CN103626864B - 一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白及其制备 - Google Patents

一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白及其制备方法，所述的可溶性重组蛋白具有SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列。本发明的蛋白能够有效的促进大黄鱼幼苗生长，具有良好的应用前景。

Description

一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白及其制备
技术领域
本发明属于分子生物学和水产养殖领域，具体而言，涉及一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白及其制备方法。
背景技术
大黄鱼(Larimichthyscrocea，Richadson)，俗称大黄花鱼，红瓜、桂花黄鱼、石首鱼、石头鱼等，是中国重要的经济养殖鱼类，属于我国四大海产之一。从分类学角度来看，大黄鱼隶属于动物界(Animalia)、脊索动物门(Chordata)、脊椎动物亚门(Vertebrata)、硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes)、石首鱼(Sciaenidae)、黄鱼属(Pseudosciaena)。其主要分布在黄海中部以南到琼州海峡以东的中国大陆近海岸，西北太平洋的亚热带区域(Santosetal.,2013)，依据海区大黄鱼产卵场的不同，大黄鱼种群分为岱衢族、闽-粤东族和硇州族。其肉质鲜美，既可鲜食，亦可晒干制成“黄鱼鲞”，加工成风味独特的水产品。耳石有清热之功效，鳔可润肺健脾、补气活血，有很高的药用价值。又因其体黄唇红的富贵之像，素有“国鱼”的美誉。
由于八十年代过度捕捞，加之海水日益严重的污染，致使大黄鱼近海资源受到严重的破坏，捕获的野生大黄鱼价格奇高。自上个世纪八十年代大黄鱼人工育苗技术获得突破性进展，大黄鱼的养殖规模日益扩大。《2012-2015年中国大黄鱼行业发展现状及投资前景分析报告》从大黄鱼产业链，行业发展环境及总体发展状况分析，深度数据挖掘分析，发现产值已达10亿以上，产生了显著的经济效益和社会效益。然而，大黄鱼作为浙江省主要的海洋经济品种，随着多年的人工网箱和土池养殖，出现了经济性退化现象，性成熟过早，生长缓慢，亲鱼个体小，肉质风味变差等一系列问题，直接影响了大黄鱼的市场供需关系。在“海洋经济”发展的浪潮中，利用现代生物遗传育种技术培育经济效益高的大黄鱼品种，积极响应了广大养殖户的要求，满足了市场需求。
肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，亦称生长分化因子-8(growthanddifferentialfactor-8，GDF-8)，是骨骼肌生长的负调控因子，基于其研究肌肉生长的策略引起了人们足够的重视。通过设计简并引物发现了小鼠的GDF-8，利用基因打靶将GDF-8失去功能，发现了小鼠骨骼肌是野生型的2-3倍之多，这是首次关于GDF-8的报道(C.Mcpherronetal.，1997)。同年，发现了比利时蓝牛(BelgianBlue)和皮尔蒙特牛(Piedmontese)的双肌性状与GDF-8有关(McpherronandLee，1997)。这掀起了以后关于MSTN在脊椎动物中研究的热潮。通过不同手段的抑制MSTN在肌肉中的负调控作用，在众多哺乳动物中被验证。在血液中，MSTN前体蛋白在形成MSTN成熟肽时，其前肽在金属蛋白酶切位点RXXR被骨形成蛋白酶[bonemorphogeneticproteins-1／tolloid(BMP-1／TLD)]切割，并与二硫键连接成熟肽二聚体以非共价形式存在，形成了潜在的无活性结构，导致了MSTN失去其肌肉抑制的作用(Wolfmanetal.,2003,Hilletal.,2002)。MSTN前肽过量表达，注射和腺病毒介导等处理的小鼠，都发现了显著的骨骼肌生长发育(Yangetal.,2001；Bartolietal.,2007；Lietal.,2010)。MSTN前肽对MSTN成熟肽活性有抑制作用，能有效提高动物的肌肉含量，促进动物生长，为养殖业发展开辟了一条新的思路，然而，如何获得能够促进大黄鱼幼苗生长的制剂，仍然是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白，其特征在于所述的可溶性重组蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO.2具有95％以上的相似性，优选具有99％以上的相似性，进一步优选为与SEQIDNO.2的氨基酸序列完全一致。
