CN103834603A - 一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株号为NJ-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月23日，保藏号为CCTCC NO：M2013489。本发明还公开了上述菌株的应用。本发明的新菌种可直接用于鸽子羽毛的分解，从而有利于鸽子的废弃物回收利用，促进鸽子的生态、循环养殖，属安全微生物，可用于鸽子羽毛的分解、肉鸽养殖废弃物发酵及生物肥料领域。
Description
技术领域
本发明涉及养殖业环境资源应用领域，尤其涉及一种分解鸽子羽毛的菌株，具体地说涉及一种能够有效地分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌及应用。
背景技术
随着养禽业的集约化发展，养殖企业，尤其是大中型畜牧场在提供肉、禽、蛋的同时，每天都会产生粪、羽毛、骨粉、血渣等大量的废弃物，这些废弃物如果处理不好，常常会污染环境，传播病原。尤其是羽毛，因其具有难以降解的特点，显得比其他废弃物更难以回收利用。而据研究报道，羽毛中的角蛋白含量高达80%，并且含有丰富的赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、组氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及其他一些维生素、常量元素及微量元素，由于缺乏实用的降解羽毛的手段，致使大量羽毛废弃、污染环境。尽管高压、酸解等处理方法能够降解羽毛，但由于成本高，不实用。
比较研究表明，生物发酵方法处理农业废弃物成为首选，而筛选最合适的微生物发酵降解菌株优势最为重要的，其根本的原因是必须要找到能够降解羽毛角蛋白的菌株。角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，是一种不溶性的纤维状动物蛋白质，是禽类羽毛的主要构成物质。角蛋白因含有较多的氢键、二硫键、盐键且折叠紧密，又不溶于水，一般不容易被酶溶解。而且由于不同禽类羽毛角蛋白的结构组成有所不同，因此，即便是能够分解一种禽类的羽毛，不一定能降解其他禽类的羽毛。
近年来，有不少专利及研究报道，不少细菌，主要是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌能够降解鸡的羽毛，少数菌可以降解鸭、鹅的羽毛，对鸽子的羽毛，尚未见有较好的降解菌分离鉴定。我们通过细菌分离降解试验表明，能够降解鸡毛的细菌用来降解鸽子羽毛，效果并不好，因此，有必要筛选、培养分解效果的更好的单一菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的空白，提供一种能够有效分解鸽子羽毛的细菌菌种。
本发明还要解决的技术问题是提供上述菌种的应用，该菌种能够有效分解鸽子羽毛中的角蛋白，变成易于吸收的氨基酸营养物质，从而可用来制备有机肥和养殖蚯蚓、蝇蛆等动物源饲料。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株号为NJ-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏日期为2013年10月23日，保藏号为CCTCC NO：M2013489。该菌株是2012年9月从江苏省南京市某鸽场鸽羽毛粪便堆积物中分离筛选获得的、对鸽子羽毛能够有效分解的细菌菌株，这对分解处理养鸽场的废弃的羽毛，降低养鸽场环境污染程度，减少疾病的传播具有重要意义。
上述分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌在分解鸽子羽毛中的应用。
应用的具体方式是，将地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2013489的发酵液直接用于鸽子羽毛的分解。
其中，所述的发酵液按如下步骤制备得到：
（1）地衣芽孢杆菌菌株NJ-01的活化
用接种环将地衣芽孢杆菌菌株NJ-01划线于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为37℃；
（2）种子液的制备
将步骤(1)所述菌株活化后，在无菌条件下用接种环接1～2环单菌落于30～40mL种子培养基中，35～40℃震荡培养24～36小时，得种子液；
（3）发酵液的制备
摇瓶发酵：以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有瓶体积40％～60％的发酵培养基的摇瓶中，35～40℃，以120～200转/分钟的转速摇瓶发酵48-60小时，发酵结束，即得发酵液；
或者，
