CN102121039B - 一种植物免疫蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体公开了一种植物免疫蛋白的制备方法，包括以下步骤：先从毕赤酵母菌的种管中挑取少量菌体并转移到固体PDA培养基上，在28℃～37℃的恒温培养箱中培养至少24h；再从所述固体PDA培养基上挑取少量菌体接种到PDA液体培养基中，在180rpm～200rpm、37℃的条件下振荡培养至少24h；对培养后的菌体进行剪切以破碎菌体细胞，得到粗蛋白溶液；向粗蛋白溶液中加入硫酸铵，使其终浓度达到20％，离心后收集沉淀；将沉淀重新溶解得到蛋白液，并将蛋白液加入到载体中，混合均匀后进行喷雾干燥制得植物免疫蛋白。本发明的制备工艺操作简单、成本低、产量大、产品质量好。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的制备，尤其涉及一种植物免疫蛋白的制备工艺。
背景技术
初生多肽复合酶（Nascent polypeptide-associated complex）最早是通过亲合纯化的方法从牛脑中纯化出来的，也是最早报道该蛋白可以与信号识别颗粒SRP（signal recognition particle）竞争性结合刚从核糖体上合成的多肽。通过亲和纯化获得了两个初生多肽复合蛋白（简称NAC蛋白），分别命名为α-NAC蛋白和β-NAC蛋白。此前根据SDS-PAGE电泳结果，初步确定这两个蛋白的分子量分别为33KD和22KD，但是直到2000年通过质谱分析才获得该蛋白的真实分子量分别为23.492KD和17.352KD。NAC类蛋白基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，其命名为ZmNAC1蛋白（GenBank登录号为EU224278），该基因序列全长为1029bp，具有完整的开放阅读框架（ORF，26~907 bp），推测编码蛋白含有293个氨基酸，分子量为32.3KD，等电点为8.65。
NAC蛋白对真核生物是非常重要的，研究发现，在水稻中的NAC基因缺失突变可引起水稻的早期胚胎死亡，在果蝇（Drosophila）中的NAC基因突变可造成果蝇的二尾现象。因为NAC蛋白是一个异二聚体，所以在真核生物体内，它作为整体的功能是首要的，但是对NAC蛋白的亚细胞定位显示以及对亚基mRNA含量进行分析发现，NAC蛋白既可以发挥整体的功能，同时作为单个功能蛋白也可以起作用。
NAC蛋白的首要作用就是与信号识别颗粒SRP在与初生多肽结合时形成竞争，避免非正确折叠和缺少信号肽的蛋白序列被转运到内质网膜（ER membrane）。 SRP是一种分子伴侣，在蛋白质的翻译过程中，SRP通过与新合成的多肽的信号肽序列结合而终止蛋白的翻译过程，并将新合成的蛋白质转运到亚细胞器上，从而使蛋白质在细胞内的运输以一个整体的形式（而非以单个氨基酸的形式）进行。尽管SRP与没有信号肽的蛋白结合和运输的效率很低，但一旦SRP与没有信号肽的蛋白结合并进行运输，这对细胞来说将是毁灭性的，因为很多的蛋白酶会把细胞本身降解。此种情况下就需要NAC蛋白的参与，在NAC复合物存在的情况下，缺少信号肽的初生多肽链首先与NAC复合物结合，从而避免其与SRP结合并发生转运；而含有信号肽的初生多肽链既可以与NAC复合物结合又可以与SRP结合，但是与SRP的结合能力更强。从这种意义上讲，NAC也是一种分子伴侣。NAC复合物通过其β亚基可以与核糖体结合，这应该与其行使分子伴侣的功能有关。
此外，由于α-NAC在细胞体内的表达量远超过了β亚基，因此它可以单体形式存在，目前已有越来越多的证据证明，α-NAC蛋白是一种新的“转录共激发子”。而最早从HeLa细胞中发现的β-NAC蛋白则被命名为BTF3（Basic Transcription Factor 3），已有的研究认为该亚基具有刺激转录的作用，但是β-NAC蛋白本身不能结合DNA，它需要RNA聚合酶II的参与，与α-NAC蛋白的活性相比，目前对β-NAC蛋白刺激转录的活性多持怀疑态度。
约翰霍普金斯医学院Kimmel癌症中心的研究人员在对比338个卵巢癌患者的原发和次发性肿瘤样本后发现，次发性肿瘤样本中NAC1的含量比同一患者来源的原发性肿瘤样本中的含量明显高出许多；且原发性癌症患者如果NAC1含量高的话，接受手术一年后更易发生次发性癌症。换句话说，如果接受卵巢癌治疗的妇女其肿瘤细胞内含有大量的引发畸型生长、降低细胞死亡的结合蛋白——NAC1，则肿瘤复发的风险会增加。研究人员还表示，可以通过在手术摘除的癌症组织中检测NAC1蛋白的含量，来判断这些接受手术的妇女癌症复发的可能性，以提高医生和患者的可预见性，提高治疗效果。研究人员还强调，阻断NAC1的活性是预防、治疗卵巢癌复发的一种治疗方法。此外，通过应用免疫共沉淀、GST pull-down实验验证人Nanog基因与NAC1的相互作用，结果表明人Nanog基因与NAC1在体内、体外均能形成复合物，二者的相互作用对于人胚胎干细胞的自我更新及肿瘤的发生可能具有重要的影响。
