CN110951757A - 一种南非2型口蹄疫病毒vp3基因的原核可溶性表达方法 - Google Patents

一种南非2型口蹄疫病毒vp3基因的原核可溶性表达方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，根据南非2型口蹄疫病毒基因序列，在FMDV SAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO‑SAT2‑VP3基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO‑SAT2‑VP3‑PUC57质粒为模板，设计扩增南非2型口蹄疫病毒VP3基因的特异性引物，PCR扩增后用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，之后将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a‑HisSUMO‑VP3，转入大肠杆菌进行表达并对重组蛋白进行纯化。本发明成功构建了pET32a‑HisSUMO‑VP3原核表达载体，实现了在大肠杆菌中的表达，纯化后的目的蛋白具有较好的反应原性，为后续南非2型口蹄疫病毒亚单位疫苗的组装奠定基础。

Description

一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法。
背景技术
口蹄疫(foot-an-mouth disease，FMD)是一种由口蹄疫病毒(Foot-an-mouthdisease，FMDV)感染引起的，能在牛、猪、绵羊、山羊和多种野生偶蹄动物中传播的烈性传染病。该病发生速度快，传播途径多，曾多次在世界范围内爆发流行，给世界养殖户造成巨大的经济损失。口蹄疫病毒由VP1、VP2、VP3和VP4共4个主要结构蛋白和2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D七种非结构蛋白组成，VP3蛋白中存在多个非连续性的抗原表位。在FMD流行的国家，疫情的控制主要依赖于现有的传统灭活疫苗，通过强制性高强度的免疫，减少疫情的发生。但由于灭活疫苗的生产过程中，存在病毒灭活不完全而散毒的风险，促使人们研制更加高效安全的新型FMD疫苗。
小分子泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier，SUMO)是一类泛素相关的蛋白质，它能通过结合赖氨酸侧链调节靶蛋白的功能。近年来，SUMO已经成为一种有效的生物技术工具，通过SUMO与靶蛋白融合可以促进蛋白质折叠，增强蛋白质的可溶性表达，保护蛋白质免受蛋白酶水解，提高蛋白质的稳定性。基于此，可将SUMO应用于口蹄疫病毒中VP3蛋白的可溶性表达，以提高蛋白质的稳定性，为后续研制更加高效安全的新型FMD疫苗提供理论基础。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，该方法包括以下步骤：
(1)合成VP3基因
根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP3(JX014256)基因优化序列为参考序列，在FMDV SAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，并进而在SUMO的上游引入6个His(组氨酸)标签编码基因，便于纯化目的蛋白，在此基础上，又根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP3基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；
(2)PCR扩增
以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57重组质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 21μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环，72℃延伸10min；将扩增产物进行凝胶电泳，观察并胶回收目的片段，于-20℃保存；
(3)pET32a-HisSUMO-VP3重组质粒的构建与鉴定
利用BamH I和Hind III分别对pET32a(+)载体和HisSUMO-VP3胶回收目的片段进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳，然后胶回收目的片段与载体，并且进行连接，取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单菌落过夜培养，离心收菌体，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序；
(4)HisSUMO-VP3重组蛋白表达
将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养2h，至OD600为0.6-1.0时，加入IPTG进行诱导表达，然后取诱导后的菌液于6000r/min离心5min，沉淀用PBS溶液重悬，取样品；
(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化
首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次，对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂-4℃结合12h，然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白，控制流速，最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白，分别收集样品。
优选地，步骤(1)中，所述引物的基因序列如下：
VP3-F：5′-CGGGATCCCATCATCATCATCATCACGGC-3′限制性酶切位点为BamH I；
VP3-R：5′-CCCAAGCTTTTACTGTCGCACAGGGTCGATA-3′限制性酶切位点为Hind III。
优选地，步骤(1)中，所述目的片段的大小为1023bp。
优选地，步骤(3)中，所述酶切中所用的酶切体系为：HisSUMO-VP3基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL，10×K Buffer 4μL，BamH I 3μL，Hind III 3μL，总体体积为40μL，30℃水浴4h后37℃水浴4h。
优选地，步骤(3)中，进行连接时所用的连接体系为：pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL，VP3基因酶切后回收产物分别为2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体体积为10μL。
优选地，进行连接的条件为：16℃连接过夜。
优选地，步骤(4)中，所述IPTG的终浓度为1mmol/L，所述诱导表达的条件为28℃诱导表达12h。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本文充分利用SUMO标签的优势，在FMDV SAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联了SUMO促溶表达标签编码基因，并进而在SUMO的上游又引入了6个His(组氨酸)标签编码基因，便于纯化目的蛋白，在此基础上，又根据大肠杆菌密码子嗜性，优化了HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；成功构建了pET32a-HisSUMO-VP3重组表达载体，在大肠杆菌表达系统中诱导表达出大小约为64kd的HisSUMO-VP3蛋白，且蛋白均以可溶性形式存在。HisSUMO-VP3重组蛋白与抗His-Tag的兔源单克隆抗体进行Western blot反应呈阳性，表明该重组蛋白具有很好的反应原性。因此，HisSUMO-VP3重组蛋白可被用于SAT型FMD VLPS疫苗的研制，为SAT2型FMDV的防控和诊断奠定了基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的SAT2-HisSUMO-VP3片段PCR扩增的结果图，图中，M：DNA标准DL2000；1-3：SAT2-HisSUMO-VP3基因PCR扩增产物；4：阴性对照。
