CN113583140B - 猪流行性腹泻病毒Nsp10蛋白、含该Nsp10蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒Nsp10蛋白、含该Nsp10蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒nsp10蛋白、含该nsp10蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。本发明将猪流行性腹泻病毒的nsp10蛋白进行了原核表达，其蛋白产量相当高，另外，本发明首次证明重组nsp10的原核表达可在小鼠体内诱导活跃的体液和细胞免疫，nsp10蛋白免疫鼠产生的nsp10抗体滴度达1:13000，MBP‑nsp10蛋白免疫鼠产生的nsp10抗体滴度高达1:42000。同时证明了MBP可增强nsp10的免疫诱导能力，上述结果表明，PEDV的nsp10蛋白可用于制备PEDV诊断试剂和疫苗。

Description

猪流行性腹泻病毒Nsp10蛋白、含该Nsp10蛋白的融合蛋白及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒Nsp10蛋白、含该Nsp10蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)是一种主要以引起猪呕吐腹泻与脱水的强传染性肠道病毒。PEDV最早在1971年爆发于英国，之后多个地区均有报道。十九世纪八十年代，中国初次报道PEDV疫情，并分离PEDV病毒株。2010年，亚洲地区多个国家出现PEDV突变毒株，导致仔猪大规模死亡，造成严重经济损失。原有疫苗对PEDV突变株不具备良好保护作用。此外，PEDV临床症状与病理特征和感染性肠胃炎、猪轮状病毒高度相似，现有检测手段存在交叉反应。因此，对PEDV突变毒株研究，为研发特异性检测方法对PEDV的防控与检测至关重要。PEDVnsp10是病毒核苷-2-O'-甲基转移酶的辅助蛋白，激活核苷-2-O'-甲基转移酶活性，是一种锌结合蛋白，单个nsp10蛋白形成12聚合物结构，不具有酶活性。nsp10在病毒复制过程中发挥重要作用，可与非结构蛋白nsp16互作拮抗干扰素β。因此，PEDV的nsp10蛋白是关键的调控亚基，是病毒RNA合成的重要调控因子，对病毒复制至关重要。
但是，关于PEDV的nsp10免疫原性的研究目前尚未见报道。
发明内容
本发明将PEDV的nsp10蛋白进行了原核表达，其蛋白产量相当高，另外，本发明首次证明重组nsp10的原核表达可在小鼠体内诱导活跃的体液和细胞免疫，同时证明了MBP可增强Nsp10的免疫诱导能力，上述结果表明，PEDV的nsp10蛋白可用于制备PEDV诊断试剂和疫苗。
本发明的技术方案为：
本发明为获得大量PEDV的nsp10重组蛋白，将目的蛋白nsp10克隆至pMAL-c2x-MBP和pET-28a载体。麦芽糖结合蛋白(MBP)通常用来提高可溶性，可以减少蛋白的降解，增加蛋白表达量和稳定性，并且有研究发现与MBP融合表达的亚单位疫苗保护力增强。本发明将重组载体转化至大肠杆菌BL21菌株中，通过优化蛋白表达条件：温度、时间、IPTG浓度，利用Ni-NTA介质亲和层析技术，通过高浓度竞争性洗脱剂将目的蛋白纯化，获得大量重组蛋白用于后续研究。分别用纯化的MBP-nsp10、nsp10和MBP-TFF免疫6～8周龄的昆明雌性小鼠，获得抗体血清，并利用间接ELISA检测相应抗体滴度。结果表明：nsp10蛋白免疫鼠产生的nsp10抗体滴度达1:13000，MBP-nsp10蛋白免疫鼠产生的nsp10抗体滴度高达1:42000，表明MBP可能发挥免疫增强功能，提高了nsp10诱导的抗体滴度。将PEDV猪阳性血清作为一抗，进行免疫印迹分析，结果表明：猪阳性血清可特异性识别nsp10蛋白，进一步证实重组蛋白nsp10的免疫原性。体液免疫和细胞免疫在宿主抗病毒过程中扮演重要角色，为了评估小鼠免疫抗原后体液和细胞免疫水平，本发明检测了小鼠脾脏淋巴细胞和血清中细胞因子的表达。由于细胞因子通常是可溶性蛋白，可分泌于体液，故而夹心ELISA法测定小鼠脾脏淋巴细胞TNF-α和血清IL-4的表达。其次，在mRNA水平对小鼠脾脏淋巴细胞中的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ进行Real-time PCR检测。结果表明：重组蛋白nsp10免疫组的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表达量较对照组均明显升高，nsp10蛋白免疫小鼠后诱导了小鼠免疫反应。
上述PEDV的nsp10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，MBP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的有益效果为：
1、本发明发现重组nsp10的可在小鼠体内诱导活跃的体液和细胞免疫，且MBP可增强nsp10的免疫诱导能力，具体的，nsp10蛋白免疫鼠产生的nsp10抗体滴度达1:13000，MBP-nsp10蛋白免疫鼠产生的nsp10抗体滴度高达1:42000。因此，重组蛋白nsp10和MBP-nsp10可参与制备PEDV疫苗。MBP还可以作为nsp10的免疫佐剂应用。
2、重组蛋白nsp10和MBP-nsp10均能与感染了PEDV的猪阳性血清发生特异性结合，因此重组蛋白nsp10和MBP-nsp10可用于制备PEDV诊断试剂。
附图说明
图1为PEDV病毒CV777的RNA提取结果(A)和PEDVnsp10基因的扩增结果(B)。图1A中M:DNAmarker 2000，Lane 1～3:Total RNA；图1B中M:DNAmarker 2000，Lane1:PEDVnsp10基因扩增条带，Lane2为阴性对照。
