CN107384793B - 一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法 - Google Patents

一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可降解羽毛菌株的筛选方法，具体步骤包括从鸡场堆积病死鸡尸的地点取土壤样品；富集；初筛；复筛；分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得单菌落即为可降解羽毛菌株ABTNL‑4。本发明还提供了可降解羽毛菌株的应用方法，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入可降解羽毛菌株ABTNL‑4，37℃培养，即可实现羽毛降解。本发明方法羽毛的降解率可高达95％，微生物法降解羽毛，较物理化学法降解羽毛来说，反应条件温和，耗能少，经济环保的同时还避免了大部分氨基酸的损失,提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

Description

一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法。
背景技术
羽毛是鸟类和禽类表皮细胞角质化的衍生物，占其体重的10％。据统计，我国家禽年出栏量：2010年110.1亿只，2011年113.3亿只，2012年120.8亿只，2013年119.0亿只，2014年115.4亿只，2015年143.52亿只。按此趋势发展，家禽的羽毛产量持续增长。
羽毛的主要成分90％以上为角蛋白，羽毛属于天然角蛋白质，一种硬蛋白，很难被消化利用，导致蛋白资源的严重浪费。
数据显示，在中国，羽毛年产量可高达1100万t；而废弃羽毛的年产量可高达10万t。这些废弃羽毛主要的处理方法为填埋、焚烧，给生态环境带来严重的挑战。
国内外很早就开展了羽毛废弃物的资源化利用，但采用的方法主要是物理法—高温高压、膨化；化学法—酸碱水解。这些方法在加工过程中存在很大的缺点：高耗能，污染环境，同时所得的羽毛粉的营养价值损失严重，可利用率低。这些条件限制严重制约了技术的应用与普及。而微生物法降解，条件比较温和，显著地缩短了发酵周期，反应条件温和，耗能少，经济环保的同时还避免了大部分氨基酸的损失,提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种可降解羽毛废弃物的方法，实现降成本、低能耗、同时避免环境污染。
为了达到上述目的，本发明提供了可降解羽毛菌株的筛选方法，具体步骤为：
1、从鸡场堆积病死鸡尸的地点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于20-30ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；
2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的20-30ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；
所述富集培养基的组成成分为：每1000ml的蒸馏水中加入：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，pH 7.4-7.6
3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；
所述液体筛选培养基的配比为每1000ml水中加入氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.3-0.5g，磷酸二氢钾0.3-0.8g，羽毛粉6.0-20.0g，pH 8.0-8.5；
4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水后进行梯度稀释，稀释至10-5-10-8倍，将稀释液涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；
所述复筛过程采用的固体筛选培养基的配比为：每1000ml水中加入氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.3-0.5g，磷酸二氢钾0.3-0.8g，羽毛粉6.0-20.0g，琼脂粉10.0-20.0g，pH 8.0-8.5；
5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得菌落即为可降解羽毛菌株ABTNL-4；
6、菌种保藏：从步骤5划线平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取菌液与已灭菌的50％的甘油以1:1的比例混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。
优选方式下，步骤4复筛中稀释过程，稀释到10-6或10-7倍。
本发明还提供了一种上述可降解羽毛菌株的应用方法，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入菌株ABTNL-4，37℃培养，即可实现羽毛降解。
优选方式下，上述可降解羽毛菌株的应用方法，具体操作为，取菌株ABTNL-4置于含有羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，即可实现羽毛降解；
所述菌株ABTNL-4的菌株浓度为108～109CFU/ml；
所述发酵培养基的配比为每1000ml水中加入硫酸镁0.04-0.3g，氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.9g，氯化钙0.01-0.1g，羽毛粉6.0g-20.0g，调节pH至8.0～8.5。
本发明所用的微生物菌株ABTNL-4是在鸡场病死鸡尸堆积点的土壤中分离得到的，经过16SrRNA，BLAST，clustalx-2分析以及系统发育树的构建及形态学、生理生化鉴定结果，将该菌株定命名为Bacillus thuringiensis ABTNL-4，该菌经发明人检测在培养48h后对羽毛的降解率高达95％。
相比于现有技术，本发明的优势在于：
1、本发明采用的微生物菌株ABTNL-4，该菌株可以从鸡场病死鸡尸堆积点的土壤中筛选获得，培养原料简单易得、来源广泛。
2、本发明菌株筛选过程中提供了多种培养基，使菌株的筛选过程更加高效准确，各筛选步骤得到的菌株纯度高，应用效果好。
3、本发明所涉及的Bacillus thuringiensis ABTNL-4，可应用于降解羽毛，48h降解率可达到95％。同时，利用现代生物技术——基因工程、代谢组学、生物系统学等高科技技术，还可进一步提高该菌株的羽毛降解率，并通过降解产物而获得高附加值的营养成分，使该菌株的工业发展前景更加广阔。