图2是本发明实施例提供的重组质粒PCR鉴定结果图，图中，M：DNA标准DL2000；1：阴性对照；2-3：重组质粒pET32a-HisSUMO-VP3(DH5α)；4：重组质粒pET32a-HisSUMO-VP3-BL21(DE3)。
图3是本发明实施例提供的重组质粒的酶切鉴定鉴定结果图，图中，M1：DNA标准DL10000；M2：DNA标准DL2000；1：pET32a-HisSUMO-VP3重组质粒；2-3：pET32a-HisSUMO-VP3用BamH I、Hind III酶切产物。
图4是本发明实施例提供的HisSUMO-VP3 BL21(DE3)表达菌在不同温度进行诱导表达的结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：pET32a空载体；2：pET32a-HisSUMO-VP3 BL21(DE3)诱导前菌体；3：pET32a-HisSUMO-VP3BL21(DE3))诱导后全菌体；4-5：pET32a-HisSUMO-VP3 BL21(DE3)16℃诱导超声破碎后上清与沉淀；6-7：pET32a-HisSUMO-VP3 BL21(DE3)28℃诱导超声破碎后上清与沉淀；8-9：pET32a-HisSUMO-VP3 BL21(DE3)37℃诱导超声破碎后上清与沉淀。
图5是本发明实施例提供的Ni-NTA树脂纯化HisSUMO-VP3目的蛋白的结果图。
图6是本发明实施例提供的HisSUMO-VP3重组蛋白的SDS-PAGE分析结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：上清；2：流穿液；3：E1液；4：E2液；5：E3液；6：E4液；7：E5液。
图7是本发明实施例提供的HisSUMO-VP3重组蛋白Western blot的结果图，图中，1，3：pET32a空载体；2：HisSUMO-VP3重组蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料与方法
1、材料
pET32a(+)载体由中国农业科学院兰州兽医研究所保存，DNAMarker、蛋白Marker、BamH I、Hind III限制性酶、Ex-Taq DNA聚合酶购于TaKaRa公司，质粒小量制备试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒都购于AxyPrep公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、氨苄西林抗生素购于索莱宝生物公司，抗His-Tag的兔源单克隆抗体购于Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购于SIGMA公司，蛋白胨、酵母提取物购自OXOID(英国)公司，Ni-NTA树脂购于QIAGEN公司，感受态细胞BL21(DE3)和DH5α均为本实验室保存，HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57质粒由生物公司合成。
2、方法
(1)引物的设计与合成
根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP3(JX014256)基因优化序列为参考序列，在FMDV SAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，并进而在SUMO的上游引入6个His(组氨酸)标签编码基因，便于纯化目的蛋白，在此基础上，又根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP3基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57质粒为模板，设计特异性引物，引物序列如下表，由西安擎科公司合成。
引物名称 限制性酶切位点 序列
VP3-F BamH I 5′-CGGGATCCCATCATCATCATCATCACGGC-3′
VP3-R Hind III 5′-CCCAAGCTTTTACTGTCGCACAGGGTCGATA-3′
(2)PCR扩增
以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57重组质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 21μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环，72℃延伸10min；取10μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，样品于-20℃保存。
(3)pET32a-HisSUMO-VP3重组质粒的构建与鉴定
利用BamH I和Hind III分别对pET32a(+)载体和HisSUMO-VP3胶回收目的片段进行酶切，酶切体系为：HisSUMO-VP3基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL，10×KBuffer 4μL，BamH I 3μL，Hind III 3μL，总体体积为40μL，30℃水浴4h后37℃水浴4h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段与载体，并且进行连接，连接体系为：pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL，VP3基因酶切后回收产物分别为2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体体积为10μL；16℃连接过夜。取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单菌落过夜培养，离心收菌体，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序。将构建成功的pET32a-HisSUMO-VP3重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并按上述相同方法培养，提取质粒，对质粒分别进行PCR鉴定和酶切鉴定，反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，预计实现pET32a-HisSUMO-VP3的构建。
(4)HisSUMO-VP3重组蛋白表达及SDS-PAGE电泳鉴定
将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养2h，至OD600为0.6-1.0时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG于菌液中进行诱导反应，诱导反应的温度和时间分别如下：16℃反应10h、28℃反应12h、37℃反应14h，同时收集未诱导的菌液及空载体转化细菌作为阴性对照，6000rpm/min离心5min收菌，1×PBS悬浮洗涤3遍，对菌体进行SDS-PAGE电泳分析，观察重组蛋白表达情况，再对重组菌体用含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液(PH8.0)悬浮进行超声破碎，10000rpm/min离心10min收集上清裂解液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白的存在方式。
(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化