目前还有研究发现，多个NAC蛋白可参与植物对逆境的响应。例如，利用盐溶液处理拟南芥，仅在其根中就发现有33个NAC基因的表达受到显著影响（Jiang and Deyholos，2006），其中部分基因已经过功能鉴定。此外，过量表达OsNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐等逆境的较强抗性（Nakashima et al.，2007）。来自水稻的SNAC2（stress-responsive NAC 2）基因受到干旱、高盐、低温以及ABA的诱导表达，其过表达使植株耐冷、抗盐并能抵御干旱。基因表达分析揭示，SNAC2蛋白诱导了许多胁迫相关基因的表达，包括过氧化物酶、热激蛋白和鸟氨酸转氨酶基因等（Hu et al，2008）。
综上所述，对NAC蛋白已有的研究表明，除了其在生物遗传领域所具有的基本蛋白功能以外，NAC蛋白还可在人体中引发肿瘤细胞畸型生长、降低细胞死亡，其还可参与植物对逆境的响应。更重要的是，从我们的研究情况来看，NAC蛋白还具有诱导或激活植物免疫反应的功能。对于具有植物免疫功能的NAC蛋白而言，如何对其进行制备和生产将直接影响到NAC蛋白的产业化应用，但目前的研究均侧重于蛋白的机理，尚未有关于NAC蛋白批量生产及制备工艺的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低、产量大、产品质量好的植物免疫蛋白的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种植物免疫蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌体培养：先从毕赤酵母菌（Pichia fermentans）的种管中挑取少量菌体（一小块即可）并转移到固体PDA培养基上，在28℃~37℃的恒温培养箱中培养至少24h；再从所述固体PDA培养基上挑取少量菌体接种到PDA液体培养基中，在180rpm~200rpm、37℃的条件下振荡培养至少24h；
（2）细胞破碎：对经过上述步骤（1）培养后的菌体进行剪切以破碎菌体细胞（可采用胶体磨进行剪切），所述剪切是在含该菌体的菌液中进行，剪切后得到粗蛋白溶液；
（3）沉淀蛋白：向所述粗蛋白溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度达到20%，离心后收集沉淀（即蛋白质）；
（4）喷雾干燥：将沉淀重新溶解到缓冲液中得到蛋白液，并将该蛋白液按5∶1的混合比（蛋白液的体积与蛋白质载体质量的比值）加入到蛋白质载体中，混合均匀后进行喷雾干燥制得植物免疫蛋白；所述植物免疫蛋白即为NAC蛋白（如SEQ ID NO：1所示）。
上述制备方法中，所述毕赤酵母菌优选为发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838。
上述制备方法的细胞破碎步骤中，所述菌液优选是指含有毕赤酵母菌菌体的磷酸缓冲液，该磷酸缓冲液中还添加有Na2HPO3和NaH2PO3，所述菌液的pH值为7.0~8.0。
上述制备方法的沉淀蛋白步骤中，离心时控制温度优选为4℃、转速优选为10000rpm~ 13000 rpm、离心时间优选为至少20min。
上述制备方法的喷雾干燥步骤中，所述蛋白质载体优选为硅藻土，所述干燥温度优选为180℃（工厂的喷雾干燥塔蒸发能力约为1 t/h）。
上述制备方法中，所述PDA培养基可以采用以下方法制得：以马铃薯200g、葡萄糖或蔗糖20g作原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖或蔗糖，再加1.5%的琼脂，并加水定容至1000mL。
上述制备方法中，所述PDA液体培养基可以采用以下方法制得：以马铃薯200g、葡萄糖或蔗糖20g作原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖或蔗糖，并加水定容至1000mL。
上述本发明方法制得的植物免疫蛋白（即NAC蛋白），具体可进行以下应用：
（1）用于提高番茄抗灰霉病的免疫力：先将所述植物免疫蛋白以清水稀释至5ppm~ 40ppm（优选30ppm），然后用稀释后的蛋白液对番茄（例如长成至3~6片叶的番茄幼苗）进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d~30d；
（2）用于提高番茄抗烟草花叶病毒的免疫力：先将所述植物免疫蛋白以清水稀释至5ppm ~40ppm（优选30ppm），然后用稀释后的蛋白液对番茄（例如长成至3~6片叶的番茄幼苗）进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d~30d；
（3）对提高辣椒抗疫霉菌病的免疫力：先将所述植物免疫蛋白以清水稀释至5ppm~ 40ppm，然后用稀释后的蛋白液对辣椒（例如长成至8~9片叶的辣椒幼苗）进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d~30d。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的工艺制备步骤简单，工艺效率高，其为产业化生产植物免疫蛋白提供了一条切实可行的途径；而且，本发明制备的植物免疫蛋白质量较好，可以有效地应用于提高植物抵抗病毒、病菌的免疫力。此外，本发明的制备工艺安全无污染，无工业废弃物产生，是一种清洁、环保的生产工艺。