图2为pMAL-c2x-MBP-nsp10和pET-28a-nsp10重组质粒的菌液PCR鉴定结果。M:DNAmarker 2000，Lane1、2、3为pMAL-c2x-MBP-nsp10，5、6为pET-28a-nsp10阳性样本，Lane4和7为阴性样本，Lane8为阴性对照。
图3为pMAL-c2x-MBP-nsp10双酶切鉴定结果。图3A中，M:DNAmarker 15000，Lane1:pMAL-c2x-MBP-nsp10(7062bp)，图3B中，M:DNAmarker 15000，Lane1:pMAL-c2x-MBP-nsp10双酶切后的条带。
图4为pET-28a-nsp10 PCR鉴定结果。图4A中M:DNAmarker 15000，Lane1:pET-28a-nsp10(5740bp)，图4B中M:DNAmarker 2000，Lane1和2是nsp10扩增产物(408bp)，Lane4和5是T7通用引物扩增产物(618bp)，Lane3是阴性对照。
图5为重组蛋白的表达。图5A中Lane1和lane2分别是MBP-TFF的诱导前和诱导后，蛋白大小为60kDa。图5B中Lane1是重组蛋白MBP-nsp10诱导前，lane2～6是诱导后，蛋白大小为56kDa。图5C中Lane1是nsp10的诱导前，Lane2～5是诱导后，蛋白大小为16kDa。
图6为MBP-TFF诱导温度优化结果。Lane1是诱导前，Lane2～7是28℃，30℃，34℃，37℃，39℃，40℃诱导后。
图7为MBP-nsp10诱导温度优化结果。Lane1分别是诱导前，Lane2～7是14℃，15℃，16℃，18℃，20℃，24℃诱导后。
图8为nsp10诱导温度优化结果。Lane1分别是诱导前，Lane2～7是34℃，37℃，39℃，40℃，42℃，43℃诱导后。
图9为MBP-TFF诱导时间优化结果。Lane1是诱导前，Lane2～7是16h，18h，20h，24h，28h，30h诱导后。
图10为MBP-nsp10诱导时间优化结果。Lane1分别是诱导前，Lane2～7是16h，18h，20h，24h，28h，30h诱导后。
图11为nsp10诱导时间优化结果。Lane1和Lane2分别是空载pET-28a诱导前和诱导后，Lane3～8是4h，6h，8h，10h，12h，16h诱导后，Lane9为nsp10未诱导。
图12为MBP-TFF诱导IPTG浓度优化结果。Lane1是诱导前，Lane2～7是0.5mM，0.8mM，1.0mM，1.4mM，1.8mM，2.0mM诱导后。
图13为MBP-nsp10诱导IPTG浓度优化结果。Lane1是诱导前，Lane2～7是0.5mM，0.8mM，1.0mM，1.4mM，1.8mM，2.0mM诱导后。
图14为nsp10诱导IPTG浓度优化结果。Lane1和Lane2分别是空载pET-28a诱导前和诱导后，Lane3～8是0.5mM，0.8mM，1.0mM，1.4mM，1.8mM，2.0mM诱导后，Lane9为nsp10未诱导。
图15为重组蛋白MBP-TFF，MBP-nsp10，nsp10的纯化结果。图15A中Lane1和Lane4是MBP-TFF蛋白未诱导，Lane2和Lane5是MBP-TFF蛋白诱导后，Lane3和Lane6是MBP-TFF蛋白250mm咪唑洗脱下来的纯化条带。图15B中Lane1是重组蛋白MBP-nsp10未诱导，Lane2～5是100mm，200mm，250mm，300mm咪唑洗脱下来的纯化条带。图15C中Lane1和Lane2是空载pET-28a未诱导和诱导后，Lane3和Lane4是nsp10未诱导和诱导后，Lane5是流穿液，Lane6是洗杂液，Lane7～8是200mm、250mm咪唑洗脱下来的纯化蛋白。
图16为重组蛋白MBP-nsp10，nsp10的Western Blot鉴定结果。MBP-nsp10从左至右Lane1为诱导前，Lane2为诱导后，Lane3为NI柱纯化蛋白。nsp10从左至右Lane1为菌体诱导前，Lane2为诱导后，Lane3为纯化蛋白。
图17为MBP-TFF，MBP-nsp10，nsp10免疫鼠血清抗体水平的ELISA检测结果。
图18为Western Blot鉴定血清抗体特异性结果。重组蛋白pMAL-c2x-MBP-nsp10和pET-28a-nsp10从左至右Lane1为诱导前，Lane2为诱导后，Lane3为纯化蛋白。
图19为小鼠脾脏中TNF-α表达ELISA结果。
图20为小鼠血清中IL-4表达的ELISA检测结果。
图21为小鼠脾脏中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ表达Real-time PCR检测结果。
图22为重组蛋白MBP-nsp10 ELISA与商业ELISA试剂盒检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
本实施例中的感染PEDV病毒CV777的Vero细胞由发明人所在实验室保存；
昆明雌性小鼠购自江西中医药大学。
一、PEDV nsp10蛋白的重组表达载体构建
1、PEDVRNA的提取
(1)准备试剂：Trizol，三氯甲烷，异丙醇，RNase-Free水，用RNase-Free水配制75％乙醇。(2)将-80℃保藏的毒液(感染PEDV病毒CV777的Vero细胞)快速解冻后，离心去除上清，获得感染PEDV的Vero细胞，向EP管中加入1mLTrizol(异硫氰酸胍/酚)，用枪反复吹打混匀，破碎细胞释放RNA，Trizol同时具有切断DNA的作用，室温下静置5min，使核酸和蛋白完全分离。
(3)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15～30s，静置2～3min。
