CN104560803A - 一种胶原蛋白酶高产海洋菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种胶原蛋白酶高产海洋菌株，保藏编号为CCTCC？NO:M？2013682,并基于16S序列进行分子系统进化分析，鉴定该菌株属于Rheinheimera属,随后并采用响应面法对它的产酶条件进行了优化。首先通过单因素试验，筛选出最适碳源为明胶，最适氮源为酵母粉。在此基础上，采用Plackett-Burman试验设计筛选出影响酶活的三个主效因子：明胶、装液量和初始pH值。再通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域，用Box-Behnken试验设计和嵴岭分析确定主效因子的最优水平。优化后酶活可达65.64U/mL，为优化前的1.34倍。

Description

一种胶原蛋白酶高产海洋菌株
技术领域
本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种胶原蛋白酶高产海洋菌株。
背景技术
中国是世界渔业生产大国、水产品出口大国和主要远洋渔业国家，水产品总产量连续20年位居世界第1，世界水产养殖总产量的70％来自中国。近年来，仅鱿鱼年产量就达到12t以上。在鱿鱼的深加工中会产生15％-20％的内脏及表皮等废弃物，不仅如此，在淡水鱼的加工中，鱼鳞和鱼皮也被作为废弃物扔掉。这些废弃物具有很高的营养价值，含有大量的粗胶原蛋白，如果能充分利用这些渔业下脚料来提取胶原蛋白，不仅能促进渔业的进一步发展产生巨大的经济效益，也能减少环境污染。
胶原蛋白是由3条肽链拧成的螺旋形蛋白质，广泛存在于人体的皮肤、骨骼、肌腱和内脏等部位，具有极其重要的生理功能，并在医疗、美容、保健、食品等许多方面具有极其广泛的应用。胶原蛋白的提取有多种方法，其中酶法在提取效率及安全性上都有明显的优势。胶原酶，即胶原蛋白水解酶，在其适合条件下能特异地降解胶原蛋白的三螺旋结构，且不损坏其活性肽结构。相比动物源胶原酶，微生物源胶原酶不只提取方便，而且具有更广的应用范围。许多土壤、皮毛、海水来源的微生物都能产生胶原酶，例如一些梭菌、弧菌和类菌体等。但对于来自于海洋微生物中的胶原蛋白酶的研究甚少。因此，有必要提供一种胶原蛋白酶的高产海洋菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白酶高产海洋菌株，从而弥补现有技术的不足。
本发明的南极适冷菌NBUMB006(Rheinheimera sp.NBUMB006)，该菌株于2013年12月22日保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013682。
本发明的南极适冷菌NBUMB006用于发酵生产胶原蛋白酶；
本发明还提供一种胶原蛋白酶的生产方法，是将南极适冷菌NBUMB006接种于发酵培养基中进行发酵制备胶原蛋白酶；
所述的发酵培养基，其组成及配比为：明胶5g/L、酵母粉1g/L、柠檬酸铁0.01g/L。
所述的培养基，其pH值为7.8。
本发明筛选分离得到一株高产胶原蛋白酶海洋菌株MB006,并基于16S序列进行分子系统进化分析，鉴定该菌株属于Rheinheimera属,随后并采用响应面法对它的产酶条件进行了优化。首先通过单因素试验，筛选出最适碳源为明胶，最适氮源为酵母粉。在此基础上，采用Plackett-Burman试验设计筛选出影响酶活的三个主效因子——明胶、装液量和初始pH值。再通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域，用Box-Behnken试验设计和嵴岭分析确定主效因子的最优水平。优化后酶活可达65.64U/mL，为优化前的1.34倍。
具体实施方式
本发明从东海海域海水中筛选分离得到一产胶原蛋白酶产生菌株，通过响应面法对胶原蛋白酶产生菌MB006的液体发酵培养条件进行了优化，为下一步的工业化生产或分子育种提高胶原蛋白酶比活力奠定基础。
本发明具体实施例中使用的大肠杆菌(Escherichia.coil)DH5α,购自TaKaRa公司。克隆载体pMD18-T Vector，Ampr，购自TaKaRa公司。细菌基因组DNA抽提试剂盒(K1071)、质粒小量提取试剂盒(GK2004)购自上海捷瑞生物工程有限公司；琼脂糖胶DNA回收纯化试剂盒(D6492)购自Omega公司；DNA Marker、rTaq聚合酶、DNA连接酶购自TaKaRa公司；不溶性Ⅰ型胶原购自生工生物工程(上海)有限公司；其他试剂均为分析纯试剂；超滤离心管Amicon Ultra-10购自Millipore公司；纯水制备系统购自美国Pall公司；台式高速冷冻离心机购自Sigma公司；酶标仪购自Thermo公司；PCR仪购自杭州博日科技有限公司；凝胶成像系统购自上海欧翔科学仪器有限公司。
