CN110862437A - 一种南非2型口蹄疫病毒vp1基因的可溶性表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,以南非2型口蹄疫病毒基因组(JX014256)为参考序列,在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因,然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因,再根据大肠杆菌密码子嗜性,优化HisSUMO‑SAT2‑VP1基因,重组至PUC57质粒,以HisSUMO‑SAT2‑VP1‑PUC57质粒为模板,设计特异性引物;PCR扩增后利用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体,将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组质粒pET32a‑HisSUMO‑VP1,转入大肠杆菌诱导表达,利用镍柱进行纯化。结果表明HisSUMO‑VP1蛋白在大肠杆菌中能可溶性表达,纯化后的目的蛋白具有较好的免疫原性。本发明充分利用His与SUMO标签的优点,不仅提高Ni与组氨酸结合的特异性和稳定性,而且提高重组蛋白纯化效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,尤其涉及一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法。
背景技术
口蹄疫(foot-an-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-an-mouthdisease,FMDV)引起的多种偶蹄动物易感的一种急性、热性、接触性传染病,对世界各地造成毁灭性的危害。FMDV属于小RNA病毒科,FMDV有4种结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和9种非结构蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。FMDV共有7个血清型,即A型、O型、C型、Asia1型和南非1~3(Southern African Territories,SAT1-3),各血清型之间无交叉保护力。研究表明,口蹄疫的VP1是诱导动物机体产生中和抗体的主要结构蛋白,其流行具有一定的地域性,其中,A型、O型和C型在欧洲、美洲、亚洲、非洲地区流行,南非型口蹄疫流行于撒哈拉沙漠以南的非洲地区。南非型口蹄疫在中国从未爆发,但由于近两年在中国爆发非洲猪瘟,给中国的养猪业带来巨大的危害,不排除以后南非型口蹄疫会传播到中国的情况。目前国内主要的研究局限在O型和A型口蹄疫,缺乏对南非2型口蹄疫的检测技术及疫苗的研究,为了更好的做好防控工作,本发明开展了对南非2型口蹄疫的研究。
酵母小泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)作为融合标签广泛用于提高异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,SUMO不仅具有保护重组蛋白不被宿主蛋白酶降解、提高蛋白稳定性、促进蛋白折叠等优点,而且还可通过SUMO蛋白酶将SUMO从作用的靶蛋白切割下来,从而得到天然的目的蛋白。除此之外,我们常用的蛋白标签还有多聚组氨酸标签(His-tag),该标签可以被Ni-NTA亲和层析树脂吸附,通过不同浓度含咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱实现蛋白纯化。鉴于SUMO作为融合标签的突出优势,可将其加以利用,解决目前VPI蛋白可溶性表达效果差,Ni与组氨酸的结合特异性和稳定性低,以及重组蛋白纯化效率低的缺陷。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足,本发明提供了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,该方法包括以下步骤:
(1)合成VP1基因
根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP1(JX014256)基因优化序列为参考序列,在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因,并进而在SUMO的上游引入6个His(组氨酸)标签编码基因,便于纯化目的蛋白,在此基础上,又根据大肠杆菌密码子嗜性,优化HisSUMO-SAT2-VP1基因,重组至PUC57质粒,以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板,设计特异性引物;
(2)PCR扩增
以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板,进行PCR扩增,PCR扩增体系为50μL:Ex-Taq Mix 25μL,上下游引物各1μL,模板2μL,ddH2O 21μL;反应程序为:94℃预变性5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,进行35个循环,72℃延伸10min;将扩增产物进行凝胶电泳,观察并胶回收目的片段,于-20℃保存;
(3)pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒的构建与鉴定
利用EcoR I和Xho I分别对pET32a(+)载体和VP1胶回收目的片段进行酶切,酶切产物进行凝胶电泳,然后胶回收目的片段与载体,并且进行连接,取连接产物转化于E.coliDH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上,37℃培养8h,挑取单菌落培养8h,12000r/min离心收菌体,提取质粒,对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序;
(4)HisSUMO-VP1重组蛋白的小剂量诱导表达