(4)4℃离心，12000g×15min。可看到EP管中样品RNA主要在上部水层。
(5)DEPC水处理1.5mLEP管，吸出RNA，弃去下层有机相，保证RNA纯度，加入500μLIsopropanol(异丙醇)，混匀后于室温下静置10min。
(6)低温离心10min，RNA沉淀于EP管的底部，呈透明胶状。
(7)弃上清，将沉淀RNA溶于预冷的75％乙醇1mL，轻轻敲打EP管壁使RNA被充分洗涤。(8)4℃12000g离心5min。
(9)倒掉上层乙醇，将EP管倒扣于桌面使液体流尽，室温放置5～10分钟，待乙醇基本挥发。
(10)加入20μL～50μL DEPC水(RNase Free)溶解RNA(若不溶，可于65℃促溶10～15min)。(11)取2μL进行电泳，其余放-80℃长期保存。
RNA电泳结果显示有比较清晰的条带，分别为28s、18s和5s，表明成功提取总RNA，如图1A所示。
2、Nsp10cDNA的合成
以提取的PEDV的RNA为模板，进行RT反应，具体反应体系如下：
RNA 1μg
5x RT Mix 4μL
Water(Nuclease-free) up to 20μL
Total volume 20μL
反应程序如下：
温度 时间
37℃ 5s
85℃ 15min
4℃ Until
3、PCR引物设计与合成
根据GENBANK中查询的PEDV nsp10(KT323979.1)序列利用Primer 6.0软件设计引物，具体见表1。
表1PEDV nsp10扩增用引物序列
Figure GDA0004085279270000051
4、PEDVnsp10基因扩增
PCR扩增nsp10，模板cDNA由步骤2合成，PCR反应体系如下：
Figure GDA0004085279270000052
Figure GDA0004085279270000061
PCR反应程序如下：
Figure GDA0004085279270000062
扩增产物均通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果显示在图1B中，在DNAmarker的500bp下方附近的位置有明显的条带，与预期的条带408bp一致，表示PCR成功扩增出目的条带。
5、PEDVnsp10的胶回收纯化
(1)取跑完的琼脂糖凝胶，尽量精确的切取所需目的条带，加入于凝胶体积3倍体积的GSB溶液，凝胶1g大约为1mL。
(2)于55℃水浴锅中融胶10分钟，期间需轻轻摇晃EP管，使管壁受热均匀，确保胶块完全融化。
(3)取出EP管，让溶液降至室温。将溶解后的溶液加入吸附柱中静置1min,10000g离心1min，可重复离心以提高胶回收效率。
(4)加入650μL洗涤液到吸附柱上，10000g离心1min。
(5)10000g离心2min，将EP管倒放流干水分，室温晾干5～10min。
(6)加入30～50μL洗脱液于吸附柱，室温下静置1～2min使洗脱液完全浸润底部，10000g离心1min洗脱DNA，可通过多次洗脱增加回收效率，提高DNA浓度
6、载体pMAL-c2x-MBP，pET-28a(+)质粒提取
(1)将含载体质粒pMAL-c2x-MBP、pET-28a的DH5a大肠杆菌，接在含有抗生素氨苄青霉素(Amp)或卡纳霉素(Kana)的LB液体培养基中，37℃震摇培养过夜。
(2)1.5mLEP管12000g离心1min收集菌体，弃上清，可多次离心收集全部菌体，倒扣EP管于滤纸上吸干水分，沉淀用1×PBS清洗。
(3)在沉淀中加入250μLP1溶液，振荡30s，使菌体充分裂解。
(4)加入250μLP2溶液，上下颠倒混匀。
(5)加入350μLP3溶液，上下温和颠倒6～8次，13000g离心10min。所述P1溶液、P2溶液和P3溶液来自质粒小提试剂盒(天根高纯度质粒小提试剂盒(DP107))。
(7)上清液转移至收集管中，尽量不吸取下层白色混合物，防止蛋白污染DNA，10000rmp离心1min。此处可重复收集DNA以提高质粒浓度。
(8)加600μL DNA Wash Buffer，10000rmp离心1min，可重复洗涤一次。
(9)室温晾干10～20min，加人50μLEB缓冲液，溶解DNA。
(10)样品放-20℃冰箱保存备用。
7、大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)前一天：-20℃取出保藏的甘油菌液，吸取大肠杆菌100μL接种于LB液体培养基，过夜培养。
(2)第二天：取50μL过夜培养菌液，1:100转接于5mLLB液体培养基。
(3)培养至大肠杆菌的生长对数期，可通过检测菌液的OD600值为0.4～0.6准确判断。
(4)分装菌液于EP管，每只EP管加入1mL菌液，冰浴10min。
(5)4℃，4000rpm离心10min，倒掉清液。
(6)0.1M CaCl2预冷后向EP管中加入1mL重悬菌体，吹打混匀后冰浴10min。
(7)4℃，4000rpm离心10min，弃上清液。
(8)每管加入200μL 0.1M CaCl2重悬细胞，以50～100μL/每管分装感受态细胞，4℃保存，一周内使用(或者每管加入240μL0.1M CaCl2和60μL50％甘油重悬细胞，以50～100μL/每管分装感受态细胞，-80℃保存，长期使用)
8、载体与目的基因片段的连接
(1)pMAL-c2x-MBP用EcoRI，HindIII双酶切消化，pET-28a用BamHI，XhoI双酶切消化，双酶切体系：
试剂名称 体积
10×Buffer 2μL
pMAL-c2x-MBP/pET-28a(+) 1μg
EcoRI/BamHI 1μL
或HindIII/XhoI 1μL
Water Upto20μL
37℃水浴1h，琼脂糖电泳回收DNA片段。
(2)DNA片段和载体连接体系：