但本领域的普通技术人员在本发明的技术思路下，可以选用已有的其它试剂，而不仅限于本发明的具体记载。
使用的2216E培养基组成如下：0.1％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.01％柠檬酸铁，过滤海水，用于海洋微生物MB006的培养。LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，用于大肠杆菌Rosseta(DH5α)的培养。
实施例1：产胶原蛋白酶菌株的筛选
取东海海区的海水涂布于2216E固体培养基进行培养，挑取单克隆菌株接种于含明胶的2216E固体培养基。从活化培养基上挑取单菌落接种于2216E初筛固体培养基中心处，培养皿在25℃下倒置培养2天，在菌落周围滴加2-3滴酸性汞试剂，显色2min。
初筛获得的菌株接种于含2216E液体培养基的试管中，25℃，180rpm条件 下振荡培养过夜。取1mL菌液，在10,000rpm、室温条件下离心1min，取上清。以不溶性胶原蛋白为底物测定胶原蛋白酶活性。
以胶原蛋白为底物，采用茚三酮显色法测定胶原蛋白酶水解底物释放的水溶性氨基酸和短肽。反应体系：0.1mL酶液，0.5mL pH 7.50.1mol/L Tris-HCl缓冲液(含50mmol CaCl2)，不溶性I型胶原1mg。37℃孵育30min，加入0.6ml 10％的三氯乙酸(TCA)终止反应。反应物10,000r/min离心10min，取上清液0.6mL并加入0.6ml pH 5.42mol/L乙酸缓冲液及0.6mL茚三酮显色溶液，充分混合后，100℃水浴中加热15min，冰水冷却5min，经60％乙醇稀释后于570nm处测定吸光值。以不加目的蛋白作为阴性对照，每组反应均重复三次。以甘氨酸为标准制作标准曲线。
酶活力定义为：在37℃，pH值7.5条件下，每分钟水解胶原蛋白产生相当于1μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位(U)。
通过上述的步骤获得了一株水解胶原蛋白效果最好的菌株，命名为NBUMB006(MB006)。
将MB006海洋细菌接种于含明胶的初筛平板上，25℃培养24h。观察该菌，菌落显圆形，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，无粘性，不透明，灰白色，滴加酸性汞试剂能产生透明水解圈，菌落直径平均约0.75cm，透明水解圈直径平均约3.00cm，比值为4.0，可以确定海洋细菌MB006产生了胶原蛋白酶，而且效果很好。
利用茚三酮显色法测定样品蛋白酶活力，绘制MB006胶原蛋白酶活力曲线；同时测OD570，绘制MB006的生长曲线。由生长曲线可知，MB006的产酶与生长趋势基本一致，这说明碱性蛋白酶的产生与生长是相耦联的。当生长至14-16h时，菌体和蛋白酶的积累均达到最高，菌体OD570达到0.29±0.02，蛋白酶活力达到44.845±2.86U/mL。
按照细菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板，利用16S通用引物克隆海洋微生物MB006的16S rRNA。将上述PCR产物回收纯化后，克隆到pMD18-T Vector中，转化E.coli DH5α，挑取经菌落PCR验证的阳性克隆子进行序列测定。利用NCBI数据库中的BLAST工具对菌MB006的16S rRNA序列进行相似性分析，选取部分同源序列，采用邻位相连(Neighbor-Joining)算法，经Consensus程序计算多数一致树，构建系统发育进化树，确定筛选的MB006菌株属于Rheinheimera属。
实施例2：发酵培养体系的优化
将产生的MB006胶原蛋白酶活力作为发酵培养条件优化的响应值，发酵培养基成分和发酵条件作为试验体系的变量(输入因子)，进行试验体系的整体优化。