发酵罐发酵：以3～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有罐体积65％～70％的发酵培养基的发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为180～220r/min,通气量以发酵液体积m3/(空气体积m3*分钟)计为1/(1.1～1.2)，罐内压力0.1±0.02MPa,发酵48～72小时，发酵结束，即得发酵液。
其中，所述的活化培养基按如下方法制备得到：称取营养琼脂38g，蒸馏水800ml，调整pH7.5，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌，制得。
其中，种子培养基按如下方法制备得到：称取牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl5g，K2HPO41g，蒸馏水800ml，初始pH7.5，加蒸馏水至1000毫升，高压灭菌，制得；
其中，发酵培养基配方如下：鸽羽毛粉2wt%，K2HPO40.04wt%，硫酸亚铁0.01wt%，NaCl0.05wt%，溶剂为水，初始pH7.5，高压灭菌。
有益效果：本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）可直接用于鸽子羽毛的分解，从而有利于鸽子的废弃物回收利用，促进鸽子的生态、循环养殖，属安全微生物，可用于鸽子羽毛的分解、肉鸽养殖废弃物发酵及生物肥料领域。
附图说明
图1NJ-01菌落形态。
图2NJ-01显微镜放大400倍菌落形态。
图3NJ-01地衣芽孢杆菌菌体形态。
图4NJ-1菌株16SrDNA核苷酸片段PCR产物电泳图。其中，M为分子量对照；1为NJ-1菌株16SrDNA扩增产物。
图5NJ-01菌株16SrDNA1098bp NCBI网blast系统发育进化树。其中，lcl│92913为NJ-01菌株。
图6NJ10菌株对鸽羽毛分解5天结果。
图7NJ10菌株对鸽羽毛分解10天结果。
图8NJ10菌株对鸽羽毛分解15天结果。
图9未加NJ10菌株鸽羽毛形态结构。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：菌株的培养鉴定。
1、原始菌株的获得
从南京某鸽场鸽粪堆积物取样5克，直接用灭菌接种环采取采集的土壤划线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h后，观察生长出的单个菌落形态，细菌直径大小2mm左右，边缘不整齐，呈淡棕色，粗造型菌落（图1）。进行进一步的分离培养，获得单个菌落后进行纯培养。细菌分离培养结果：通过细菌分离培养，获得一株纯培养细菌，命名为NJ-01。分离到的细菌在400倍低倍显微镜下呈花瓣状（图2）。细菌经革兰氏染色后置于显微镜油镜下进行观察，结果为有芽孢的G+中等大小的杆菌，多数单在，少数呈3～5个短链状，繁殖体细菌大小0.6～0.8μm×1.5～3.0μm，细菌芽孢为椭圆形，中生，大小为0.6～0.9μm×1.0～1.5μm。
2、细菌的生化反应鉴定
取分离培养出的单个细菌菌落在载玻片上涂片进行革兰氏染色，然后置于光学显微镜油镜头下进行观察。挑取菌落接种于微量生化鉴定管，37℃培养24h后观察结果。并按常规方法接种三糖铁琼脂斜面和进行吲哚试验、MR试验、VP试验、柠檬酸盐利用试验、半固体营养琼脂穿刺试验并观察。
表1NJ01菌株生化反应试验结果
注:“+”表示分离菌生化反应呈阳性；“-”表示分离菌生化反应呈阴性。
细菌的生化反应鉴定结果表明，该菌株属于地衣芽孢杆菌。结果见表1。
从表可以看出，该菌株尿素、苯丙氨酸、硫化氢、匍酸盐、靛基质均为阴性，VP试验、枸橼酸盐、半固体、赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖发酵均为阳性。蔗糖、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖均为阴性。
对照伯吉氏细菌学鉴定手册，该分离的菌株在生化鉴定上属于地衣芽孢杆菌。
3、细菌16SrDNA基因片段序列测定
为了进一步鉴定该菌种，本研究作了细菌16SrDNA基因片段序列测定。取分离培养细菌接种营养肉汤，37℃振荡培养箱中150r/min培养10h后，用灭菌生理盐水10000rpm/min洗涤两次后，再用生理盐水稀释为原菌液体积作为细菌DNA模板。PCR扩增体系为在总量为50μl的反应体系中加入2×Tag PCR mix25μl、上下游引物各2μl，细菌DNA模板0.5μl，加灭菌超纯水至50μl。PCR扩增条件为：94℃8min；94℃45s，56℃45ｓ，72℃1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。以不加DNA模板的反应体系溶液作为空白对照。100ml1.2%琼脂糖（TaKaRa公司生产）微波炉完全溶化后加入goldview5ml混匀，待冷至80℃时倒板，待凝胶完全凝固后拔出梳子，每孔加样PCR扩增产物3μl进行凝胶电泳，电泳条件为电压100～110V，电流90～100mA，电泳时间45min，电泳完毕后立即放入凝胶成像系统进行观察和捕获图象，细菌16SrDNA核苷酸片段PCR产物电泳结果见图4。取PCR扩增产物30μl作为模板测定分离细菌16SrDNA1468bp核苷酸片段序列。