Figure GDA0004085279270000071
Figure GDA0004085279270000081
连接后得重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10、pET-28a-nsp10。
(3)16℃反应12h～16h，10μL转化感受态细胞。
9、重组质粒的转化
(1)灭菌的LB固体培养基加热至沸腾，室温冷却至50℃～60℃，加入抗生素Amp或Kana，超净工作台倒平板，准备不含抗生素的LB固体培养基作对照。
(2)分装好的大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃取出，冰浴融化5min。
(3)加入连接产物10μL，冰浴30min。
(4)42℃水浴热击1min 30s。
(5)立刻冰浴3min。
(6)加入600μL无抗生素培养基，37℃于摇床振荡培养45min。
(7)菌体8000rmp离心30s，留下300μL涂板于含抗生素的固体培养基，过夜37℃倒置培养。若有需要可做不加抗生素的对照组。
10、重组质粒的鉴定
(1)菌液PCR鉴定：挑取重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10和pET-28a-nsp10菌液分别就进行PCR鉴定，PCR体系：
试剂名称 体积
5×PCR Mix 2μL
Forward primer(10μM) 0.2μL
Reverse primer(10μM) 0.2μL
单菌落菌液 0.2μL
Water Nuclease-free Up to 10μL
PCR反应程序参考上述步骤4。
菌液PCR扩增结果显示产物条带位于DNAmarker的500bp下方附近，与预期条带(408bp)一致，如图2所示。
(2)酶切鉴定：提取重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10，经EcoRI、Hind III双酶切鉴定，体系如下：
试剂名称 体积
10×Buffer 2μL
重组质粒 1μg
EcoRI 1μL
HindIII 1μL
Water Up to 20μL
Total volume 20μL
37℃水浴1小时，1％琼脂糖电泳鉴定，鉴定结果如图3所示。经过双酶切后的重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10得到两条条带，一条为pMAL-c2x-MBP载体的线性片段，另外一条在408bp的位置，与预期条带(408bp)一致。初步确定重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10构建成功。
(3)PCR鉴定：提取重组质粒pET-28a-nsp10。pET-28a-nsp10可直接通过T7通用引物及PCR引物进行PCR鉴定，鉴定结果如图4所示，适用于pET-28a的nsp10正反向引物扩增出的条带在DNAmarker的500bp下方附近，T7通用引物扩增的条带在DNAmarker的500bp和750bp之间，与预期条带(408bp、621bp)一致。初步确定重组质粒pET-28a-nsp10构建成功。
11、测序鉴定
将经PCR和双酶切鉴定的重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10、pET-28a-nsp10送往测序公司测序，测序结果经NCBI Blast比对发现均没有碱基的缺失和突变。表明成功构建了2个原核重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp10，pET-28a-nsp10。
二、重组nsp10蛋白的表达和纯化
1、重组蛋白的表达鉴定
(1)前一天于含抗生素的LB液体培养基中接种重组质粒表达菌株，37℃过夜培养。
(2)第2天按1:100的比例转接至新的培养基中，继续培养至OD600为0.6～0.8。
(3)按照表达条件范围：①MBP-TFF：28℃～40℃，IPTG浓度0.5mM～2.0mM，诱导时间15h～30h；②MBP-nsp10：15℃～24℃，IPTG浓度0.5mM～2.0mM，诱导16h～30h；③nsp10：34℃～43℃，IPTG浓度0.5mM～2.0mM，诱导4h～16h。未加诱导剂的菌液为阴性对照。(3)将诱导前后的菌液各收集至1.5mL离心管中，12000rmp离心1min，去上清，沉淀用500μL的1×PBS重悬，取50μL重悬液，加入10μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸10min。取10μL样品进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色定性。
结果如图5所示，MBP-TFF诱导后的蛋白大小约为60kDa，MBP-nsp10诱导后的蛋白大小约为56kDa，nsp10诱导后的蛋白大小约为16kDa，MBP-TFF、MBP-nsp10和nsp10诱导成功。因此蛋白表达的条件范围即为：
①MBP-TFF：28℃～40℃，IPTG浓度0.5mM～2.0mM，诱导时间15h～30h；
②MBP-nsp10：15℃～24℃，IPTG浓度0.5mM～2.0mM，诱导16h～30h；
③nsp10：34℃～43℃，IPTG浓度0.5mM～2.0mM，诱导4h～16h。
2、诱导温度优化
(1)5mL LB液体培养基中加入氨苄青霉素或卡那霉素至终浓度为50μg/μL，接种重组质粒表达菌株，37℃过夜培养。
(2)第2天，将重组质粒表达菌株按1:100转接至新的培养基中，酶标仪测菌液OD600值为0.6～0.8时加入IPTG，终浓度为1mmoL/L。