4、本发明采用的微生物菌株ABTNL-4，该菌株不但降解羽毛周期短，而且降解效率高，可有效解决废弃羽毛的资源浪费问题，得到可利用的氨基酸和多肽，减少环境污染；同时由于降解产物中所含附加营养成分较高，因而满足了工业化生产。
5、本发明微生物法降解羽毛，与物理化学法相比，无需提供设备，使能耗大大降低，同时，发酵周期短，降解效率高，避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。
附图说明
图1为微生物菌株Bacillus thuringiensis ABTNL-4的扫描电镜照片；
图2为ABTNL-4的系统发育树；
图3为实施例4中在微生物菌株Bacillus thuringiensis ABTNL-4的作用下48h羽毛的降解情况。
保藏信息
本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ABTNL-4，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10036。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
以下具体实施方式为对本发明的上述内容做进-步的详细说明，但并不意味着本发明上述主体的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：羽毛降解菌种的筛选1
从普兰店某鸡场采集病死鸡尸堆积点土壤。
通过富集培养和初筛、复筛、进一步分离纯化得ABTNL-4菌株。
试验装置与羽毛处理
粉碎羽毛的实验装置：220V，3.6KW的高速多功能粉碎机。
羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，55℃烘干4-7天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。
富集培养基的配制：向含有1000ml蒸馏水的锥形瓶中分别加入牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，然后在磁力搅拌器上搅拌溶解，溶解后用2mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4-7.6。加盖密封，121℃，高温湿热灭菌20min。
培养基的分装：取已灭菌的富集培养基20ml置于已灭菌的50ml的离心管中备用。
筛选培养基的配制：以羽毛作为唯一的碳源氮源，只有可以利用羽毛的微生物菌株才能在该培养基上生长。根据液体筛选培养基的配方所需，称取氯化钠0.6g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.5g，溶解后，再加水至1L。pH 8.0-8.5取100ml于250ml的锥形瓶中，再加入羽毛0.8g。以此逐个分装。121℃，高温湿热灭菌20min。
固体筛选培养基的配制：在以上液体筛选培养基的基础上再加入琼脂粉20.0g即可。然后置于灭菌锅中，121℃，高温湿热灭菌20min。
具体的筛选步骤如下：
1、从普兰店某鸡场采集病死鸡尸堆积点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于25ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；
2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的25ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；
3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；
4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，然后选取10-6，涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；
5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取了单菌落进行平板划线；
6、菌种保藏：从固体平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取600μl于600μl已灭菌的50％的甘油混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。
实施例2：羽毛降解菌种的筛选2
从普兰店某鸡场病死鸡尸堆积点采集土壤样品。
通过富集培养和初筛、复筛、进一步分离纯化得ABTNL-4菌株。
试验装置与羽毛处理
粉碎羽毛的实验装置：220V，3.6KW的高速多功能粉碎机。
羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，55℃烘干5-7天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。
富集培养基的配制：分别称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，加入到含有1000ml蒸馏水的锥形瓶中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，溶解后用2mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4-7.6。加盖密封，121℃，高温湿热灭菌20min。
培养基的分装：取已灭菌的富集培养基25ml置于已灭菌的50ml的离心管中备用。
筛选培养基的配制：以羽毛作为唯一的碳源氮源，只有可以利用羽毛的微生物菌株才能在该培养基上生长。根据液体筛选培养基的配方所需，称取氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.4g，溶解后，再加水至1L。pH 8.0-8.5取100ml于250ml的锥形瓶中，再加入羽毛1.0g。以此逐个分装。121℃，高温湿热灭菌20min。
固体筛选培养基的配制：在以上液体筛选培养基的基础上再加入琼脂粉20.0g即可。然后置于灭菌锅中，121℃，高温湿热灭菌20min。
具体的筛选步骤如下：
1、从普兰店某鸡场病死鸡尸堆积点取土壤样品若干，称取土壤样品1g，溶于20ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；
2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的25ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；
3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；