首先将Ni-NTA树脂自然沉降，用ddH20充分洗涤4～8次，用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次，对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂-4℃结合12h，上柱，控制流速，然后分别用Wash Buffer(20mM咪唑的磷酸盐缓冲液，PH8.0)洗涤杂蛋白，并分别收集样品，最后用Elution Buffer(250mM咪唑的磷酸盐缓冲液，PH8.0)洗涤目的蛋白，分别收集样品，测定含有目的蛋白条带积份的OD280值，确定目的蛋白存在于何种积份，最后对重组蛋白进行SDS-PAGE分析。
(6)重组蛋白的Western blot分析
纯化的HisSUMO-VP3重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加抗His-Tag的兔源单克隆抗体(1：2000稀释)于-4℃摇床孵育过夜，PBST缓冲液洗涤PVDF膜5遍，每遍10min，再加HRP标记的兔二抗(1：5000稀释)于室温摇床孵育1h，PBST缓冲液洗PVDF膜5遍，ECL底物显色试剂避光显色1min，暗室中曝光，同时设pET32a空载体诱导表达菌作为阴性对照。
二、结果分析
1、PCR扩增结果
以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57基因为模板，VP3-F、VP3-R为引物，扩增获得1条约1024bp的目的片段(如图1所示)，与预期结果相符合。
2、重组质粒的鉴定结果
构建的重组质粒pET32a-HisSUMO-VP3经PCR鉴定，获得大小为1024bp的HisSUMO-VP3基因目的片段，而阴性对照无目的条带(如图2所示)；重组质粒经BamH I、Hind III酶切鉴定，获得1024bp的HisSUMO-VP3基因片段和5900bp的pET32a(+)载体片段，而阴性对照无目的条带((如图3所示)。
3、重组蛋白表达结果
HisSUMO-VP3-BL21(DE3)表达菌在不同温度进行诱导表达，结果如图4所示，表明不同诱导温度对目的蛋白的表达量有影响，终浓度为1mmol/L的IPTG条件下对重组表达菌进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，HisSUMO-VP3蛋白表达产物的分子量约为64kD，与理论值相一致，同时发现HisSUMO-VP3重组蛋白均在16℃与28℃主要以可溶性形式存在上清中，其中28℃可溶性表达量最大，而在37℃主要以包涵体形式存在沉淀中。
4、重组蛋白Ni柱纯化结果
Ni-NTA树脂纯化HisSUMO-VP3目的蛋白主要集中于E3积份，其中在E1-E4阶段出现较集中的洗脱峰(如图5-图6所示)。
5、重组蛋白的Western blot分析结果
表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜，用抗His-Tag兔源单克隆抗体检测重组蛋白的反应原性。结果如图7所示，可以看出HisSUMO-VP3重组蛋白在64kD处出现特异性的显色条带，而pET32a空载体处无特异性条带。因此，HisSUMO-VP3重组蛋白与抗His-Tag兔源单克隆抗体发生特异性反应，表明具有良好的反应原性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)合成VP3基因
根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP3(JX014256)基因优化序列为参考序列，在FMDVSAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，并进而在SUMO的上游引入6个His(组氨酸)标签编码基因，便于纯化目的蛋白，在此基础上，又根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP3基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；
(2)PCR扩增
以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57重组质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 21μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环，72℃延伸10min；将扩增产物进行凝胶电泳，观察并胶回收目的片段，于-20℃保存；
(3)pET32a-HisSUMO-VP3重组质粒的构建与鉴定
利用BamH I和Hind III分别对pET32a(+)载体和HisSUMO-VP3胶回收目的片段进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳，然后胶回收目的片段与载体，并且进行连接，取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单菌落过夜培养，离心收菌体，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序；
(4)HisSUMO-VP3重组蛋白表达
将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养2h，至OD600为0.6-1.0时，加入IPTG进行诱导表达，然后取诱导后的菌液于6000r/min离心5min，沉淀用PBS溶液重悬，取样品；
(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化
首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次，对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂-4℃结合12h，然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白，控制流速，最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白，分别收集样品。
2.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物的基因序列如下：
VP3-F：5′-CGGGATCCCATCATCATCATCATCACGGC-3′限制性酶切位点为BamH I；
VP3-R：5′-CCCAAGCTTTTACTGTCGCACAGGGTCGATA-3′限制性酶切位点为Hind III。
3.如权利要求2所述的南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述目的片段的大小为1023bp。
4.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶切中所用的酶切体系为：HisSUMO-VP3基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL，10×K Buffer 4μL，BamH I 3μL，Hind III 3μL，总体体积为40μL，30℃水浴4h后37℃水浴4h。
5.如权利要求4所述的南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(3)中，进行连接时所用的连接体系为：pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL，VP3基因酶切后回收产物分别为2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体体积为10μL。
6.如权利要求5所述的南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，进行连接的条件为：16℃连接过夜。
7.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(4)中，所述IPTG的终浓度为1mmol/L，所述诱导表达的条件为28℃诱导表达12h。
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