将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中,200r/min,37℃培养2h,至OD600为0.6-1.0时,加入IPTG进行诱导表达,然后取1ml诱导后的菌液于6000r/min离心5min,沉淀用PBS溶液重悬,取样品,100℃煮沸10min;
(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化
首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次,对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂4℃结合12h,然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白,控制流速,最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白,分别收集样品。
优选地,步骤(1)中,所述引物的基因序列如下:
上游引物:5‘-CGGAATTCCACCACCATCATCACCAC-3’,划下横线处为EcoR I限制性酶切位点;
下游引物5‘-CCGCTCGAGTTACAGGGTCTGACGCTCAACG-3’,划下横线处为Xho I限制性酶切位点。
优选地,步骤(1)中,所述目的片段的大小为993bp。
优选地,步骤(3)中,所述酶切中所用的酶切体系为:VP1基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL,10×K Buffer 4μL,EcoR I 3μL,Xho I 3μL,总体体积为40μL,37℃水浴12h。
优选地,步骤(3)中,进行连接时所用的连接体系为:pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL,VP1基因酶切后回收产物分别为2μL,T4连接酶1μL,T4 Buffer 1μL,总体体积为10μL。
优选地,进行连接的条件为:16℃过夜连接。
优选地,步骤(4)中,所述IPTG的终浓度为1mmol/L,所述诱导表达的条件为16℃诱导表达12h。
相比于现有技术的缺点和不足,本发明具有以下有益效果:本发明充分利用His与SUMO标签的优点,设计并优化序列,在其N端依次添加His、SUMO标签,Ni与组氨酸的结合,不仅提高结合特异性和稳定性,而且提高重组蛋白纯化效率。同时SUMO标签实现了重组蛋白的可溶性表达。此外,本实验还摸索纯化条件,且对表达产物进行鉴定,探讨该重组蛋白的反应原性,为后继的VLP的体外组装和建立ELISA等检测方法奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PCR扩增结果图,图中,M:DNA标准DL2000;1-3:HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57基因PCR扩增产物;4:阴性对照。
图2是本发明实施例提供的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1的鉴定结果图,图中,M:DNA标准DL10000;1:pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒PCR扩增产物;2:阴性对照;3:pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒;4:pET32a-HisSUMO-VP1酶切产物。
图3是本发明实施例提供的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1在大肠杆菌中诱导表达结果图,图中,M:蛋白分子质量标准;1:pET32a空载体;2:IPTG诱导前;3:IPTG诱导后。
图4是本发明实施例提供的HisSUMO-VP1蛋白不同诱导温度的可溶性表达结果图,图中,M:蛋白分子质量标准;1:pET32a空载体;2:诱导前菌体;3-4:16℃诱导超声破碎后上清与沉淀;5-6:28℃诱导超声破碎后上清与沉淀;7-8:37℃诱导超声破碎后上清与沉淀。
图5是本发明实施例提供的HisSUMO-VP1蛋白不同诱导时间的可溶性表达结果图,图中,M:蛋白分子质量标准;1:pET32a空载体;2:诱导前菌体;3-8:诱导表达时间分别为3h、6h、9h、12h、16h、24h。
图6A是本发明实施例提供的SAT2-VP1重组蛋白纯化SDS-PAGE分析的结果图,图中,M:蛋白分子质量标准;1:上清;2:流穿液;3:E1液;4:E2液;5:E3液;6:E4液;7:E5液;8::E6液;9:E7液;图6B是本发明实施例提供的重组蛋白Western blot分析的结果图,图中,1:pET32a空载体;2:VP1重组蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
一、材料与方法
1、材料
pET32a(+)载体由中国农业科学院兰州兽医研究所保存,DNA Marker、蛋白Marker、EcoR I、Xho I限制性酶、Ex-Taq DNA聚合酶购于TaKaRa公司,质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒都购于AxyPrep公司,异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、氨苄西林抗生素购于索莱宝生物公司,抗组氨酸标签(His-Tag)的兔源单克隆抗体购于Abcam公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购于SIGMA公司,蛋白胨、酵母提取物购自OXOID(英国)公司,Ni-NTA树脂购于QIAGEN公司,感受态细胞BL21(DE3)和DH5α均为本实验室保存,HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒由南京金斯瑞生物公司优化合成。
2、VP1基因的合成