(3)分别在MBP-TFF：28℃，30℃，32℃，34℃，37℃，40℃；MBP-nsp10：14℃，15℃，16℃，18℃，20℃，24℃；nsp10：34℃，37℃，39℃，40℃，42℃，43℃；诱导8h，阴性对照未加诱导剂。
(4)菌体12000g离心1min，PBS清洗后重悬，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃加热10min，离心后经12％SDS-PAGE分析确定最佳诱导温度。
对于重组蛋白MBP-TFF，结果如图6所示，MBP-TFF蛋白大小约60kDa，MBP-TFF蛋白的表达从Lane2开始，随着温度的升高先升高后降低，37℃时MBP蛋白表达达到最大值，由此可以得出MBP-TFF蛋白最佳表达温度为37℃。
对于重组蛋白MBP-nsp10，结果如图7所示，MBP-nsp10蛋白大小约56kDa，从Lane3的15℃开始MBP-nsp10蛋白开始表达，随着温度的增加发现在Lane3和Lane4即15℃、16℃时蛋白有表达，在16℃诱导表达MBP-nsp10蛋白表达量最大，其他温度不表达或者表达量较小，因此得出MBP-nsp10蛋白最佳表达温度为16℃。
对于重组蛋白nsp10，结果如图8所示，nsp10蛋白大小约16kDa，从Lane2的34℃开始nsp10蛋白开始表达，蛋白表达量随温度升高先升高后降低，nsp10蛋白在40℃时达到最高表达，由此得出nsp10蛋白最佳表达温度为40℃。
3、诱导时间优化
(1)重组质粒表达菌株培养方法与上述相同。
(2)分别在37℃诱导MBP-TFF：16h，18h，20h，24h，28h，30h；16℃诱导MBP-nsp10：16h，18h，20h，24h，28h，30h；40℃诱导nsp10：4h，6h，8h，10h，12h，16h。未加诱导剂的菌液被作为阴性对照。
(3)12000g离心1min收集菌体，PBS洗涤一次，PBS重悬，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃加热10min，离心后经12％SDS-PAGE分析得出最佳诱导时间。
对于重组蛋白MBP-TFF，结果如图9所示，MBP-TFF蛋白大小约60kDa，从Lane2 MBP蛋白开始表达，随着时间的增加蛋白表达量先增加后减小，在诱导表达24h时MBP-TFF蛋白量达到最大，即得出MBP-TFF蛋白最佳表达时间为24h。
对于重组蛋白MBP-nsp10，结果如图10所示，MBP-nsp10蛋白大小约56kDa，从Lane2开始MBP-nsp10蛋白开始表达，随着时间的增加发现在Lane2、Lane3、Lane5时即在表达16h，18h，24h时蛋白有表达量较高，在诱导表达24h时MBP-nsp10蛋白表达量最大，即得出MBP-nsp10蛋白最佳表达时间为24h。
对于重组蛋白nsp10，结果如图11所示，nsp10蛋白大小约16kDa，从Lane3开始nsp10蛋白有表达，随着时间的增加蛋白表达量先增加后减小，在诱导表达8h时nsp10蛋白量达到最大，即得出nsp10蛋白最佳表达时间为8h。
4、IPTG诱导浓度优化
(1)重组质粒表达菌株培养方法同上，培养至OD600为0.6～0.8时，MBP-TFF加入IPTG：0.5mM，1.0mM，1.2mM，1.4mM，1.8mM，2.0Mm在37℃诱导24h；MBP-nsp10加入IPTG：0.5mM，1.0mM，1.2mM，1.4mM，1.8mM，2.0Mm在16℃诱导24h；nsp10加入IPTG：0.5mM，1.0mM，1.2mM，1.4mM，1.8mM，2.0Mm在40℃诱导8h。未加诱导剂的菌液为阴性对照。
(2)12000g离心1min收集菌体，PBS洗涤一次，PBS重悬，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃加热10min，离心后经12％SDS-PAGE分析得出最佳IPTG终浓度。
对于重组蛋白MBP-TFF，结果如图12所示，MBP-TFF蛋白大小约60kDa，从Lane2MBP-TFF蛋白开始表达，随着时间的增加蛋白表达量先增加后减小，在IPTG浓度为1.0mM诱导表达MBP-TFF蛋白量达到最大，即得出MBP-TFF蛋白最佳IPTG浓度为1.0mM。
对于重组蛋白MBP-nsp，结果如图13所示，MBP-nsp10蛋白大小约56kDa，从Lane2开始MBP-nsp10蛋白开始表达，随着浓度的增加发现在Lane5、Lane6即在IPTG浓度为1.4mM、1.8mM时蛋白有较高表达量，在1.4mM诱导表达MBP-nsp10蛋白表达量最大，即得出MBP-nsp10蛋白最佳IPTG浓度为1.4mM。
对于重组蛋白nsp10，结果如图14所示，nsp10蛋白大小约16kDa，从Lane3开始nsp10蛋白有表达，随着时间的增加蛋白表达量先增加后减小，在1.4mM诱导表达nsp10蛋白量达到最大，即得出nsp10蛋白最佳表达IPTG浓度为1.4mM。
5、重组蛋白的纯化
(1)大量表达重组蛋白MBP-nsp10、nsp10和MBP-TFF蛋白，12000g离心1min收集菌体，PBS重悬，超声破碎，加PMSF使终浓度至1mM，破碎菌体至菌液澄清透亮。
(2)离心去上清，沉淀按每100mg加入2mL包涵体溶解液(8M尿素或6M盐酸胍)，10000g高速离心1h取上清。
(3)溶解后的包涵体12000g离心20～30min，上层清液于先用0.45μm的滤嘴粗滤，以防大量杂质堵塞滤嘴，再用0.22μm的滤嘴精滤。
(4)10倍于柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱。
(5)将过滤好的目的蛋白加入镍柱，通过重力自然流下
(6)上样完成后加入于柱体积5倍的洗杂缓冲液，将结合在镍柱上的杂质蛋白洗去。
(5)洗杂结束，用2～3倍柱体积梯度咪唑洗脱目的蛋白。