附图说明
图1为本发明实施例中的双子叶植物灰霉病的分级图。
图2为本发明实施例中植物免疫蛋白制备工艺的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例：
一种如图2所示的本发明的植物免疫蛋白的制备工艺，具体包括以下步骤：
1、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）菌株的培养
将发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838（不限于该菌株，例如树干毕赤酵母菌株亦可）菌株用PDA培养基试管斜面培养，然后加50%液体石蜡油封存并置于-70℃超低温冰箱中保存，大量摇菌则采用PDA液体培养基培养。
在紫外光照射25min后的洁净工作台上，先从低温保存的种管中挑取少量发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体，将该菌体转接到固体PDA培养基上，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24h，完成一级发酵，再从固体PDA培养基上挑取少量菌体接种到PDA液体培养基中，并置于180rpm、37℃条件下的振荡摇床中培养24h，完成二级发酵。
2、发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体细胞的破碎
通过上述步骤1的培养后，NAC蛋白已包含于发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体细胞内，我们再采用胶体磨对该菌株的菌体进行剪切，以破碎其菌体细胞；剪切是在含该菌体的菌液（菌体浓度OD值为600，1010~1012 cfu/ml）中进行，菌液是指含有毕赤酵母菌菌体的磷酸缓冲液（pH值为7.0~8.0），该磷酸缓冲液中还添加有0.81g的Na2HPO3和0.125g的NaH2PO3；剪切完成后得到粗蛋白溶液。
3、硫酸铵沉淀NAC蛋白
通过上述步骤2制得的粗蛋白溶液用加入盐（也可加入有机溶剂）的方法进行分离。硫酸铵是蛋白质初级分离中广泛使用的盐类，它在使蛋白质与其他物质分离的同时，能较好的保持蛋白质活性。因此，我们采用向粗蛋白溶液中加入硫酸铵的方式对发酵后的粗蛋白溶液进行分离。硫酸铵沉淀的具体操作为：先将盛有发酵后粗蛋白溶液的烧杯置于冰盒内，以磁力搅拌器匀速搅拌，缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至其终浓度（质量分数）达到20%，溶解1h后以4℃、13000 rpm的离心条件离心20min，收集沉淀。
4、喷雾干燥
将收集的蛋白沉淀加入到100ml的磷酸缓冲液（pH值为7.0~8.0）中重新溶解，得到蛋白液，将该蛋白液按5:1的体积质量比例加入到300目的硅藻土载体中，混合均匀，再将混合物打入喷粉塔中，控制塔内温度为180℃，出风温度85℃，在塔底得到植物免疫蛋白干粉。
上述PDA培养基是通过以下方法制得：以削皮马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g为原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖，再加1.5%的琼脂，并加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌20min即可。
上述PDA液体培养基是通过以下方法制得：以削皮马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g为原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖，并加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌20min即可。
应用1：将上述实施例制得的植物免疫蛋白（即SEQ ID NO：1所示的NAC蛋白）以清水稀释至30ppm，用稀释后的蛋白液对番茄幼苗叶片（5~6片叶）进行喷雾处理，以清水作对照，每个处理30 株苗。处理7d、14d后，分别用喷雾法将番茄灰霉病菌孢子悬浮液（105个/ml）接种到番茄幼苗上，48h保湿，一周后进行病情指数调查，计算防治效果，各处理均重复三次，处理后的实验结果如下表1所示。
表1：NAC蛋白对番茄诱导抗病性的实验对照结果
上表1中：
病情指数Pt=×100
（病叶的分级方法可参考图1）
诱抗效果=
×100%，其中Pt1表示实施例1方法处理后的病情指数；PtCK表示清水对照的病情指数。