根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP1(JX014256)基因优化序列为参考序列,在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因,然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因,再根据大肠杆菌密码子嗜性,优化HisSUMO-SAT2-VP1基因,重组至PUC57质粒,以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板,设计引物;引物的基因序列如下:
上游引物:5‘-CGGAATTCCACCACCATCATCACCAC-3’,划下横线处为EcoR I限制性酶切位点;
下游引物5‘-CCGCTCGAGTTACAGGGTCTGACGCTCAACG-3’,划下横线处为Xho I限制性酶切位点。引物由西安擎科生物科技有限公司合成。
3、PCR扩增
以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板,进行PCR扩增,PCR扩增体系为50μL:Ex-Taq Mix 25μL,上下游引物各1μL,模板2μL,ddH2O 21μL;反应程序为:94℃预变性5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,进行35个循环,72℃延伸10min;将扩增产物进行凝胶电泳,观察并胶回收目的片段,于-20℃保存。
4、pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒的构建与鉴定
利用EcoR I和Xho I分别对pET32a(+)载体和VP1胶回收目的片段进行酶切,所述酶切中所用的酶切体系为:VP1基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL,10×K Buffer4μL,EcoR I 3μL,Xho I 3μL,总体体积为40μL,37℃水浴12h;酶切产物进行凝胶电泳,胶回收目的片段与载体,并且进行连接,连接体系为:pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL,VP1基因酶切后回收产物分别为2μL,T4连接酶1μL,T4 Buffer 1μL,总体体积为10μL,16℃过夜连接。取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上,37℃培养8h,挑取单菌落培养8h,12000r/min离心收菌体,提取质粒,对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序。
5、HisSUMO-VP1重组蛋白的小剂量诱导表达
将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中,200r/min,37℃培养2h,至OD600为0.6-1.0时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,16℃诱导表达12h。然后取1ml诱导后的菌液于6000r/min离心5min,沉淀用PBS溶液重悬,取样品,100℃煮沸10min,将未诱导的菌液做阴性对照进行SDS-PAGE电泳。
6、蛋白质可溶性表达预测
根据公式:
CV=λ1(N+G+P+S)/n+λ2[(R+K)+(D+E)]/n-0.03|
其中n为蛋白中氨基酸数
N、G、P、S分别为Asn、Gly、Pro、Ser残基的数量
R、K、D、E分别为Arg、Lys、Asp、Glu残基的数量
λ1=0.202,λ2=-0.23
CV’=1.71
可溶性概率=CV-CV’
判定标准:如果CV-CV’>0不可溶;CV-CV’<0有可能可溶。
将SAT2-HisSUMO-VP1-PUC57测序结果的核酸序列翻译为蛋白质序列代入公式,预测各结构基因在大肠杆菌中可溶性表达的概率。
7、蛋白表达条件的优化
(1)蛋白表达温度的优化
将复苏的菌液扩大培养至50ml LB培养基中,200r/min,37℃培养2h,至OD600为0.8时,加入终浓度为1mmol/L IPTG,分别在16℃、28℃、37℃下诱导16h,未诱导菌液与空载体作阴性对照,各取1ml菌液6000rpm/min离心5min收菌,1×PBS悬浮洗涤3遍,对菌体进行SDS-PAGE电泳分析,观察蛋白的表达情况,再对菌体进行超声破碎后,10000rpm/min离心10min收集上清裂解液和沉淀,分别进行SDS-PAGE电泳分析,分析重组蛋白的存在方式。
(2)IPTG诱导时间的优化
在16℃、终浓度为1mmol/L IPTG条件下诱导表达,表达时间分别为3、6、9、12、16、24h,各取1ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析VP1蛋白的表达量,确定诱导表达的最佳时间。
8、重组蛋白Ni-NTA树脂纯化与Western blot分析
首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次,对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂4℃结合12h,然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白,控制流速,最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白,分别收集样品。测定含有目的蛋白条带积份的OD280值,确定目的蛋白存在于何种积份,最后进行SDS-PAGE分析。
纯化后的VP1重组蛋白经SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,用5%脱脂奶粉室温封闭1h,加抗His-Tag的单克隆抗体(1:2000稀释)于4℃摇床孵育过夜,PBST缓冲液洗涤PVDF膜5遍,每遍10min,再加HRP标记的山羊抗兔(1:5000稀释)于室温摇床孵育1h,PBST缓冲液洗PVDF膜5遍,ECL底物显色试剂避光显色1min,暗室中曝光,同时设pET32a空载体诱导表达菌作为阴性对照。
二、结果分析
1、PCR扩增结果
以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57基因为模板,用上下游物扩增获得1条约993bp的目的片段,如图1所示,由图可知其与预期结果相符合。