细菌16SrDNA基因片段PCR产物有1098bp，序列测序结果如SEQ ID No：1所示。
4、NJ-01菌株16SrDNA系统发育进化树结果
将NJ-01菌株16SrDNA1098bp核苷酸片段上述测序结果在NCBI网进行blast，结果表明，NJ-01菌株1098bp核苷酸片段与Genbank中已知地衣芽孢杆菌对应核苷酸片段同源性均高达99%以上，与地衣芽孢杆菌（登录号JX025165）同源性高达100%。具体进化说明见图5。
通过以上结果分析表明，该分离的菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。
实施例2：地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2013489的发酵。
（1）地衣芽孢杆菌菌株NJ-01的活化
用接种环将地衣芽孢杆菌菌株NJ-01划线于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为37℃；
（2）种子液的制备
将步骤(1)所述菌株活化后，在无菌条件下用接种环接1～2环单菌落于30～40mL种子培养基中，35～40℃震荡培养24～36小时，得种子液；
（3）发酵液的制备
摇瓶发酵：以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有瓶体积40％～60％的发酵培养基的摇瓶中，35～40℃，以120～200转/分钟的转速摇瓶发酵48-60小时，发酵结束，即得发酵液；
或者，
发酵罐发酵：以3～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有罐体积65％～70％的发酵培养基的发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为180～220r/min,通气量以发酵液体积m3/(空气体积m3*分钟)计为1/(1.1～1.2)，罐内压力0.1±0.02MPa,发酵48～72小时，发酵结束，即得发酵液。
所述的活化培养基按如下方法制备得到：称取营养琼脂38g，蒸馏水800ml，调整pH7.5，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌，制得。
所述的种子培养基按如下方法制备得到：称取牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl5g，K2HPO41g，蒸馏水800ml，初始pH7.5，加蒸馏水至1000毫升，高压灭菌，制得；
所述的发酵培养基配方如下：鸽羽毛粉2wt%，K2HPO40.04wt%，硫酸亚铁0.01wt%，NaCl0.05wt%，溶剂为水，初始pH7.5，高压灭菌。
实施例3：细菌对鸽羽毛片分解形态观察。
该分离培养出的细菌NJ-01能对不加任何营养成份的鸽羽毛片进行分解，37℃分别培养5d、10d、15d分解结果如图6、图7、图8，图9为未加菌株对照。每天观察的羽毛形态为：
原始羽毛片：可见到完整的羽干，上面分出众多的纤细羽枝，每根羽枝上又伸出若干更细的羽小枝，相连的羽小枝上面的小钩子相互钩连，羽毛片呈网状结构。
第5天羽毛片：羽干仍然完整，羽枝变得松软，羽小枝解体，羽枝钩溶解，羽毛网状结构消失，附羽部分消失。
第10天羽毛片：羽干松软，羽枝消失，羽小枝脱落、部分溶解消失，附羽全部消失。
第15天羽毛片：羽干大部分消失，仅留羽根硬角质部分，羽枝、羽小枝溶解，呈絮状，摇动分散后消失。至此，羽毛片基本溶解。
对照组与原始羽毛无明显区别。
实施例4：细菌对鸽羽毛分解残留量测定
取250ml规格三角烧瓶18个，各加入鸽羽毛粉1克及发酵培养基50ml，高压灭菌15磅121℃15min，待冷后备用。然后分成二组，第一组9个，每个各接种适量分离培养出的细菌（每毫升不少于109CFU），另一组9个作空白对照，置37℃振荡培养箱中150rpm/min培养后第5天、第10天及第15天分别从第一组及对照组各取样3份，取出羽毛粉，干燥，称重，观察结果。
细菌对鸽羽毛分解残留量测定结果：该分离培养出的细菌接种鸽羽毛粉发酵培养基置37℃振荡培养箱中150rpm/min培养15d后测定结果如下表2。
表2地衣芽孢杆菌NJ01菌株分解鸽羽毛残留量测定