4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，然后选取10-7，涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；
5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取了单菌落进行平板划线；
6、菌种保藏：从固体平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取600μl于600μl已灭菌的50％的甘油混匀于已灭菌的1.5ml的离心管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。
实施例3：菌种鉴定
本发明上述可降解羽毛菌株鉴定过程具体为：
菌种鉴定：采用16SrRNA法对微生物菌株进行鉴定
菌种鉴定结果：PCR扩增、测序：该菌株以肉汤培养基为底物培养至指数生长期，离心收集菌体，用PCR仪进行煮沸获取总DNA，16S rRNA PCR反应体系所用引物为通用引物(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)。
PCR反应体系
Figure BDA0001358342540000061
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min；第2步循环29次；72℃10min，电泳观察。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
根据上海生工生物工程技术服务有限公司的测序结果，进入NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)进行BLAST比对，然后进行clustalx-2.0，MEGA5.0构建系统发育树，结果如图2所示。
经测定，本发明所述的菌株具有以下微生物学特性：
形态学的特性：微生物菌株在肉汤固体培养基培养过夜，菌落呈现为圆形,白色,边缘光滑,不透明.菌体在显微镜下观察呈椭圆形杆状,大小为(1.2～1.8)μm×(3.0～5.0)μm。
扫描电镜观察：取对数生长期菌液，离心收集菌体，以PBS缓冲液(pH7.2)冲洗，样品送大连海洋大学做喷金处理，处理后的样品送大连交通大学进行扫描电镜观察并拍照。如图1所示
培养学特性：以1％的羽毛粉作为唯一的碳源和氮源，再选取基本培养基进行好氧培养。
上述所述的基本培养基的配比为：每1000ml蒸馏水中加入氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.3g，磷酸二氢钾0.4g，琼脂粉20.0g，pH 8.0-8.5。
综上所述各项指标可得知所筛到的可降解羽毛的菌株为Bacillusthuringiensis，并命名为Bacillus thuringiensis ABTNL-4。
实施例4：微生物菌株ABTNL-4的应用1
菌种的复苏：从-80℃的冰箱中取出已冻存的菌种，待其慢慢融化，取100μl于20ml已灭菌的NB培养基中，37℃，160r/min的摇床中培养过夜。
从培养过夜的NB培养基中取出100μl于100ml含有1g羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，实时观察检测羽毛粉的降解情况。培养过夜的微生物菌株ABTNL-4的菌株浓度达到108-×109CFU/ml。
发酵培养基的具体成分为：硫酸镁0.1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.35g，磷酸二氢钾0.45g，氯化钙0.01g，羽毛粉10.0g，蒸馏水1000ml，pH 8.0-8.5。
实验结果：微生物菌株ABTNL-4在37℃，160r/min的条件下培养，经过48h，羽毛粉的降解率可高达95％，巯基含量可高达2.05mmol/L。从本实施例的结果可以看出微生物菌株ABTNL-4可高效率的降解废弃羽毛。
降解效果如图3所示。
实施例5：微生物菌株ABTNL-4的应用2
菌种的复苏：从-80℃的冰箱中取出已冻存的菌种，待其慢慢融化，取100μl于25ml已灭菌的基础培养基中，37℃，160r/min的摇床中培养过夜。
从培养过夜的NB培养基中取出100μl于100ml含有1.5g羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，实时观察检测羽毛粉的降解情况。培养过夜的微生物菌株ABTNL-4的菌株浓度达到108-109CFU/ml。
发酵培养基的具体成分为：硫酸镁0.15g，氯化钠0.6g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.02g，羽毛粉15.0g，蒸馏水1000ml，pH 8.0-8.5
实验结果：微生物菌株ABTNL-4在37℃，160r/min的条件下培养，经过48h，羽毛粉的降解率可高达94.7％，巯基含量可高达2.02mmol/L。
从实施例4和实施例5的实验结果可以看出微生物菌株ABTNL-4可高效降解废弃羽毛，减少环境污染的同时，也实现资源的再利用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ABTNL-4，其特征在于：保藏编号为CGMCC NO.10036，该菌株用于降解羽毛。
2.根据权利要求1所述用于降解羽毛的菌株，其特征在于，该菌株的应用方法包括以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述发酵培养基中加入浓度为108~109CFU/ml所述可降解羽毛菌株ABTNL-4，37℃下160r/min的摇床中培养，即可实现羽毛降解；
所述发酵培养基的配比为每1000ml水中加入硫酸镁0.04-0.3g，氯化钠0.4-0.9 g，磷酸氢二钾0.2-0.6 g，磷酸二氢钾0.3 -0.9g，氯化钙0.01-0.1 g，羽毛粉6.0g-20.0 g，调节pH至 8.0~8.5。
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Feather degradation by strains of Bacillus isolated from decomposing feathers;Swetlana Nagal等;《Brazilian Journal of Microbiology》;20100301;第41卷(第1期);第196-200页 *
一株羽毛角蛋白降解菌的分离鉴定及特性研究;何熙璞 等;《环境科学与技术》;20140715;第37卷(第7期);第49-54页 *
高效降解角蛋白菌株的分离筛选与鉴定;王政 等;《中国农学通报》;20090920;第25卷(第18期);第22-24页 *

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