在本发明的另一方面，还涉及上述可溶性重组蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一：取-80℃的冻存的大黄鱼骨骼肌肌肉组织，30mg-50mg组织在液氮中充分研磨至粉末状，加入1mlTrizol，用枪头反复吸打至均匀；
步骤二：肌肉样品裂解之后置于室温下5-10min，使得核蛋白和核酸完全分离；
步骤三：加入300μl氯仿，混匀震荡15sec，置于室温5min，然后4℃，10000rpm下离心15min。漩涡混匀，样品会出现三层：上清水相，中层和下层为有机相，总RNA位于上层水相；
步骤四：将上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异戊醇，混匀后，置于室温20min；
步骤五：4℃时12000rpm下离心10min，弃去上清。置于室温干燥5-10min。用DEPC-H2O配置75％乙醇。通常1mlTrizol需加入1ml75％乙醇洗涤沉淀；用枪头吸出残液，不要吸到沉淀；室温晾晒5min；
步骤六：加入35μlRNase-free的DEPC-H2O，充分溶解RNA，置于-70℃保存；
步骤七：设计MSTN-1前肽引物：
上游引物5’-CCGGAATTCGACCAAGAGACGCACCAG-3’
下游引物5’-CCCAAGCTTTCACACCTCCATGAACGGTT-3’
以大黄鱼cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；PCR反应体系：10×buffer5μl，2mMdNTPs5μl，25mMMgSO43μl，模板cDNA3μl，KOD-PlusNeo1μl，加水至50μl。扩增程序：预变性94℃，2min；变性98℃，10sec，退火，55℃，30sec，延伸68℃，30sec，进行35个循环，收集扩增产物，扩增产物的链长为723bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1；
步骤八：对目的片段进行加a尾；
步骤九：用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pMD19-T以及pMALc2x克隆质粒表达质粒以及扩增的加a尾的目的片段，分别构建LcMSTN1pro-pMD19-T以及MSTN1pro-pMALc2x表达载体；将所述的表达载体进行表达，得到的LcMSTN1pro-MBP蛋白，其分子量为69.56KDa，由625个氨基酸组成，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。
在本发明的另一方面，还涉及上述可溶性重组蛋白在促进大黄鱼增重中的应用，特别是促进大黄鱼幼苗增重中的应用。
本发明的蛋白能够有效的促进大黄鱼幼苗生长，具有良好的应用前景。
具体实施方式
样品采集
大黄鱼骨骼肌样品取自浙江宁波象山港湾苗种有限公司的一龄大黄鱼侧线以上，背鳍以下的背部，装在1.5mlRNasefree的离心管，迅速放入液氮，带回实验室保存于-70℃，用于提取总RNA。
RNA操作相关试剂
Trizol试剂：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
氯仿，无水乙醇(AR级)和异丙醇：均购于宁波博奥科学仪器有限公司；
70％的乙醇：取70ml的无水乙醇，加RNaseFree-H2O定容到100ml，置于4℃保存备用；
RNaseFree-H2O：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
氯仿：异戊醇(24：1)：将48ml的氯仿和2ml异戊醇充分混匀，置于4℃保存备用。氯仿、异戊醇试剂均购于宁波博奥科学仪器有限公司；
3mol醋酸钠(NaAC)：将81.6gNaAc-3H2O溶于160mlRNaseFree-H2O，用3mol醋酸调至pH5.2，加RNaseFree-H2O定容到200ml，高压高温灭菌，然后保存于4℃冰箱备用；
1×TAE电泳缓冲液：称取Tris4.84g，Na2EDTA·2H2O0.74g，冰醋酸1.14ml放入烧杯中，RNaseFree-H2O定容至1升，玻璃容器常温保存。Tris、冰醋酸和Na2EDTA·2H2O，均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
10mg／ml溴化乙锭(EB)：在100mlddH2O中充分溶解1g溴化乙锭，转移至的棕色瓶中，并用铝箔包裹瓶体以避光，室温保存。溴化乙锭购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
1％琼脂糖凝胶：称取0.2gAgaroseH和20ml1×TAE电泳缓冲液混匀，置于烧杯中，微波炉加热溶解，冷却至约50℃左右时加入以上配置的溴化乙锭1μl，摇匀后倒入制胶槽中，插入点样孔梳子，待室温下凝固完全后，轻轻拔出插好的梳子。AgaroseH购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