由表2可见，试验组羽毛片在第五天就有65%左右的部分被分解，第10天分解率可达84%，至第15天可完全分解。
实施例5：鸽场羽毛粪便混合废弃物分解测定
取鸽场粪便羽毛混合废弃物，其中羽毛成分约占15%-20%。羽毛不作粉碎等机械性处理。在该废弃物中加入30%左右的麸皮及谷糠混合物，搅拌，混匀。将上述混合物分成3组，第1组为分解鸽毛的地衣芽孢杆菌NJ-01试验组，平均每千克含有不少于109CFU；第2组为能够分解鸡毛的地衣芽孢杆菌JK12试验组，平均每千克含有不少于109CFU；第3组为不加菌株的对照组。各组均用塑料薄膜密封，盖上盖子。分别置于15-25℃的环境中，任其发酵。分别在发酵后第5天及第10天及第15天打开塑料盖及薄膜进行检查，观察鸽粪及鸽子羽毛发酵分解的情况。
分解结果见表3。
表3地衣芽孢杆菌NJ01菌株发酵分解鸽子羽毛特征观察
由表3可见，地衣芽孢杆菌NJ01菌株能够有效地分解鸽子的羽毛片结构，发酵第5天羽枝、羽小枝及羽毛网状结构就能消失，部分附羽分解，而用来分解鸡毛的JK12菌株组羽干、羽枝仍然完整，羽小枝松软，附羽、微钩尚存，部分仍可见网状结构；第10天的时候NJ01菌株组即仅剩下部分羽干，至第15天，羽毛片基本上分解，仅留羽根。而分解鸡毛的JK12菌株组羽小枝、附羽及网状结构消失，但大部分羽枝分解，羽干仍较完整。至于对照组，第15天附羽及羽毛网状结构消失，羽小枝、羽枝仅部分分解，羽干仍完整。说明地衣芽孢杆菌NJ01菌株分解鸽毛的效果最好。
Claims (7)
1.一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株号为NJ-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月23日，保藏号为CCTCC NO：M2013489。
2.权利要求1所述的分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌在分解鸽子羽毛中的应用。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，将地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2013489的发酵液直接用于鸽子羽毛的分解。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵液按如下步骤制备得到：
（1）地衣芽孢杆菌菌株NJ-01的活化
用接种环将地衣芽孢杆菌菌株NJ-01划线于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为37℃；
（2）种子液的制备
将步骤(1)所述菌株活化后，在无菌条件下用接种环接1～2环单菌落于30～40mL种子培养基中，35～40℃震荡培养24～36小时，得种子液；
（3）发酵液的制备
摇瓶发酵：以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有瓶体积40％～60％的发酵培养基的摇瓶中，35～40℃，以120～200转/分钟的转速摇瓶发酵48-60小时，发酵结束，即得发酵液；
或者，
发酵罐发酵：以3～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有罐体积65％～70％的发酵培养基的发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为180～220r/min,通气量以发酵液体积m3/(空气体积m3*分钟)计为1/(1.1～1.2)，罐内压力0.1±0.02MPa,发酵48～72小时，发酵结束，即得发酵液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的活化培养基按如下方法制备得到：称取营养琼脂38g，蒸馏水800ml，调整pH7.5，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌，制得。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，种子培养基按如下方法制备得到：称取牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl5g，K2HPO41g，蒸馏水800ml，初始pH7.5，加蒸馏水至1000毫升，高压灭菌，制得。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基配方如下：鸽羽毛粉2wt%， K2HPO40.04wt%，硫酸亚铁0.01wt%，NaCl0.05wt%，溶剂为水，初始pH7.5，高压灭菌。
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