2、重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1的鉴定结果
构建的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1经PCR扩增鉴定和酶切鉴定,产物经琼脂糖凝胶电泳,如图2所示,结果显示扩增条带及酶切片段长约获得993bp,与预期片段的大小一致,而阴性对照无目的条带。
3、重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1在大肠杆菌中诱导表达结果
将阳性重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,16℃诱导表达培养后,经SDS-PAGE结果显示,如图3所示,诱导后的重组菌的分子量约为63kd,与预期表达蛋白的大小一致。
4、蛋白质可溶性表达预测
将测序的核酸序列翻译为蛋白质序列,代入公式中,求得CV-CV’值,预测VP1结构基因在大肠杆菌中可溶性表达的概率,结果如表1所示:
表1 SAT2型FMDV VP1结构基因可溶性表达预测结果
5、HisSUMO-VP1融合蛋白表达条件的优化
为了提高HisSUMO-VP1融合蛋白的表达量,对诱导条件进行优化,主要包括诱导温度与可溶性表达和诱导表达时间等方面。实验结果表明,HisSUMO-VP1重组蛋白均在16℃与28℃主要以可溶性形式存在上清中,且可溶性表达量较大,而在37℃主要以包涵体形式存在沉淀中(如图4),由此确定表达温度为16℃。优化IPTG的诱导表达时间结果显示,HisSUMO-VP1蛋白第12h的表达量与第16h的表达量接近,因而选定最佳的诱导时间为16h(如图5)。
6、HisSUMO-VP1重组蛋白Ni-NTA树脂纯化与Western blot鉴定结果
Ni-NTA树脂纯化HisSUMO-VP1目的蛋白主要集中于E3积份,其中在E2-E4阶段出现较集中的洗脱峰(如图6A)。表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜,用抗His-Tag单克隆抗体检测反应原性。结果表明,HisSUMO-VP1重组蛋白在63kD处出现特异性的显色条带,而pET32a空载体处无特异性条带。因此,HisSUMO-VP1重组蛋白与抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应,表明具有良好的反应原性(如图6B)。
三、结论
Western blot结果表明HisSUMO-VP1融合蛋白能与抗His单克隆抗体发生特异性反应,因而SUMO融合系统是大规模生产功能性VP1融合蛋白的理想选择。SUMO融合技术已经广泛用于原核表达系统中,而在真核生物中,SUMO标签会被SUMO蛋白酶裂解。研究人员升级了SUMO标签,称为SUMOstar标签,它不仅在真核生物系统中可以抵抗相扑蛋白酶的裂解。而且还可以在酵母、昆虫和哺乳动物细胞中维持增强蛋白表达和溶解性。
本发明通过对SAT2型FMDV的结构基因VP1所翻译的蛋白质进行预测可以发现VP1具有一定可溶性表达,试验结果和预测结果较为一致。成功构建了pET32a-HisSUMO-VP1重组表达载体,在大肠杆菌表达系统中诱导表达出大小约为63kd的HisSUMO-VP1蛋白,而且目的蛋白均以可溶性形式存在,并且重组蛋白与抗His-Tag的单克隆抗体进行Western blot反应呈阳性,表明该重组蛋白具有很好的反应原性。因此,该重组蛋白可被用于SAT2型FMDVLP疫苗的研制,为SAT2型FMDV的防控和诊断奠定了基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)合成VP1基因
根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP1 JX014256基因优化序列为参考序列,在FMDVSAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因,然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因,再根据大肠杆菌密码子嗜性,优化HisSUMO-SAT2-VP1基因,重组至PUC57质粒,以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板,设计特异性引物;
(2)PCR扩增
以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板,进行PCR扩增,PCR扩增体系为50μL:Ex-Taq Mix 25μL,上下游引物各1μL,模板2μL,ddH2O 21μL;反应程序为:94℃预变性5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,进行35个循环,72℃延伸10min;将扩增产物进行凝胶电泳,观察并胶回收目的片段,于-20℃保存;
(3)pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒的构建与鉴定
利用EcoR I和Xho I分别对pET32a(+)载体和VP1胶回收目的片段进行酶切,酶切产物进行凝胶电泳,胶回收目的片段与载体,并且进行连接,取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上,37℃培养8h,挑取单菌落培养8h,12000r/min离心收菌体,提取质粒,对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序;
(4)HisSUMO-VP1重组蛋白的小剂量诱导表达
将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中,200r/min,37℃培养2h,至OD600为0.6-1.0时,加入IPTG进行诱导表达,然后取1ml诱导后的菌液于6000r/min离心5min,沉淀用PBS溶液重悬,取样品,100℃煮沸10min;
(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化