PCR扩增相关试剂
高保真酶扩增
KOD-Plus-Neo(1.0U／μl)：购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；
10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo：购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；
25mMMgSO4：购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；
2mMdNTPs：购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。
加‘a’尾及菌落PCR检测
rTaqDNA聚合酶(5U／μL)、dNTPMixture(各2.5mmol)、10×PCRBuffer(Mg-)(100mmolTris-HCL，pH8.3；500mmolKCL)和MgCL2(25mmol)：均购于宝生物工程(大连)有限公司。
检测marker
DL1000DNAmarker：购于宝生物工程(大连)有限公司；
SupercoliedDNALadderMarker：购于宝生物工程(大连)有限公司。
克隆过程相关试剂
0.1molCaCL2：在200mlddH2O中溶解54gCaCL2·6H2O，高压灭菌，4℃保存备用。CaCL2·6H2O购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
100mg／ml氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：将0.1g氨苄青霉素溶解于1ml的ddH2O中，混匀，-20℃保存备用。氨苄青霉素购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
LB固体培养基：将Tryptone1g，YeastExtract0.5g，NaCL1g，琼脂粉A1.Sg在玻璃容器中混匀，加ddH2O定容至100ml。用1mol的NaOH溶液调节pH至7.0。121℃高温高压湿热灭菌20min，冷却至55℃左右加入100mg／ml氨苄青霉素溶液0.1ml，每20ml倒一个已灭菌的培养皿，完全凝固后，保鲜膜包裹置于4℃保存备用。Tryptone、YeastExtract、NaCL、NaOH和琼脂粉A均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
LB液体培养基：将Tryptone1g，YeastExtract0.5g和NaCL1g在玻璃容器中混匀，加ddH2O定容至100ml。用1mol的NaOH溶液调节pH至7.0。121℃高温高压灭菌20min，冷却至55℃左右加入100mg／ml氨苄青霉素溶液0.1ml，4℃保存备用。
用1mol的NaOH溶液调节至pH7.0。121℃高温高压灭菌20min，冷却至55℃加入100mg／ml氨苄青霉素溶液200μL，4℃保存备用；
克隆菌株TG1：本实验室-80℃冰箱保存。
大黄鱼MSTN基因cDNA合成
(1)取-80℃的冻存肌肉组织，30mg-50mg组织在液氮中充分研磨至粉末状，加入1mlTrizol，用枪头反复吸打至均匀。
(2)肌肉样品裂解之后置于室温下5-10min，使得核蛋白和核酸完全分离。
(3)加入300μl氯仿，混匀震荡15sec，置于室温5min，然后4℃，10000rpm下离心15min。漩涡混匀，样品会出现三层：上清水相，中层和下层为有机相，总RNA位于上层水相。
(4)将上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异戊醇，混匀后，置于室温20min。切勿吸取到中间层物质，否则可能会出现染色体DNA污染。
(5)4℃时12000rpm下离心10min，弃去上清。置于室温干燥5-10min。用DEPC-H2O配置75％乙醇。通常1mlTrizol需加入1ml75％乙醇洗涤沉淀。用枪头吸出残液，不要吸到沉淀。室温晾晒5min。
(6)加入35μlRNase-free的DEPC-H2O，充分溶解RNA，置于-70℃保存用于后续实验。
大黄鱼MSTN1前肽的克隆
设计MSTN-1前肽引物：
上游引物5’-CCGGACCAAGAGACGCACCAG-3’
3个保护碱基+EcoRI(斜体)酶切位点
下游引物5’-CCC TCACACCTCCATGAACGGTT-3’
以大黄鱼cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：10×buffer5μl，2mMdNTPs5μl，25mMMgSO43μl，模板cDNA3μl，KOD-PlusNeo1μl，加水至50μl。扩增程序：预变性94℃，2min；变性98℃，10sec，退火，55℃，30sec，延伸68℃，30sec，进行35个循环，收集扩增产物，扩增产物的链长为723bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。