首先通过单因素实验，分别从半乳糖、蛋白胨、淀粉、明胶、酵母粉、硫酸铵、硝酸钠等碳、氮源原料中确定最佳碳、氮源。然后设计Plackett-Burrman试验，筛选出三个影响菌株发酵产酶的主要影响因素，并通过最陡爬坡实验，逼近主效因子的最大产酶效应区域。最后，根据Box-Behnken中心组合设计，进行发酵条件的响应面优化，建立拟合模型，找出最优发酵条件。
以发酵初始培养基为基础，探讨不同氮源对海洋微生物MB006胶原蛋白酶产生的影响。发酵培养产生蛋白酶的能力为：酵母粉＞蛋白胨＞硫酸铵＞硫酸钾＞硫酸钠，最高蛋白酶活力可达46.75±3.28U/mL。根据以酵母粉为氮源的发酵培养基探讨不同碳源对胶原蛋白酶产生的影响。发酵培养产生蛋白酶的能力为：明胶＞淀粉＞葡萄糖＞蛋白胨＞碳酸氢钠＞半乳糖，最高蛋白酶活力可达48.87±3.75)U/mL。因此，筛选获得发酵培养基的氮源、碳源分别为1g/L酵母粉和5g/L明胶。
根据单因素实验的优化结果，选择培养条件和培养基成分等共6个因素作为优化的输入因子。试验设计因素有初始pH值、装液量(250mL三角瓶)、酵母粉、明胶、柠檬酸铁、和温度，每个因素各取低(-1)和高(+1)两个水平，低水平为初始培养条件，高水平约取低水平的1.25-2倍。试验设计响应值Y为胶原蛋白酶的酶活力。
由各因素代表参数、水平及结果分析得知，对产酶的影响最显著的三个因素依次为：装液量＞初始pH值＞明胶(按显著性大小顺序)，它们对产酶的影响达到显著水平(p＜0.05)。
在上述6个影响产酶的相关因素中，酵母粉、明胶和温度对产酶呈正效应，而装液量、初始pH值和柠檬酸铁呈负效应，这说明当前中心设定值仍过低或过高。根据各因素的显著性，在进一步优化实验中，确定明胶、装液量和初始pH值为三个影响海洋微生物MB006产胶原蛋白酶的主效因子，其他因素根据其效应值的正负，分别固定在高低水平上。
根据Plackett-Burrman设计筛选出的主效因子效应值的正负及大小设计各因素的爬坡方向和步长，进行最陡爬坡实验，以逼近最大产酶区域。由实验设计及发酵液酶活可知，第四组实验取得最大酶活。故以第三组实验的条件为水平中心点，进行Box-Behnken实验设计。
Box-Behnken试验设计结果及响应面模拟
根据最陡爬坡试验选取明胶、装液量和初始pH值三个因素为自变量，胶原蛋白酶活力为响应值，对MB006的培养条件进行二阶优化。设三个因素的中心点分别为8.25g/L、85mL和7.125，通过N＝15的三因素三水平的Box-Behnken试验设计，借助Minitab软件辅助完成试验设计和数据统计。
利用Minitab16统计软件对Box-Behnken设计的试验数据进行二次响应面回归(RSREG)分析，并建立多项式回归模型：
Y＝-434.89+150.83X1-35.67X2+4.16X3-21.21X1X1+0.08X2X2-0.02X3X3
+6.07X1X2-0.18X1X3+0.07X2X3
对回归模型的方差分析表明，该模型R2＝95.11％，实验结果可靠。从响应面拟合图中可以看出，初始pH值X2的值固定后，即可取得最大响应值，而当X2变化时，预测模型响应面呈马鞍面，存在多个极值。采用典型相关分析和嵴岭分析方法模拟预测响应最大值为68.679U/mL，因子实际水平胶原(X1)、初始pH值(X2)和装液量(X3)分别为：4.141g/L、7.815、112.538mL时模型取得最大响应值。
实施例3：胶原蛋白酶的发酵
在初始pH值为7.815、装液量112.538mL(250mL三角瓶)、培养基组成为明胶5g/L、酵母粉1g/L、柠檬酸铁0.01g/L时，Rheinheimera MB006可获得65.64U/mL的胶原蛋白酶活力，较优化前提高到原来的1.34倍，为其下一步的工业化生产或分子育种提高胶原蛋白酶比活力奠定了基础。

Claims (5)

1.一种南极适冷菌，其特征在于，所述的南极适冷菌的保藏编号为CCTCCNO:M 2013682。
2.权利要求1所述的南极适冷菌在发酵生产胶原蛋白酶中的应用。
3.一种胶原蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求1所述的南极适冷菌接种于发酵培养基中进行发酵制备胶原蛋白酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基，其组成及配比为明胶5g/L、酵母粉1g/L、柠檬酸铁0.01g/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的pH值为7.8。
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