首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次,对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂4℃结合12h,然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白,控制流速,最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白,分别收集样品。
2.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,步骤(1)中,所述引物的基因序列如下:
上游引物:5‘-CGGAATTCCACCACCATCATCACCAC-3’,划下横线处为EcoR I限制性酶切位点;
下游引物5‘-CCGCTCGAGTTACAGGGTCTGACGCTCAACG-3’,划下横线处为Xho I限制性酶切位点。
3.如权利要求2所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,所述目的片段的大小为993bp。
4.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,步骤(3)中,所述酶切中所用的酶切体系为:VP1基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL,10×K Buffer 4μL,EcoR I 3μL,Xho I 3μL,总体体积为40μL,37℃水浴12h。
5.如权利要求4所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,步骤(3)中,进行连接时所用的连接体系为:pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL,VP1基因酶切后回收产物分别为2μL,T4连接酶1μL,T4 Buffer 1μL,总体体积为10μL。
6.如权利要求5所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,进行连接的条件为:16℃过夜连接。
7.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法,其特征在于,步骤(4)中,所述IPTG的终浓度为1mmol/L,所述诱导表达的条件为16℃诱导表达12h。
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CN114806994A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-07-29 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 表达sat2型口蹄疫病毒结构蛋白vp1的枯草芽孢杆菌及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090280531A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Academia Sinica | Preparation of Soluble Capsid Proteins of Picornaviruses Using SUMO Fusion Technology |
CN108367066A (zh) * | 2015-09-10 | 2018-08-03 | 中央研究院 | 包括类病毒颗粒及新型佐剂的禽流感疫苗组合物 |
CN109799343A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-05-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 基于病毒样颗粒的a型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒 |
-
2019
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090280531A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Academia Sinica | Preparation of Soluble Capsid Proteins of Picornaviruses Using SUMO Fusion Technology |
CN108367066A (zh) * | 2015-09-10 | 2018-08-03 | 中央研究院 | 包括类病毒颗粒及新型佐剂的禽流感疫苗组合物 |
CN109799343A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-05-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 基于病毒样颗粒的a型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHIEN-DER LEE等: "Production of FMDV virus-like particles by a SUMO fusion protein approach in Escherichia coli", 《JOURNAL OF BIOMEDICAL SCIENCE》 * |
NCBI: "《GenBank Database》", 8 August 2012, NCBI * |
刘文倩等: "C型口蹄疫结构蛋白VP3的原核表达及生物活性", 《江苏农业科学》 * |
董虎: "南非2型口蹄疫病毒样颗粒体外组装及嵌合病毒样颗粒的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114806994A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-07-29 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 表达sat2型口蹄疫病毒结构蛋白vp1的枯草芽孢杆菌及应用 |
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