由于使用高保真酶得到的目的片段不能直接进行TA克隆，故需加a尾。反应体系：割胶回收扩增产物30μl，10×buffer5μl，MgCL25μl，dNTPs5μl，rTaq酶0.3μl，加水9μl。反应程序：72℃，20min。
用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pMD19-T以及pMALc2x克隆质粒表达质粒以及扩增的产物，分别构建LcMSTN1pro-pMD19-T以及MSTN1pro-pMALc2x表达载体。将所述的表达载体进行表达，得到的LcMSTN1pro-MBP蛋白，其分子量为69.56KDa，由625个氨基酸组成，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。
以含有LcMSTN1pro-MBP蛋白的溶液来处理大黄鱼幼鱼
对照组为海水直接浸泡，实验组为浸泡1mg/L的LcMSTN1pro-MBP蛋白的溶液和5mg／L的LcMSTN1pro-MBP蛋白的溶液进行投放浸泡实验。
通过四个时间段(0d，12d，28d，41d)不同处理下对大黄鱼幼鱼体重增长的数据记录分析发现，浸泡LcMSTN1pro-MBP蛋白的溶液的幼鱼比海水浸泡体重增重快，浸泡1mg／LLcMSTN1pro-MBP蛋白溶液的实验鱼比对照组增重速度快7.3％，浸泡5mg/LLcMSTN1pro-MBP蛋白溶液的实验鱼比对照组增重速度快14.7％(具体数据见下表)，增重率与LcMSTN1pro-MBP蛋白的溶液浸泡浓度成正相关。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白，其特征在于所述的可溶性重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.根据权利要求1所述的可溶性重组蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取-80℃的冻存的大黄鱼骨骼肌肌肉组织，30mg-50mg组织在液氮中充分研磨至粉末状，加入1mlTrizol，用枪头反复吸打至均匀；
(2)肌肉样品裂解之后置于室温下5-10min，使得核蛋白和核酸完全分离；
(3)加入300μl氯仿，混匀震荡15sec置于室温5min，然后4℃，10000rpm下离心15min，漩涡混匀，样品会出现三层：上清水相，中层和下层为有机相，总RNA位于上层水相；
(4)将上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异戊醇，混匀后，置于室温20min；
(5)4℃时12000rpm下离心10min，弃去上清。置于室温干燥5-10min。用DEPC-H2O配置75％乙醇，通常1mlTrizol需加入1ml75％乙醇洗涤沉淀；用枪头吸出残液，不要吸到沉淀；室温瞭晒5min；
(6)加入35μlRNasefree的DEPC-H2O，充分溶解RNA，置于-70℃保存；
(7)设计MSTN-1前肽引物：
上游引物5’-CCGGAATTCGACCAAGAGACGCACCAG-3’
下游引物5’-CCCAAGCTTTCACACCTCCATGAACGGTT-3’
以大黄鱼cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；PCR反应体系：10Xbufer5μl，2mMdNTPs5μl，25mMMgSO43μl，模板cDNA3μl，KOD-PlusNeo1μl，加水至50μl，扩增程序：预变性94℃，2min；变性98℃，10sec，退火，55℃，30sec，延伸68℃，30sec，进行35个循环，收集扩增产物，扩增产物的链长为723bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1；
(8)对目的片段进行加a尾；
用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pMD19-T以及pMALc2x克隆质粒表达质粒以及扩增的加a尾的目的片段，分别构建LcMSTN1pro-pMD19-T以及MSTN1pro-pMALc2x表达载体；将所述的表达载体进行表达，得到的LcMSTN1pro-MBP蛋白，其分子量为69.56Kda，由625个氨基酸组成，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。
3.根据权利要求1所述的可溶性重组蛋白在促进大黄鱼增重中的应用。
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