(6)洗脱完毕10倍柱体积的500mM咪唑清洗镍柱上残留的蛋白，10倍柱体积平衡缓冲液清洗镍柱，10倍柱体积去离子水清洗镍柱。
(7)清洗完成后，加入20％乙醇，镍柱上下两端密封，保存4℃冰箱。
(8)取50μL洗脱液，加入10μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10min。取10μL样品进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色鉴定。
重组蛋白MBP-TFF、MBP-nsp10和nsp10纯化结果如图15所示。
6、重组蛋白的Western Blot鉴定
(1)制备SDS-PAGE胶。
(2)取50μL蛋白纯化的洗脱液，加入10μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10min。取10μL样品进行SDS-PAGE，将SDS-PAGE胶取出浸泡在新鲜配制的1×转膜液5～10min。(3)根据所需泳道大小，裁剪适合的PVDF膜，甲醇浸泡2分钟。
(4)按顺序在黑色的转膜板上面放入垫片、3层滤纸、PAGE胶、PVDF膜，3层滤纸、垫片，白色转模板盖住小心压紧。转膜时设置电流为300mA，根据转膜蛋白大小，每1kDa转模1min设置转模时间。
(5)转模完毕，取下PVDF膜，用5％脱脂奶粉37℃密封1h，于摇床上1×TBST漂洗两遍，每次10min。
(6)PVDF膜孵育在一抗(6×His-Tag鼠源抗体或者MBP鼠源抗体)中，4℃孵育过夜。第二天，用1×TBST于摇床上漂洗3次，每次10min。
(7)二抗羊抗鼠-HRP用1×PBS以1:5000稀释，PVDF膜浸透于抗体中于摇床低转速室温孵育2h，1×TBST漂洗3次，每次10min。
(8)1:1配置化学发光液，现配现用，凝胶成像系统分析Western Blot条带。
MBP-TFF蛋白，用MBP标签抗体作为一抗鉴定MBP-TFF的表达。结果如图16所示，结果表明：Lane1为诱导前，诱导前无特异性条带，Lane2为诱导后，Lane3为NI柱纯化蛋白，诱导后和纯化后均有明显特异性条带。
三、重组蛋白多克隆抗体效价测定及特异性分析
1、动物免疫
(1)取定量好的抗原(重组蛋白)与弗氏完全佐剂1:1加入充分乳化，用旋转混匀仪混匀20～30min，待液体滴在水面上不散开为止，即得到稳定的乳化液，以50μg每只鼠的剂量皮下多点注射或腹腔注射接种4只6～8周龄昆明雌鼠。
(2)间隔7d后，抗原(重组蛋白)与弗氏不完全佐剂1:1加入，匀速混匀仪混匀至混合液滴入水中不分散即为充分乳化，以与首次免疫同样的免疫方式，及首次免疫一半的剂量进行加强免疫。
(3)在首免第三周，用无菌剪刀或剃毛刀片切掉小鼠尾巴0.2～0.3cm采血。收集100～200μL血装于1.5mL的微量离心管。将小鼠尾部放在37℃温水中2～3min，或用拇指和食指挼搓1～2min，使小鼠尾部充血，方便采血。
(4)采血时弃去第一滴血，每只小鼠取200～400uL，血液于37℃放置1h，然后低速离心15～20min。
(5)将离心后的上层血清轻轻吸出，于-20℃可保存1～3个月。此后每间隔7d取一次血分离血清，经ELISA确定血清抗体滴度。
表2不同免疫原的免疫方式
免疫原 免疫次数 周龄 小鼠数量 免疫方式 免疫量(μg)
MBP-nsp10 3 6～8 4 皮下 50
MBP-<sub>TFF</sub> 3 6～8 4 皮下 50
PBS 3 6～8 4 皮下 50
nsp10 3 6～8 4 腹腔 50
PBS 3 6～8 4 腹腔 50
2、间接ELISA检测抗体滴度
(1)BSA测定抗原浓度，包被液稀释至1～10μg/mL，酶标板中每孔加100μL，4℃过夜。
(2)次日1×TBST洗涤3次，每次3min。
(3)加封闭液于37℃温育1h。洗涤。
(4)加入一定稀释的血清样品300μL，可通过梯度稀释法测抗体滴度，酶标板于37℃作用2小时。1×TBST洗涤，尽可能多洗几次，以防影响血清中的与酶连二抗的结合。
(5)1:50001×PBS或1×TBS稀释羊抗鼠-HRP，酶标板每孔加入100μL，置室温2h。1×TBST洗涤6～8次，每次3min
(6)用排枪于酶标板每孔中快速加入100μLTMB底物反应液，必要时加完可轻轻拍打酶标板混匀，于室温避光显色15分钟。
(7)2M硫酸终止反应，每孔加100μL。
(8)酶标仪检测小鼠血清抗体OD值。
重组蛋白nsp10包被酶标板，以免疫了重组蛋白MBP-nsp10的血清为一抗孵育酶标板，羊抗鼠-HRP(辣根过氧化物酶)为二抗孵育，检测nsp10蛋白的抗体滴度为1:42000(图17A)，以单独的nsp10蛋白包被板子，以免疫了重组蛋白nsp10的血清为一抗孵育酶标板，检测nsp10蛋白的抗体滴度为1:13000(图17C)。图17B为MBP-TFF蛋白单独免疫小鼠产生的免疫效果。从图17的结果看，在有MBP蛋白的存在下重组蛋白nsp10的免疫原性显著增加，即MBP蛋白在与nsp10融合表达的过程中起到了加强免疫的的作用，增强了nsp10蛋白的免疫效果，但是同时单独的MBP-TFF蛋白免疫小鼠也会使小鼠产生抗体。ELISA结果表明，重组蛋白nsp10和MBP-nsp10都具有良好的免疫原性。
3、Western Blot检测抗体特异性
(1)制备SDS-PAGE胶。
(2)取菌液、纯化蛋白和Protein Marker点样，跑SDS-PAGE胶，浓缩胶80V，分离胶120V。(3)取出SDS-PAGE胶，转模。
(4)取出PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h。
(5)PVDF膜孵育抗体：鼠血清一抗，羊抗鼠-HRP为二抗；或者猪血清为一抗，羊抗猪-HRP二抗。
(6)1×TBST漂洗PVDF膜3次，于摇床上漂洗，每次10min。