结果与分析：由表1可见，NAC蛋白能够显著增强番茄自身对抗灰霉病的免疫力，应用本发明方法处理后的番茄对灰霉病的抗性有显著增长；经7天后，NAC蛋白处理过的番茄对灰霉病的抗性达到最高值，处理后的诱抗效果为67.1%。本实施例的应用结果表明，以NAC蛋白的稀释液处理番茄叶片后，在处理后的第7天番茄对灰霉病的诱抗效果达到最佳，而且番茄病情指数在第7天、第14天时均显著低于空白对照，其诱抗效果分别为67.1%和48.1%。
应用2：将上述实施例制得的植物免疫蛋白以清水稀释至25ppm，用稀释后的蛋白液对辣椒（品种：中椒三号）进行喷雾处理，以清水作对照，处理7d后用辣椒疫霉菌接种灌根，灌根接种后的第7天调查病情指数，计算防治效果如下表2所示。调查实验数据均采用DPS数据处理系统进行5%水平上的差异显著性分析。
表2： 植物免疫蛋白对辣椒疫病诱抗效果的实验对照
上表2中：
病情指数Pt=
×100
诱抗效果=
×100%，其中Pt2表示实施例2方法处理后的病情指数；PtCK表示清水对照的病情指数。
辣椒疫霉菌病苗期病情分级标准为（以整株为单位）：
0级：无病；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1cm~2cm，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过2cm，多数叶片明显萎蔫或落叶明显，植株不倒伏或稍倒伏；
4级：幼苗茎部变黑绕缩，除生长点外全部叶脱落或整株萎蔫，植株倒伏；
5级：植株枯死。
预防作用以处理第7d后植物免疫蛋白的处理效果好，防效为67.4%，说明本实施例制得的植物蛋白有进一步开发的价值。
应用3：首先用消毒土培育出3~4叶的番茄幼苗（长约6cm~8cm），然后将本实施例制得的植物免疫蛋白以清水稀释至30ppm，用稀释后的蛋白液对番茄幼苗（3~4片叶）进行喷雾处理，以清水处理作对照。喷药处理后的第7天、第14天接种烟草花叶病毒（TMV），各处理均重复三次。接种病毒后的第7天调查各个番茄幼苗的病情指数，计算诱抗效果如下表3所示。
表3：植物免疫蛋白对番茄诱导抗病毒性的实验对照结果
上表3中病情指数和诱抗效果的计算方法参见应用1。
由上表3的实验测定结果可见，经本实施例制得的植物免疫蛋白喷施的番茄植株对烟草花叶病毒病抗性明显提高，防治效果达到57.1%。
Claims (6)
1.一种植物免疫蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌体培养：先从发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）的种管中挑取少量菌体并转移到固体PDA培养基上，在28℃~37℃的恒温培养箱中培养至少24h；再从所述固体PDA培养基上挑取少量菌体接种到PDA液体培养基中，在180rpm~200rpm、37℃的条件下振荡培养至少24h，所述发酵毕赤酵母的保藏号为CGMCC 2.1838；
（2）细胞破碎：对经过上述步骤（1）培养后的菌体进行剪切以破碎菌体细胞，所述剪切是在含该菌体的菌液中进行，剪切后得到粗蛋白溶液；
（3）沉淀蛋白：向所述粗蛋白溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度达到20%，离心后收集沉淀；
（4）喷雾干燥：将沉淀重新溶解到缓冲液中得到蛋白液，并将该蛋白液按5∶1的混合比加入到蛋白质载体中，混合均匀后进行喷雾干燥制得植物免疫蛋白；所述植物免疫蛋白即为NAC蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎步骤中，所述菌液是指含有毕赤酵母菌菌体的磷酸缓冲液，该磷酸缓冲液中还添加有Na2HPO3和NaH2PO3，所述菌液的pH值为7.0~8.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述沉淀蛋白步骤中，离心时控制温度为4℃、转速为10000rpm~13000rpm、离心时间至少为20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述喷雾干燥步骤中，所述蛋白质载体为硅藻土，所述干燥温度为180℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PDA培养基的制备方法为：以马铃薯200g、葡萄糖或蔗糖20g作原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖或蔗糖，再加入1.5%的琼脂，并加水定容至1000mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PDA液体培养基的制备方法为：以马铃薯200g、葡萄糖或蔗糖20g作原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖或蔗糖，并加水定容至1000mL。
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