys Gly Phe Lys Lys Gly Ser
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Arg Lys Cys Ile Val Thr Lys Thr Pro Cys Val Arg Glu Arg Lys Thr
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<212>  DNA
<213>  斜带石斑鱼
 
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<212>  PRT
<213>  斜带石斑鱼
 
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<211>  699
<212>  DNA
<213>  斜带石斑鱼
 
<400>  4
gatgttctca agctctccaa ggcgagaagg cagagacggg ttagcactga ggggccacca       60
 
tcttgcccca aaggctgtga ccgatgctcc gagtataacg gctgcatcaa atgtagaccc      120
 
aagctcttca tcttcctgga gcgcaatgat attcgtcaga taggcgtgtg cctcgcctcc      180
 
tgccccatgg gatactttgg catgaggaac ccagaaggca acaacagatg cacccaatgt      240
 
aaaatagaca attgtgaagc gtgtttcaat cgcaattttt gcacaaaatg taaggagggc      300
 
ttgtattcac acagtgggcg atgttatgtc agctgccctc caggccagcg cacctccaac      360
 
gagactatgg agtgtgtcgg tcagcgtcct gcagagtgtg aactgggcga gtggagccag      420
 
tggggttcct gtatgaagaa gaacaaaaca tgtggattta agaaaggctc ccagtcccgg      480
 
gttcgcatgc ccctaccgca ggtcgatatc cctgacactt ccccggcctt ggtgccctca      540
 
cagacctgtg ctccacagac agagaggagg aagtgcattg tgaccaagac gccttgtgtg      600
 
agagagagga agaccaaggg agaccgacaa gatgatacaa acagggagaa tgcacgcggg      660
 
cgaggacgag acagcatcac aaccagctct gtcagctaa                             699
 
 
<210>  5
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  5
cgcggatccg atgttctcaa gctctc                                            26
 
 
<210>  6
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  6
cggggtacct tagctgacag agctgg                                            26

Claims (8)

1.斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1的编码蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1蛋白的核酸序列。
3.根据权利2所述的核酸序列,其特征在于:该核酸序列为基因Rspo1的cDNA,全长756bp,其序列如SEQ ID NO:2所示。
4.斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1的重组蛋白,其特征在于:该重组蛋白含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
5.编码权利要求4所述的斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1的重组蛋白的核酸序列。
6.根据权利5所述的核酸序列,其特征在于:其含有如SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
7.Rspo1的编码蛋白或重组蛋白在制备鱼类性别催熟剂中的应用。
8.Rspo1的编码蛋白或重组蛋白在制备鱼类性别转换剂中的应用。
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