(7)高灵敏度度化学发光液显色。
检测结果表明血清中的抗体能够与各自相对应的重组蛋白特异性结合，如图18所示，从图18中可看到诱导前均无特异性条带，诱导后和纯化蛋白均有特异性条带，鼠阳性血清特异性结合有明显条带，鼠阴性血清则没有明显条带，表明小鼠产生了针对抗原MBP-nsp10和nsp10的特异性抗体。且nsp10重组蛋白能与感染了PEDV的猪阳性血清特异性结合，有明显条带，与猪阴性血清则没有明显反应，说明重组蛋白能与感染了天然PEDV的猪阳性血清相互作用。用MBP-TFF再次鉴定血清的特异性，同样的，对于小鼠阳性血清有明显条带，而阴性血清则未有条带，并且不能与感染了PEDV的猪血清结合，表明小鼠同时产生了针对抗原MBP-nsp10和MBP-TFF的特异性抗体。
四、重组蛋白诱导细胞因子
1、夹心ELLISA法检测小鼠脾脏中TNF-α表达差异
1.1获取淋巴细胞
(1)所用工具全部灭菌，在超净工作台实验，除去室温下的实验，其他操作必须在低温进行；(2)取nsp10蛋白免疫小鼠后的脾脏，放入Hanks/PBS溶液(加入2％细胞培养液)中，用玻片磨砂的一面磨开脾脏，得到含有淋巴细胞和血细胞的混合液，1500rmp离心4～5min，得到沉淀用力刮松动；
(3)室温下向沉淀中加入3～5mLRBC NH4Cl Buffer悬浮细胞3～5min，再加入5～10mL2％的细胞培养液清洗，离心去上清；悬浮细胞放入培养瓶培养37℃温育1～2h；
(4)在培养基中加入纯化的目的蛋白20μg、40μg、60μg体外刺激淋巴细胞使其保持活性2～3天，分别在24h、48h、72h离心收集培养液进行夹心ELISA实验。对照组为PBS组淋巴细胞培养液。
1.2夹心ELISA
(1)选取TNF-α兔多克隆抗体为捕获抗体，包被液稀释捕获抗体至浓度为1～10μg/mL，4℃孵育过夜。
(2)第二天将酶标板倒扣于纸巾，倒干包被液，1×TBST洗涤5～6次，轻轻拍打酶标板，每次3min。
(3)5％脱脂奶粉加入酶标板中，每孔添加100μL，37℃封闭1h或4℃冰箱孵育过夜。
(4)1×TBST洗涤6～8次，每次3min，洗涤液体积要高于加入的样品体积，以便去除多余的封闭液。
(5)待测样品鼠血清加入酶标板，每孔添加100μL，在37℃下孵育90分钟或在4℃下孵育过夜。
(6)弃去样品，洗涤同上。
(7)每孔添加100μL经过稀释的鼠源单抗TNF-α作检测抗体，室温下孵育2小时。
(8)在干燥的纸巾上倒扣酶标板，时孔内孵育的抗体流干，弃去样品，1×TBST洗涤同上。(9)检测抗体羊抗鼠-HRP加入100μL，室温下孵育2～4h。
(10)1×TBST洗涤同上。
(11)TMB显色液每孔加100μL，室温避光反应15～30分钟，2M H2SO4终止液终止反应，酶标仪测450nm OD值。
1.3夹心ELLISA法检测鼠血清中IL-4表达差异
ELISA操作步骤同上。
结果如图19所示，重组蛋白nsp10免疫后的小鼠淋巴细胞培养液中TNF-α表达量皆明显高于PBS免疫组。
1.4小鼠淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ细胞因子检测
1.5RNA提取同上
用Trizol试剂一步法抽提：从重组蛋白nsp10免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞提取RNA，测定RNA浓度，按照试剂盒的操作步骤反转合成cDNA。反转录cDNA，反转体系：
试剂名称 体积
SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10.0μL
ROX refer-ence dyeⅡ(10×) 0.4μL
cDNA 2.0μL
上游引物(10μmoL/L) 0.4μL
下游引物(10μmoL/L) 0.4μL
RNasefreed H<sub>2</sub>O Up to 20μL
反转录反应体系为:
Figure GDA0004085279270000161
1.6引物设计
引用PrimerBank中小鼠的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ5种细胞因子的扩增引物。扩增引物登录号及扩增片段长度见表3，内参为鼠源GAPDH基因。数据用下述公式计算分析：2-△△CT(△△CT＝目的基因△Ct值-内参△Ct值)。
扩增反应体系如下：
Figure GDA0004085279270000162
表3细胞因子的扩增引物
Figure GDA0004085279270000163
Real-timePCR检测小鼠血清中IL-4表达结果如图20所示，重组蛋白nsp10免疫组IL-4的表达量明显高于对照组。
Real-time PCR检测小鼠脾脏中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ表达水平变化，结果如图21所示，与PBS组相比，重组蛋白nsp10免疫组的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ表达量明显升高。这与之前在蛋白水平上的验证结果一致，说明重组蛋白诱发了小鼠的免疫保护机制。
五、重组蛋白MBP-nsp10 ELISA与商业ELISA试剂盒对比
将用MBP-Nsp10作为抗原包被的ELISA检测板和商业化PEDV-Ab ELISA检测试剂盒(购自上海优选生物科技有限公司)作比较。其中猪血清样本采集于中国江西省养猪场。
取30份来自养殖场的猪PEDV抗体阳性或阴性血清样本随机混合(样本数量n＝30)通过用MBP-Nsp10包被的ELISA检测板(图22左)和商业试剂盒抗原包被的ELISA检测板(图22右)进行ELISA测试。图中每个点代表一个样本，实线代表临界值，根据试剂盒说明书及实验结果确定临界值为0.2，即OD450值高于0.2则判定为阳性。结果显示猪血清样本与作为抗原的MBP-Nsp10和商业化试剂盒包被的抗原呈现出不同的反应，存在差异的样本用箭头表示。经对比，30份样本中，MBP-Nsp10作为抗原有29份样本的检测结果与商业化试剂盒的检测结果相符合，符合率为96.67％。表明使用重组MBP-Nsp10作为包被抗原的ELISA方法结果稳定可靠，可用于临床样品的检测。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西农业大学
<120> 猪流行性腹泻病毒Nsp10蛋白、含该Nsp10蛋白的融合蛋白及其制备方法和应
用
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> porcine epidemic diarrhea virus
<400> 1
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<210> 2
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
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Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Met Arg Asn Val Leu Leu Val Gly Ser
385 390 395 400
Phe Leu Thr Phe Phe Trp Ser Glu Leu Val Ser Tyr Thr Lys Phe Phe
405 410 415
Trp Val Asn Pro Gly Tyr Val Thr Pro Met Phe Ala Cys Leu Ser Leu
420 425 430
Leu Ser Ser Leu Leu Met Phe Thr Leu Lys His Lys Thr Leu Phe Phe
435 440 445
Gln Val Phe Leu Ile Pro Ala Leu Ile Val Thr Ser Cys Ile Asn Leu
450 455 460
Ala Phe Asp Val Glu Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Glu His Phe Asp Tyr
465 470 475 480
His Val Ser Leu Met Gly Phe Asn Ala Gln Gly Leu Val Asn Ile Phe
485 490 495
Val Cys Phe Val Val Thr Ile Leu His Gly Thr Tyr Thr Trp Arg Phe
500 505 510
Phe Asn Thr Thr Val Ser Ser Val Thr Tyr Val Val Ala Leu Leu Thr
515 520 525
Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe Tyr Ala Ser Asp Ile Leu Ser Cys Ala Met
530 535 540
Thr Leu Phe Ala Ser Val Thr Gly Asn Trp Phe Val Gly Ala Val Cys
545 550 555 560
Tyr Lys Ala Ala Val Tyr Met Ala Leu Arg Phe Pro Thr Phe Val Ala
565 570 575
Ile Phe Gly Asp Ile Lys Ser Val Met Phe Cys Tyr Leu Val Leu Gly
580 585 590
Tyr Phe Thr Cys Cys Phe Tyr Gly Ile Leu Tyr Trp Phe Asn Arg Phe
595 600 605
Phe Glu Val Gly Val Gly Val Tyr Asp Tyr Thr Val Ser Ala Ala Glu
610 615 620
Phe Lys Tyr Met Ala Ala Asn Gly Leu Arg Ala Pro Thr Gly Thr Leu
625 630 635 640
Asp Ser Leu Leu Leu Ser Ala Lys Leu Ile Gly Ile Gly Gly Glu Arg
645 650 655
Asn Ile Lys Ile Ser Ser Val Gln Ser Lys Leu Thr Asp Ile Lys
660 665 670

Claims (2)

1.猪流行性腹泻病毒nsp10蛋白和融合蛋白分别作为单一成分在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用，所述猪流行性腹泻病毒nsp10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；融合蛋白为MBP-nsp10，MBP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.猪流行性腹泻病毒nsp10蛋白和融合蛋白分别作为单一成分在制备猪流行性腹泻病毒诊断试剂中的应用，所述猪流行性腹泻病毒nsp10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；融合蛋白为MBP-nsp10，MBP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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